预热１０ｍｉｎ，然后加适当稀释的酶液０．５ｍＬ，反应５ｍｉｎ后，用５ｍＬ０．１
ｍｏｌ／１Ｈ２ｓ０４终止反应．取０．５ｍＬ反应液与５ｍＬＴ作碘液显色，在６２０ｎｉｎ处测光密度．以０．５ｍＬ水代替０．５ｍＬ反应液为空白，以不加酶液（加相同的水）的管为对照酶活力根据下式计算：
酶活力（ｕ／ｍＬ）＝（Ｒｏ—Ｒ）／Ｒｏｘ５０×Ｄ
式中‰，Ｒ分别表示对照和反应液的光密度，Ｄ为酶的稀释倍数．调整Ｄ使（Ｒｏ－Ｒ）／凡在０．２－０．７Ｚ间。
酶活力单位定义：在４０℃，５ｍｉＩｌ内水解ｌｍｇ淀粉（０．５％淀粉）的酶量为一个活力单位。
３结果
３．１初筛结果
从淀粉筛选平板上，挑出有明显淀粉水解圈的菌株共２００余株。
图１—１菌株Ｌｌ在筛选平板上产生的淀粉水解透明圈照片其中Ｘ１，Ｘ９，Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４，ｚ菌落周围有明显的透明圈，
０
生物化学学号： 淀粉酶酶学性质的研究 学生姓名：#### 指导教师：##### 所在院系：生命科学学院 所学专业：####### 学号：##### #### 大学 中国·哈尔滨 2011 年12 月
摘要： 酶是酶是一种生物催化剂，它具有催化剂属性，同是也具有一些无机催化剂所不具有的特性。催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。本实验通过利用淀粉酶水解还原糖，还原糖能使3，5-二硝基水杨酸还原，生成棕色的3-氨基-5硝基水杨酸。淀粉酶活力与还原糖的量成正比，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位质量样品在一定时间内生成还原糖的量表示酶活力。酶的活性又同时受到温度、PH、激活剂抑制剂等的影响。 关键词： 淀粉酶活力温度 PH 激活剂和抑制剂 前言： 淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。淀粉酶的种类很多，根据织物不同，设备组合不同，工艺流程也不同，目前所用的退浆方法有浸渍法、堆置法、卷染法、连续洗等，由于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少，可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜明的环保特色。 此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子和激活因子，也有部分淀粉酶为非Ca2+依赖型。淀粉酶既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地随机切断糖链内部的α－1，4-链。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以葡萄糖为主，此外，还有少量麦芽三糖及麦芽糖，其中真菌a-淀粉酶水解淀粉的终产物主要以麦芽糖为主且不含大分子极限糊精，在烘焙业和麦芽糖制造业具有广泛的应用。另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精（又称α-糊精）。一般分解限度以葡萄糖为准是35-50%，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70%分解限度的（最终游离出葡萄糖）。 通过研究淀粉酶的性质，能使我们更好的了解它，并充分利用于工业生产、食品加工、医疗等产业。
碱性蛋白酶是在碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，一般最适pH值为9~11，属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，主要用于加酶洗涤剂中，在制革、纺织、医药、化妆品等的生产中也有广泛的应用[1]。目前，全世界所生产的酶中碱性蛋白酶占到总产量的30%左右，显示出良好的使用性能和经济价值。 碱性蛋白酶广泛存在于细菌、放线菌和真菌中，其中以芽孢杆菌属的碱性蛋白酶研究的最深入。本实验从山东东营的盐碱地采集土样，从中分离出若干株产碱性蛋白酶的菌株，并对其进行16S rRNA分子鉴定以及酶学性质的初步研究，以期为工业应用提供基础理论依据。 1材料与方法 1.1土样来源 山东东营盐碱地中采集土样。 1.2培养基 富集培养基：牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、NaCl0.5g、水 产碱性蛋白酶菌株的筛选、分子鉴定及其酶学性质的初步研究 成堃，路福平*，李玉，王盛楠，王建玲 （天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院，天津300457） 摘要：从盐碱地土壤中筛选到5株产碱性蛋白酶的细菌，分别命名为TCCC11001、TCCC11004、TCCC11013、TCCC11024、TC-CC11029。将其革兰氏染色、16S rRNA鉴定为Bacillus subtilis、Bacillus alcalophilus、Bacillus pumilus、Bacillus subtilis、Bacillus licheni-formis。将菌株接入发酵培养基中，37℃、180r/min摇床培养48h，发酵液进行不同处理后Folin法测定酶活。