哺乳动物克隆是近十几年来生命科学领域最引人注意的高新技术。1996—1997年英国科学家开创性的连续用胚胎成纤维细胞、成年动物乳腺上皮细胞获得了克隆绵羊。Dolly 羊的出生为体细胞克隆时代的来临拉开了序幕。近年来,动物体细胞克隆得到了长足的发展,牛、山羊和猪等动物相继克隆成功,而且克隆技术也不断完善,克隆方法不断优化。但该技术还有很多需要解决的问题,克隆效率极低,表现为孕期流产率高,以及出生后生长异常等,在理论和技术上也还很不成熟,如基因组重新编程的机制尚不清楚,选择合适的
施主细胞和实现核质同步协调性的问题尚没有完全解决,异种克隆动物有很大的困难等。鉴于体细胞克隆技术对抢救珍奇濒危动物、复制优良家畜个体、扩大良种动物群体、提高畜群遗传素质和生产性能、提供足量试验动物、推进转基因动物研究、攻克遗传性疾病、研制高水平新药、生产可供人移植的内脏器官等方面中具有重要的研究意义及现实应用意义。本文对动物克隆技术中涉及的应用方法,动物克隆技术中亟待解决的问题,哺乳动物核移植技术的应用前景等关键问题进行了系统的介绍,旨在阐明国内外哺乳动物体细胞克隆的
哺乳动物克隆的现状和研究进展
盛鹏程1,2,苗向阳1,朱瑞良2
1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193
2.山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018
收稿日期:2010-03-26
基金项目:国家高科技研究发展计划(863计划项目(2008AA10Z140;转基因生物新品种培育科技重大专项(2009ZX08008-004B ,2008ZX08008-
003;国家自然科学基金项目(30571339;中国农业科学院创新基金项目(2004-院-1
作者简介:盛鹏程,硕士研究生,研究方向为微生物与免疫及转基因动物,电子信箱:spc198696@https://www.doczj.com/doc/b616052942.html, ;苗向阳(通信作者,研究员,研究方向为
基因工程与功能基因组学及转基因动物,电子信箱:myx32@https://www.doczj.com/doc/b616052942.html,
摘要
哺乳动物细胞克隆是20世纪末生命科学领域最引人注目的高新技术,该技术对于优良种畜的复制、减少试验用动物数目、
动物遗传多样性保存及濒危动物挽救、转基因动物培育等方面具有重要意义。近年来克隆技术发展迅速,多种哺乳动物相继克隆成功,但也存在克隆效率太低、克隆动物表型正常而实质异常的问题。本文详细阐述了克隆效率太低、克隆动物表型正常而实质异常问题,介绍了当前动物克隆技术的发展现状,并对动物克隆涉及的技术进行了总结和概括,着重介绍了卵母细胞的去核方法和重组胚的构建方法。
关键词哺乳动物;核移植;体细胞克隆
中图分类号S814.8文献标识码A 文章编号1000-7875(201013-0105-06
Status and Research Progress in the Mammalian Cloning
SHENG Pengcheng 1,2,MIAO Xiangyang 1,ZHU Ruiliang 2
1.Institute of Animal Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China
2.Animal Science and Technology,Shandong Agricultural University,Tai'an 271018,Shandong Province,China
Abstract
Mammalian cell cloning is the most compelling high -technology in life sciences in the late 20th century.It is important
because of its roles played in the reproduction of good breeding stock,reduction of the number of experimental animals,reserving of animal genetic diversity,saving of endangered animals,transgenic animal breeding and other aspects.A variety of cloning animals have been made successful,but with a low efficiency and frequent abnormality in birth weight and physiological conditions,which are discussed in detail in this
paper,together with the current developments of animal cloning,and the technologies involved in cloning animals.The methods to remove the nuclei from oocytes and to reconstruct embryos are highlighted.The application prospects are also commented.
Keywords mammals;nuclear transfer;somatic cell clone
综述文章(Reviews
研究现状及其发展前景,为进一步研究动物体细胞克隆提供参考。
1动物克隆技术
1.1动物克隆技术的研究方法
目前动物克隆技术的核心是核移植。核移植是指将胚胎细胞或体细胞的细胞核用显微外科手术的方法移入去核的卵母细胞中,构建成重组,通过体内或体外培养、胚胎移植,产生与供体细胞基因型相同的后代的技术过程,又称为动物克隆技术。根据核供体的来源不同,可将其分为胚胎细胞克隆技术及体细胞克隆技术,主要包括胚胎细胞核移植、胚胎干细胞核移植、胎儿成纤维细胞核移植、体细胞核移植。胞质内全细胞直接注射法主要有两种方式:Piezo驱动装置辅助的直接注核[1]和普通显微操作系统辅助的直接注核[2]。胎儿成纤维细胞由于能在克隆前进行基因修饰,故目前大多数家畜的克隆都以它为供核细胞[3]。一些研究人员尝试利用未进行破膜处理的供体细胞进行全细胞直接注射核移植,避开了核的分离和电融合过程,该方法也成功获得克隆后代[4]。
1.2核移植的基本技术环节
动物细胞核移植是一项复杂的生物技术,主要包括1组以显微操作与常规操作相结合的技术:卵母细胞去核、供核细胞的获得和处理、供核细胞移入受体细胞、细胞融合和激活、重组胚的体内外培养及发育胚移入雌性受体的过程。
1.2.1受体卵母细胞
在细胞核移植的研究中,作为核受体的主要有去核受精卵和去核成熟卵母细胞2种。Willadsen[5]首创用去核成熟卵母细胞(M期作受体细胞后,得到了胚胎克隆绵羊。以后的研究者大部分用去核成熟卵母细胞作受体,相继得到了克隆动物。结果证明,处于M期的卵母细胞有利于供体核在重组胚中的再程序化,保证了核移植一定的成功率。去核率越高,其重组胚发育成个体的可能性越大[6]。卵母细胞的去核方法主要如下。
1示核法。传统的Hoechst33342示核法为短波激发荧光,可以显示极体与卵母细胞中期板的相对位置,从而可以作为判断去核是否成功的标志。采用这种方法,需要使用紫外光照射,紫外线对卵母细胞可能会造成不同程度的伤害,从而影响克隆胚胎的后续发育。
2盲吸法。采用盲吸法去核,去核效率达90%以上。不需要荧光,也避免了Hoechst33342可能对卵母细胞的不利影响。由于处于M期的卵母细胞核不易辨认,在操作过程中一般采用盲吸法。
3化学法。上述两种方法虽然常用,但每次只能处理一个卵母细胞,而且操作的技能要求高,去除的胞质体积大,对卵母细胞常常造成机械性的伤害。在卵母细胞成熟期间可以把一些化学试剂添加到成熟液中,造成卵母细胞分裂,分离的动力系统发生改变,使得中期板和极体一同排出,从而达到去核的目的。用于化学去核的物质和方案主要有Etoposide+CHX,DC+CHX,Democolcine+sucrose等组合。这种方法可以成批处理卵母细胞。
4离心法。由于卵母细胞核与细胞质,极体之间的质量不同,可以利用梯度离心法处理,细胞核和极体一同排出。但还没有获得克隆后代的报道。
5功能法。利用物理或化学处理,使卵母细胞的核变性,失去功能,从而达到类似的去核目的。这种非机械法去核得到的克隆囊胚率及胚胎细胞遗传学,核型及微管组成都与常规机械法处理没有太大的区别。目前,该法使用较少。
