实验五 2-甲基-2-己醇的合成
一、实验目的
1．通过格氏反应制备产物。
2.熟悉格氏试剂的制备、应用和进行格氏反应的条件。
3.掌握无水反应装置、机械搅拌装置和滴液漏斗的使用。
4.正确安装无水反应、并且带有滴液漏斗和回流冷凝管的机械搅拌装置。
二、实验原理
醇的制法很多，简单和常用的醇在工业上利用水煤气合成、淀粉发酵、烯烃水合及易得的卤代烃的水解等反应来制备。实验室醇的制备，除了羰基还原（醛、酮、羧酸和羧酸酯）和烯烃的硼氢化—氧化等方法外，利用Grignard 反应是合成各种结构复杂的醇的主要方法。
卤代烷和溴代芳烃与金属镁在无水乙醚中反应生成烃基卤化镁，又称Grignard 试剂。芳香和乙烯型氯化物，则需用四氢呋喃（沸点66℃）为溶剂，才能发生反应。
RX + Mg
无水乙醚
RMgX
Crignard 试剂为烃基卤化镁与二烃基镁和卤化镁的平衡混合物：
2Mg + MgX 2
乙醚在Crignard 试剂的制备中有重要作用，醚分子中氧上的非键电子可以和试剂中带部分正电荷的镁作用，生成络合物：
Et
Et Et Et
R-Mg-X
乙醚的溶剂作用是使有机镁化合物更稳定，并能溶解于乙醚。此外，乙醚价格低廉，沸点低，反应结束后容易除去。
卤代烷生成Grignard 试剂的活性次序为：RI ＞RBr ＞RC1。实验室通常使用活性居中的溴化物，氯化物反应较难开始，碘化物价格较贵，且容易在金属表面发生偶合，产生副产物烃〔R —R ）。
Grignard 试剂中，碳—金属键是极化的，带部分负电荷的碳具有显着的亲核性质，在增长碳链的方法中有重要用途，其最重要的性质是与醛、酮、羧酸衍生物、环氧化合物、二氧化碳及腈等发生反应，生成相应的醇、羧酸和酮等化合物。
RMgX
R-C-OMgX
R
H
+
C=O R-C-OH
R' C OCH 3
O RMgX R' C OMgX
R
2H
+
R R' C OH
R
22H 2C
O
CH 2
RMgX
RCH 2CH 2OMgX
H +RCH 2CH 2OH
2
R
CO 2RMgX
O
R C OMgX
H +
O R C OH
R' C N
R' C NMgX
H
+
R' C R
O
2H 2O
反应所产生的卤化镁络合物，通常由冷的无机酸水解，就可使有机化合物游离出来。对强酸敏感的醇类化合物可用氯化铵溶液进行水解。
Grignard 试剂的制备必须在无水条件下进行，所用仪器和试剂均需干燥，因为微量水分的存在抑制反应的引发，而且会分解形成的 Crignard 试剂而影响产率：
RMgX + H 2O
RH + Mg(OH)X
此外，Grignard 试剂尚能与氧、二氧化碳（见上）作用及发生偶合反应。
2RMgX + O 2
2ROMgX
RMgX + RX
R-R + MgX 2
故Grignard 试剂不宜较长时间保存。研究工作中，有时需在惰性气体（氮、氦气）保护下进行反应。用乙醚作溶剂时，醚高的蒸气压可以排除反应器中大部分空气。用活泼的卤代烃和碘化物制备Crignard 试剂时，耦合反应是主要的副反应，可以采取搅拌、控制卤代烃的滴加速度和降低溶液浓度等措施减少副反应的发生。
Grignard 反应是一个放热反应，所以卤代烃的滴加速度不宜过快，必要时可用冷水冷却。反应开始后，应调节滴加速度，使反应物保持微沸为宜。对活性较差的卤化物或当反应不易发生时，可采用加入少许碘粒的1，2-二溴乙烷或事先已制好的Crignard 试剂引发反应发生。
2-甲基-2-己醇的合成反应为：
OMgBr
H +n -C 4H 9Br + Mg n -C 4H 9MgBr
n -C 4H 9MgBr + CH 3COCH 3 n -C 4H 9C(CH 3)2OMgBr
n -C 4H 9C(CH 3)2
+ H 2O
OH
n -C 4H 9C(CH 3)2
三、仪器及试剂
仪器：带干燥管电动搅拌装置一套；蒸馏装置一套；萃取装置一套。 试剂：镁条（）；正溴丁烷17g （，约）；丙酮）（10mL ，）；无水乙醚（自制）；乙醚；10%硫酸溶液；5%碳酸钠溶液；无水碳酸钾；碘。
无水乙醚无易发燃不溶溶镁条银色立方650 1117 / 不不不硫酸无色液体/ 340 / 溶分解碳酸钠白色粉末851 分解易溶微溶不
兰色鳞片
碘
或片状
四、实验步骤
1．正丁基溴化镁[1]的制备
在250 mL三颈烧瓶[2]上分别装置搅拌器[3]、冷凝管及滴液漏斗，在冷凝管及滴液漏斗上口装置氯化钙干燥管（所有仪器必须干燥）。向三颈瓶内投入镁屑[4]、15mL无水乙醚及一小粒碘片；在恒压滴液漏斗中混合正溴丁烷和15mL无水乙醚。
先向瓶内滴入约5mL混合液，数分钟后溶液呈微沸状态，碘的颜色消失[5]。若不发生反应，可用温水浴加热。反应开始比较剧烈，必要时可用冷水浴冷却。
待反应缓和后，至冷凝管上端加入25mL无水乙醚。开动搅拌器（用手帮助旋动搅拌棒的同时启动调速旋纽，至合适转速），并滴入其余的正溴丁烷-无水乙醚混合液，控制滴加速度维持反应液呈微沸状态。
滴加完毕后，在热水浴上回流20min，使镁条几乎作用完全。
2．2-甲基-2-己醇的制备
将上面制好的Grignard试剂在冰水浴冷却和搅拌下，自恒压滴液漏斗中滴入10mL 丙酮和15mL无水乙醚的混合液，控制滴加速度，勿使反应过于猛烈。加完后，在室温下继续搅拌15min（溶液中可能有白色粘稠状固体析出）。
将反应瓶在冰水浴冷却和搅拌下，自恒压滴液漏斗中分批加入100mL10%硫酸溶液，分解上述加成产物（开始滴入宜慢，以后可逐渐加快）。待分解完全后，将溶液倒入分液漏斗中，分出醚层。水层每次用25mL乙醚萃取两次，合并醚层，用30mL5%碳酸钠溶液洗涤一次，分液后，用无水碳酸钾干燥[6]。
装配蒸馏装置。将干燥后的粗产物醚溶液过滤到小烧瓶中，用温水浴蒸去乙醚[7]，再在电热套上直接加热蒸出产品，收集137～141℃馏分，产量7～8g。本实验约需6h。
图制备2-甲基-2-己醇的装置图
五、结果与讨论
纯粹的2-甲基-2-己醇的沸点为143℃，折光率n D20为。测定所合成2-甲基-2-己醇的折光率，与文献数相比较。
本实验如果产率偏低原因是什么？你认为本实验成败的关键是什么？
【本实验成败的关键】
反应用的仪器与试剂是否彻底干燥和滴加速度的控制。
