犬细小病毒治疗方法 犬细小无特效治疗方法，医生各有各的经验，各有各的处方。但治疗原则基本相同，常采用特异疗法、支持疗法、对症治疗、控制继发感染和中草药治疗。 CPV-1的治疗效果不理想，给新生犬保温、给予适当的营养和水分可大大降低死亡率。 CPV-2无特效治疗药物，临床上常采用以下综合治疗措施。 （1）特异疗法 早期使用高免血清、细小病毒单克隆抗体、干扰素、免疫球蛋白、血浆，在减轻疾病严重程度、缩短治疗疗程上都有一定的作用。 市场上出售的这些产品生产厂家多、品种多，无正式批号的也不少，质量参差不一，价格差异很大。购买时要看厂家、抗体滴度、数量、主要成分含量，用法用量。按说明书上介绍的用量很难达到预期的疗效，特别是价格低廉的血清，其效果更差。应购买使用知名厂家，价格较合理的生物制品使用，切勿贪图便宜。 血清及单抗2ml/kg，肌肉注射，每天1次，连用3～5天。 单抗1～2ml/kg，肌肉注射，每天1次，连用3～5天。 干扰素，成犬每日肌注1～2支（100万国际单位），幼犬每日0.5～1支，连续3～5天。 免疫血浆，10～20/ml，静滴，每天1次，连用3～5天。血浆和单抗，或血浆和干扰联合使用，效果更佳。 （2）对症治疗 止吐：止吐药有助于减少体液流失，减轻患畜痛苦，以及维持肠道营养。首选爱茂尔肌注，必要时用阿托品，胃肠道有出血者忌用胃复安。还可以用昂丹司琼或多拉司琼止吐。 止泻：鞣酸蛋白，施密达都有止泻作用，但因其呕吐，不适宜口服给药，用施密达深部灌肠效果较好。 止血：肾上腺色腙、安甲苯酸、安甲环酸、VK3 ，V～K1均可用于止血，肌注效果不理想，采用联合用药肌注或静滴止血敏、氨甲苯酸有较好的疗效。如果止血无效，可静滴立止血、卡络磺钠。另外全血、血浆、代血浆也有止血作用。 心功能不全者，可静滴生脉注射液1～10ml；V～B12 0.25～0.5mg，肌苷50～100mg，混合肌注。 低蛋白血症：一些幼犬会出现低蛋白血症，输入全血将有助于这个问题的解决，但是如果不需要补充红细胞时，最好输入血浆。低蛋白造成水肿而且输入血浆后并未有所改善，应该考虑使用胶体羟乙基淀粉。理想的血浆蛋白浓度应该维持在2g/dl或则更高。 贫血：有些幼犬严重贫血，这是由于细小病毒肠炎引起的胃肠道失血造成的，或者这个跟细小病毒没有关系的寄生虫引起的。幼犬严重贫血必须输血，全血对动物的贫血和低蛋白血症更有好处。 败血症和内毒素血症：在治疗早期可用糖皮质激素和氟尼辛葡甲胺可能有好处，在脱水被矫正之后不要使用，
单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针
对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
66 2012·07中国工作犬业 1范围 本标准规定了犬细小病毒病的临床检查、血凝与血凝抑制试验、PCR 检测的操作方法。 本标准适用于犬细小病毒病的鉴定及其流行学调查、诊断和监测。其中病毒分离、血凝与血凝抑制试验、PCR 检测适用于犬细小病毒的病原诊断。 2试剂和材料 2.1 FK81细胞（猫肾细胞）。2.2 0.9%生理盐水。2.3 1%猪红细胞液。2.4 犬细小病毒阳性血清。2.5 96孔“v”形微量反应板。2.6 Taq 酶及10倍Taq 酶反应缓冲液：Taq 酶浓度为5U/μL，-20℃保存。 2.7 1.5mL Eppendorf 管。2.8 0.2mL PCR 薄壁管。2.9 dNTP:含dCTP、dGTP、dATP 、dTTP 各10mmol/L，-20℃保存。 2.10 引物：浓度为20μmol/L，其序列如下： 上游引物（CPVF ）：5’GAA TCT GCT ACT CAG CCA CCA AC3’； 下游引物（CPVR ）：5’GTG CAC TAT AAC CAA CCT CAG C3’。 2.11 10%十二烷基硫酸钠：配制参见附录A。 2.12 蛋白酶K 贮备液。2.13 5×TBE 电泳缓冲液。 3器材和设备 3.1 PCR 仪。 3.2 高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000g 以上。 3.3 水平电泳仪。3.4 凝胶成像系统。 4临床检查 4.1 临床特征 4.1.1 潜伏期1周到2周，病初无任何症状，食欲减退或废绝，体温40℃以上，粉红色黏稠血样物。 