结果发现：TCCC11001、TCCC11029的最适作用温度为40℃，TCCC11004、TCCC11013、TCCC11024的最适作用温度为50℃；TCCC11001、TCCC11004、TC-CC11013、TCCC11024、TCCC11029的最适作用pH值分别为10.0、11.0、10.0、9.0、11.0；TCCC11004、TCCC11013于40℃保温2h，残留酶活为最高酶活70%；TCCC11001、TCCC11024、TCCC11029的残留酶活＜50%。DFP、PMSF完全抑制酶的活性，表明5种蛋白酶是典型的丝氨酸蛋白酶。 关键词：碱性蛋白酶；芽孢杆菌；分子鉴定；热稳定性 中图分类号：Q93-331；Q55文献标识码：A文章编号：0254－5071（2009）02-0033-04 Screening,molecular classification of alkaline protease-producing strains and enzyme characteristics CHENG Kun,LU Fuping*,LI Yu,WANG Shengnan,WANG Jianling (Tianjin Key Lab of Industrial Microbiology,College of Bioengineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin300457,China) Abstract：5strains which could produce alkaline protease were isolated from soil and named TCCC11001,TCCC11004,TCCC11013,TCCC11024 and TCCC11029.They were regarded as Bacillus subtilis,Bacillus alcalophilus,Bacillus pumilus,Bacillus subtilis,Bacillus licheniformis after deter-mination of16s rRNA and Gram staining.Enzyme activities were determined after incubating these strains at37℃,180r/min for48h.The results showed the optimal temperature of TCCC11001and TCCC11029was40℃,and for the others,the temperature was50℃;the optimal pH of these five strains were10.0,11.0,10.0,9.0and11.0respectively.Residual enzyme activities of TCCC11004and TCCC11013were as much as70%com-pared to the maximum activity when incubated at40℃for2h,and residual enzyme activities of TCCC11001,TCCC11024,TCCC11029were less than50%.The enzyme activity could be completely inhibited by DFP and PMSF,and it showed that these five proteases were typical serine protease. Key words:alkaline protease;Bacillus;molecular determination;thermostability 收稿日期：2008-10-23 基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）资助项目（2007AA02Z212）；国家科技基础条件平台项目（2005DKA21204-10） 作者简介：成堃（1982-），女，山东济南人，博士研究生，研究方向为发酵工程；路福平*，教授，通讯作者。 [13]TAKAHASHI M,SEKINE T,UBA N,et al.The production of recom- binant APRP,an alkaline protease derived from Bacillus pumilus TY-O-67,by in vitro refolding of Pro-enzyme Fixed on a solid surface[J].J Biochem，2004，136（4）：549-556. [14]WONG S L,CHESTER W.The subtilisin E gene of Bacillus subtilis is transcribed from aσ38Promoter in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA，1984，81：1184-1188. [15]CHANG C T,FAN M H,KUO F C.Potent fibrinolytic enzyme from a mutant of Bacillus subtilis IMR-NK1[J].J Agr Food Chem，2000，48（8）：3210-3216.