胚胎冷冻保存技术
摘要; 胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。研究和优化胚胎冷冻保存技术对胚胎工程的发展有重要的意义。
关键词：胚胎冷冻保存
为便于长途运输和随时供移植使用，将那些６～７日龄已有２０～３０个细胞的新鲜活胚胎（或分割后的半胚胎、１／４胎）在－１９６℃的超低温下冷冻贮存就是胚胎冷冻保存技术。这是在冷冻精子的技术基础上进一步发展起来的一项新技术。目前用冷冻胚胎移植的成功率约为鲜胚胎的７０％～８０％，胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。
现有的胚胎冷冻保存方法有四种：
一、常规冷冻法
常规冷冻法：也叫慢速冷冻法、逐步降温法。将采集到的胚胎用培养液洗涤后置入有不同冷冻保护剂(甘油或二甲亚枫(DMSO)等)浓度的三种冷冻液中(冷冻液浓度由低到高，最终浓度1．4M)，每种冷冻液中平衡5分钟，然后将胚胎和冷冻液装入细管中封口、标记，放入冷冻仪中进行冷冻。冷冻速率先以1～3~C／分下降至-6～-7℃，在此温度诱发结晶，平衡10分钟，然后，以0．3℃／分的速率降温至-35～_38℃，之后投入液氮中保存。胚胎解冻后，需按胚胎进入冷冻液时的相反浓度，即从高到低浓度脱除冷冻保护剂，每步5分钟，最后置入含20％血清的PBS保护液中洗涤3次，彻底脱除冷冻保护剂。或者将解冻后的胚胎放入0．5M(或1．0M)的蔗糖溶液中平衡10分钟，再用上述PBS液洗涤3次。
二、一步冷冻法
一步冷冻法：也叫一步细管法。该方法是由慢速冷冻法改进而来，细管内的冷冻液和蔗糖液是分开的，因此，在细管内用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂，从而利于在生产中推广应用。
三、程序冷冻法
程序冷冻法主要采用低浓度冻结保存剂梯度脱水,经程序冷冻仪缓慢降温。主要操作步骤包括:将细胞顺序放入一系列逐渐增加保存剂浓度的溶液中梯度脱水,置入程序冷冻仪快速降温至-6℃植冰(人工诱导冰晶形成),然后程序冷冻仪缓慢降温至-30℃~-80℃后液氮贮存。
程序冷冻法主要使用渗透较慢的低温保护剂，如乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO)，使冷冻保护剂充分渗透人胚胎细胞内，平衡后，利用程序降温仪缓慢降温，最后投入液氮保存。程序冷冻法采用较低浓度的冷冻保护剂，对胚胎毒性损害小，解冻后存活率较高。但因其操作繁琐，降温速度慢，致使所需时间长，需要特殊的降温装置，在不具备实验条件的场所不能使用此法进行胚胎冷冻。目前国内外均较少使用。
通常在程序化慢冷的液体中，各含有一种细胞渗透性冷冻保护剂和一种非细胞渗透性保护剂，于室温下，在低浓度的冷冻保护剂溶液中预平衡，然后放置在终浓度的冷冻液中。在冷冻仪内于预设的程序下降温标本，经过冷冻保护剂的处理后，胞内渗透压增高，意味着细胞内液冰点下降。由于细胞自身的特性，
它在细胞内外电解质平衡时，胞内液冰点比胞外低。
在室温到植冰点之间降温，往往冰晶还未来得及形成，但此期可以发生温度休克。温度休克al shock)是指某些细胞在降温过快时受到损伤，甚至在冷冻过程中被破坏的一种表现。其特点是与温度变化速率有关，常发生在15℃一一5℃降温过程之间。这可能是由于细胞膜脂类的相变，膜受损后渗透率改变；或在不同的热收缩应激反应时，细胞膜结构的断裂引起的。卵磷脂被认为有保护作用。
