水溶性阳离子荧光共轭聚合物作为荧光
探针测定三磷酸腺苷
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
作者：王运王伟何治柯关洪亮
【摘要】利用荧光光谱研究了三磷酸腺苷(ATP)与水溶性阳离子荧光共轭聚合物的相互作用，发现加入ATP后，聚合物的荧光强度被显著猝灭，且猝灭程度与ATP的加入量成正比，据此建立了测定ATP 的方法。荧光光谱的激发波长选择395 nm，发射波长为521 nm，激发狭缝宽度为10.0 nm，发射狭缝宽度为10.0 nm。在0.05 mol/L Tris HCl缓冲溶液(pH=7.4)中，测定ATP的线性范围为8.0×10-8～1.0×10-5 mol/L; 检出限为 2.0×10-8 mol/L; 回收率在93.6%～105.6%之间; 相对标准偏差在2.2%～6.9%之间。本方法用于三磷酸腺苷二钠药片和鲫鱼肉中ATP的测定，获得满意结果。
【关键词】荧光共轭聚合物;荧光光谱;三磷酸腺苷二钠
1 引言
三磷酸腺苷(ATP)是生物体中重要的能量物质[1]，建立快速、简便监测ATP的方法对于深入研究其功能具有重要意义。目前，测
定ATP含量的方法主要有电化学分析法[2]、生物发光法[3]、高效液相色谱法[4]、毛细管区带电泳法[5]及荧光光谱法[6]等。但电化学分析法、生物发光法、毛细管区带电泳法和高效液相色谱法存在仪器昂贵、操作繁琐等缺点，而ATP检测试剂盒价格较高，试剂保存条件苛刻，不利于反复使用。虽然检测ATP的方法在不断改进，但灵敏度和选择性仍然难以满足实际需要。荧光光谱法具有操作简便、灵敏度高、选择性好等特点，作为荧光探针的有小分子[7]、聚合物[8]及量子点等[9]。水溶性荧光共轭聚合物作为一类新型荧光探针具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高等优点，还具有“分子导线”的功能，能够实现荧光信号的放大，常用于生物大分子和生物小分子的检测等[10～13]。
本实验采用的水溶性阳离子荧光共轭聚合物(WCFP)属于一种聚噻吩衍生物。噻吩是五元环结构，符合休克尔规则，具有适中的能隙、较宽的光谱响应、良好的环境稳定性和热稳定性，是一类性能优异的π电子系共轭光、电材料[14,15]。利用WCFP与ATP相互作用的荧光光谱特性，建立了以WCFP为荧光探针测定ATP的新方法，并将本方法应用于三磷酸腺苷二钠药片和鲫鱼肉中ATP的测定，结果令人满意。本方法不仅简便、准确，试剂稳定、重现性好，而且具有反应时间短，试剂用量少，污染小等优点。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
LS55型荧光光谱仪(美国Perkin Elmer公司)，Nicolet
Evolution 300型紫外可见分光光度计(美国热电公司)。本实验所采用的WCFP属于一种聚噻吩衍生物，结构见图1插图。单体的相对分子量为285.57，按文献[16]方法合成。ATP(相对分子量为605.2，上海伯奥生物科技有限公司);WCFP和ATP均配制成 2.00 ×10-5mol/L的储备液，其中WCFP浓度以单位计;其它试剂均为分析纯，所用纯水来自Aquapro纯水系统(中国重庆颐洋有限公司，18 M Ω·cm)。0.5 mol/L Tris HCl缓冲液。
2.2 实验方法
荧光光谱的激发波长为395 nm，发射波长为521 nm，激发和发射光谱宽度带为10.0 nm。实验考察了缓冲溶液、pH值、离子强度、干扰离子等对ATP猝灭聚合物荧光光谱的影响。
3 结果与讨论
3.1 ATP 对WCFP荧光光谱的影响
由加入ATP前后WCFP的荧光光谱(图1)可见，WCFP的最大发射波长均为521 nm(曲线a)。随着ATP浓度的增加，WCFP的荧光强度逐步下降(曲线b～i)，但其最大发射波长并未发生改变。
3.2 缓冲溶液和酸度的影响
考察不同缓冲溶液对体系的影响，发现磷酸盐缓冲溶液对聚合物荧光猝灭较强，影响检测灵敏度;Tris HCl缓冲溶液较好。当Tris HCl缓冲溶液浓度从0.01 mol/L增大到0.10 mol/L时，荧光猝灭程度逐渐增强;当Tris HCl浓度达到0.04 mol/L时，相对荧光猝灭程度变化趋于平缓。因此，选择0.05 mol/L Tris HCl缓冲溶液。
图2为不同pH条件下ATP对WCFP荧光的影响。在pH 6～9之间，加入ATP前后荧光强度较为稳定，并且在此pH区间体系被猝灭程度最大。由于此实验是研究生理条件下水溶性阳离子荧光聚合物与ATP的相互作用，因此选用反应的最适Tris HCl缓冲溶液(pH 7.4)。
3.3 工作曲线及检出限