实验关键步骤：
1、严格按操作规程装配实验装置，电动搅拌棒必须垂直且转动顺畅。
2、Grignard试剂的制备所需仪器必须干燥。
3、反应的全过程应控制好滴加速度，使反应平稳进行。
4、干燥剂用量合理，且将产物醚溶液干燥完全。
仪器安装要点
在安装电动搅拌装置时应做到:
（1）搅拌器的轴与搅拌棒在同一直线上。
（2）先用手试验搅拌棒转动是否灵活,再以低转速开动搅拌器,试验运转情况。
（3）搅拌棒下端位于液面以下,以离烧杯底部3～5 mm为宜。
六、注意事项
1．严格按操作规程装配实验装置，电动搅拌棒必须垂直且转动顺畅。
2．Grignard试剂的制备所需仪器必须干燥。
3．反应的全过程应控制好滴加速度，使反应平稳进行。
4．干燥剂用量合理，且将产物醚溶液干燥完全。
七、参考资料
[1]如需替换，可用（12mL,）溴乙烷代替正溴丁烷，其余步骤相同，产物为2-甲基-2-丁醇。蒸馏收集95～105℃馏分，产量约5g。纯粹2-甲基-2-丁醇的沸点为102℃，折光率n D20为。
[2]本实验所用仪器及试剂必须充分干燥。正溴丁烷用无水氯化钙干燥并蒸馏纯化；丙醛用无水碳酸钾干燥，亦经蒸馏纯化。
所用仪器，在烘箱中烘干后，取出稍冷即放入干燥器中冷却。或将仪器取出后，在开口处用塞子塞紧，以防止在冷却过程中玻璃壁吸附空气中的水分。
[3]本实验的搅拌棒的密封可采用图的装置。若采用筒易密封装置，应用石蜡油润滑之。装置搅拌器时应注意：
①搅拌棒应保持垂直，其末端不要触及瓶底，最好距瓶底3～5mm。
②装好后应先用手旋动搅拌棒，试验装置无阻滞后，方可开动搅拌器。
[4]镁屑不宜采用长期放置的。可用镁带代替镁屑，使用前用细砂纸将其表面擦亮，剪成小段。
[5]为了使开始时溴乙烷局部浓度较大，易于发生反应，故搅拌应在反应开始后进行。若5min后反应仍不开始，可用温水浴温热，或在加热前加入一小粒碘来促使反应开始。
[6]2-甲基-2-己醇与水能形成共沸物，因此必须很好地干燥，否则前馏分将大大地增加。
[7]由于醚溶液体积较大，可采取分批过滤蒸去乙醚。
八、思考题
1．本实验在将Crignard试剂加成物水解前的各步中，为什么使用的药品仪器均须绝对干燥？为此你采取了什么措施？
2．如反应未开始前，加入大量正溴丁烷有什么不好？
3．本实验有哪些可能的副反应，如何避免？
4．为什么本实验得到的粗产物不能用无水氯化钙干燥？
5．用Grignard试剂法制备2-甲基-2-己醇，还可采取什么原料？写出反应式并对几种不同的路线加以比较。
DNA 甲基化重亚硫酸氢盐修饰法（DNA METHYLATION BISULFITE MODIFICATION） 实验操作原理及方法 一、实验目的： 通过本实验，可以检测特定DNA序列的甲基化状态。 二、实验原理： DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG 二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-m C）的一种化学反应。DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗传的修饰方式。 DNA 甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。DNA 甲基化引起基因转录抑制的机制可能主要有以下3 种：（1）DNA甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位置的结合。（2）序列特异性的甲基化DNA 结合蛋白与启动子区甲基化CpG 岛结合，募集一些蛋白，形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的转录。（3）DNA 甲基化通过改变染色质结构，抑制基因表达。 重亚硫酸氢盐修饰法检测DNA甲基化的基本原理是基于DNA变性后用重亚硫酸氢盐处理，可将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。此反应的步骤是：1、在C-6位点磺化胞嘧啶残基；2、在C-4处水解去氨基来产生尿嘧啶磺酸盐；3、在碱性条件下去硫酸化。在这个过程中，5-甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸氢盐进入到C-6位点而保持着未反应的状态。在重亚硫酸氢盐处理后，使用针对每个修饰后DNA链的引物进行PCR反应。在这个PCR产物中，每5-甲基胞嘧啶显示为胞嘧啶，而由未甲基化胞嘧啶转变成的尿嘧啶则在扩增过程中被胸腺嘧啶所取代。 BSP(bisulfate sequencing PCR) ：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行PCR扩增。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。
4、六亚甲基四胺（Hexamine） 4.1标识 别名: 乌洛托品、四氮六甲环，胺仿，环六亚甲基四胺，促进剂H，海克山明，Hexamethylene tetramine, Acceleralor H, Amino- form, Cystamin, Cystogen, Fermine, Hexamethylenamine, Methenamine Urotropine 分子式：(CH 2) 6 N 4 相对分子量：140.2 4.2危规分类及编号 按GB13690归类为第4类“易燃固体、自燃物品和遇湿易燃物品” 危规分类及编号：GB13690 4.1类“易燃固体” 危规号：41528 UN No. 1328；IMDG CODE 4150页，4.1类。 4.3规格、用途 规格：工业级（GB 9015-88）含量≥优等品99.3%，一等品99%，合格品98%。试剂级（GB 1400-78）含量≥分析纯99%，化学纯98%。 用途：用于医药、炸药、橡胶、塑料的促进剂和发泡剂。也用作纺织品的防缩剂和发泡剂，光的气体吸收剂。 4.4物化性质 无色或白色结晶或结晶性粉末，无臭，味甜而苦。在空气中吸水，有潮解性。相对密度1.27，加热至260～263℃即升华。易溶于水，水溶液呈碱性，溶于醇。不溶于汽油、丙酮。微溶于醚。与稀硝酸和乙酸反应能生成盐，与稀硫酸作用放出甲醛。。 4.5危险特性：遇明火有燃烧危险，接触皮肤稍有腐蚀性。 4.6应急措施 消防方法：用砂土、泡沫、二氧化碳灭火。 急救：应使患者移至有新鲜空气的场所休息并保暖；皮肤沾染用大量清水冲洗，严重者送医院诊治。 4.7储运须知 包装标志：易燃固体。 包装方法：（Ⅲ）类，麻袋、编制袋内衬塑料袋。