冷冻液通常在达到诸如一15℃的温度而冰晶尚未形成，即处于超冷状态。为了避免过冷状态的发展，使每一个溶液在一个特定的温度时开始冻结，使细胞脱水逐步顺利地进行，及为了控制过冷生物样品中过度大冰晶的形成作用，可通过两种方法来诱发结晶：一是向液体中加入微量冰晶，较少采。二是较常用的植冰(seeding)：用预冷至一70℃，或更低温度的金属棒在标本溶液冰点以下2–3℃时，瞬间地接触样品容器，可以带走大量水在液相转化为固相的潜伏热，这样可以激发和协助溶液中许多小冰晶的形成。辅助生殖中常采用的植冰温度是一6℃一– 8℃。目前，人工植冰比冷冻仪自动植冰可靠，用冷冻过的金属镊接触的部位应避免标本刚好所在位置，以免将样品迅速降温至细胞内冰晶形成而致死，一旦看到细胞外溶液中有一个白点样的小冰晶出现，提示溶液中已有大量冰核形成，即应立刻移开金属镊，将冷冻管放回冷冻仪，数秒钟后如再次拿出冷冻管观察，则标本溶液呈白色云雾状，提示溶液中已有大量小冰品形成，提示植冰成功。植冰在超冷状态极容易成功，否则不易进行。当麦管离开冷冻仪时，温度迅速上升。因此在诱导冰晶形成时，麦管离开冷冻仪的距离宜短，操作动作必须快，以避免温度波动过大。其次，冷冻仪的温度必须准确而且稳定。在诱导结晶后，冷冻植冰后大量冰晶形成导致大量潜热的释放，所以诱导结晶后在植冰温度保留5–10分钟以达到平衡状态。植冰使溶液浓度进一步增高，细胞进一步脱水。
植冰后的冷冻速率非常重要。因为如果降温过快，则细胞内的水分来不及脱出，造成在胞内液渗透压还来不及增高，冰点还来不及降低的情况下，由于外界温度明显降至胞内液冰点之下，细胞内形成冰晶。如果降温过慢，由于胞外溶液中的水逐渐结冰，剩余溶液的溶质浓度越来越高，细胞长时间地处于剧烈变化的外界pH和高渗透压中，将导致脂蛋白的变性而引起细胞的质膜的僵硬、收缩和受损，这称为溶液效应(solutioneffect)。最佳的冷冻速率应当慢到足以防止细胞内产生冰晶；快到使细胞置于高电解质溶液中的时间缩短到最低限度，以减少溶液效应。
植冰后，在适宜冷冻速率下，随着冷冻过程中温度的下降，围绕胞外小冰晶将有更多的水结冰，细胞脱水则随着溶液中的水逐渐转变为冰晶而顺利进行。随着细胞内外水分越来越少，溶质的浓度越来越高，细胞内、外液渐渐变为极其粘稠的状态，此时可以将其快速投入液氮。这时，粘稠的胞内外液体立即转化为玻璃样的固体，与先前溶液中形成的冰晶凝固为一体。胚胎投入液氮前的温度对复温后的活力影响极大。在采用PROH方案时，在一25℃时将胚胎投入到液氮中保存，复温后极少胚胎存活；＿ 25℃一一30℃吋将胚胎投入液氮，复温后的存活率明显低于在一80℃一100℃时投入液态者；这说明在使用目前的冷冻器材的情况下，只有在较低温度下，细胞内的高浓度液体才能玻璃样固化而不至于形成大的冰晶。虽然在低于一30℃时投液氮都是可行的，但许多IVF中心选择更低的温度，显然是考虑到投液氮过程中标本复温，以及标本稳定性等问题。
不论是细胞渗透性还是细胞非渗透性的保护剂都主要是为了给细胞造成脱水状态，但脱水的同时不能影响到细胞的生存；减少细胞外大冰晶的形成对细胞造成的损害也是冷冻应注意的方面之一。业已证实，单纯就低温保存而言，影响细胞冷冻保存的关键因素，是细胞冷冻和复温过程中，必须两次经过冰晶形成和重结晶的中间损伤温度区。在冷冻过程中，如果含水量过多，细胞可能毁于过度冰晶形成。但脱水过度，细胞也可能死亡。理想的冷冻方案是：①找到细胞含水过多和脱水过度之间的平衡点；②合适剂量的冷冻保护剂，既可以取代细胞质膜周围的水分子，又避免“溶质效应”；③合适的冷冻速率。
四、玻璃化冷冻法
玻璃化冷冻法是将胚胎在适当的冷冻保护剂混合液中作短暂处理后，直接投入液氮。冷冻保护剂在急剧降温到很低温度时能被浓缩而不结晶，而且液体的粘性增强，由液态变为透明的固态，形成玻璃化（“玻璃化”的概念是指水或溶液快速降温达到或低于-100℃~-110℃的温度范围时,形成一种高黏度的介于液态和固态之间、非晶体的、透明的玻璃态）。用这种方法冷冻，无需冻前分步添加抗冻剂和冻后分步脱除抗冻剂的繁琐步骤，简化了冷冻过程，是一种简便、快速、有效的冷冻方法，不需要冷冻仪器。玻璃化超快速冷冻技术它是最简洁、最快速的胚胎冷冻保存技术，冷冻过程不超过 1 min，不需要昂贵的程控冷冻仪器，是促进胚胎移植产业化的关键技术之一。