6半卵法。用显微分割刀将卵母细胞一分为二,选择无核物质的一半,同供核体细胞融合重组胚胎。这是绵羊首次胚胎克隆成功应用的方法。缺点是卵胞质去除体积量大,机械伤害大。如果将两个无核物质的半卵同一个体细胞重构卵,则造成浪费。现在此方法使用较少。
7末期去核法。在减数分裂第二次成熟分裂的末期,以第二极体为指示,去除与其相邻的部分胞质,去除的胞质少,效率高。
8极化显微镜法。可以不用任何染料,普通光路下即可看到清晰的极体以及中期板,但没有关于成活克隆后代的报道。
9挤压法。在卵母细胞成熟的一定阶段,如牛的卵母细胞体外培养16~17h,在多数卵的第一极体即将排出的时候,在极体附近挑破透明带,挤压使极体排出。由于此时极体尚未完全与中期板分开,从而可以带着相邻的核一同排出。这种方法己经在牛、猪上进行了尝试,并且取得了成功。
1.2.2体细胞的制备
从哺乳动物细胞核移植发展过程看,供体细胞核主要包括胚胎分裂球、体细胞、胚胎细胞。Dolly羊的成功,使得体细胞作为一个新的供核资源加入到核移植的行列。与胚胎细胞相比,用体细胞作为核供体具有明显优势,而且其应用价值远远大于胚胎细胞作为供体核。
目前,在体细胞克隆时供核体细胞的准备方案基本上可分为4种:①罗斯林方案(即血清饥饿法,使细胞处于GO 期;②檀香山方案,即使用新鲜分离或者处于活跃分
裂期的细胞;③北京方案,即将体细胞在4℃冷藏一段时间用于克隆;④ACT方案,即
接触抑制的细胞准备方案。还有一种就是-70℃或者液氮冻存的细胞直接复苏后用作供体。其中使用最为广泛的是罗斯林方案。
1996年Campbell等[7]首先采用血清饥饿法控制细胞周期,使细胞停留在GO期,从而提高了体细胞克隆的成功率。Kubota等[8]通过实验表明,血清饥饿培养对核移植胚胎融合率、卵裂率及囊胚率的影响不显著,但对重组胚胎的妊娠率有较大影响,也就是说,饥饿法处理有助于重组胚后期的发育。因此,在当前体细胞克隆成活率低的前提下,为期望获得较高的成功率,选用血清饥饿法处理供核细胞仍是明智之举[9]。Wilmut等[10]认为该方法对Dolly羊的诞生起到关键性的作用。然而,1998年Cibelli[11]在其研究中发现用正常细胞和饥饿处理的细胞克隆动物的出生率相同。由此可见,核与质的
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相容性是一个非常复杂的问题。
有人尝试了一些改变供核体细胞表观遗传状态的方法,例如,将细胞置于55℃或75℃水浴中,由于细胞处于非生理温度,蛋白质高级结构发生变性,用这种方法得到了克隆绵羊后代[12]。另外有人在牛上使用一些抗癌药物,如5-Aza(去甲基化试
剂,TSA(促进乙酞化试剂处理牛的体细胞,从而改变了供核的表观遗传学状态,可以使TSA处理的供核克隆胚胎体外发育到囊胚的比例提高[13]。最近,Sullivan 等[14]建立了一种新的体细胞处理方法,在核移植前对供体细胞进行重塑,即在Streptolysni-O 中渗透处理30min后,再用含ATP能量系统的有丝分裂药物细胞提取物(Mitotic extract+ATP处理45min,以便染色体凝集以及除去核成分(不是核物质。然后用
2mmol/L氯化钙封闭处理2h,再用作供体移入卵胞质。这种方法获得的克隆牛成活率较高。
1.2.3重组胚的构建方法
1融合法
最初利用灭活的仙台病毒介导膜融合,而后逐渐被毒性较低的聚乙烯乙二醇诱导融合。与化学诱导膜融合同时发展起来的还有电融合技术,其容易操作,稳定而可靠。目前比较流行。
2胞质内注射
胞质内注射重组胚胎技术强调在注射前,要将供核体细胞的细胞膜撸破,然后再行注射,胞质内注射法比较好,对卵的伤害较轻。有人对传统方法进行了改进,先将体细胞注入到卵胞质内,在撤针时把细胞核吸出。现在人们用此法得到了牛的体细胞克隆后代[15]。另外,还有人不使用Piezo驱动,而使用普通的显微操作设备注射,也得到了山羊的克隆后代[16]。
3去透明带——
—显微操作仪辅助去核法
克隆研究和生产中,绝大部分都是利用显微操作仪获得成功的。但显微操作设备价格昂贵,对操作者的技能要求高,无法实现操作的批量进行。已经有利用无透明带——
—显微操作辅助的重组胚方案,并且在牛上取得了极大的成功[17]。
4去透明带手工克隆方案
该技术完全做到手工操作,不仅省去了繁杂的显微操作步骤,大大降低了生产成本,而且由于去除了透明带,更便于卵母细胞与供体细胞的融合,从而可进一步提高核移植的成功率。在猪上利用无透明带法也取得了囊胚,但效率不高[18]。随着实验方法的改进,采用WOW培养法进行无透明带胚胎的培养,即将单个无透明带胚胎放于自制的小凹内,不仅可为胚胎提供一个相对稳定的微环境,而且多个小凹处在同一个
大微滴中,可发挥群卵培养的优势,便于胚胎细胞间的信息交流、营养物质的供应和有毒代谢产物的扩散。另外,所做的“U”形小凹还可以使致密化前的卵裂球间的细胞连接更加紧密。由于以上优点,该法被广泛应用于无透明带手工核移植中,获得了较高的囊胚率。
5连续核移植
应用于克隆的连续核移植方案主要有两种,其一是先构建初级克隆胚胎,再用此胚胎作供核,移植到原核期去核遗传物质的受精卵内,构建二级重组胚。第二种方案是先构建克隆胚胎,于体内外培养发育到囊胚期以前的各个阶段,分离卵裂球作供核,再移植给去除核遗传物质的卵母细胞,重组胚胎的方法。连续核移植使供体核多次暴露在卵胞质环境中,有利于核的重编程,从而提高重构胚的发育率。但有些动物不能进行连续核移植,如水牛。
6四倍体胎盘补偿法
将胚胎干细胞与四倍体胚胎嵌合,使二者的发育潜能互相补偿,就可能得到完全由胚胎干细胞发育而成的个体,其胚外组织则由四倍体胚胎生成,这种技术被称为四倍体胚胎补偿技术(Tetraploid Embryo Complementation。胚胎干细胞与二倍体胚胎的嵌合体中,胚胎干细胞能参与胚体所有组织的生成;而在四倍体胚胎与二倍体胚胎的嵌合体中,四倍体胚胎只参与胚外组织的生成。四倍体细胞与二倍体细胞在嵌合体组织中的严重偏离分布现象已被生物学家应用于许多实验,以挽救胚外组织的发育缺陷、划分遗传不相似组织、快速获得基因突变小鼠以及分析突变基因的表型。其优点是耐受免疫排斥。
1.2.4融合和激活
目前采用的融合-激活方案有3种:①融合前激活,即在卵母细胞与供核体细胞融合前激活卵母细胞,首例体细胞克隆山羊就是通过这种方案取得成功。②融合时激活,即在将供受体融合的同时激活卵。③融合后激活,即在供受体融合后数小时再激活,可延长核在受体胞质内的时间,使重编程更彻底。多数研究都是采用后两种方法
得到克隆后代,尤其认为融合后激活法,可以使供核与卵胞质充分的相互作用,有利于供核的重新程序化。为保证重组胚的正常染色体倍数,供体细胞和受体可通过2种办法来协调,如用MII期去核卵(激活前融合,则供体细胞必须处于2倍体的G1期,如不能保证供体细胞处于G1期,则受体卵去核并应在融合前激活。
哺乳动物融合一般采用2次连续的直流电脉冲进行融合,然后再进一步用化学药物激活。在小鼠、家兔的融合中发现,脉冲强度为2.0~3.6K/cm,融合时间
60~200μs是适宜范围。链球菌溶血素处理的猪胎儿成纤维细胞似乎可以改善融合率,促进体外重构胚的形成[19]。Wakayama等[20]用化学融合和激活在小鼠克隆上亦取得了良好结果。主要采用琼脂包埋后移入输卵管内培养4~7d,发育至桑椹胚和囊胚。目前的研究显示,在单峰骆驼中,无论来源于成年成纤维细胞还是颗粒细胞的核转移胚胎都能够在体外形成,这些胚胎转移到受体后,可以导致受体怀孕[21]。
1.3去核卵母细胞质对供体细胞核移植效果的影响
虽然理论上去核完全的受体胞质核移植效果相同,但实际上,体细胞在受体胞质中进行发育程序的重编受多因素的影响,并不是所有的受体环境都可支持分化细胞进行发育程序重构化。一些受体胞质构建的重组胚发育不超过两细胞阶
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段,如用去核受精卵作核移植受体,当供核的胚胎卵裂球超过2~3细胞阶段时,其构建的重组胚不能正常分裂。所以在保证一定去核效率的基础上,必须考虑不同受体内部环境对核移植效果的影响。
在牛体细胞核移植中,高水平的卵母细胞促成熟因子(MPF是重组胚发育程序重编所必需的。卵母细胞有高水平MPF,有利于供体核在融合之后发生核膜破裂(NEBD和染色体超前凝集(PCC,而NEBD和PCC是牛核移胚重组所必需的。MII期卵母细胞含有较高水平的MPF,有利于牛核移植胚胎的重组。
2克隆技术中亟待解决的问题
2.1体细胞克隆成功率低