[16]SEO,J H,LEE S P.Production of Fibrinolytic enzyme from soybean Grits fermented by Bacillus firmus NA-1[J].J Med Food，2004，7（4）：442-449. [17]KIM H K,KIM G T,KIM D K,et al.Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus sp.KA38originated from fermented fish[J].J Ferment Bioeng，1997，84：307-312. [18]PENG Y,HUANG Q,ZHANG R H,et al.Purification and characteriza- tion of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4screened from dou-chi,a traditional Chinese soybean food[J]. Comp Biochem Phy B，2003，134：45-52. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
1.6 酶学性质研究 （1）pH 的影响：分别测定粗酶液在pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0下的酶活力，确定其最适反应pH 值；将粗酶液用上述pH 缓冲液稀释后，45℃水浴保温4小时后，测定其剩余酶活力。 （2）温度的影响：分别在40~95℃下测定酶活力，确定其最适反应温度；将酶液在40～90℃范围内的不同温度下保温60 min 后，测定其剩余酶活力。 （3）金属离子的影响：在酶液中分别添加各种金属离子，使其浓度为4 mmol ／L ，然后测定酶活力。 2.5 纤维素酶粗酶液酶学性质 2.5.1酶反应的最适pH 值和酶的pH 稳定性 粗酶液在不同pH 值下测得的酶活及在不同pH 值下处理4小时后测得的相对酶活示于图11。结果表明，CMCase 在pH 3.5～4.5有较高的酶活力，最适反应pH 值为4.0；β-Gluase 在pH 4.5～5.5酶活力较高，最适反应pH 值为5.0，同样方法测得FPA 最适反应pH 为5.0。可见，该菌株所产的各组分纤维素酶是酸性酶。 图11表明，该菌产CMCase 在pH3.0～6.0的范围内，β-Gluase 在pH3.5～5.5的范围内，酶活力均可保持在80％以上，说明该菌株所产酸性纤维素酶可在较宽的pH 值范围内保持其酶活力的稳定性。2.5.2 酶反应的最适温度和酶的热稳定性 在不同温度下直接进行酶促反应测得的酶活及在不同温度下热处理60 min 后于最适反应温度和最适pH 下测得的相对酶活(以4℃保存的酶液活力为100%)示于图12。结果表明，CMCase 、β-Gluase 及FPA 最适反应温度均为65℃。 c e l l u l a s e a c t i v i t y ( U .m l -1) pH r e l a t i v e y a c t i v i t y （%） c e l l u l a s e a c t i v i t y ( U .m l -1) temperature ( o C ) r e l a t i v e y a c t i v i t y （%） 图11 pH 值对酶活力及酶稳定性的影响 Fig.10 Effects of pH value on Cellulase activity and stability 图12 温度对酶活力及酶稳定性的影响 Fig.11 Effects of temperature on activity and stability of cellulase
第33卷第2期2014年 4月 大豆科学SOYBEAN SCIENCE Vol．33No．2Apr． 2014 大豆根瘤菌剂载体的选择及最佳施用浓度筛选 刘庆莉1，王金生1，刘丽君1，林蔚刚1，王红蕾2，张俐俐3，吴俊江 1 （1．黑龙江省农业科学院大豆研究所，黑龙江哈尔滨150086；2．黑龙江省农业科学院信息中心，黑龙江哈尔滨150086；3．黑龙江省农业科学院，黑龙江哈尔滨150086） 摘要：为筛选出适宜根瘤菌吸附且能促进大豆生长、提高产量的优质载体，并且在优质载体的条件下，筛选出大豆 根瘤菌液的最佳使用浓度，通过3种载体吸附不同浓度根瘤菌液拌种大豆盆栽播种后，对大豆的生物量、结瘤及产量的对比发现：不同载体介入、大豆接入根瘤菌后均对大豆的生物量及结瘤产生一定的促进作用。根瘤菌以草炭和蛭石为载体，更有利于促使大豆植株生长，积累更多的干物质；草炭的促进结瘤作用持续效果时间较长，液体的持续效果时间最短，而蛭石的持续效果时间相对比较居中；以草炭和蛭石作为根瘤菌载体，低浓度的根瘤菌液接入更能发挥其提高产量的作用，以液体作为根瘤菌载体，根瘤菌接入浓度较高才能发挥其提高产量的作用。结合生产成本来看， 草炭土更适宜作为自主研发根瘤菌剂的载体，同时推荐根瘤菌使用浓度为1．4?108 菌细胞 ·mL －1。关键词：大豆根瘤菌；结瘤；载体 中图分类号：S565．1文献标识码：A 文章编号：1000- 9841（2014）02-0207-04收稿日期：2013-10-11基金项目：国家“十二五”科技支撑计划（2012BAD14B06）；现代农业产业技术体系（CAＲS-004）；黑龙江省自然科学基金（C201104）；哈尔滨市科技创新人才研究专项资金（2013ＲFXYJ043）。 