下面介绍几种常用的玻璃化冷冻法。
①超快速冷冻法
l985年，Rail等首次应用DMSO、乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇组成的玻璃化溶液超快速冷冻小鼠胚胎获得成功。1986年，Scheffen等以25%甘油和25% 1，2一丙二醇玻璃化超快速冷冻牛胚胎，降低了玻璃化溶液的毒性；同年，Kasai等以40 %乙二醇、0．5 mol／L蔗糖和30 Ficoll的混合溶液超快速冷冻小鼠胚胎。获得了较高存活率(98 %)，进一步降低了玻璃化溶液的毒性；2002年，朱士恩等应用以EG和DMSO 为主体的抗冻保护剂玻璃化冷冻小鼠原核胚，移植后妊娠率和产仔率与鲜胚的效果相近。2003年，Fujio 等以DAP213(2．0 mol／LDMSO+1．0 mol／l 乙酰胺+3．0 mol／L丙二醇)为冷冻保护剂冷冻小鼠获得成功；2005年，Baranyai等分别用SSV(Solid surface vitrification)法和麦管法冷冻小鼠8一细胞期胚胎，证明了SSV法对于桑椹胚和胚泡阶段的胚胎是一种较好的冷冻方法。
②开放式拉长塑料细管法(open pulled straws，OPS)
OPS法是丹麦人Vajta于1997年发明的，他使用薄壁细管，利用毛细现象将微量冷冻液滴和胚胎一起吸人管内后，投入液氮。这种方法克服了传统玻璃化的缺点，加快了冷冻速度和复苏速度，其降温速率可达 2 500℃／min，且对细胞的毒性和损伤作用较小。1998年，Vajta等应用OPS法冷冻牛不同阶段的胚胎，结果表明，受精后3～7 d的胚胎复苏后囊胚形成率为60 ～95 %，和新鲜胚胎无显著差别，且牛卵母细胞复苏后囊胚形成率高达25%，移植后产生3个仔牛。Lazar等应用OPS玻璃化法冷冻了117个牛囊胎，复苏后孵化率为39．5%，移植率和妊娠率分别为16．7% 和50%，均显著高于普通麦管玻璃化冷冻。朱亮等应用OPS法和传统麦管法对小鼠扩张囊胚进行玻璃化冷冻，结果表明，应用OPS法冷冻小鼠囊胚存活率(82．3 %)显著高于应用传统麦管者(68．6％)，且前者的冷冻囊胚孵出率(70．3 %)也明显高于后者(57．1 %)，因此认为OPS法是一种行之有效的冷冻方法。但是OPS法也存在一些不足，由于冷冻液与液氮直接接触，液氮里的一些潜在的污染源会增加污染的机会。
③封闭式拉长塑料细管法(closed pulled straws，CPS)
CPS法与OPS法相似，两者的区别在于CPS方法采用封闭式系统，即将含有胚胎的冷冻液通过两端的空气段和溶液段与外界隔开，从而能够避免胚胎和液氮直接接触而导致的损伤，有效降低了胚胎污染的危险性。Chen等Lj 应用CPS方法冷冻小鼠卵母细胞并与OPS法进行比较，结果发现冷冻后2组之间受精率、囊胚形成率均无显著性差异，但CPS的存活率较0PS组明显提高(79% VS 63%)。Ramezani等¨副对2一细胞期小鼠胚胎采用3种玻璃化冷冻方法(CS法、OPS法和CPS法)进行冷冻。玻璃化冷冻组的胚胎以由5．5 mol ／l EG和1．0 mol／L蔗糖组成的冷冻液作为冷冻保护剂，分别装于CS(普通麦管)、OPS和CPS管，投入液氮保存。复苏时将胚胎依次放人浓度递减的蔗糖中，复苏后的胚胎均置于人输卵管液(HTF)中培养。结果表明，用CPS法冷冻的胚胎的复苏率明显高于OPS和CS组；3组的孵化率无显著性差异，但CS组和OPS 组低于对照组。认为CPS冷冻法是一种迅速、简单、有效的冷冻2一细胞期胚胎的方法。
参考文献：
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【3】孙志宏, 马莉, 周茂林, 李延清. 人类胚胎冷冻保存技术的研究进展与应用前景【J】. 陕西医学杂志- 2008 /02.