免疫组化实验步骤 细胞和组织的固定 （一）固定 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大 （二）固定剂 用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。 1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K 链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 1）4%多聚甲醛为我们常用固定剂 2）Bouin’s液 该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。 2．丙酮及醇类固定剂 系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。 以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记
DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。 第一步：试剂准备 （1）3 M NaOH原料（用前现配） 把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。 （2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配） 配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。 （3）溶解试剂Ⅰ（用前现配） 打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。试剂Ⅰ避光保存以免分解。为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。 （4）溶解试剂Ⅱ 打开前将试剂瓶加温至室温。将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。充分混合确保完全溶解。过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。 第二步：DNA修饰程序 1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中（10ng/μl），混匀。 注意：如果样本含有的DNA量不到1.0μg，就向样本DNA中加入2 μl DNA修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。再加入7.0μl 3M NaOH并混匀。 2、50℃ DNA孵育10分钟（加热块或水浴）
六亚甲基四胺化学品安 全技术说明书 Hessen was revised in January 2021
六亚甲基四胺化学品安全技术说明书 第一部分：化学品名称 化学品中文名称：,六亚甲基四胺? 化学品英文名称：,hexamethylenetetramine? 中文名称2：乌洛托品 英文名称2：Urotropine 技术说明书编码：484 CAS No.：100-97-0? 分子式： C 6H 12 N 4 分子量： 第二部分：成分/组成信息 有害物成分含量 CAS No. 六亚甲基四胺 100-97-0 第三部分：危险性概述 危险性类别： 侵入途径： 健康危害：生产条件下，主要引起皮炎和湿疹。皮疹多为多形性，奇痒，初起局限于接触部位，以后可蔓延，甚至遍及全身。 环境危害： 燃爆危险：本品易燃，具腐蚀性，可致人体灼伤，接触可引起皮炎，奇痒。 第四部分：急救措施 皮肤接触：脱去污染的衣着，用肥皂水和清水彻底冲洗皮肤。 眼睛接触：提起眼睑，用流动清水或生理盐水冲洗。就医。 吸入：迅速脱离现场至空气新鲜处。保持呼吸道通畅。如呼吸困难，给输氧。如呼吸停止，立即进行人工呼吸。就医。 食入：饮足量温水，催吐。就医。 第五部分：消防措施 危险特性：遇明火有引起燃烧的危险。受热分解放出有毒的氧化氮烟气。与氧化剂混合能形成爆炸性混合物。具有腐蚀性。 有害燃烧产物：一氧化碳、二氧化碳、氧化氮。 灭火方法：喷水冷却容器，可能的话将容器从火场移至空旷处。灭火剂：泡沫、二氧化碳、雾状水、砂土。
第六部分：泄漏应急处理 应急处理：隔离泄漏污染区，限制出入。切断火源。建议应急处理人员戴防尘面具（全面罩），穿防毒服。不要直接接触泄漏物。小量泄漏：用洁净的铲子收集于干燥、洁净、有盖的容器中。大量泄漏：用塑料布、帆布覆盖。使用无火花工具收集回收或运至废物处理场所处置。 第七部分：操作处置与储存 操作注意事项：密闭操作，局部排风。操作人员必须经过专门培训，严格遵守操作规程。建议操作人员佩戴自吸过滤式防尘口罩，戴化学安全防护眼镜，穿防毒物渗透工作服。远离火种、热源，工作场所严禁吸烟。使用防爆型的通风系统和设备。避免产生粉尘。避免与氧化剂、酸类接触。搬运时要轻装轻卸，防止包装及容器损坏。配备相应品种和数量的消防器材及泄漏应急处理设备。倒空的容器可能残留有害物。 储存注意事项：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。包装密封。应与氧化剂、酸类分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有合适的材料收容泄漏物。 第八部分：接触控制/个体防护 职业接触限值 中国MAC(mg/m3)：未制定标准 前苏联MAC(mg/m3)：未制定标准 TLVTN：未制定标准 TLVWN：未制定标准 监测方法： 工程控制：密闭操作，局部排风。 呼吸系统防护：粉尘浓度较高的环境中，佩戴自吸过滤式防尘口罩。必要时，建议佩戴自给式呼吸器。 眼睛防护：戴化学安全防护眼镜。 身体防护：穿防毒物渗透工作服。 手防护：戴一般作业防护手套。 其他防护：工作现场禁止吸烟、进食和饮水。工作完毕，淋浴更衣。注意个人清洁卫生。 第九部分：理化特性 主要成分：纯品 外观与性状：白色细粒状结晶，味初甜后苦。 pH： 熔点(℃)： 263(升华) 沸点(℃)：无资料 相对密度(水=1)：