4.1.2 病犬先出现呕吐，呕吐出白色泡沫或黄色液体，继而腹泻，粪便稀薄而恶臭，剧烈的腹泻呈喷射状，粪便呈红色，混有大量黏液或假膜。后期排番茄汁样稀便，并有特殊的腥臭味。 4.1.3 患犬迅速消瘦，倦卧不起，目光呆滞，眼窝下陷，腹围紧缩，机体脱水，皮肤干燥、弹性降低。 4.2 病理变化 4.2.1 心脏肿大呈灰黄色，切面外翻，质地松软，心肌有出血性斑纹。 4.2.2 肝脏肿大，包膜紧张，多呈黄褐色，质地松软有局灶性坏死，断面有豆蔻状花纹。 4.2.3 胃空虚，黏膜轻度潮红，附有大量黏液；小肠壁增厚，肠管变粗，肠腔狭窄，形成厚层黏膜皱褶，易于剥落，肠腔内充满紫红色粥样内容物并混有血凝块。 4.3 判定 若临床症状符合4.1.1或4.1.2且出现4.2.1或4.2.3的病理变化，则可判定疑似犬细小病毒病，其他临床症状和病理变化可作为参考指标；疑似病例可采用血凝与血凝抑制试验或PCR 检测进行确诊。 5血凝与血凝抑制试验 5.1 血凝试验（HA ）的操作方法 5.1.1 样品采集活犬的泪液、鼻液、粪便，病死犬的肝、脾、肺等组织器官。将待检组织或粪便样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000g离心15min，收集上清液待检；口腔拭子、粪拭子用少量生理盐水浸润后，取上清液待检。 5.1.2 在96孔“v”形微量反应板上进行，自左至右各孔加50μL 理盐水。 5.1.3 于左侧第1孔加50μL 待检样品混合均后，吸50μL 至第2孔，混合均匀后，吸50μL 至第3孔，依次倍比稀释，至第11孔，吸弃50μL，稀释后病毒稀释度为 犬细小病毒病诊断技术国家标准 nformation· Reference I 资料 参考
单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫
第四章单克隆抗体与基因工程抗体制备技术 本章考点 1.概念 2.杂交瘤技术基本原理 3.杂交瘤抗体的制备技术 4.基因工程抗体 由杂交瘤细胞产生的针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。其理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、且来源容易。 传统的方法是将抗原注入动物，由动物体内B细胞产生的抗体。由于多数天然的抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。因此，将抗原注入机体后，刺激多个B细胞克隆所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称为多克隆抗体（PoAb）。 第一节杂交瘤技术基本原理 单克隆是指利用在细胞融合基础上的B细胞杂交瘤技术。 杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。 一、B细胞杂交瘤技术 1.细胞的选择和融合：杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异性的单克隆抗体，所以融合一方必须是经过抗原免疫的B细胞，通常选用被免疫动物的脾细胞，脾淋巴细胞的主要特征是抗体分泌功能。融合细胞另一方则要求在培养条件下的永生性，只有肿瘤细胞才是具备这一条件，所以选择同一体系的骨髓瘤细胞，因多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，其特点是稳定易培养、自身不分泌免疫球蛋白及细胞因子、融合率高、是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾细胞融合对象。 2.选择培养基的应用：细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字头称为HAT培养基。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷是细胞DNA合成的途径；氨甲蝶呤（A）是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合作用的瘤细胞是经毒性培养基选取出的缺乏HGPRT细胞株，不能在该培养基上生长，只有融合细胞具有亲代双方遗传性能，才能在HAT 培养基上长期存活与繁殖。 3.有限稀释与抗原特异性的选择：细胞融合是一个随机的过程，需在融合细胞抗体筛选的基础上进行特异性筛选。将融合细胞进行充分稀释，进行克隆化处理，再将阳性细胞进行再次克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株进行增殖，再进行冰冻，体外培养或动物腹腔接种。