尽管也有少数体细胞克隆成功率较高的报道,但目前公认的体细胞克隆成功率在1%~3%。克隆胚胎移植后的出生率平均不到10%。表观遗传修饰异常应该是体细胞核转移后供体细胞核在细胞质中可逆分化效率低的原因之一[22]。胎儿异常、流产和围产期死亡率高,出生后一周的死亡率最高可达100%。最近有研究表明,睾丸抽提物(TE可以使成纤维细胞表达雄性生殖细胞的功能,提高猪的核移植胚胎发育的效率[23]。
2.2供体核与受体胞质细胞周期同步的问题
供体核与受体胞质细胞周期同步与否是影响克隆胚胎发育的重要因素之一。目前通用的受体胞质是MII期的卵母细胞。使用猪的MII期的卵母细胞构建的鼠体细胞核移植胚胎有在体外发育到胚泡阶段的潜力[24]。最近有实验表明,供体细胞和移植胚胎中组蛋白乙酰化水平可能是对预测兔体细胞核移植效率有用的一种表观遗传标记[25]。
2.3线粒体来源问题
无论直接注射还是细胞融合,供体核都带入一部分细胞质。于是,就出现了移核胚胎的线粒体来源问题。Evans等[26]发现,Dolly和另外9只经细胞融合产生的克隆绵羊的mtDNA 完全来源于受体胞质。Meirelles等[27]证明,瘤牛(Bos indicus克隆后代的线粒体完全来源于黄牛(Bos taurus卵母细胞质。但Steinborn等[28]却发现,克隆牛的线粒体为杂合型,既有来自于供核细胞的,也有来自于受体胞质的。因此,核移植克隆动物实际上是一种遗传嵌合体-nDNA来源于核供体细胞,而mtDNA则至少部分来自受体胞质。
2.4端粒的问题
端粒是染色体端部特化部分,因无黏性而能防止染色体黏着。端粒由高度重复的短序列核苷酸组成,具有高度保守性。细胞每复制一次端粒核苷酸就减少
50~100bp。端粒复制要靠端粒酶。正常细胞缺乏此酶,故端粒随细胞分裂而变短,细胞衰老。而生殖细胞和癌细胞则都有此酶,因此不衰老。那么,克隆动物是否会遗传供核细胞缩短的端粒而提前衰老呢?Shiels等[29]发现,Dolly等3只克隆羊的端粒限制性片段平均长度(mean Terminal Restriction Fragment,TRF都比同龄对照羊短。供核细胞培养时间越长,TRF越短。然而,Betts等[30]都证明,克隆牛的端粒不缩短。Wakayama等[31]证明克隆小鼠的端粒也恢复到原有长度。Xu等[32]在牛体外受精、孤雌生殖和克隆各阶段早期胚胎都检测到了端粒酶活性,囊胚活性最高。Betts 等[33]发现,牛克隆胚胎最初接受了供核细胞在体内、外所获得的基因组修饰,端粒缩短,但在后来的发育过程中又擦除了这些修饰,端粒长度恢复。因此,关于克隆动物端粒酶活性是否恢复的研究结果是趋于肯定的。
2.5X染色体灭活问题
雌、雄哺乳动物的基因剂量补偿是通过灭活雌性动物的一条X染色体来实现。正常情况下,着床前胚胎的两条X染色体都活动。后来,上胚层中X染色体随机灭活,而滋养层细胞则专门灭活父系X染色体。Eggan等[34]发现,小鼠克隆胚胎胚体的X染色体灭活方式是随机的;即体细胞中活动X染色体Xa与灭活X染色体Xi 之间不同的标志在核移植后被擦除了,重新发生随机灭活。但克隆胚的滋养层则保留了原有体细胞的X染色体灭活状态。然而,Xue等[35]发现,死亡克隆牛X-连锁基因在同一器官中有的表达,有的不表达,说明X 染色体灭活不完全。死亡克隆胎盘X 染色体随机灭活,但活克隆为父亲X染色体灭活。
2.6克隆胚胎某些基因的再程序化异常
已经证明,受精后父系和母系基因组都发生广泛的去甲基化。Dean等[36]发现,牛正常胚胎在8-细胞前,甲基化程度进一步下降,到16-细胞时又开始再甲基化。克隆1-细胞胚胎的甲基化程度下降,但以后并不进一步去甲基化,而是提前发生再甲基化。克隆桑椹胚所有卵裂球的核都高度甲基化,类似于供核胎儿成纤维细胞。经过
咖啡因或钒酸盐处理的核能够影响核转移的发展和甲基化程度[37]。还有人证明,牛着床前移核胚胎中有些重复序列的甲基化异常,某些胚胎基因往往不能再激活[38]。这说明,大多数克隆胚胎的后成性再程序化异常,不彻底的再程序化可能是造成克隆成功率低的原因。
3哺乳动物核移植技术的应用前景
哺乳动物核移植技术特别是体细胞核移植技术为生物学带来了一场革命,也为人类的科学研究提供了许多新思路,具有非常广阔的应用前景。
3.1在畜牧方面的作用
利用核移植技术可以大规模地生产具有优良性状、理想性别,相同遗传背景的克隆动物。利用体细胞克隆技术,结合胚胎移植等已经非常成熟的生物技术,可以节约大量生产种牛的时间和费用,同时,完成对高产、优秀奶牛的扩群。越来越多的资料表明,克隆奶牛的牛奶,克隆肉牛的肉质与自然交配生产的后代之间并没有什么不同,完全可以放心食用[39]。这无疑是动物育种方面最具潜力的方法之一。
3.2复制濒危动物扩大其种群
Dominko等[40]发现除去核的牛的卵母细胞能使来自羊、猴、鼠、猪等不同种属的细胞核激活并在体外发育成相应的胚胎,如在2001年,Nature Biotechnology上报道了异种体细
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胞克隆濒危哺乳动物-欧洲盘羊的成功,为濒危动物的保护提供了重要的借鉴[41]。中国科学家提出用异种核移植技术克隆大熊猫,把大熊猫体细胞核移至兔的去核卵细胞质中可以发育到囊胚[42]。
3.3体细胞克隆技术在医药生产方面的价值
将体细胞克隆技术与生物反应器的生产制作技术结合,可以对体细胞进行转基因或基因组修饰后,制作生产生物反应器,利用动物的乳腺、膀胱等器官,生产治疗人类疾病、保健所需的蛋白。许多全球知名的生物技术企业尤其看重体细胞克隆技术在这些方面的应用价值,纷纷投资科研机构开展研究。实际上第1个体细胞克隆动物——
—绵羊Dolly的诞生就是这种动机的直接产物。
3.4体细胞核移植结合基因打靶技术、胚胎干细胞技术将提
高转基因动物的生产效率
用于做核供体的细胞是确保整合了的某一外源基因的细胞,一旦移植成功,就意味着得到了转基因动物。此外,核移植制备转基因动物还有性别可提前确定、转基因定点整合效率高等优点。由于转基因生物反应器可以降低人类所需药物蛋白的成本,确定转基因动物的无性繁殖技术具有深远的现实意义。Maga等[43]将人溶菌酶基因在转基因山羊乳腺中的表达量提高到270μg/mL。邹贤刚等[44]利用转基因克隆奶山羊乳腺生物反应器大量生产重组人的抗凝血酶III(rhAT III蛋白,其中1头转基因克隆羊后代的奶中rhAT III的含量为3g/L。3.5在临床方面的作用
通过深入研究细胞质核的相互作用,控制胚胎细胞的分化方向,有望获得适合向人体移植的具有遗传改变的动物器官,通过细胞核移植技术可以避免不必要的免疫排斥作用。目前,人们已经利用体细胞克隆技术获得了小鼠一小鼠、人一兔、人一人ES细胞系,并已经在小鼠模式上开展了如帕金森氏症等神经退行性疾病的治疗尝试。
3.6体细胞克隆对帮助阐明一些生物学基础问题的价值
体细胞克隆技术除了在上述生产实践中具有极大的价值之外,还为许多生物学基础问题的研究提供了一个强大的技术平台。体细胞克隆技术本身涉及到细胞生物
学、发育生物学、胚胎生物学、遗传学、分子生物学、生物化学等诸多学科的理论问题。利用这一技术对人们进一步深入认识发育、分化、生长、衰老、肿瘤发生等长期困扰人们的常见的生物学现象提供了可能。如Li等[45]利用小鼠嗅觉神经元得到了克隆小鼠后代,证明了细胞分化过程中基因表达本身是不可逆的。
4结语
哺乳动物体细胞克隆技术仍处于发展阶段,故在一定程度上存在技术缺陷,需要不断地完善提高才能达到较高的水平。我们相信,随着哺乳动物体细胞克隆技术的发展,不管是品种的繁殖、某些濒危物种的保护,还是在医学领域的应用,其都将成为生物学家今后研究的热点。至于有人利用“克隆人”可能引发的伦理、道德等问题而对体细胞克隆技术进行无端的阻挠与抨击,那是很片面的认识。因为体细胞克隆技术是一门生物高新技术,它能否朝着良性方向发展关键在于人们能否正确而合理的应用它。也就是说,“克隆人”可能引发的一些伦理、道德等问题与体细胞克隆技术本身无必然的联系,而仅与人们利用该技术的动机有关。所以,不能只凭此消极影响否定其产生的应用价值,而应有一个正确的认识,采取正确的态度与措施。一方面,应加快该技术的完善,使其产生更广泛的应用价值;另一方面,呼吁各国政府立法禁止克隆人实验或制定国际公约禁止克隆人,使哺乳动物体细胞克隆技术在有关的法律范围内朝着理性方向发展,造福于人类。可以预言,体细胞克隆技术将会在新的世纪不断完善并得到更为广泛的应用。