免疫组化超详细步骤 Prepared on 22 November 2020
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理:应用基本原理——抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使的（、酶、、）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和），对其进行定位、定性及定量的研究，称为或. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液配成1000毫升溶液 应用液BNa2HPO4·配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A枸橼酸配成1000毫升溶液 应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝蒸馏水750毫升，碘酸钠，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras1:50-1:500 H-Ras1:50-1:500 K-Ras1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2切片脱蜡水化程序 ⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟； ⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟；（洗二甲苯） ⑶95%乙醇3分钟； ⑷85%乙醇3分钟； 3自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。 4组织修复采用高温高压法：压力锅中加入，抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。 5停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。 6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂 3%H2O2，室温放置4分钟。（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。
Ensembl data bank 甲基化测序BSP法的那个黑白点状图（黑表示甲基化、白点表示非甲基化）是怎么做出来的呀上 用BiQ ANALYZER软件，免费的可以下载，安装需要最新的java程序 ，关于后续的一些步骤，我看了一篇国内的硕士论文，如下： 2.2.1.4.6连接反应产物的转化 (l)每个连接反应准备1个含有氨节青霉素的LB平板，涂板前半小时将平板从冰箱 中取出平衡至室温。 (2)离心使连接反应内容物汇集到管底，吸取10ul连接反应产物加到置于冰上的 1.5ml离心管中. (3)将冻存的JM109高效率感受态细胞从一70℃冰箱中取出，放置在冰浴直至融化 (大概5分钟)，轻轻振动离心管使之混匀。 (4)向步骤2准备的每个转化管中加入50ul感受态细胞。 (5)轻轻振动小管混匀，冰浴30分钟。 (6)在精确的42℃水浴中热击45一50秒(不要振动)。 (7)迅速将管子移到冰浴中，使细胞冷却2分钟。 (8)每管连接反应转化细胞中加入平衡至室温的200ulLB培养基， (9)在37℃振荡培养(150rpm)1小时。 (10)将每个转化培养基200ul涂到LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板上。 (11)将平板于37℃恒温箱中过夜培养(16一24小时)。 2.2.L4.7阳性克隆筛选 从培养箱中取出平板，置于4℃冰箱使蓝色充分显现。挑取白斑菌落到5mLB培 基，37℃摇床上培养过夜。吸取lml菌液送测序，引物为通用引物M13。 进入丁香园，是从做MSP开始的。从对DNA甲基化的一无所知到MSP实验成功，经历了很多艰难，同时也收获得了不少经验。从丁香园的帖子可以看出，近几年来，国内对DNA 甲基化的研究在逐年增加，战友们在实验中遇到的困难也不少。在这里谈一下对MSP,及BSP的一点体会，希望能对新手们有所帮助，也请老手们批评补充。 亚硫酸氢盐转化和PCR扩增是MSP,BSP的两个基本步骤。亚硫酸氢盐转化，估计现在做手工修饰的也不多了，试剂盒能够很方便的帮我们解决问题。但PCR中的引物设计，现在可能还是个难题。看到很多帖子里提到的引物都是来源于文献的，但事实上在很多情况下，我们是没法找到现存引物的，因此掌握BSP,MSP引物的设计就显得非常必要了。 BSP，MSP引物设计的一个最大问题在于亚硫酸氢盐的转化使得模板的序列复杂性大大降低，而且经常产生T或G或者富含GC片段交替出现的序列。这个会使引物选择变得困难。因此，往往我们需要设计巢式引物来解决这个问题。BSP,MSP引物的设计，除了要遵循引物设计的基本原则外，还要注意一下一些规则：