单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合
犬细小病毒病的诊断与治疗 概述：一、诊断 现场诊断可以根据流行病学、特征临诊症状和病理变化等做出初步判断。实验室确诊需要进行如下检查。 (一)病毒分离与签定 用患病犬粪便液或濒死期扑杀犬的肠内容物，加适量氯仿混匀，置4摄氏度过夜处理，离心后上清液接种MDCK、F81等传代细胞分离培养病毒。也可采取濒死期病犬的肾、肺或睾丸作细胞培养，5—7天后转原代或继代细胞，也易获得病毒，可用荧光抗体染色、微量血凝抑制试验等对分离病毒进行鉴定。 (二)血清学诊断 微量血凝试验和血凝抑制试验、灾光抗体技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法可用于该病的特异快速诊断。国内外常用血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验。血凝试验用于测定粪便和细胞培养物中的病毒效价。用0.5%—1%猪红细胞指示系统。试验证明HA1：80可作为阳性感染的指示标准。血凝抑制试验主要用作流行病学调查，也可用于检测粪便中的抗体。 在诊断中要注意与犬瘟热、犬传染性肝炎和出血性胃肠炎等疾病进行区别诊断。 二、治疗 1.心肌炎往往来不及治疗就发生死亡，即使治疗，其效果往往不佳，常以死亡告终。
2.肠炎型治疗原则是特异性血清治疗，配合对症、抗菌、解毒、抗休克治疗和防止继发感染。 3.特异性血清治疗：使用抗犬细小病毒高免血清进行治疗，效果可靠。 4.对症治疗：注射阿托品止呕吐：腹泻可口服硝酸铋、鞣酸蛋白;出血性腹泻可注射维生素K、安络血等止血剂;出现脱水可补液，注意先盐后糖，采用静脉注射，如有困难可采用腹腔注射;结膜发绀则加入碳酸氢纳防止酸中毒。 5.防止继发感染：可使用庆大霉素、红霉素、卡那霉素等抗菌药物，也可配合使用抗病毒药物。 6.在护理上要注意病初应禁食1—2天;恢复期应控制饮食，给予稀软易消化的食物，少量多次，逐渐恢复到正常饮食。
单抗制备流程 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。 制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。 一、细胞融合前准备 (一) 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射) ↓2～3周后 第二次免疫1×10７／0.5ml ip ↓3周后 加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射) ↓ 取脾融合 2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。 初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射
│(一般0.8～1ml 0.2ml／点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip │(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip │ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果) ↓2～3周后 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。 (二) 饲养细胞 在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄 ↓ 拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟 ↓
目录 第1章文献综述 (1) 1.1 鹅细小病毒流行现状 (1) 1.2 鹅细小病毒的特性 (2) 1.2.1 GPV形态结构和理化特性 (2) 1.2.2 宿主范围和培养特性 (2) 1.2.3 临床症状及病理特性 (3) 1.2.4 GPV的基因结构 (4) 1.2.5 GPV编码蛋白及功能 (6) 1.3 鹅细小病毒诊断方法的研究进展 (8) 1.3.1 病原学诊断 (8) 1.3.2 分子生物学诊断 (9) 1.3.3 血清学诊断 (10) 1.4 鹅细小病毒病的防治 (13) 1.5 本研究的目的和意义 (14) 第2章鹅细小病毒VP3蛋白的原核表达 (15) 2.1 材料与试剂 (15) 2.1.1 菌种和载体 (15) 2.1.2 酶和试剂 (15) 2.1.3 各种溶液及培养基 (15) 2.1.4 主要仪器 (17) 2.2 方法 (18) 2.2.1 鹅细小病毒的分离鉴定 (18) 2.2.2 鹅细小病毒VP3蛋白的原核表达 (18) 2.3 结果 (21) 2.3.1 鹅细小病毒的分离鉴定 (21) 2.3.2 原核表达载体pET32a-VP3的构建 (21)
2.3.3 目的蛋白的表达 (22) 2.4 讨论 (23) 第3章鹅细小病毒VP3蛋白的纯化与鉴定 (24) 3.1 材料 (24) 3.1.1 酶和试剂 (24) 3.1.2 各种溶液 (24) 3.1.3 主要仪器 (24) 3.2 方法 (24) 3.2.1 VP3蛋白包涵体的提取 (24) 3.2.2 包涵体粗纯化 (25) 3.2.3 VP3蛋白Ni柱亲和层析 (25) 3.2.4 重组VP3蛋白Western-blot分析 (25) 3.3 结果 (26) 3.3.1 包涵体粗纯化 (26) 3.3.2 VP3蛋白Ni柱亲和层析 (26) 3.3.3 重组VP3蛋白Western-blot分析 (27) 3.4讨论 (27) 3.4 讨论 (27) 第4章间接ELISA方法的建立及评价 (28) 4.1 材料 (28) 4.1.1 病毒和血清 (28) 4.1.2 试剂及溶液 (28) 4.1.3 主要设备 (28) 4.2 方法 (28) 4.2.1 间接ELISA方法步骤 (28) 4.2.2 间接ELISA方法条件的优化 (29) 4.2.3 间接ELISA方法的评价 (30) 4.2.4 血清样品的检测 (31)
犬细小病毒病的诊断与治疗 摘要：细小病毒病是由细小病毒（CPV）引起的一种致死率极高的传染病。在治疗上，一般采用对症疗法和支持疗法，结合特异性疗法，在诊治犬细小病毒病时，关键就是要把握好初步诊断关与及时对症治疗关，这样就有可能获得较好的临床治疗效果。但平时的饲养管理也是很重要的，坚持进行疫苗注射。 关键词：犬；细小病毒；诊断；治疗 1977年，Eugester在美国首次从患出血性肠炎病犬的粪便中发现了犬细小病毒。以后许多国家和我国（1980年）均报道了本病的发生。犬细小病毒主要感染犬，尤其2-4月龄幼犬多发。该病一年四季均可发生，以春、秋多发。天气变化、饲养条件不好以及并发感染等，可使病情加重，加大死亡率。 犬细小病毒病已经成为危害宠物犬健康的一个重要疾病。其发病率为20%-100%，死亡率为10%-100%，但在精心治疗与护理下死亡率可大大降低。因此，犬细小病毒病的诊断与防治在兽医临床上有着重要的意义。犬细小病毒对犬有高度的接触性的传染性，无论是什么年龄的犬都可以感染。但以刚刚断乳至90日龄的犬发病比较多，病情会较严重。幼犬有的可呈现心肌炎症状然后突然死亡。依据临床发病犬的种类来看，纯种犬和外来犬比土种犬的发病率要高。 11．发病情况 1.1病例：红贵宾犬；雄性； 4月龄左右；体重： 2.3千克 畜主述：12月10日从本市宠物市场买回，据说已于12月8日已注射荷兰英特威公司的犬二联疫苗。头两天精神状态一直很好。12月12日周六，早上喂牛奶、狗粮。下午两点开始出现呕吐，自己给其喂服一支庆大霉素。到下午近五点，已呕吐3次，且粪便稀软。即送来英牛宠物就医。就诊时间：2008年12月12日傍晚。 2.临床症状
单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。 主要仪器设备： 超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。 方法 动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理： B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程： 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都