家畜胚胎超低温冷冻保存的研究进展 蔡元1、2，张凤鸣1、2，潘红梅1、2、，陈四清1、2 (1.重庆市畜牧科学院重庆荣昌402460 .2.重庆市养猪工程技术研究中心重庆荣昌402460) 摘要：本文对家畜胚胎冷冻保护液的成分、冷冻方法、胚胎解冻方法与冷冻保护剂的脱除及最新研究进展进行了综述。 关键词：家畜；胚胎；冷冻保存 Present Research Advance in Cryopreservation of Livestock Embryos Cai yuan1、2, Zhang fengming1 2 ,Pan hongmei1、2 ,Chengsiqing1 2 (1.Chongqing Institute of Animal Science ,Chongqing Rongchang 402460 2.Chongqing Swine engineering Research，Chongqing Rongchang 402460) Abstract： Advances on cryoprotextive solution, freezing way, thaw way and the elimination of cryoprotective solution and recent situation in livestock embryos were reviewed in this paper. Key words：Livestock；Embryo；Cryopreservation 家畜胚胎的超低温冷冻保存技术不仅为动物种质资源的保存和良种家畜的国际交流提供了简单有效的手段,而且还是胚胎移植、体外受精、转基因和克隆等胚胎生物技术不可分割的组成部分。自从1972年,英国学者Whittingham等人首次冷冻保存小鼠胚胎获得成功后[1]，到目前已经在20多种哺乳动物上获得成功，奶牛、黄牛、山羊、绵羊、马、兔和小鼠等的冷冻胚胎已得到较广泛的使用[2-3]，特别是牛和羊的胚胎冷冻保存研究进展很快，其冷冻胚胎已经走向商品化应用。目前人们对冷冻保存原理、冷冻保存的因素和冷冻方法进行了广泛的研究并取得了巨大进步。 1、抗冻保护剂和冷冻溶液 在哺乳动物的胚胎冷冻过程中，加入抗冻保护剂的目的是为了防止冰晶的形成。抗冻保护剂常可分为三类：(1)细胞内液抗冻保护剂。常用低分子量可渗性物质，例如甲醇、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO)等；(2)细胞外液抗冻保护剂。常用低分子量不可渗性物质，例如半乳糖(Galactose)、蔗糖(Sucrose)、海藻糖(Trchaose)、聚蔗糖(Ficoll)等。（3）大分子量不可渗性物质，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PVA)，羟乙基淀粉及其它一些聚合物。 在实际应用中，缓慢冷冻法经常只使用一种抗冻保护剂，如甘油或乙二醇等，而快速冷冻和玻璃化冷冻常应用多种抗冻保护剂，如甘油和丙二醇、甘油和乙二醇或者乙二醇和丙二醇，再加入葡萄糖、蔗糖或半乳糖。甘油可调节细胞脱水并保护蛋白结构，而糖类，例如海藻糖可以保持膜结构，甘油本身并不能保持细胞膜结构，而且在高浓度和高温下可以诱发膜融合，因此解冻后需尽快除去甘油。这些不同低温保护液的特性表明，他们是以不同方法来保持胚胎细胞免受冷冻损伤，有效的低温保护液应将各种低温保护剂
玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用 戴志俊季钢张芳芳张奕 （合肥市妇幼保健院，合肥230001，安徽） 摘要：目的：探讨玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用效果。方法：回顾性分析2011年1月～10月在我院生殖中心行玻璃化冷冻解冻囊胚患者共12个周期的结局。结果：玻璃化冷冻解冻共21枚胚胎，存活21枚（存活率100%），共解冻12个周期，均有胚胎移植，获得临床妊娠5例（妊娠率41.67%），着床率23.81%（5/21）。结论：玻璃化冷冻法是保存人类囊胚的一种有效方法。 