第一作者简介：刘庆莉（1971-），女，技师，主要从事大豆耕作与栽培研究。E-mail ：liuqingli1971@126．com 。通讯作者：吴俊江（1970-），男，博士， 研究员，主要从事大豆耕作与栽培研究。E-mail ：nkywujj@163．com 。Chosen of Soybean Ｒhizobia Carrier and Screening of the Best Concentration LIU Qing-li 1，WANG Jin-sheng 1，LIU Li-jun 1，LIN Wei-gang 1，WANG Hong-lei 2，ZHANG Li-li 3，WU Jun-jiang 1 （1．Soybean Ｒesearch Institute ，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，China ；2．Information Center of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，China ；3．Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，China ） Abstract ：In order to screen the carrier that was more appropriate for the absorption of rhizobia ，improving yield and quality of inoculated soybean ，and screen the best soybean rhizobia bacterial concentration at levels of quality carrier ，three carriers ab-sorbed different soybean rhizobia bacterial concentration with seed dressing were performed according to the biomass ，nodular rate and yields of soybean plant by soil pot experiments．The results showed that different carriers and inoculating soybean rhi-zobia could improve the biomass and nodular rate of soybean plant．Peat and vermiculite were used as carriers of rhizobia could remarkably promote the growth of soybean plant and enhance dry matter accumulation ；thus the lasting effect of nodular was the longest ，followed by vermiculite and liquid．Low level bacterial concentration could remarkably increased soybean yield and quality with peat and vermiculite as carriers ，however the opposite when used liquid as carriers．In conclusion ，in view of the cost ，peat was more appropriate for soybean rhizobia ，and the best bacterial concentration was 1．4?108 cells ·mL －1．Key words ：Soybean rhizobia ；Nodulation ；Carrier 施用根瘤菌菌剂能促进大豆结瘤， 有效提高豆科植物的产量，减少生产中的化肥使用量，降低生产成本，而且可以提高土壤肥力，同时，由于根瘤菌剂耐污染能力强［1］ ，还可以减少因长期使用化肥对 环境的破坏 ［2-3］ ，对无公害大豆生产以及降低农民 投人， 保护环境等具有十分重要的作用［4-5］ 。因此 引起了人们的极大兴趣和广泛关注，已成为豆科植 物增产的主要研究方向。 近年来随着新技术特别是分子生物学技术的发展，各种高效菌种不断被选育或改造，制备菌剂的工艺、保藏菌剂的方法也不断完善和发展，配制成的菌剂的效果越来越好，在农业生产中得到了广泛利用。与此同时，诸如发酵水平低、保质期短和 技术不成熟、质量不过关等问题限制了根瘤菌剂的产业化和大面积推广应用。其中，菌种质量的高低一直是影响其应用效果的一个突出问题；载体也是大豆根瘤菌肥料质量控制的一个关键因素 ［6］ 。作 为根瘤菌的载体很多， 如草炭、蛭石、珍珠岩、煤炭、草炭、膨润土和高岭土等。草炭、蛭石由于其营养与pH 适中，表面积比较大和吸附性好，有利于根瘤菌的存活及菌剂保存，是理想的载体 ［7-9］ 。另外，草 炭和蛭石等资源丰富，价格低廉，适合于在根瘤菌剂生产中应用推广，已成为当代根瘤菌类肥料的主要类型。 本文的研究目的是筛选出适宜根瘤菌吸附且接种大豆能促进大豆生长、提高产量的优质载体，