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰测序法） 基本原理在于：样本经亚硫氢酸盐处理后,甲基化的胞嘧啶（C）保持不变,但非甲基化的胞嘧啶被转化成脲嘧啶,因此在利用该处理产物作为模板的PCR产物中,甲基化的胞嘧啶还是胞嘧啶,但非甲基化胞嘧啶变成了脲嘧啶（胸腺嘧啶）,此时检测到的胞嘧啶（C）即是样品中本身的甲基化位点. 第一部分基因组DNA的提取。 DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。 此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。 使用两者的细节： 1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml； 2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。 验证提取DNA的纯度的方法有二： 1：紫外分光光度计计算OD比值； 2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。 我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。 第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。 1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul； 2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； 3：42℃水浴30min； 水浴期间配制： 4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色） 5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。 6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。 8：50℃避光水浴16h。 一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。 这一步细节： 1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。
六亚甲基四胺 第一部分：化学品及企业标识 化学品中文名称六亚甲基四胺化学品英文名称hexamethylenetetramine 中文名称2 乌洛托品英文名称2 Urotropine 分子式C6H12N4分子量140.18 第二部分：成分/组成信息 有害物成分含量CAS No 六亚甲基四胺100-97-0 第三部分：危险性概述 危险性类别第4.1类易燃固体 侵入途径吸入、食入 健康危害生产条件下，主要引起皮炎和湿疹。皮疹多为多形性，奇痒，初起局限于接触部位，以后可蔓延，甚至遍及全身。 环境危害对环境有害。 燃爆危险本品易燃，其粉末与空气混合，能形成爆炸性混合物。 第四部分：急救措施 皮肤接触脱去污染的衣着，用肥皂水和清水彻底冲洗皮肤。 眼睛接触提起眼睑，用流动清水或生理盐水冲洗。就医。 吸入迅速脱离现场至空气新鲜处。保持呼吸道通畅。如呼吸困难，给输氧。如呼吸停止，立即进行人工呼吸。就医。 食入饮足量温水，催吐。就医。 第五部分：消防措施 危险特性遇明火有引起燃烧的危险。受热分解放出有毒的氧化氮烟气。与氧化剂混合能形成爆炸性混合物。具有腐蚀性。 有害燃烧产 物 一氧化碳、二氧化碳、氧化氮。 灭火方法用泡沫、二氧化碳、雾状水、砂土灭火。 灭火注意事项及措施消防人员必须穿全身耐酸碱消防服、佩戴空气呼吸器灭火。尽可能将容器从火场移至空旷处。喷水保持火场容器冷却，直至灭火结束。 第六部分：泄漏应急处理 应急行动隔离泄漏污染区，限制出入。切断火源。建议应急处理人员戴防尘面具（全面罩），穿防毒服。不要直接接触泄漏物。小量泄漏：用洁净的铲子收集于干燥、洁净、有盖的容器中。大量泄漏：用塑料布、帆布覆盖。使用无火花工具收集回收或运至废物处理场所处置。 第七部分：操作处置与储存 操作注意事 项密闭操作，局部排风。操作人员必须经过专门培训，严格遵守操作规程。建议操作人员佩戴自吸过滤式防尘口罩，戴化学安全防护眼镜，穿防毒物渗透工作服。远离火种、热源，工作场所严禁吸烟。使用防爆型的通风系统和设备。避免产生粉尘。避免与氧化剂、酸类接触。搬运时要轻装轻卸，防止包装及容器损坏。配备相应品种和数量的消防器材及泄漏应急处理设备。倒空的容器可能残留有害物。 储存注意事 项储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。包装密封。应与氧化剂、酸类分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有合适的材料收容泄漏物。
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理: 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB 显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、0.05%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液A NaH2PO4 38.4g配成1000毫升溶液 应用液B Na2HPO4·12H2O 114.8g配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加8.5gNaCl。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A 枸橼酸 10.55g配成1000毫升溶液 应用液B 柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠） 29.01g 配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝17.6g蒸馏水750毫升，碘酸钠0.2g，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras 1:50-1:500 H-Ras 1:50-1:500 K-Ras 1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2 切片脱蜡水化程序