关键词：囊胚，玻璃化，冷冻保存，人类 Clinical Application Of Vitrification For Human Blastocysts Dai Zhijun, Ji Gang , Zhang Fangfang , Zhang Yi （Hefei Maternity and Child Health Hospital,Hefei 230001,Anhui）Abstract:Objective: To examine the clinical value of vitrification for human blastocysts. Methods: Retrospective analysis of 12 patients who conduct embryos vitrification from Jua.2011 to Oct.2011. Results: All of the 21 blastocysts were thawed and survived , survival rate was 100%(21/21);5 cycles of 12 cycles got clinical pregnancy after transferred, clinical pregnancy rate were 41.67% ,implantion rate were 作者单位：合肥市妇幼保健院 安徽医科大学妇幼保健临床学院安徽230001
胚胎冷冻保存技术 摘要; 胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。研究和优化胚胎冷冻保存技术对胚胎工程的发展有重要的意义。 关键词：胚胎冷冻保存 为便于长途运输和随时供移植使用，将那些６～７日龄已有２０～３０个细胞的新鲜活胚胎（或分割后的半胚胎、１／４胎）在－１９６℃的超低温下冷冻贮存就是胚胎冷冻保存技术。这是在冷冻精子的技术基础上进一步发展起来的一项新技术。目前用冷冻胚胎移植的成功率约为鲜胚胎的７０％～８０％，胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。 现有的胚胎冷冻保存方法有四种： 一、常规冷冻法 常规冷冻法：也叫慢速冷冻法、逐步降温法。将采集到的胚胎用培养液洗涤后置入有不同冷冻保护剂(甘油或二甲亚枫(DMSO)等)浓度的三种冷冻液中(冷冻液浓度由低到高，最终浓度1．4M)，每种冷冻液中平衡5分钟，然后将胚胎和冷冻液装入细管中封口、标记，放入冷冻仪中进行冷冻。冷冻速率先以1～3~C／分下降至-6～-7℃，在此温度诱发结晶，平衡10分钟，然后，以0．3℃／分的速率降温至-35～_38℃，之后投入液氮中保存。胚胎解冻后，需按胚胎进入冷冻液时的相反浓度，即从高到低浓度脱除冷冻保护剂，每步5分钟，最后置入含20％血清的PBS保护液中洗涤3次，彻底脱除冷冻保护剂。或者将解冻后的胚胎放入0．5M(或1．0M)的蔗糖溶液中平衡10分钟，再用上述PBS液洗涤3次。 二、一步冷冻法 一步冷冻法：也叫一步细管法。该方法是由慢速冷冻法改进而来，细管内的冷冻液和蔗糖液是分开的，因此，在细管内用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂，从而利于在生产中推广应用。 三、程序冷冻法 程序冷冻法主要采用低浓度冻结保存剂梯度脱水,经程序冷冻仪缓慢降温。主要操作步骤包括:将细胞顺序放入一系列逐渐增加保存剂浓度的溶液中梯度脱水,置入程序冷冻仪快速降温至-6℃植冰(人工诱导冰晶形成),然后程序冷冻仪缓慢降温至-30℃~-80℃后液氮贮存。 程序冷冻法主要使用渗透较慢的低温保护剂，如乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO)，使冷冻保护剂充分渗透人胚胎细胞内，平衡后，利用程序降温仪缓慢降温，最后投入液氮保存。程序冷冻法采用较低浓度的冷冻保护剂，对胚胎毒性损害小，解冻后存活率较高。但因其操作繁琐，降温速度慢，致使所需时间长，需要特殊的降温装置，在不具备实验条件的场所不能使用此法进行胚胎冷冻。目前国内外均较少使用。 通常在程序化慢冷的液体中，各含有一种细胞渗透性冷冻保护剂和一种非细胞渗透性保护剂，于室温下，在低浓度的冷冻保护剂溶液中预平衡，然后放置在终浓度的冷冻液中。在冷冻仪内于预设的程序下降温标本，经过冷冻保护剂的处理后，胞内渗透压增高，意味着细胞内液冰点下降。由于细胞自身的特性，