实验四酶学性质研究 一、实验目的 1、了解pH、温度、金属离子对酶的活性的影响机理； 2、掌握如何选择酶催化反应的最适pH、温度和获得最适pH条件的确定、以及Km常数的测定。 二、实验原理 酶促反应速度受介质pH的影响，一种酶在几种pH介质中测其活力，可看到在某一pH时酶促效率最高，这个pH称为该酶的最适pH。pH影响酶分子的活性部位的解离，另外，也影响底物的解离状态，从而影响酶活性中心的结合与底物或催化。其次，有关基团解离状态的改变影响酶的空间构象，甚至会使酶变性。酶的最适pH不是酶的特征性常数，如缓冲液的种类与浓度，底物浓度等均可改变酶作用的最适pH。 在一定温度范围内，酶促反应速率随温度的升高而加快；但当温度高到一定限度时，酶促反应速率不仅不再加快反而随着温度的升高而下降，最终，酶因高温变性失去活性，失去了催化能力。在一定条件下，每一种酶在某一温度时活力最大，这个温度称为这种酶的最适温度 在进行酶学研究时一般都要制作一条pH与酶活性的关系曲线，即保持其他条件恒定，在不同pH条件下测定酶促反应速度，以pH值为横坐标，反应速度为纵坐标作图。由此曲线，不仅可以了解反应速度随pH值变化的情况，而且可以求得酶的最适pH。最适温度的实验方法和pH类似。 酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数K m值等于酶促反应速度为最大速度一般时所对应的底物浓度，其值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。不同酶的K m值不同，同一种酶与不同的底物反应
时，其Km值也不同，Km值反映了酶和底物亲和力的强弱程度，Km值越大，表明酶和底物的亲和力越弱；Km值越小，表明酶与底物的亲和力越强。 酶的活力就是酶所催活的反应速度，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间的关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。所以，为了准确表示酶的反应速度必须采用初速度，即保持恒定时的速度。同样，不同酶浓度下的反应进程曲线也可以说明这个问题。V=Vmax[S]/Km+[S]，Vmax 指该酶促反应的最大速度，[S]为底物浓度，Km是米氏常数，V是在某一底物浓度时相应的反应速度。双倒数作图（将米氏方程两边取倒数，可转化为下列形式：1／V=Km／Vmax.1／[S]+1／Vmax，可知，1/V对1/[S]的作图得一直线，其斜率是Km/V，在纵轴上的截距为1/Vmax，横轴上的截距为-1/Km。此作图除用来求Km和Vmax值外，在研究酶的抑制作用方面还有重要价值 三、实验器材与试剂 1、试剂：磷酸二氢钠、柠檬酸、ABTS、酸性靛蓝。 2、器材：可见分光光度计、恒温水浴锅、试管、酸度计 四、操作步骤 1、配置缓冲溶液 按下表配置缓冲溶液，其溶液pH值以酸度计测定值为准。
一株纤维素酶产生菌的鉴定及酶学性质 研究 1 引言 1.1 研究纤维素酶的作用和意义 纤维素是植物纤维的主要成分，也是地球上最丰富的可再生有机资源。据报道，全世界每年通过光合作用产生的纤维素，其中有89%尚未被人类利用，我国每年仅农业生产中形成的农作物残渣(稻草、秸秆等)就约有7亿t，如何有效利用这些资源已经成为近年来研究的热点。纤维素占植物干重的35%-50%，是地球上分布最广的碳水化合物，同时又是自然界数量最大的可再生资源。纤维素废弃物的有效利用和生物转化已成为世界上许多国家关注的重要科研领域之一。要使纤维素酶真正能够用于工业生产，首先要降低纤维素酶的生产成本。因此，选育高酶活的纤维素分解菌株就成了解决问题的关键之一。 1.2牛胃消化纤维素 图1-1 图1-2 瘤胃微生物(rumen rnicrobes)是指栖息在瘤胃中的微生物。瘤胃是反刍动物降解纤维素的消化器官，纤维素的降解靠瘤胃微生物分泌的纤维素分
解酶，瘤胃内含有复杂的微生物区系，不同的微生物对纤维素和其它营养物质的消化各显功能，并有互补作用。纤维素的消化是纤维素酶水解的结果，纤维素酶是多组分复合酶，主要为内切型葡聚糖酶，外切型葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。瘤胃微生物通过合成和分泌β-1，4-纤维素分解酶复合物，确保了对植物细胞壁的水解，调控瘤胃内环境促进微生物分泌消化酶，或者向饲料中添加酶制剂，都有利于饲料纤维素的利用。 瘤胃微生物能分泌纤维素酶，因此瘤胃有较强的发酵和分解纤维素的作用。在瘤胃微生物中，对纤维素降解起主要作用的还是瘤胃细菌。本文主要从牛胃液中分离出兼性氧的高产纤维素酶细菌，对分离所得菌株进行初步鉴定及并对其发酵产纤维素酶的酶学性质进行初步探讨，从而为最终得到产纤维素酶，性能优良的微生物菌株。 2 菌种的鉴定 2.1 材料与方法 2.1.1实验的菌种实验用的菌种由齐肇然同学提供的产纤维素酶枯草芽孢杆菌属的Q菌种。 2.1.2 培养基 固体培养基：蛋白胨5.0g，(NH4)2S041.0g，羧甲基纤维素钠 CMC—Na 10.0g，NaCl3.0g，KH2PO4 2.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，FeSO4·7H20 10.0mg、MnSO4·H20 5.0mg，琼脂粉20.0g，蒸馏水1000mL，调pH值6.7。 发酵培养基：蛋白胨2.0g，酵母膏1.0g，(NH4)2SO4 2.0g，CMC-Na 20.0g，NaC1 3.0g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H20 1.0g，FeSO4·7H2O 10.0 mg MnSO4·H2O 5.0mg，调pH值6.7。 