PCR 扩增的原理和步骤 聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技术是20世纪80年代中期发 展起来的一项基因检测即一种体外核酸扩增技术。它具有许多优点：特异性、易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医学领域具有划时代的意义。但是，传统PCR技术有它的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方法进行了许多探索研究，直到1996 年由美国Applied Biosystems公司推出了一种新的定量试验技术—荧光定量PCR(F lurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR；real-time quantitati ve PCR,RT-qPCR or qPCR)，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记 跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计 算待测样品模板的初始浓度，实现了PCR 从定性到定量质的跨越，具有里程碑 意义。目前，此项技术已应用于干细胞研究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检 测和传染病研究、药物分析、药物基因组学、植物学研究和农业生物科技等多领 域研究中。本文对实时荧光定量PCR 的原理、分类和应用进行阐述。 一、实时荧光定量PCR技术的原理 real-time quantitative PCR 技术是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，通过 荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中有2个概念比较重要。(1)荧光域值(t hreshold)的设定： PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15 个循环的荧光信号标准偏差的10 倍。(2)Ct 值：C 代表Cycle，t 代表 threshold，Ct 值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值 时所经历的循环数。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。一般来说，整条曲线可以分3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号与背景无法区分，无法判断产物量的变化。在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，所以反应终产物量与起始模板量之间已 经不存在线性关系，通过反应终产物也算不出起始DNA 拷贝数。只有在荧光产
免疫组化入门实验操作 一、实验目的： 1.了解免疫组化基本原理。 2.了解免疫组化实验操作及注意事项。 3.免疫组化结果判定。 通过实验，让学生熟悉免疫组化操作流程及注意事项，对抗原抗体结合、抗原修复和酶催化底物显色进行研究。要求学生通过查阅文献，在归纳、对比、总结的基础上对免疫组化有进一步的了解。 二、实验原理： 三、实验材料： 一抗：CD5、CK8、Ki67 二抗：MaxVision3 其它：柠檬酸抗原修复液、过氧化物酶阻断剂、PBS缓冲液、DAB、孵育盒、染色架、苏木素、盖玻片、冲洗瓶、中性树胶，孵育盒。 四、实验步骤：
1.脱蜡水化 二甲苯5min，二甲苯5min，二甲苯5min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，95%酒精2min，85%酒精2min，自来水冲洗。 2.抗原修复 高压锅中加入1200mL柠檬酸修复液，电磁炉煮沸后放入切片，扣紧锅盖，功率调至800W，至压力阀均匀喷气后计时 1.5min，移开高压锅室温冷却10min，自来水冷却。 3.过氧化物酶阻断 修复结束后，流水冲洗干净，除去自来水，在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈或用纸巾擦干组织外残留的液体，滴加50 μL（一滴）过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min，PBS冲洗3×3min。 4.一抗 甩去PBS，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）相应一抗，室温下孵育60分钟，PBS冲洗3×3min。 5.二抗 甩去PBS，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）MaxVisionTM试剂，室温下孵育30分钟，PBS冲洗3×3min。 6.DAB 甩去PBS液，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）新鲜配制的DAB，显色5分钟，自来水冲洗。 7.苏木素复染 每张切片滴加50 μL（一滴）苏木素，20-30秒后自来水冲洗30s以上，或浸泡于PBS中30s以上再自来水冲洗。 8.封片 梯度酒精脱水干燥（85%酒精2min，95%酒精2min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，二甲苯1min），或直接电吹风吹干，中性树胶封固。