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综述文章（Reviews ） [15] Renard J P, Zhou Q, LeBourhis D, et al. Nuclear transfer technologies: between successes and doubts[J]. Theriogenolgy, 2002, 57(1: 203-222. [16] Guo J T, An Z X, Li Y, et al. Cloned goats (Capra hircus from adult ear cels[J]. Science in China: Serices C, 2002, 45(3: 260-267. [17] Oback B,Wells D. Donor cells for nuclear cloning: many are called,but few are chosen[J]. Cloning Stem Cells, 2002, 4(2: 147-168. [18] Kragh P M, Vajta G, Coyrdon T J, et al. Production of transgenic porcine blastocysts by hand-made cloning [J]. Reprod Fertil Dev, 2004, l6(3: 315-318. [19] Narnus K, Quan Y S, Kim B C, et al. Streptolysin-o treatment of fetal fibroblasts improves cell fusion and in vitro development of porcine nuclear transfer embryos[J]. J Reprod Dev, 2009, 55(3: 236-239. [20] Wakayama T, Perry A C F, Zuccotti M, et al.
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晓丽） !!!!!!!!!!!!!!! !!!!!!!!!!!!!!!!!!! 《科技导报》“研究论文”栏目征稿《科技导
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论克隆技术的利与弊 湘潭大学化工学院环境科学与工程 LYL 摘要：自从克隆羊多利诞生以来,有关克隆技术的伦理学争论就一直喋喋不休。本文分析了克隆技术的发展过程,论述了克隆技术在科学技术中的应用前景,并对其所引出的伦理、道德等问题进行了探讨。 关键词:克隆,多利,伦理. 前言 1997年2月27日,著名的《自然》杂志发表了苏格兰罗斯林研究所威尔莫特(Ian Wilmut)等人撰写的实验研究论文,作者声明采用动物体细胞核移植技术(也即人们常说的克隆技术)成功产生出一例小羊羔,后来被命名为“多利”。许多人赞誉这是一项划时代的科学成果。例如,中国科学院院士邹承鲁先生曾经指出,“克隆羊”的出生是生物工程技术发展史中的一个里程碑[1]。同时,一石激起千层浪,宗教人士、法律专家、哲学家、社会学家等对克隆技术派生出的治疗性克隆和生殖性克隆产生强烈反响,并引发伦理问题的广泛争议。 1克隆技术的发展 1952年,科学家用青蛙进行克隆实验。从此以后,动物克隆的试验结果不断涌现。1970年克隆青蛙实验取得突破,青蛙卵发育成了蝌蚪。1984年第一只胚胎克隆羊诞生。1997年2月24日,英国罗斯林研究所的科学家用取自一只6岁成年羊的乳腺细胞培育成功一只克隆羊。1998年7月,日本科学家利用成年动物体细胞克隆的两头牛犊诞生。2000年1月,美国科学家宣布克隆猴成功。2000年3月14日,曾参与克隆小羊“多利”的英国PPL公司宣布,他们成功培育出5头克隆猪。随着一系列克隆技术突破的完成,克隆人从技术上来讲已成为可能。有的科学家认为,从技术上说克隆人并不比克隆其它哺乳动物更困难。克隆人即将出世的消息也不断传来。意大利著名的“克隆狂”安蒂诺里曾宣布,克隆胎儿将于2003年1月问世。2003年第一期《发现》杂志也把2002年“命名”为“克隆年”,理由是克隆技术在当时已经进入了克隆人的阶段。该杂志断言:“虽然世界不想要克隆人,但克隆
集成电路的现状与发展趋势 1、国内外技术现状及发展趋势 目前，以集成电路为核心的电子信息产业超过了以汽车、石油、钢铁为代表的传统工业成为第一大产业，成为改造和拉动传统产业迈向数字时代的强大引擎和雄厚基石。1999年全球集成电路的销售额为1250亿美元，而以集成电路为核心的电子信息产业的世界贸易总额约占世界GNP的3%，现代经济发展的数据表明，每l~2元的集成电路产值，带动了10元左右电子工业产值的形成，进而带动了100元GDP的增长。目前，发达国家国民经济总产值增长部分的65%与集成电路相关；美国国防预算中的电子含量已占据了半壁江山（2001年为43.6%）。预计未来10年内，世界集成电路销售额将以年平均15%的速度增长，2010年将达到6000~8000亿美元。作为当今世界经济竞争的焦点，拥有自主版权的集成电路已曰益成为经济发展的命脉、社会进步的基础、国际竞争的筹码和国家安全的保障。 集成电路的集成度和产品性能每18个月增加一倍。据专家预测，今后20年左右，集成电路技术及其产品仍将遵循这一规律发展。集成电路最重要的生产过程包括：开发EDA（电子设计自动化）工具，利用EDA进行集成电路设计，根据设计结果在硅圆片上加工芯片（主要流程为薄膜制造、曝光和刻蚀），对加工完毕的芯片进行测试，为芯片进行封装，最后经应用开发将其装备到整机系统上与最终消费者见面。 20世纪80年代中期我国集成电路的加工水平为5微米，其后，经历了3、1、0.8、0.5、0.35微米的发展，目前达到了0.18 微米的水平，而当前国际水平为0.09微米（90纳米），我国与之相差约为2-3代。 （1）设计工具与设计方法。随着集成电路复杂程度的不断提高，单个芯片容纳器件的数量急剧增加，其设计工具也由最初的手工绘制转为计算机辅助设计（CAD），相应的设计工具根据市场需求迅速发展，出现了专门的EDA工具供应商。目前，EDA主要市场份额为美国的Cadence、Synopsys和Mentor等少数企业所垄断。中国华大集成电路设计中心是国内唯一一家EDA开发和产品供应商。 由于整机系统不断向轻、薄、小的方向发展，集成电路结构也由简单功能转向具备更多和更为复杂的功能，如彩电由5片机到3片机直到现在的单片机，手机用集成电路也经历了由多片到单片的变化。目前，SoC作为系统级集成电路，能在单一硅芯片上实现信号采集、转换、存储、处理和I/O等功能，将数字电路、存储器、MPU、MCU、DSP等集成在一块芯片上实现一个完整系统的功能。它的制造主要涉及深亚微米技术，特殊电路的工艺兼容技术，设计方法的研究，嵌入式IP核设计技术，测试策略和可测性技术，软硬件协同设计技术和安全保密技术。SoC以IP复用为基础，把已有优化的子系统甚至系统级模块纳入到新的系统设计之中，实现了集成电路设计能力的第4次飞跃。
哺乳动物体细胞克隆技术研究现状及其存在的问题 马志杰１ （生命科学与技术学院遗传育种与繁殖专业 四川成都 ６１００４１） 摘要具有划时代里程碑的作用关键技术及研究现状 然后 关键字： 哺乳动物 体细胞 重组胚胎 克隆 1997年2月英国Rosolin研究所的科学家W ilmut等人宣布了克隆羊的诞生[1] 相对于之前的动物克隆技术而言 自诞生以后经过５年多的时间 并获得了重要的理论成果与实际应用体细胞克隆技术还存在理论与技 术上的缺陷与不足 克隆其含义是无性繁殖 在这个细胞系中哺乳动物克隆又称核移植技术 显微操作对哺乳动物特定发育阶段的核供体及相应的核受体进行体外重构 胚胎移植通过核移植产生的动物其遗传结构与细胞核供体完全相同所用的供体细胞若为体细胞 2 哺乳动物体细胞克隆技术的主要环节及其研究现状 哺乳动物体细胞克隆技术主要包括以下5个主要环节 激活技术； (4) 重组胚的体内或体外培养； (5) 重组胚胎的移植 2.1供体核的准备 最早人们用青蛙肠粘膜上皮细胞的核作为供体核获得后代 多莉实验表明 并非一切体细胞都可作为供核细胞进行核移植 故目前大多数家畜的克隆都以它为供核细胞[3]ê???1ü?°×ó1?é??¤??°? ??á￡??°?ò?°??D??è??a Campbell(1996)[4]认为 并首次采用血清饥饿法使供核细胞同期化在Go期 也有科学家对此提出质疑 饥饿过程并不是一个必要的过程在处于活跃分裂期的仔猪胎儿成纤维细胞培养物中Kubota等(2000)[7]的实验表明 马志杰 收稿日期０６