犬细小病毒症状及治疗方法 犬细小病毒是危害犬类最烈性的传染性病毒，潜伏期短、死亡率高。患病期间狗狗会呕吐并腹泻出血，精神不振，看起来十分难受。今天小编给大家介绍犬细小病毒症状及治疗方法。 1.流行病学本病一年四季均可发生,以冬春多发。饲养管理条件骤变、长途运输、寒冷等可促使本病发生。病犬的呕吐物和粪便是本病的主要传染源,康复犬仍可长期通过粪便向外排毒。健康犬通过与病犬或带毒犬直接接触,或经污染的饲料和饮水感染。 2.症状 该病潜伏期7天左右,多发生在刚换环境后(如新买的幼犬)。洗澡、过食是诱因。该病多数呈现胃肠炎综合征,少数呈现心肌炎综合征。 胃肠炎型病犬初期精神沉郁,厌食,偶见发热,轻度腹泻或轻呕吐,随后发展成频繁呕吐和剧烈腹泻。起初粪便呈灰色,黄色或乳白色糊状大便,其后排出恶臭的酱油样或番茄汁样血便。病犬迅速脱水,消瘦,眼窝深陷,被毛凌乱,皮肤无弹性,耳鼻、四肢发凉,精神高度沉郁,休克,死亡。从病初症状轻微到严重一般不超过2天,整个病程一般不超过1周。 心肌炎型多见于4~6周龄的幼犬,常无先兆性症状,或仅表现轻微腹泻,继而突然衰弱,呻吟,黏膜发绀,呼吸极度困难,脉搏快而弱,心脏听诊出现杂音,常在数小时内死亡。 3.诊断根据流行症状和血清学反应,可作出诊断。该病发病迅
速,传染性强,往往呈局部暴发性。临场表现为呕吐、腹泻、脱水等肠炎综合征,死亡率高。血清学反应多用酶联免疫吸附试验,国内外都有其检测试剂盒,该技术成熟,检出率高。 4.治疗临床上主要是对症治疗配合高免血清和单克隆抗体治疗成犬治愈率高,幼犬预后谨慎。 止吐:胃复安或爱茂尔0.05毫升/公斤肌注;止血:安络血0.2~0.5毫升肌注,或止血敏0.5毫升肌注;补液和调整酸碱平衡:根据脱水情况,30~70毫升/公斤补等渗糖盐水,若有酸中毒可能,则用5%碳酸氢钠10亳升静注。治疗过程中最好禁食禁水,以免刺激胃肠道。 5.预防犬细小病毒对外界的抵抗力强,自然条件下存活时间较长发病时,应迅速隔离病犬,对病犬污染的犬舍饲具、用具、运输工具进行严格的消毒。 选用可靠疫苗,按照说明书推荐免疫程序进行及时、可靠的免疫接种,是预防本病的根本措施。
小鹅瘟(鹅细小病毒感染) 小鹅瘟(鹅细小病毒感染) 【病因】本病为雏鹅的急性传染病，主要病原体是小鹅瘟病毒，存在于病鹅脑、肝、脾、肠内容物及其他组织中。主要是通过消化道感染，与病鹅直接接触或接触病鹅的排泄物沾污的饲料和饮水、带病毒的种蛋是传播的主要途径。 【症状】7日龄左右的雏鹅感染后，往往是最急性型，有时不见任何症状即突然死亡，只有半天或1天的病程。病初精神不振，缩颈，打瞌睡，拒食，但多饮水，排出灰白色或黄绿色稀粪，并混有气泡，气喘流涎，两腿麻痹或抽搐，两脚缩起，半小时即死。 【诊断】主要是1日龄鹅易感，成年鹅不感染。临床症状表现为严重的下痢和排出灰白色或黄绿色水样稀粪，剖检见肠管膨大，里面含有带状或圆柱状的白色栓子，基本可确诊。 【预防】小鹅瘟主要是通过孵坊传播的，因此孵坊中的一切用具设备，在每次使用后必须清洗消毒。收购来的种蛋最好用福尔马林熏烟消毒。刚出壳的雏鹅要注意不与新收进的种蛋和大鹅接触，以防感染。预防可接种小鹅瘟鸭胚化GD弱毒疫苗。 每只小鹅喂服2粒白胡椒，只用1次，可预防小鹅瘟。
【治疗】 方l新鲜鱼腥草适量，捣汁灌服或自饮。病鹅每只每次1～2毫升，分早、午、晚3次灌服，也可让其随意自饮。 何日远[《中兽医学杂志》介绍，用此方给病鹅每次灌服2毫升，1日3次，连灌2天痊愈，取得100％的治疗效果。 方2马齿苋120克，黄连50克，黄芩80克，黄柏80克，连翘75克，双花85克，白芍70克，地榆90克，栀子70克(200只鹅用量)。 上述药物以水煎煮，药液灌服或拌饲料喂，1日2次，连用3～4天。治疗效果很好[卢文贵，《中兽医医药杂志》。 方3每10只小鹅，每天用鲜半边莲50～100克，以冷开水捣烂取其汁。肉豆蔻15～25克、大风藤(入地麝香、过山香)20～30克、砂仁3～5克，如下痢不止或遇寒冷阴雨天可 再加肉桂3克、鸡矢藤5～10克，加清水共煎。取上述两种药液和大米粉混成米浆(或浸米)，饲喂病鹅(7日龄内的小鹅应极少喂或不喂青菜)。 或每10只小鹅每天用通城虎5～10克，肉豆蔻20～25克，遇寒冷阴雨天加桂枝5～10克，用法同上。病鹅经服药2～6天可见明显效果。治疗256只病鹅，观察20日以上，治 愈180只，疗效达70％。