Q菌的硫化氢培养基：蛋白胨10.0g ，牛肉膏10.0g ，酵母膏5.0g ，柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7] 2.0g，葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0g，乙酸钠（CH3COONa·3H2O）5.0g ，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）2.0g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58g ，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25g，琼脂 18.0g、蒸馏水1000mL，pH6.2～6.6。 Q菌的硝酸盐培养基：硝酸盐培养基，硝酸盐培养基成分为硝酸钾0.2g 蛋白5g，蒸馏水1000mL，pH 7.4。试剂：甲液（对氨基苯磺酸0.8g 5moL/L
萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质研究（东北农业大学，生命科学学院，黑龙江省哈尔滨市150030） 摘要： 酶是酶是一种生物催化剂，它具有催化剂属性，同是也具有一些无机催化剂所不具有的特性。催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。本实验通过利用淀粉酶水解还原糖，还原糖能使3，5-二硝基水杨酸还原，生成棕色的3-氨基-5硝基水杨酸。淀粉酶活力与还原糖的量成正比，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位质量样品在一定时间内生成还原糖的量表示酶活力。以淀粉在碘液中显蓝色性质，探究酶活性影响因素，常见的影响因素有：温度 pH 活性剂和抑制剂等。 Abstract:Enzyme is a biological catalyst is an enzyme, the catalyst having the property, the same also has some inorganic catalysts do not have the characteristics. Proteins catalyze specific chemical reactions,RNA or a composite thereof. Are biological catalysts,by reducing the activation energy of the reaction to accelerate the reaction rate, but does not change the equilibrium reaction. In this study, the use of enzymatic hydrolysis of starch sugar, sugar makes 3,5-dinitrosalicylic acid reduction ,a brown 3-amino-nitro-salicylic acid.Proportional to the amount of amylase activity and reducing sugars,measuring the amount of amylase in starch sugar produced by colorimetry ,a unit mass of the sample at the certain time. 关键词： 淀粉酶活性温度 PH 激活剂和抑制剂 引言： 新陈代谢是生命活动的基础，是生命活动最重要的特征。而构成新陈代谢的许多复杂而有规律的物质变化与能量变化，都是在酶催化下进行的。生物的生长发育、繁殖、遗传、运动、神经传导等生命活动都与酶的催化过程紧密相关，可以说，没有酶的参与，生命活动一刻也不能进行。酶是细胞产生的，受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂，与一般催化剂比较有以下不同点：酶易失活、酶具有很高的催化效率、酶具有高度专一性、酶活性受到调节和控制。而调节和控制又包括调节酶浓度、抑制剂和激活剂的调节等。[1] 按照淀粉酶水解淀粉的作用方式，可以分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶和麦芽糖酶四种类型。实验证明，当谷类种子萌发时，两类淀粉酶（α，β型）都存在，淀粉酶总酶
自生固氮菌微生物的筛选与生物学特征的研究 引言 氮元素是农作物生长必不可少的一种元素，而它作为农肥的主要成分之一，能提高农作物产量，使作物在贫瘠的土壤上也能获得丰硕的成果。然而，工业固氮的成功使得人们忽略了原本更加天然的固氮方式-使用固氮菌。在全球人口呈现爆炸上升趋势的同时，人们需要。农业生产提供大量的粮食以满足温饱，这就导致工业固氮产业的蓬勃发展。但谁也没想到大量使用氮肥正威胁着人类赖以生存的地球环境：高浓度的氮氧化物是产生颗粒物和地面大气臭氧的重要原因。红潮等的多次出现，杀死数以万计的鱼类，都是由于许多农作土壤也呈氮肥饱和趋势，多余的活性氮肥都被排进湖海之中，最终导致富营养化。 