药品器材清单 PMSG 孕马血清促性腺激素 hCG 人绒毛膜促性腺激素 DPBS 杜氏磷酸缓冲液 M16 体外培养液 EG 乙二醇 蔗糖 塑料细管 1ml注射器 35mm培养皿若干 二氧化碳培养箱 小鼠胚胎的获取 控光（14h光照，10h黑暗）饲养1-2周后的4-6周龄小白雌鼠，腹腔注射10 IU/只PMSG，48h后腹腔注射10 IU/只hCG。注射hCG后（计时为0h）当晚与雄鼠（≥8周龄）合笼（雌：雄=2:1或1:1）。次日早晨检查阴道栓，见栓雌鼠于72-82h颈椎脱臼处死，采集桑椹胚。在DPBS中洗净后移入M16培养基，置于5 %CO2,95 %空气,相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中待用。 小鼠胚胎的玻璃化冷冻 平衡液EG10，见附录溶液的配制。 玻璃化溶液EFS40 ，见附表2。或者EG40，亦见附录溶液的配制。 解冻稀释液用DPBS稀释而成的0. 5mol/L蔗糖溶液。 将室温调至25℃,经1～2小时将溶液及用具充分平衡后，用0. 25ml的塑料细管(Flance) 按顺序吸入解冻稀释液5cm———空气1㎝——1.5cm玻璃化溶液。 用吸管将胚胎移入平衡液平衡5分钟,而后导入细管内的玻璃化溶液中平衡30秒。这30秒接着吸入空气1cm——吸满解冻稀释液，封口后直接投入液氮中保存。 小鼠冷冻胚胎的解冻 将冻好保存于液氮中的细管,取出后直接投入25℃水中快速解冻。当解冻稀释液部分由乳白变为透明时取出,用吸水纸将细管水珠拭净,剪断细管两端的栓塞后,用含有解冻稀释液(0. 8ml)的注射器(带16号针头),将细管内容物冲洗于表面皿中，轻轻摇匀,置于实体显微镜下回收胚胎。回收的胚胎于解冻稀释液中平衡5分钟,以便脱出细胞内部乙二醇,再用PBS洗净后,移入M16溶液中于5 %CO2,95 %空气,相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中培养。 小鼠胚胎的发育能力判定 体外培养回收的胚胎在M16中培养48小时以内恢复到囊胚或继续发育的胚胎视为有发育能力胚胎。 胚胎移植解冻后的胚胎,约经3小时培养,选择外形良好的胚胎移植于与结扎输精管的公鼠交配后即假妊娠第3天受体鼠的子宫中,一侧5～7枚,每只受体10～14枚胚胎为宜。妊娠19～22天观察产仔情况。
哺乳动物胚胎冷冻保存综述 09动物生物技术2班 200930380216 宋骥晨 摘要：哺乳动物胚胎冷冻保存效果受冷冻保护剂、冷冻方法、解冻方法等多种因素影响, 其中冷冻方法是一个关键性因素。目前胚胎冷冻方法主要有常规慢速冷冻法和玻璃化冷冻法两种。常规慢速冷冻法是指利用甘油、乙二醇等做冷冻保护剂通过缓慢降温的方式进行胚胎冷冻; 玻璃化冷冻法是指利用高浓度的冷冻保护剂通过快速降温的方式进行胚胎冷冻。与常规慢速冷冻法相比, 玻璃化冷冻法简化了操作过程, 大大缩短了操作时间, 不需昂贵的程序控制冷冻仪。 关键词：胚胎; 冷冻保存; 冷冻保护剂; 冷冻; 解冻 胚胎冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程序使胚胎在 -196℃温度下停止代谢活动, 而升温后又不失去代谢能力的一种长期保存技术, 是实现动物胚胎生产技术实用化和商业化的重要保证。1972年, whittingham等首先发明了慢速冷冻法, 成功地保存了小鼠胚胎, 并在解冻后移植产下了后代。这种方法经过30多年的发展, 冷冻效果已基本稳定, 迄今为止, 已有多种动物胚胎经常规冷冻、解冻后移植至受体得到后代。 1.胚胎冷冻保存原理 胚胎细胞是发育中的细胞, 细胞内水分含量达到80%以上, 如
果不经保护, 冷冻时细胞内部就会形成冰晶, 破坏蛋白质的结构使其发生不可逆的变化, 从而导致胚胎死亡。常规慢速冷冻法的原理是通过加入低浓度的防冻剂, 缓慢降温将胚胎内的水分在冻结前脱出, 阻止冷冻过程中形成有害冰晶而造成胚胎损伤。将胚胎放到含有渗透性防冻剂的溶液中,防冻剂使胚胎细胞内的水分能够在-10℃以上不冻结并且能替换出部分水分。随着降温的进行, 细胞外液开始形成冰晶, 细胞外液浓度变高, 由于渗透压的原理使细胞内的水分开始脱出。为了保证细胞外液冰晶形成的时间总是早于细胞内液, 大多数冷冻程序采用植冰的方式来诱发细胞外液冰晶的生长, 植冰通常在-5℃到- 7℃进行。缓慢降温使细胞内的水分有更多的时间在冻结前脱出。需要指出的是, 胚胎在冷冻过程中不可避免地要形成冰晶。关键是冰晶的大小和数量能否造成胚胎的损伤。玻璃化冷冻保存的原理是在足够低的温度下或采用高浓度的防冻剂使冷冻过程中形成玻璃样物质减少细胞内外冰晶的形成。总之, 无论采取何种冷冻方法, 胚胎冷冻保存的原理都是阻止冷冻、解冻过程中细胞内形成致死冰晶。 2.抗冻保护剂和冷冻保护液 在哺乳动物的胚胎冷冻过程中, 冰晶的形成对胚胎的损伤是致命的。-15℃~ -50℃是一个致死温度区, 在这个温度区细胞容易形成大的冰晶。加入抗冻保护剂能避免冰晶的形成。抗冻保护剂主要分为3类：（1）低分子质量可渗物质, 如甲醇、乙二醇、丙二醇、甘油等一些醇类; （2）低分子质量不可渗物质, 如葡萄