目录 1 病原 (2) 2 流行病学 (2) 3 发病机理 (2) 4 症状 (3) 4.1 肠炎型 (3) 4.2 心肌炎型 (3) 5 诊断 (3) 5.1实验室诊断 (3) 5.2 试纸论断 (3) 6 治疗 (4) 6.1免疫血清 (4) 6.2补液 (4) 6.3 抗菌消炎 (4) 6.4 对症治疗 (4) 7 预防 (5) 7.1定期接种 (5) 7.2加强兽医卫生防疫 (5) 7.3及时隔离治疗 (5) 7.4消毒 (5) 8 结论 (5) 参考文献 (6) 致谢 (7)
犬细小病毒的诊断预防与治疗 摘要:犬细小病毒是1977年首先在美国被发现的，从发现该病毒至今，世界各地均有流行，是危害犬类的最主要的烈性传染病之一。本病的发生主要与气温与个体抵抗力大小与接种犬细小病毒预防疫苗与否有着密切的关系。 关键词：犬细小病毒传染病诊断 犬细小病毒主要感染犬，尤其幼犬，传染性极强，死亡率也高。一年四季均可发病，以冬，春多发。饲养管理条件骤变，长途运输，寒冷，拥挤均可促使本病发生。 1 病原 犬细小病毒属细小病毒科，细小病毒属。犬细小病毒对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力，在4～10℃存活6个月，37℃存活2周，56℃存活24h，80℃存活15min，在室温下保存3个月感染性仅轻度下降，在粪便中可存活数月至数年。该病毒对乙醚，氯仿，醇类有抵抗力，对紫外线，福尔马林，次氯酸钠，氧化剂敏感。 2 流行病学 病犬是主要传染源，呕吐物，唾液，粪便中均有大量病毒。康复犬仍可长期通过粪便向外排毒。健康犬与病犬或带毒犬直接接触，或经污染的饲料和饮水通过消化道感染。病犬是本病的主要传染源，病犬的粪、尿、呕吐物和唾液中含毒量最高。病犬不断向外排毒而感染其他健康犬。康复犬粪便中长期带毒。因此，犬群中一但发病，极难彻底清除。本病主要通过直接或间接接触而感染。犬细小病毒对外界因素的抵抗力较强，于60℃环境可存活1h，在偏酸偏碱的环境中病毒仍有感染性。在粪便和固体污染物上的病毒可存活数月至数年。在低温环境，其感染性可长期保持。 3 发病机理 健康犬经消化道感染病毒后，病毒主要攻击两种细胞，一种是肠上皮细胞，一种是心肌细胞，分别表现胃肠道症状和心肌炎症状，心肌炎以幼犬多见。
制备单克隆抗体是复杂而费时的工作，整个技术流程如图: 单克隆抗体制备（免疫2-3月，总周期4-6 月） 准备抗原 动物免疫——选择免疫动物 Elisa测抗血清--------- ? ￥ 分离脾细胞骨髓瘤细胞 细胞融合（融合剂：PEJ HAT培养基筛选杂交瘤细胞 筛选阳性细胞------- * （三天内做完流式）“ 阳性克隆并扩大培养呻—细胞冻存 性！ 扩大培养收集上清动物接种收集腹水 单克隆抗体纯化保存 1、抗原提纯与动物免疫： 选择BALB/c健康小鼠。如为细胞抗原，可取 1 X 107个细胞作腹腔免疫；可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。免疫3?4只小鼠，间隔一般2?3周，末次免疫后3?4天，分离脾细胞。 2、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 选择Sp2/0细胞株，将昆明鼠的腹腔细胞作为饲养细胞 3、细胞融合 将两种细胞混合后加入PEG（融合剂）使细胞彼此融合。其后用培养液稀释PEG 消除PEG的作用。注意：细胞比例、培养液成分、反应时间 4、有限稀释法筛选阳性株 筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株（一般稀释至0.8个细胞/孔）细胞培养至覆盖0 %?20%孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的ELISA 测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。 5、单克隆抗体的制备与保存 筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠，先用液体石蜡进行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5?10ml的腹水，冻存。6、单克隆抗体的纯化 硫酸铵沉淀法