血清饥饿培养对核移植胚胎融合率但对重组胚胎的妊娠成功率有较大的影响饥饿法处理有助于重组胚胎后期的发育在当前体细胞克隆成活率低的情况下血清饥饿法以期获得较高的成功率 2.2受体细胞质的选取 研究人员早期曾以受精卵或去核2-细胞胚作为受体卵 成熟卵母细胞比受精卵或2-细胞胚更适合于用作核移植的受体细胞质重新编序近年来通常以第二次减数分裂中期卵母细胞取代原核受体1999年猪或大鼠的皮肤成纤维细胞作为供核体细胞卵母细胞采集后在培养液中培养成熟至第一极体排出一般去核的方法有盲吸法 以往很多人采用盲吸法 效果不佳去核效果可达90%以上事先在HSOF一类的培养液中 ５靏／ｍｌＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２和7.5ìg/ml细胞松弛素B制成染色剂 在DNA被染色后 因此丹麦的Vajta等(2001)[11]发明了一种新的核移植方法培养的卵母细胞至成熟于0.5%的链蛋白酶中培养5分钟去除卵细胞的透明带 紫外光下挑选不含染色体的胞质体体细胞形成双胞质体－体细胞三联体的重组胚胎 简化了预备工作预计在体细胞核移植中将会被广泛采用去掉卵母细胞的细胞核是核移植胚胎发育的先决条件之一否则 或者两个细胞核相互干扰 2.3核质重组融合 方法是用注射针吸取供核细胞 如Onishi等(2000)用此法获得克隆猪 成功率偏低 早前采用仙台病毒法激活核质已较少采用将重组胚胎置于融合小室内在一定的电场强度下 近年来如离子素钙离子载体A23187和钙离子酶素等或单独或混合使用进行化学激活 效果均令人满意[8, 12] óDì??úoíì?íaá????à??·?ê? ?-êyììoó?ì2a·￠óy?y3￡μ??ò???òé￡?°??ì?ía ?à??ê????¤??oóμ???×é???ú?à??òo?D?à???á?ò?? Onishi(2000)在猪克隆胚的研究中表明 并且胚胎的发育也有差异在使用先融合后激活(FBA)
我国生物技术的现状发展及展望 课程：食品生物技术 专业： 班级： 学号： 姓名： 完成时间：2011 年5月23日
我国生物技术的现状发展及展望 摘要：生物技术是20 世纪后期人类科技史上最令人瞩目的高新技术，它是国际科技竞争乃至经济安全的重点。在我国生物技术一直受到国家的高度重视，并从政策、环境方面采取了多项有效措施来推动生物技术与产业的发展。特别是改革开放二十多年来，国家相继出台了重大科技计划，把生物技术作为优先发展的领域，从而进一步加快了生物技术的发展步伐。我国还积极参与国际生物计划，如人类基因组计划、人类脑计划、人类肝脏蛋白质组计划等。有些研究领域已走在世界前列，初步建立起较为完整的生物技术研发体系，生物产业也初具规模，生物经济初见端倪。 关键词：生物技术现状发展前景 0前言 生物技术是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物作为反应器将物料进行加工以提供产品来为社会服务的技术。[1]主要包括基因、细胞、酶、发酵等工程学科,近年来在医药、农业、食品、化工、能源、冶金、环保等领域有了越来越广泛的应用,形成了一个新兴的生物技术产业群。 目前，我国生物技术已广泛用于农业、医药、环保、轻化工等重要领域，为生物技术创新和产业化奠定了良好基础。生物技术与产业已经开始从跟踪仿制到自主创新的转变；从实验室探索到产业化的转变；从单项技术突破到整体协调发展的转变。中国生物科技发展中心主任王宏广说，我国生物技术在让企业积极参与产业化的同时，还要加强有独立知识产权成果的创新。努力培养技术、管理人才，建立产品标准化体系，组建相关行业协会，规范市场秩序。 1我国生物技术的发展 1.1生物技术在我国的兴起 我国第一个生物制品研究所始建于1919年，在北平天坛成立了中央防疫处--即今天的北京生物制品研究所，迄今已有80多年的历史。我国自七十年代末开始了现代生物技术的研究。国家高度重视生物技术的发展，不仅被列为863计划之首，而且纳入七五、八五、九五国家重点攻关计划。这一系列的举措，大大促进了我国医药生物技术的发展，并形成了一定的产业规模。据统计，我国现有456个单位从事生物技术的研究、开发和生产，其中医药领域的有165个，占36%，专业人员约6800人，
Germany embryologists pointed out for the first time, and then was born dolly, then what the pig sheep cow came, Use the way monkey cloning embryos split researchers recently announced that they in biotechnology fields have achieved a landmark progress. Scientists use the cloning of embryos split ways, created a monkey. Rather, it is a rhesus monkeys, named "TaiTeLa", it is the first time scientists have been cloned way to foster primates. Now the technology have been developed to human cloning is not a problem, but it is the condemnation of the factors against, so it YuKeLong application on organs necrosis, for the benefit of mankind. 德国胚胎学家首次提出的，然后就诞生了克隆羊多莉，接着的什么猪羊牛的都来了， 运用分裂胚胎的方式克隆猴子科研人员最近宣布,他们在生物工艺学领域取得了一项有里程碑意义的进展。科学家们利用分裂胚胎的克隆方式,培育出了一只猴子。确切地说,这是一只恒河猴,名叫“泰特拉”,它是科学家首次以克隆方式培育出的灵长目动物。 现在的技术已经发展到克隆人是不成问题的，但这会受到社会的谴责的因素的反对，所以就把它应用于克隆坏死的器官上，为人类造福。 Cloning technology, has experienced three periods: the first period is microbial cloning, which is a bacteria soon copies of tens of thousands of and it exactly the same bacteria, and become a bacteria group; The second period is biological cloning technology, such as by using the genetic gene-DNA cloned; The third period is animal cloning, namely the a cells cloned into an animal. Cloned sheep "duoli" by a head of s omatic cells and to which cloning, the use of animal cloning technology is. 克隆技术，已经经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。 As the new century advanced science, cloning technology from its birth of the moment attracts many the world's attention. As the world's largest developing country, China has been dedicated to the frontier science research. 作为新世纪的尖端科学，克隆技术从它诞生的那一刻起就吸引了众多世人的目光。作为世界最大的发展中国家，中国一直在致力于前沿科学的研究。 Science has always been a double-edged sword. But, a scientific and technological progress is not really good for people, the key lies in how to treat and apply it to humans, and not for the temporary unreasonable of it. 科学从来都是一把双刃剑。但是，某项科技进步是否真正有益于人类，关键在于人类如何对待和应用它，而不能因为暂时不合情理就因噎废食。 