操作过程 在1000mL带有搅拌的高压釜内加入3,3’-二氯联苯胺盐酸盐32.5g，氯化亚铜1g，铜粉0.3g，七水合硫酸亚铁2g，碳酸铵0.3g，28%的氨水155mL，密闭高压釜，通入氮气置换三次。向釜内通入约22g液氨，升温于200～210℃，控制釜内压力为4～5Mpa(s)，搅拌反应18小时，反应结束后，冷至室温，打开高压釜，加入10g九水合硫化钠，密闭高压釜，升温至120℃保温1小时，降至室温，向其中加入约42mL浓盐酸调PH=2，过滤出少量沉淀，滤液减压浓缩至结晶析出，加入100mL浓盐酸，冷冻结晶，过滤，烘干得产品约40g，紫白色的固体，收率：90% 3-amino-2-methyl-4-(methylsulfonyl)benzoic acid 分子式C9H11NO4S摩尔质量229.25合成反应式 操作过程 在1000mL带有搅拌的高压釜内加入93.76g的原料，氯化亚铜1g，氧化亚铜1g，28%的氨水500mL，密闭高压釜，升温于180℃，搅拌反应18小时，反应结束后，冷至室温，打开高压釜，将溶液减压浓缩干，残余物经稀盐酸酸化到酸性，加入乙酸乙酯萃取，干燥，减压浓缩干，加入正己烷过滤出固体，烘干得产品约50g，浅褐色的固体，熔点：197-198℃，收率：68% 其它反应 参考文献
参考文献 [1]Jack(Jianhua)Cao unpublished result [2]Chand,Pooran;Kotian,Pravin L.;Morris,Philip E.;Bantia,Shanta;Walsh,David A.; Babu,Yarlagadda S.;Bioorganic&Medicinal chemistry,13(7),2005,2665-2678 2．1．8用六亚甲基四胺（乌络托品）制备 (4-bromophenyl)methanamine 分子式C7H8BrN摩尔质量186.05合成反应式 操作过程 向500mL反应瓶内加入15.4g乌络托品和120mL的氯仿，油浴升温于50℃，开始滴加25g的对溴溴苄，搅拌反应24小时后，反应结束后，冷至室温，过滤，得中间体，将中间体加入250mL反应瓶内，搅拌下加入73mL的浓盐酸，升温回流并蒸出，收集馏出物，向其中加入约50mL的40%氢氧化钠水溶液，分出油层，水层用THF 萃取，合并干燥，减压浓缩干，得产品约15.8g，黄色的油状物，收率：85% 2．1．9二苄基胺为胺化试剂 N,N-dibenzyl-2-chloro-5H-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-4-amine 分子式C20H17ClN4摩尔质量348.83 合成反应式 操作过程
免疫组化 一，免疫组织化学简介 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。 二，免疫组化技术的基本原理 免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。 免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。 三，免疫组化步骤 1，切片，烤片60℃，1h； 2，脱蜡及复水 二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min； 3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min； 4，微波修复 将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次； 5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；
甲基化整体研究思路 DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA 甲基化转移酶（DNMTs）的作用下的CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因重新活化和表达。研究这种DNA修饰方式在不改变基因序列的前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA甲基化状态与生长发育调控及生理状态密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则程高度的甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。 原核生物中甲基化多发生在CCA/TGG和GATC序列；真核生物中DNA甲基化一般发生在CpG位点上；哺乳动物DNA甲基化只发生在CpG岛的胞嘧啶，植物甲基化发生在CpG和CpNpG。甲基化会使胞嘧啶转为5-甲基胞嘧啶，CpG位点在基因组是不常见的，主要密集于接近基因启动子的位置，统称为CpG岛。CpG位点的甲基化可以对基因表现有重要的影响。 哺乳动物中，CpG序列在基因组中出现的频率仅有1%，远低于的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上即所谓的CpG岛。通常，CpG岛大约含有500多个碱基，位于基因的启动子区或第一个外显子区。在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛，而且只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化。 甲基化研究思路：
1. 寻找甲基化位点 1) 甲基化二代测序寻找甲基化位点； 2) 对照组和实验组进行甲基化芯片检测，找到相关的甲基化位点； 3) 一些相关研究显示某些基因存在表达量降低的现象，可预测该基因是否存在CpG岛； 4) 根据文献寻找相关基因的甲基化位点。 2. 验证甲基化位点，并进行甲基化程度分析 采用对照组和实验组样本进行甲基化验证。 1) MSP方法：可进行特定位点甲基化验证，适用于甲基化芯片后的结果，无法进行甲基化程度分析； 2) BSP克隆测序法：验证某些相关基因的甲基化位点，并计算出精确的甲基化程度百分比； 3) HRM法：适用于大批量样本甲基化验证，并能计算出甲基化程度范围； 4）焦磷酸测序法：验证某些相关基因的甲基化位点，并计算出精确的甲基化程度百分比。 3. 分析甲基化位点与研究的相关性 根据对照组和实验组样本的检测结果，分析与研究的相关性。 