江苏省无锡市中级人民法院 民事判决书 （2014）锡民终字第01235号 上诉人（原审原告）沈新南。 上诉人（原审原告）邵玉妹。 两上诉人的共同委托代理人郭小兵，江苏瑞莱律师事务所律师。 两上诉人的共同委托代理人郭伟，江苏瑞莱律师事务所律师。 被上诉人（原审被告）刘金法。 被上诉人（原审被告）胡杏仙。 原审第三人南京鼓楼医院，住所地南京市鼓楼区中山路321号。 法定代表人韩光曙，该院院长。 委托代理人王玢，该院生殖中心医生。 委托代理人郑哲兰，江苏永衡昭辉律师事务所律师。 上诉人沈新南、邵玉妹因与被上诉人刘金法、胡杏仙，原审第三人南京鼓楼医院监管权和处置权纠纷一案，不服宜兴市人民法院（2013）宜民初字第2729号民事判决，向本院提起上诉。本院于2014年7月2日受理后，依法组成合议庭审理了本案，现已审理终结。 原审法院审理查明： 沈杰与刘曦于2010年10月13日登记结婚，于2012年4月6日取得生育证明。2012年8月，沈杰与刘曦因“原发性不孕症、外院反复促排卵及人工授精失败”，要求在南京市鼓楼医院（以下简称鼓楼医院）施行体外受精-胚胎移植助孕手术；鼓楼医院在治疗过程中，获卵15枚，受精13枚，分裂13枚；取卵后72小时为预防“卵巢过度刺激综合征”，鼓楼医院未对刘曦移植新鲜胚胎，而于当天冷冻4枚受精胚胎。治疗期间，刘曦曾于2012年3月5日与鼓楼医院签订《辅助生殖染色体诊断知情同意书》，刘曦在该同意书中明确对染色体检查及相关事项已经了解清楚，同意进行该检查；愿意承担因该检查可能带来的各种风险；所取样本如有剩余，同意由诊断中心按国家相关法律、法规的要求代为处理等。2012年9月3日，沈杰、刘曦与鼓楼医院签订《配子、胚胎去向知情同意书》，上载明两人在鼓楼医院生殖医学中心实施了试管手术，获卵15枚，移植0枚，冷冻4枚，继续观察6枚胚胎；对于剩余配子(卵子、精子)、胚胎，两人选择同意丢
首例冷冻胚胎继承案民 事判决书 Revised as of 23 November 2020
我国首例冷冻胚胎继承案民事判决书江苏省无锡市中级人民法院民事判决书（2014）锡民终字第01235号上诉人（原审原告）沈新南。上诉人（原审原告）邵玉妹。两上诉人的共同委托代理人郭小兵，江苏瑞莱律师事务所律师。两上诉人的共同委托代理人郭伟，江苏瑞莱律师事务所律师。被上诉人（原审被告）刘金法。被上诉人（原审被告）胡杏仙。原审第三人南京鼓楼医院，住所地南京市鼓楼区中山路321号。法定代表人韩光曙，该院院长。委托代理人王玢，该院生殖中心医生。委托代理人郑哲兰，江苏永衡昭辉律师事务所律师。上诉人沈新南、邵玉妹因与被上诉人刘金法、胡杏仙，原审第三人南京鼓楼医院监管权和处置权纠纷一案，不服宜兴市人民法院（2013）宜民初字第2729号民事判决，向本院提起上诉。本院于2014年7月2日受理后，依法组成合议庭审理了本案，现已审理终结。原审法院审理查明：沈杰与刘曦于2010年10月13日登记结婚，于2012年4月6日取得生育证明。2012年8月，沈杰与刘曦因“原发性不孕症、外院反复促排卵及人工授精失败”，要求在南京市鼓楼医院（以下简称鼓楼医院）施行体外受精-胚胎移植助孕手术；鼓楼医院在治疗过程中，获卵15枚，受精13枚，分裂13枚；取卵后72小时为预防“卵巢过度刺激综合征”，鼓楼医院未对刘曦移植新鲜胚胎，而于当天冷冻4枚受精胚胎。治疗期间，刘曦曾于2012年3月5日与鼓楼医院签订《辅助生殖染色体诊断知情同意书》，刘曦在该同意书中明确对染色体检查及相关事项已经了解清楚，同意进行该检查；愿意承担因该检查可能带来的各种风险；所取样本如有剩余，同意由诊断中心按国家相关法律、法规的要求代为处理等。2012年9月3日，沈杰、刘曦与鼓楼医院签订《配子、胚胎去向知情同意书》，上载明两人在鼓楼医院生殖医学中心实施了试管手术，获卵15枚，移植0枚，冷冻4枚，继续观察6枚胚胎；对于剩余配子(卵子、精子)、胚胎，两人选择同意丢弃；对于继续观察的胚胎，如果发展成囊胚，两人选择同意囊胚冷冻。同日，沈杰、刘曦与鼓楼医院签订《胚胎和囊胚冷冻、解冻及移植知情同意书》，鼓楼医院在该同意书中明确，胚胎不能无限期保存，目前该中心冷冻保存期限为一年，首次费用为三个月，如需继续冷冻，需补交费用，逾期不予保存；如果超过保存期，沈杰、刘曦选择同意将胚胎丢弃。2013年3月20日23时20分许，沈杰驾驶苏B5U858车途中在道路左侧侧翻，撞到路边树木，造成刘曦当日死亡，沈杰于同年3月25日死亡的后果。现沈杰、刘