Cloning, is Clone of transliteration, meaning asexual reproduction, cloning technology which asexual reproduction technology. Recently reported the roslin institute of British trials are successful dolly, is for the first time use somatic cells cloned successfully, it in the biological engineering in history has turned a new page. 克隆，是Clone的译音，意为无性繁殖，克隆技术即无性繁殖技术。前不久报道的英国罗斯林研究所试验成功的克隆羊多利，是首次利用体细胞克隆成功的，它在生物工程史上揭开了新的一页。 At present, cloning, gene engineering research is improved by leaps and bounds of forward development, the establishment of the gene concept and the theory, opened the humans to understand life and control the window of the life. Genetic research has become the current scientific research of one of the most decisive field, become the impetus biological pharmaceutical industry, food and the development of the engine. As is known to all, the development of the 20 th century genetics worldwide attention, because the genetics of development, the social function of science and social science to the restriction of the more concern, from the test tube babies to cloning technology to the human genome map the affects all the hearts of men. 21 century is the century of biological technology revolution, the cloning technology application will promote genetics, cell developmental biology, produce scientific disciplines such as research, and to the whole world of scientific progress and improve the quality of life, the life of mankind will have
植物基因克隆技术的研究进展 随着科学技术的不断发展，人类基因组计划的不断实施，世界生命科技工作者对于植物基因克隆技术的研究不断进步，近年来，我国在基因克隆技术领域也有了长足的进步，在玉米，小麦，大豆，水稻，拟南芥等植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。文章主要从基因芯片技术，功能克隆、定位克隆、同源序列克隆、PCR擴增技术分别介绍基因克隆技术的现状以及研究进展。 标签：植物；基因克隆技术；研究 植物基因克隆技术在生命科学技术中扮演着越来越重要的角色，而植物基因克隆技术从传统意义上来讲可分为两种不同的方式。正向以及反向的遗传学方式，正向遗传学途径是一种很早的经典的克隆方法，通过研究突变表型性状进行克隆，包括了功能以及表型克隆等较为基本的克隆的方式；反向遗传学途径和正向遗传学途径截然不同，它是通过一些特殊的方法，获得遗传基因片段，然后经过一系列的定位，将之后所研究的基因逆向研究。如定位克隆，同源序列克隆等。除了这两种克隆技术外，随着社会发展，也有一些新的克隆技术产生。 1 基因芯片技术 基因芯片技术是电子克隆技术的典型代表，基因芯片又称DNA芯片、DNA 微阵列，是以预先设计的方式将大量的基因探针固定在玻片、硅片等固相载体上组成的密集分子阵列。基因芯片技术类似于计算机的电子芯片技术，其具有高通量、微型化、连续化、自动化、快速和准确等特点。是一种随着人类基因组计划的进行而发展出的产物，这一发展使得人类对越来越多的微生物和动植物基因组取得了更长远的认识，对其的研究，是全人类对于基因组认识做出的不断地努力的成果，其中不乏许多典型的实例，用cDNA芯片技术对草莓、矮牵牛其基因是如何进行表达的进行研究，进而实现对转基因植物进行形状的观察及控制，可以更好的获悉分子对于基因表达是如何作用以及影响的也有利于获得更为优异更为良好的作物[1]。 基因芯片技术是一种新型的克隆技术，是科技创新和生命科学的很好的结合，代表着人类在基因的克隆方面进展和成就，解决了很多传统克隆不能解决的问题，也讲基因克隆技术引向一种新的思维模式。 2 功能克隆 功能克隆是人类采用最早的基因克隆策略，功能克隆技术从已知蛋白质的功能着手进行研究，其方法原理是先测知基因的编码蛋白质，利用它的信使RNA 进行反转录成cRNA，再利用cDNA做探针，从基因组中获取基因本身，进而完成克隆。
光刻技术及其应用的状况和未来发展 光刻技术及其应用的状况和未来发展1 引言 光刻技术作为半导体及其相关产业发展和进步的关键技术之一，一方面在过去的几十年中发挥了重大作用；另一方面，随着光刻技术在应用中技术问题的增多、用户对应用本身需求的提高和光刻技术进步滞后于其他技术的进步凸显等等，寻找解决技术障碍的新方案、寻找COO更加低的技术和找到下一俩代可行的技术路径，去支持产业的进步也显得非常紧迫，备受人们的关注。就像ITRS对未来技术路径的修订一样，上世纪基本上3～5年修正一次，而进入本世纪后，基本上每年都有修正和新的版本出现，这充分说明了光刻技术的重要性和对产业进步的影响。如图1所示，是基于2005年ITRS对未来几种可能光刻技术方案的预测。也正是基于这一点，新一轮技术和市场的竞争正在如火如荼的展开，大量的研发和开发资金投入到了这场竞赛中。因此，正确把握光刻技术发展的主流十分重要，不仅可以节省时间和金钱，同时可以缩短和用户使用之间的周期、缩短开发投入的回报时间，因为光刻技术开发的投入比较庞大。 2 光刻技术的纷争及其应用状况 众说周知，电子产业发展的主流和不可阻挡的趋势是"轻、薄、短、小"，这给光刻技术提出的技术方向是不断提高其分辨率，即提高可以完成转印图形或者加工图形的最小间距或者宽度，以满足产业发展的需求；另一方面，光刻工艺在整个工艺过程中的多次性使得光刻技术的稳定性、可靠性和工艺成品率对产品的质量、良率和成本有着重要的影响，这也要求光刻技术在满足技术需求的前提下，具有较低的COO和COC。因此，光刻技术的纷争主要是厂家可以提供给用户什么样分辨率和产能的设备及其相关的技术。 以Photons为光源的光刻技术 2.1 以Photons为光源的光刻技术 在光刻技术的研究和开发中，以光子为基础的光刻技术种类很多，但产业化前景较好的主要是紫外(UV)光刻技术、深紫外(DUV)光刻技术、极紫外(EUV)光刻技术和X射线(X-ray)光刻技术。不但取得了很大成就，而且是目前产业中使用最多的技术，特别是前两种技术，在半导体工业的进步中，起到了重要作用。 紫外光刻技术是以高压和超高压汞(Hg)或者汞-氙(Hg-Xe)弧灯在近紫外(350～450nm)的3条光强很强的光谱(g、h、i线)线，特别是波长为365nm的i线为光源，配合使用像离轴照明技术(OAI)、移相掩模技术(PSM)、光学接近矫正技术(OPC)等等，可为0.35～0.25μm的大生产提供成熟的技术支持和设备保障，在目前任何一家FAB中，此类设备和技术会占整个光刻技术至少50％的份额；同时，还覆盖了低端和特殊领域对光刻技术的要求。光学系统的结构方面，有全反射式(Catoptrics)投影光学系统、折反射式(Catadioptrics)系统和折射式(Dioptrics)系统等，如图2所示。主要供应商是众所周知的ASML、NIKON、CANON、ULTRATECH 和SUSS MICROTECH等等。系统的类型方面，ASML以提供前工程的l:4步进扫描系统为主，分辨率覆盖0.5～0.25μm：NIKON以提供前工程的1：5步进重复系统和LCD的1：1步进重复系统为主，分辨率覆盖0.8～0.35μm和2～0.8μm；CANON以提供前工程的1：4步进重复系统和LCD的1：1步进重复系统为主，分辨率也覆盖0.8～0.35μm和1～0.8μm；ULTRATECH以提供低端前工程的1：5步进重复系统和特殊用途(先进封装／MEMS／，薄膜磁头等等)的1：1步进重复系统为主；而SUSS MICTOTECH以提供低端前工程的l：1接触／接近式系统和特殊用途(先进封装／MEMS／HDI等等)的1：1接触／接近式系为主。另外，在这个领域的系统供应商还有USHlO、TAMARACK和EV Group等。 深紫外技术