1) 比较对照组和实验组相同甲基化位点甲基化是否有差异； 2) 比对对照组合实验组相同基因启动子区甲基化程度是否有差异； 4. 验证启动子发生甲基化的基因的表达量变化 采用荧光定量PCR的方法检测相关基因的表达量，如果表达量降低，可能由于启动子区发生甲基化导致的，从而影响该基因所在的某些通路，导致一些疾病，或表型发生变化；如果没有发生变化，可能由于发生甲基化的区域与转录因子之间关联不是很密切，从而不会影响基因的表达。 除了以上4个基础方向外，还有两个特殊方向： 1.省钱思路：老数据二次挖掘 第一步：先从原有的表达谱芯片数据或转录组数据中，挖掘到差异表达的甲基化酶； 第二步：对挖掘到的甲基化酶如METTL3或FTO等进行qPCR验证，并进行m6A-seq分析哪些基因甲基化水平发生改变； 第三步：在细胞或动物模型中对这些基因进行敲低和过表达，qPCR和WB检测基因表达情况，并用LC-MS/MS法检测RNA整体m6A水平； 第四步：继续对这些敲低和过表达的细胞进行转录组测序/小RNA测序或表达谱芯片/小RNA 芯片，分析哪些基因出现差异表达变化和可变剪切变化； 第五步：找到甲基化酶调控的靶基因，进行敲低和过表达，看甲基化酶缺陷的细胞或动物模型表型能否补救； 第六步：在确定上一步靶基因确实受到甲基化酶调控后，对靶基因上的motif进行点突变后进行验证； 第七步：鉴定新型的甲基化酶（可选）。
免疫组化实验步骤 Revised final draft November 26, 2020
石蜡切片免疫组化实验步骤 石蜡切片步骤按照晓峰整理的步骤进行（From徐晓峰、朱老师的“石蜡切片”方案）： 1）材料的准备 在本实验室条件下推荐使用FAA（50%ethanol,5%aceticacid,3.7%甲醛）固定材料。 FAA固定液（100ml），室温保存： 无水乙醇50ml 冰醋酸5ml 37%甲醛10ml 水35ml 第一天：组织固定 用FAA固定，详见“石蜡切片”protocol。 第二天：脱水 以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇。 *组织可在70%ethanol4℃可存放几个月 第三天：进一步脱水和浸蜡 以下所有步骤在4℃进行并不时轻摇
以下所有步骤在室温进行并不时轻摇 准备工作：60℃预热plus蜡片（ParaplastPlus）石蜡可反复融凝而去气泡 第四天：浸蜡2 将材料置于42℃直至蜡块完全熔化。再加1/4体积的蜡块至完全熔化后移至60℃。几个小时后换上新鲜熔好的蜡液，过夜。 第五天：浸蜡3 换蜡两次（ParaplastPlus） 第六天：浸蜡4 换蜡两次（ParaplastPlus） 第七天：浸蜡5 换蜡两次（ParaplastPlus） 准备工作：60℃预热Regular蜡片（ParaplastRegular）
第八天：包埋（包埋块可长久保存） 第九天及之后： 开始切片，切片应包括自己的片子及正负对照等。事先打开烘片机至37度，在涂有多聚赖氨酸的玻片上加1~2ml的蒸馏水。切好的片子轻至于加水的玻片上。待所有片子准备完之后盖上盖子，烘片过夜。 用自来水及双蒸水清洗免疫组化专用塑料，放在烘箱烘干待用。 第二天：开始脱蜡（From徐晓峰、朱老师整理的“石蜡切片”protocol） （用新买来的免疫组化塑料小盒，每一步只需加入试剂220~250毫升） 抗原修复： 在切片还浸入酒精时，可以事先将煮锅清洗干净，用蒸馏水洗1~2遍，最后加入0.01M柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)，煮沸(保持在95度左右)，将过完PBS的片子让入煮沸的锅中，煮片10~15min。然后将电磁炉关闭，自然冷却锅中切片（千万不要把片子拿出来，放在缓冲液中一起自然冷却至室温！！！） 将片子浸入PBS（PH=7.4）5min。
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法） 第一部分基因组DNA的提取。 这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA 应该是完整的。 此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。 使用两者的细节： 1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml； 2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。验证提取DNA的纯度的方法有二： 1：紫外分光光度计计算OD比值； 2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。 我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。 第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。 1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul； 2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； 3：42℃水浴30min； 水浴期间配制： 4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色） 5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。 8：50℃避光水浴16h。 一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。 这一步细节： 1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。 2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。 3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。