为了达到科学而且环保的目的，只有利用固氮生物进行绿色氮肥的生产，这样不仅可以节省生产氮肥的成本而且还不会造成活性氮流失事实上，许多试验都证明在某些环境状态下，接种的固氮菌对植物田有很大的帮助作用，这是由于固氮菌能在常温常压条件下，通过其体内固氮酶的作用，把空气中的氮固定下来形成氨，进一步变成植物可利用的氨素，从而让土壤中固定的氮元素增加，本实验主要是对自生固氮菌的筛选以及其生物学特征的研究。 1.材料和方法 1.1无氮培养基（富集培养）配方： 葡萄糖10克磷酸二氢钾0.2克硫酸镁0.2克 硫酸钙0.2克氯化钠0.2克碳酸钙 5.0克 琼脂20克蒸馏水1000mL PH 6,5—7..0 瓦克斯曼77号培养基（分离培养） 葡萄糖10克磷酸二氢钾0.5克MgSO4.7H2O 0.2克 1%MnSO4.4H2O溶液2滴1%FeCl3溶液2滴 蒸馏水1000mL 琼脂20克PH 7.0—7.2 1.2自生固氮菌的生态分布 1.2.1土样采集：选定肥沃菜园土采集土样时，先铲去1-4厘米的部分，去5-10厘米深层土样，记录采集土样的时间地点和日期，带回实验室备用。 1.2.2土样备用：将采集的土样放入28摄氏度恒温箱中，不仅可以活化菌，而且还可以干燥土壤，便于土样播撒。 1.2.3自生固氮菌的分离：配制无氮培养基，并将其进行灭菌，冷却至适当温度，倒入灭过菌的培养基中，待凝后地面朝上备用（防止水汽污染）. 将恒温箱中的土样取出，将欲分离的土样均匀地撒在无菌的无氮培养基平板上，每块平板分别撒0.25克，共撒三块平板。在培养基上表明土样号，分离日期，将培养皿倒置。放入28—30摄氏度下培养4-7天。 1.2.4当土粒周围长出浑浊，半透明的胶状菌落时，对菌落特征进行观察，计数和编号。 1.3自生固氮菌的纯化： 1.3.1将融化的改良瓦克斯曼77号培养基倒入无菌平板中，凝固后将平板放入65~70摄氏度的烤箱中烘烤15~20min，以除去平板表面的水分。将土样或加富后的土粒样品用无菌水分别稀释至0.1，0.001，0.0001稀释度，并将各稀释度的菌落0.1mL加在平板上，用无菌刮铲涂匀后，放在28~30摄氏度恒温箱中培养7天，经过一周后长出的菌落既为好气性自生固氮菌。 1.3.2挑菌培养并保存
根瘤菌与豆科植物及其应用 摘要：自贝叶林克1888年首次从豆科植物根瘤中分离获得根瘤菌以来，国内外的许多学者都为揭开这一大自然的奥秘进行着孜孜不倦的研究，成为生命科学最为活跃的领域之一。人们从生物学，生态学，生理生化，分类和遗传等方面对根瘤菌进行了广泛研究，在根瘤菌和根瘤的形态结构，固氮酶的结构和功能，固氮机理和作用调件，根瘤菌在细菌分类学中的地位直到固氮基因，结瘤基因，固氮生态等应用方面都有着较快发展，20世纪90年代共生固氮体系已进入分子水平，研究转入根瘤菌与宿主豆目植物植物的相互识别和信息传递以及根瘤菌群体感应等方面。 关键词：根瘤菌生物固氮根瘤菌应用 一．根瘤菌的生物学特征 根瘤菌：根瘤菌主要指与豆类作物根部共生形成根瘤并能固氮的细菌，一般指根瘤菌属和慢生根瘤菌属；两属都属于根瘤菌目。根瘤菌侵入寄主根内，刺激根部皮层和中柱鞘的某些细胞，引起这些细胞的强烈和生长，使根的局部膨大形成根瘤；根瘤菌在根内定居，植物供给根瘤菌以矿物养料和能源，根瘤菌固定大气中游离氮气，为植物提供氮素养料，两者在拮抗寄生关系中处于均衡状态而表现共生现象。 根瘤菌的形态特征：根瘤菌是短杆状细菌，因生活环境和发育阶段的不同，在形态上有显著变化.根瘤菌在固体培养基上和土壤中呈杆状，端生或周生鞭毛能运动，革兰氏染色阴性，无芽孢，培养较久
菌体粗大，染色不均。 生存习性：根瘤菌与植物的共生体系具有很强的固氮能力。已知全世界豆科植物近两万种。根瘤菌是通过豆科植物根毛、侧根杈口(如花生)或其他部位侵入，形成侵入线，进到根的皮层，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤，根瘤菌从侵入线进到根瘤细胞，继续繁殖，根瘤中含有根瘤菌的细胞群构成含菌组织。 根瘤菌进入这些宿主细胞后被一层膜套包围，有些菌在膜套内能继续繁殖，大量增加根瘤内的根瘤菌数，以后停止增殖，成为成熟的类菌体；宿主细胞与根瘤菌共同合成豆血红蛋白，分布在膜套内外，作为氧的载体，调节膜套内外的氧量。 类菌体执行固氮功能，将分子氮还原成NH3，分泌至根瘤细胞内，并合成酰胺类或酰尿类化合物，输出根瘤，由根的传导组织运输至宿主地上部分供利用。与宿主的共生关系是宿主为根瘤菌提供良好的居住环境、碳源和能源以及其他必需营养，而根瘤菌则为宿主提供氮素营养。 二．根瘤菌与豆科植物 根瘤菌(root nodule bacteria)是与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类杆状细菌。这种共生体系具有很强的固氮能力。已知全世界豆科植物近两万种。根瘤菌是通过豆科植物根毛、侧根杈口(如花生)或其他部位侵入，形成侵入线，进到根的皮层，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤，根瘤菌从侵入线进到根