基因工程的现状及发展 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
基因工程的现状及发展 研究背景： 迄今为止，基因工程还没有用于人体，但已在从细菌到家畜的几乎所有非人生命物体上做了实验，并取得了成功。事实上，所有用于治疗糖尿病的胰岛素都来自一种细菌，其DNA中被插入人类可产生胰岛素的基因，细菌便可自行复制胰岛素。基因工程技术使得许多植物具有了抗病虫害和抗除草剂的能力；在美国，大约有一半的大豆和四分之一的玉米都是转基因的。目前，是否该在农业中采用转基因动植物已成为人们争论的焦点：支持者认为，转基因的农产品更容易生长，也含有更多的营养（甚至药物），有助于减缓世界范围内的饥荒和疾病；而反对者则认为，在农产品中引入新的基因会产生副作用，尤其是会破坏环境。 目的意义： 如果将一种生物的 DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA 链上去，将DNA重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型。 内容摘要： 如果将一种生物的 DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA 链上去，将DNA重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型，这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同。这种做法就像技术科学的工程设计，按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。 基因工程在20世纪取得了很大的进展，这至少有两个有力的证明。一是转基因动植物，一是克隆技术。转基因动植物由于植入了新的基因，使得动植物具有了原先没有的全新的性状，这引起了一场农业革命。如今，转基因技术已经开始广泛应用，如抗虫西红柿、生长迅速的鲫鱼等。1997年世界十大科技突破之首是克隆羊的诞生。这只叫“多利”母绵羊是第一只通过无性繁殖产生的哺乳动物，它完全秉承了给予它细胞核的那只母羊的遗传基因。“克隆”一时间成为人们注目的焦点。尽管有着伦理和社会方面的忧虑，但生物技术的巨大进步使人类对未来的想象有了更广阔的空间。 成果展示：
克隆技术的发展及应用前景 克隆通常是一种人工诱导的无性生殖方式或者自然的无性生殖方式（如植物）。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一种生物完全一样。克隆可以是自然克隆，例如由无性生殖或是由于偶然的原因产生两个遗传上完全一样的个体（就像同卵双生一样）。但是通常所说的克隆是指通过有意识的设计来产生的完全一样的复制。克隆技术在现代生物学中被称为“生物放大技术”，它已经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。 目前，克隆技术发展十分迅速。各国政府有关人士、民间对克隆技术的评价褒贬不一。克隆技术已展示出广阔的应用前景，包括以下四个方面： （1）培育优良畜种和生产实验动物； （2）生产转基因动物； （3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法； （4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。 在不久的将来，克隆技术技术将可以用来治疗糖尿病、中风、癌症、爱滋病、心脏病以及诸如帕金森综合症等精神疾病，并极大改变现有的器官移植理论和治疗手段，给人类带来福音。 克隆技术会给人类带来极大的好处，例如，英国PPL公司已培育出羊奶中含有治疗肺气肿的a-1抗胰蛋白酶的母羊。这种羊奶的售价是6千美元一升。一只母羊就好比一座制药厂，用什么办法能最有效、最方便地使这种羊扩大繁殖呢？最好的办法就是“克隆”。同样，荷兰PHP公司培育出能分泌人乳铁蛋白的牛，以色列LAS公司育成了能生产血清白蛋白的羊，这些高附加值的牲畜如何有效地繁殖？答案当然还是“克隆”。母马配公驴可以得到杂种优势特别强的动物——骡，骡不能繁殖后代，那么，优良的骡如何扩大繁殖？最好的办法也是“克隆”，我国的大熊猫是国宝，但自然交配成功率低，因此已濒临绝种。如何挽救这类珍稀动物？“克隆”为人类提供了切实可行的途径。具体应用有以下几个方面： 转基因动物研究 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了10多年，但在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，5～6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和
基因工程技术的现状和前景发展 摘要 从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。 基因工程应用于植物方面 农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战，耐涝、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种(系)也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增长，从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来，导入植物体可获得转基因植物，目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中。随着生活水平的提高，人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明，利用基因工程可以有效地改善植物的品质，而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域，近几年利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展，如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获取蛋白质合成基因，成功地导入到马铃薯中，培育出高蛋白马铃薯品种，其蛋白质含量接近大豆，**提高了营养价值，得到了农场主及消费者的普遍欢迎。在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究。 基因工程应用于医药方面 目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。目前，应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。由中国、美国、德国三国科学家及中外六家研究机构参与研制的专门用于治疗乙肝、慢迁肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的体细胞基因生物注射剂，最终解决了从剪切、分离到吞食肝细胞内肝炎病毒，修复、促进肝细胞再生的全过程。经4年临床试验已在全国面向肝炎患者。此项基因学研究成果在国际治肝领域中，是继干扰素等药物之后的一项具有革命性转变的重大医学成果。 基因工程应用于环保方面