WCFP浓度对ATP测定有一定的影响，当WCFP浓度过大时，会导致检测灵敏度变低;而WCFP浓度过小又会影响测定线性范围。本实验选择最佳浓度为4.0×10-6 mol/L(按单体计)。将不同量ATP加入到阳离子荧光聚合物溶液中，在最佳实验条件分别测定其荧光强度猝灭值ΔF，得到工作曲线，其相应的线性回归方程和相关系数分别为Y=0.81x+10.2，r=0.98，n=5。平行测定12次空白溶液的荧光强度，计算其标准偏差，以3倍的标准偏差除以标准工作曲线的斜率的方法得检出限为2.0×10-8 mol/L。
3.4 干扰物质的测定
混合体系中阳离子荧光聚合物浓度为4.0 μmol/L，ATP浓度为0.4 μmol/L，考察了共存物质的干扰情况。结果表明，以相对荧光强度变化为±5%计，共存组分允许存在的浓度见表1。1000倍的谷氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、组氨酸、丙氨酸、乙醇、蔗糖、葡萄糖、NH4Cl、NaNO3、KF、NaBr;600倍的异亮氨酸、甲硫氨酸、NaH2PO4、乙酸钠; 500倍的Na2CO3; 300倍的Na2HPO4、K2SO4; 100倍的苯丙氨酸、Na3PO4、NaI; 25倍的有柠檬酸钠、ZnNO3、
MgCl2; 12倍的La(NO3)3、Al(NO3)3, 测定干扰在5%以内。小牛胸腺DNA、牛血清白蛋白(BSA)和腺嘌啉的干扰严重。
3.5 样品中ATP含量的测定
取2片三磷酸腺苷二钠药片(每片含量20 mg)，加入三氯乙酸0.30 g，过滤，用超纯水定容至100 mL，再逐级稀释至测定ATP的线性范围之内。新鲜鲫鱼购于当地市场，去除鱼鳞、鱼皮和鱼刺，用表1 干扰物质的测定error (%)L Alanine5.0×10-4-3.5NH4Cl5.0×10-4+3.9L Glutamine5.0×10-4-1.7NaNO35.0×10-4+1.1L Methionine2.5×10-4-3.1CH3COONa2.5×10-4+2.5L Leucine5.0×10-4-2.4KF5.0×10-4-1.5L Tryptophane4.0×10-4-3.8NaBr4.0×10-4-3.0L Threonine5.0×10-4-1.5NaI4.0×10-5-4.6L Isoleucine2.5×10-4-4.3Na2CO32.0×10-4-4.2L Histidine5.0×10-4+2.5K2SO41.5×10-4-4.5Phenylalanine5.0×10-5-4.0MgCl21.5×10-5+2.0CH3CH2OH5.0×10-4+1.5Zn(NO3)21.0×10-5+4.5C12H22O112.0×10-4+3.9La(NO3)35.0×10-6+3.5C6H12O65.0×10-4+1.9Al(NO3)35.0×10-6+3.8NaH2PO42.5×10-4-2.6Trisodium citrate1.0 ×10-5-4.5Na2HPO41.25×10-4-2.5牛血清白蛋白BSA1.0×10-7-1.5Na3PO45.0×10-5-2.0腺嘌呤Adenine2.0×10-8-2.5小牛胸腺DNA4.8×10-8-2.2 高速组织捣碎机捣碎。根据文献[17]处理方法提取ATP，准确称取1.0 g已捣碎鲜鱼肉样品，加10倍体积(15 mL)
的4 mol/L HClO4，漩涡混匀器混匀1 min，冰浴1 min，重复7次后，以6000 r/min离心30 min，取上清液2.0 mL，加入1.8 mL 4 mol/L KOH中和，再以3500 r/min离心5 min，取所得混合溶液稀释到测定ATP的线性范围之内。以上测定均以0.05 mol/L Tris HCl(pH=7.4)控制溶液的pH值，ATP固体标样均在样品制备处理前加入。测定结果见表2，取得满意的回收率。表2 药片及鱼肉中ATP含量的测定
3.6 作用机理探讨
由于WCFP带有大量的正电荷，常用于DNA快速高灵敏检测，其原理主要基于其与DNA之间的静电相互作用[18]。为了探讨WCFP 与ATP的作用机理，考察了离子强度对反应体系的影响(见图3)。如图3所示，固定ATP与WCFP浓度不变，在反应体系中不断增加NaCl的浓度，可以看出，荧光强度比值
图3 离子强度对体系荧光强度的影响
Fig.3 Effect of NaCl on the fluorescence intensity of WCFP and WCFP ATP at 0.05 mol/L pH=7.4 Tris HCl buffer. The concentration of ATP and WCFP were 4.0×10-7 and 4.0×10-6 mol/L, respectively.(F0/F)随着溶液中离子强度的增加而减小。这说明水溶性阳离子荧光聚合物与ATP的相互作用受离子强度的影响较大，静电引力是其相互作用的主要作用力，这与文献[19]报道的WCFP与DNA的作用主要表现为静电作用是相吻合的。
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