摘要:哺乳动物胚胎冷冻保存效果受从稀释液和冷冻保护剂、冷冻前处理、冷冻剂型、冷冻速率、解冻等方面的因素。,其中冷冻方法是一个关键性因素。目前胚胎冷冻方法主要有常规慢速冷冻法和玻璃化冷冻法两种。常规慢速冷冻法是指利用甘油、乙二醇等做冷冻保护剂通过缓慢降温的方式进行胚胎冷冻;玻璃化冷冻法是指利用高浓度的冷冻保护剂通过快速降温的方式进行胚胎冷冻。与常规慢速冷冻法相比,玻璃化冷冻法简化了操作过程,大大缩短了操作时间,不需昂贵的程序控制冷冻仪。 关键词:胚胎;冷冻保存;冷冻保护剂;冷冻;解冻,玻璃化 胚胎冷冻保存[1]是指通过特殊的保护措施和降温程序,使胚胎在-196℃条件下停止代谢,而升温后又恢复代谢能力的一种技术。一般指0～-80℃的温度下保存胚胎,而超低温冷冻保存则是在极低的温度(液氮-196℃、液氦-269℃)下保存动物胚胎.处于超低温下的胚胎,其新陈代谢几乎完全暂时停止,因而可以达到长期保存的目的[2]。1972年Whittingham[3，4，5]等首次在超低温条件下成功地冷冻保存了小鼠胚胎, 解冻后移植产下后代。由于这种方法的诞生引来了很多的人的注意，此后,许多学者对哺乳动物胚胎冷冻保存进行了大量的研究,取得了大量研究成果, 牛(Wilmut & Rowson,1973)、家兔(Whittingham & Adams,1976)、大鼠(Whittingham,1975)、山羊(Bilton et al.,1976)和绵羊(Willadsen et al.,1976)等动物的胚胎超低温保存也相继取得成功. 1977年Willadsen等[6]对上述方法进行了改良,发明了快速冷冻法,将冷冻降温时间缩短了1 h.1985年Rall等[7]首次发明了玻璃化冷冻法,对小鼠8细胞胚胎冷冻保存取得成功.随后经研究者的不断改进,使这项技术日趋成熟,部分动物胚胎经玻璃化冷冻后已在生产中示范应用,有望在生产实际中得到推广，本文对哺乳动物胚胎冷冻保存技术的最新研究进展加以综述。 1冷冻保护剂的种类 抗冻保护剂(Cryoprotective agents,CAP)也就是冷冻保存剂是指可以保护细胞抵抗低温或超低温时对细胞产生的损害,如细胞结冰、脱水、溶质浓度提高和蛋白质变性及其骨架结构的损伤等的一类化合物。 1.1抗冻保护剂[8]主要包括丙三醇(glycer-ol)、二甲基亚砜(dimethylsulphoxide,DMSO)、丙二醇(propyleneglycol)、乙二醇( ethylene glycol)、乙酰胺( acetamide)、甲醇(methyl alcohol)和丁二醇(butadiene)等。又称细胞内液抗冻保护剂,这类保护剂分子量小, 能够保证细胞内水分的及时脱出,而且还能降低溶液的凝固点,这样使胚胎有更多的时间把细胞内的水分脱出,避免细胞内形成冰晶。并通过与胚胎的平衡,替换出细胞内的部分水分,这样降低细胞内形成冰晶。但是它们对胚胎有毒害作用,尤其在高浓度或高温下毒害作用更大。 各种渗透性抗冻保护剂对胚胎的保护作用机制基本是相同的,但它们的毒性和渗透性有很大差别,因此在玻璃化冷冻的胚胎存活率上效果不同。关于不同种类的抗冻保护剂的渗透性和毒性,Leibo用毒性相对较低的Gly和EG对牛胚作对比研究发现,EG对细胞的渗透性强。Kasai等用30% (v/v)浓度抗冻保护剂处理小鼠桑椹胚30 min,观察对生存率影响实验的结果表明,乙二醇的化学毒性最小,其次是丙三醇、DMSO、丙二醇,乙酰胺毒性最高。另外,对不同发育时期的胚胎来说,抗冻保护剂的毒性也不尽相同。 1. 2分子量非渗透性抗冻保护剂低分子量非渗透性冷冻保护剂是胚胎冷冻液中 的另一个关键性成分。其主要指糖类,如单糖(葡萄糖、果糖、山梨醇和甘露醇)、二糖(蔗糖、海藻糖)和多糖(棉子糖),目前应用最广泛的是蔗糖。糖类除了能通过提高渗透压来促进细胞脱水外,还能保持细胞结构的完整。同时,糖类能减少达到玻璃化所需的渗透性冷冻保护剂的浓度,这两个特性均可降低冷冻保护剂对胚胎的毒害作用。此外,糖类还可以作为渗透压缓冲