克隆技术带来的伦理反思 许芳，长安大学，科学技术哲学，2011111078 【摘要】现代科学技术的快速发展，给人类带来了福祉的同时，也引发了科学技术与伦理道德的两难问题。科学技术是一把双刃剑，既有对人类有利的一面，也有其可能产生不利的一面。当科技改变生活，人类的命运也就开始逐渐被自己所掌握。生物科学技术的每一次飞跃，必然随之而来众多的非议，因为即使是一小步，都是在迈向那片禁区的一大步。单纯的科学，却很有可能带来不单纯的后果。克隆技术就是如此，它可能给人类带来巨大的利益，也可能给人类带来严重的后果。已经在动植物领域运用的克隆技术，是否适应于人类，尤其是生殖性克隆，对人类的生育方式、婚姻方式等方面的影响，也对伦理道德产生了全面冲击。解决这一问题不仅需要立法，更需要完备的道德体系，要做到既尊重科学技术，又要尊重人。 【关键词】克隆技术伦理道德尊重 一、克隆技术的概述 克隆是指生物体通过细胞进行的无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群，简称为“无性繁殖”。该术语很快得到学术界的认同并加以广泛使用。随着一系列克隆技术突破性的完成，克隆人也从技术上来讲已成为可能。这给我们带来了前所未有的伦理大思考，观念大考验。 克隆开始进入普通大众的视野，应当是由威尔姆特博士创造出“多利”这一轰动性的新闻传遍全球所引起的。克隆是人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术。克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎,再将发育到一定程度的胚胎植入动物子宫中使其怀孕，以产下与提供细胞者基因相同的动物，简单的说就是人工诱导的无性生殖方式。 二、克隆技术的发展 1952年，第一次进行动物克隆，罗伯特.布瑞格和托马斯.金对小蝌蚪的细胞核进行无性繁殖。1970年英国科学家约翰.戈德和同事经过培养的成年青蛙表皮细胞核克隆成功成年青蛙。1978年 7月 25日世界上首例经体外受精—胚胎移植形成的试管婴儿 Louise Brown 诞生。1993年人类胚胎克隆成功。1997年，英国胚胎学家威尔穆特和他的同事用母羊乳腺细胞克隆成功了第一只克隆羊“多利”，开创了成年哺乳动物克隆的先河。2000年6月22日，世界首批体细胞克隆山羊在中国西北农林科技大学诞生。2002年11月25日，美国科学家宣称首次成功克隆出可供医用的人类胚胎。2007年的 12月，韩国宣布成功地克隆了可以发荧光的小鼠，中国宣布克隆成功了兔。 三、克隆的负面影响
光刻技术及其应用的现状与展望
1 引言 光刻技术作为半导体及其相关产业发展和进步的关键技术之一，一方面在过去的几十年中发挥了重大作用；另一方面，随着光刻技术在应用术问题的增多、用户对应用本身需求的提高和光刻技术进步滞后于其他技术的进步凸显等等，寻找解决技术障碍的新方案、寻找COO更加低的技术和找到下一俩代可行的技术路径，去支持产业的进步也显得非常紧迫，备受人们的关注。就像ITRS对未来技术路径的修订一样，上世纪基本上3～5年修正一次，而进入本世纪后，基本上每年都有修正和新的版本出现，这充分说明了光刻技术的重要性和对产业进步的影响。2005年ITRS对未来几种可能光刻技术方案进行预测。也正是基于这一点，新一轮技术和市场的竞争正在如火如荼的展开，大量的研发和开发资金投入到了这场竞赛中。因此，正确把握光刻技术发展的主流十分重要，不仅可以节省时间和金钱，同时可以缩短和用户使用之间的周期、缩短开发投入的回报时间，因为光刻技术开发的投入比较庞大。 2 光刻技术的现状及其应用状况
众说周知，电子产业发展的主流和不可阻挡的趋势是“轻、薄、短、小”，这给光刻技术提出的技术方向是不断提高其分辨率，即提高可以完成转印图形或者加工图形的最小间距或者宽度，以满足产业发展的需求；另一方面，光刻工艺在整个工艺过程中的多次性使得光刻技术的稳定性、可靠性和工艺成品率对产品的质量、良率和成本有着重要的影响，这也要求光刻技术在满足技术需求的前提下，具有较低的COO和COC。因此，光刻技术的纷争主要是厂家可以提供给用户什么样分辨率和产能的设备及其相关的技术。 2.1 以Photons为光源的光刻技术 在光刻技术的研究和开发中，以光子为基础的光刻技术种类很多，但产业化前景较好的主要是紫外(UV)光刻技术、深紫外(DUV)光刻技术、极紫外(EUV)光刻技术和X射线(X-ray)光刻技术。不但取得了很大成就，而且是目前产业中使用最多的技术，特别是前两种技术，在半导体工业的进步中，起到了重要作用。 紫外光刻技术是以高压和超高压汞(Hg)或者汞-氙(Hg-Xe)弧灯在近紫外(350～450nm)的3条光强很强的光谱(g、h、i线)线，特别是波长为365nm的i线为光源，配合使用像离轴照明技术(OAI)、移相掩模技术(PSM)、光学接近矫正技术(OPC)等等，可为0.35～0.25μm的大生产提供成熟的技术支持和设备保障，在目前任何一家FAB中，此类设备和技术会占整个光刻技术至少50％的份额；同时，还覆盖了低端和特殊领域对光刻技术的要求。光学系统的结构方面，有全反射式(Catoptrics)投影光学系统、折反射式(Catadioptrics)系统和折射式(Dioptrics)系统等。主要供应商是众所周知的ASML、NIKON、CANON、ULTRATECH和SUSS MICROTECH等等。系统的类型方面，ASML以提供前工
来自dxy 22003luocong 植物基因全长克隆几种方法的比较 基因是遗传物质基本的功能单位，分离和克隆目的基因是研究基因结构、揭示基因功能及表达的基础，因此，克隆某个功能基因是生物工程及分子生物学研究的一个重点。经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病, 即实验操作繁琐, 周期较长、工作量繁重,且不易得到全长序列。又由于在不同植物中目的基因mRNA丰度不同，所以获得目的基因的难易程度又不一样，特别是对于丰度比较低的目的基因即使使用不用的方法也不一定能获得成功。近年来随着PCR技术的快速发展和成熟.已经有多种方法可以获得基因的全长序列, 比如经典的RACE技术，染色体步移法和同源克隆法等，本文主要综述几种重要的克隆方法的原理和运用，并且比较分析这几种方法的优缺点，为你的实验节约时间和成本。 1 RACE技术 1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Mulis等[1]发明的PCR技术使生命科学得到了飞跃性的发展。1988年Frohman等[2] 在PCR技术的基础上发明了一项新技术, 即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends, RACE), 其实质是长距PCR( long distance, PCR)。通过PCR由已知的部分cDNA 序列, 获得5′端和3′端完整的cDNA, 该方法也被称为锚定PCR ( anchored PCR) [3] 和单边PCR( one-sidePCR) [4]。RACE技术又分为3?RACE和5?端RACE。3′RACE 的原理是利用mRNA 的3′端天然的poly(A) 尾巴作为一个引物结合位点进行PCR, 以Oligo( dT) 和一个接头组成的接头引物( adaptor primer, AP)反转录mRNA得到加接头的第一链cDNA。然后用一个正向的基因特异性引物( gene-specific primer, GSP) 和一个含有接头序列的引物分别与已知序列区和poly(A) 尾区退火, 经PCR扩增位于已知序列区域和poly( A) 尾区之间的未知序列，若为了防止非特异性条带的产生, 可采用巢式引物( nested primer) 进行第二轮扩增, 即巢式PCR( nested PCR) [5，6]。5?RACE 跟3?RACE原理基本一样，但是相对于3?RACE来说难度较大。 5'-RACE受到诸多因素的影响而常常不能获取全长，因此研究者都着手改进它。这些措施主要是通过逆转录酶、5'接头引物等的改变来实现的，因此出现了包括基于“模板跳转反转录”的SMART RACE技术( switching mechanism at 5′ end of RNA transcript) [7] , 基于5′脱帽和RNA酶连接技术的RLM-RACE技术(RNA ligase mediated RACE)[8], 利用RNA连接酶为cDNA第一链接上寡聚核苷酸接头的SLC RACE技术(single strand ligation to single-stranded cDNA)[9] , 以及以内部环化的cDNA第一链为模板进行扩增的自连接或环化RACE技术(self-ligation RACE or circular RACE)[10]，和通过末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾后引入锚定引物的锚定RACE技术( anchored RACE)[11]。 笔者主要介绍两种比较新的RACE技术，基于…模板跳转?的SMART RACE 技术和末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾技术。 1.1基于‘模板跳转’的SMART RACE技术[7，12]