单克隆抗体制备的技术原理 单克隆抗体是由一个杂交瘤细胞及其后代所产生的抗体，具有单一、特异与纯化的特性。该抗体在医学临床诊断及治疗上具有极其重要的作用。因此它的问世在现代免疫学上具有划时代的意义。 大家知道，当外源性物质在人体或动物血液中出现时，机体中有一些淋巴细胞便会做出反应，产生一些特殊的免疫球蛋白，叫做抗体。而那些外源性物质则称为抗原。抗体与抗原能发生特异结合，从而清除异物，达到保护肌体的作用。抗原不同，它所诱发的抗体也不一样。如细菌或病毒表面存在着几种抗原，因此它们就会对应地诱发出几种不同的抗体。过去人们为了获得抗体，就根据上述原理，反复注射某种抗原到动物（如兔、羊、马等）体内，然后从其血清中分离出所需的抗体。长期以来，用这种经典方法得到的抗体，往往存在着两个严重的缺点：第一，这些抗体不是均质的，而是一种抗体的混合物，特异性差，效价低；第二，抗体的产生是有限量的，因为分泌抗体的成熟淋巴细胞寿命很短，一般只能存活几天，无法大量生产。 为了克服上述缺点，许多免疫学家曾进行了长期的研究与探索，这一难题终于在1975年被国外两名免疫学家考勒和米尔斯坦解决了。他们利用自己创立的杂交瘤技术，使产生抗体的淋巴细胞能在体外长期存活，并源源不断地分泌抗体。这就是有高特异性和非常均质的单克隆抗体。 单克隆抗体的技术原理并不十分复杂。它是把能产生单一抗体的淋巴细胞与有增殖能力的骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞，又称杂交瘤。由于这些杂种细胞继承了双亲细胞的遗传物质，因此它们不仅能表现出淋巴细胞分泌单一抗体的能力，而且还能表现出骨髓瘤细胞在体外大量繁殖的本领。就这样，取长补短，使杂交瘤变成了一座制造单克隆抗体的理想“工厂”。 目前制备单克隆抗体的具体方法，主要有以下三步（图2－9）。 第一步：将抗原注射到小鼠体内进行免疫，取出受免脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合。 第二步：用选择培养基，选出杂交瘤细胞，逐一克隆或扩增，从中挑出能产生抗体的杂交瘤细胞。 第三步：将杂交瘤细胞接种在培养瓶中扩大培养或注射到动物的体液中作为腹水癌生长，然后再分离纯化单克隆抗体。
单克隆抗体的制备 摘要:单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所产生的单克隆抗体。这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。下面主要讲述制备单抗的实验过程。 关键词：抗体，单克隆，肿瘤，细胞融合，淋巴细胞 现代生物技术制药工业始于1971年，现已创造出35个重要治疗药物，全球大约有2500多家公司，主要产品有重组蛋白质药品、重组疫苗和诊断、治疗用的单克隆机体三大类。我国自80年代在采用现代生物技术改造传统生物技术制药产业方面已取得初步成果。但我国生物技术诊断试剂、酶工程、动植物细胞工程医药产品、现代生物技术支撑技术、后处理技术和制剂技术等方面与国外还存在差距。 1．国外现代生物技术产业发展的现状 自1971年Cetus公司成立至今，现代生物技术制药工业已走完了二十五年的路程，创造出35个重要的治疗药物，目前已在治疗癌症、多发性硬化症、贫血、发育不良，糖尿病、肝炎、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传性疾病中取得良好效果。在医药工业中，传统生物技术（包括近代生物技术）已为人类提供了许多重要药品，在保障人类生命健康和推动社会进步中发挥了巨大作用；现代生物技术以其特有的高新技术又为人类提供了传统生物技术难以获得的极微量的珍贵药品。由于这一系列现代生物技术新型药物的出现，使过去无法治疗的疑难疾病得到了治疗。同时，应用现代生物技术DNA重组，细胞融合以及细胞大规模培养等现代生物技术发展和提高传统生物技术的生产水平，为抗生素、氨基酸、维生素以及基体激素等药品的生产，构建了高产新菌株，创造新工艺，提高生产能力，降低生产成本，促进生产发展。