壳聚糖酶生产菌筛选、鉴定及其酶学性质 阎贺静，周念波，涂邵勇，梅双喜，王海波，李 佳 （武汉生物工程学院生物工程系，湖北武汉430415） 摘 要：以壳聚糖为唯一碳源，筛选获得壳聚糖酶活力较高的菌株，根据菌株菌落形态及ITS 序列分析，初步鉴定该菌株为烟 曲霉(Aspergillus fumigatus )。该壳聚糖酶的最适反应温度为55℃，最适pH 值为5.6，在45~60℃和pH 值4.0~8.0范围内稳定，Mn 2+对 酶有明显的促进作用，Ag +、Cu 2+、Zn 2+对酶有明显的抑制作用，其酶学特征表明该壳聚糖酶在壳聚糖降解方面具有应用潜力。 关键词：壳聚糖酶；筛选；鉴定；酶学特性中图分类号：Q814.1 文献标识码：A 文章编号：1004-874X （2012）24-0161-04 Isolation,identification and enzyme characteristics of a strain producing chitosanase YAN He-jing,ZHOU Nian-bo,TU Shao-yong,MEI Shuang-xi,WANG Hai-bo,LI Jia (Bioengineering Department,Wuhan Bioengineering Institute,Wuhan 430415,China ) Abstract:The aim of this paper was to screen chitosanase producing strain and to investigate the characteristics of the chitosanase produced by this strain.Chitsoan was used as the sole carbon source for the acclimatization and screening of strain.A strain with a higher chitosanase activity was isolated from soil.It was identified as Aspergillus fumigatus by its morphology in solid medium and by analyzing the sequence of ITS.The optimum temperature and pH were 55℃and 5.6,respectively.And the chitosanase is stable at 45~60℃and pH 4.0~8.0,respectively.The activity of the enzyme is strongly promoted by Mn 2+and inhibited by Ag +,Cu 2+and Zn 2+.The properties of chitosanase indicated that it has a great potential application in chitosan degradation. Key words:chitosanase;isolation;identification;enzyme characteristics 壳聚糖酶(chitosanase ，EC.3.2.1.132)又称壳聚糖-N-乙酰-氨基葡糖苷水解酶(chitosan N-acetylglucosaminohydr-olase)，是一种对线性壳聚糖具有水解专一性的酶。壳聚糖酶对真菌细胞壁有降解作用，广泛应用于真菌原生质体的提取。同时，壳聚糖酶还可用于真菌的分类研究以及真菌致病菌的诊断。此外，壳聚糖酶在酶解壳聚糖为壳寡糖方面作用理想，且在食品及医药领域具有巨大应用潜力，使壳聚糖酶成为目前国内外研究热点。 目前，壳聚糖酶生产水平较低、价格昂贵，限制了壳聚糖酶的应用。因此，提高壳聚糖酶的生产水平成为研究重点。国内外学者对此进行了大量研究，主要集中在高产菌株筛选、诱变以及基因工程菌构建等方面。目前已筛选出多种产壳聚糖酶的微生物，包括细菌如Bacillus circulans 、Bacillus cereus 及Bacillus subtilis [1-3]，链霉菌如 Streptomyces [4]，真菌如Aspergillus fumigatas 、Aspergillus oryzae 及Trichoderma reesei 等[5-7]。但壳聚糖酶产量较高者并不多见。近年来，随着分子生物学技术的发展，许多壳聚糖酶基因被克隆、表达。国内外已有许多成功克隆表达壳聚糖酶的例子，如Streptomyces N -174、Bcillus circulans MH -K1、Bacillus subtilis HD145、Aspergillus fumigatus 等[8-11]。但是，壳聚糖酶的克隆、表达主要集中在 酶的催化特性及分子结构研究，关于重组酶产量的报道较少。虽然国内近年来关于壳聚糖酶的克隆和表达的研究报告逐年增多，但重组体壳聚糖酶的产量尚未满足工业化生产的水平[12-15]。因此，获得高效、稳定的壳聚糖酶基因及其高产菌株仍是目前应用中的关键问题。从自然界中发现、筛选、诱变或构建壳聚糖酶高产菌株是提高目的酶生产水平的主要途径。我们从湖泊、河流附近采集样品进行壳聚糖酶生产菌的筛选，对筛选菌株进行平板培养考察其生长特性，并进行ITS 序列分类鉴定，通过粗酶酶学特性的研究考察该壳聚糖酶的应用潜力。 1 材料与方法 1.1 试验材料 供试土壤采集于武汉各地河流、湖畔附件的泥土或水 底淤泥。其他化学试剂均为分析纯。 初筛培养基：胶体壳聚糖1%（取1g 壳聚糖粉末用30mL 1%HAC 溶解)、(NH 4)2SO 40.5%、K 2HPO 40.2%、NaCl 0.5%、MgSO 4·7H 2O 0.1%、琼脂2%。复筛培养基：(NH 4)2SO 41%、酵母提取物0.05%、 K 2HPO 40.07%、KH 2PO 40.03%、NaCl 0.5%、MgSO 4·7H 2O 0.05%、葡萄糖0.1%、胶体壳聚糖1%。 发酵培养基同复筛培养基。 1.2试验方法 1.2.1菌株筛选（1）样品处理：称取10g 新鲜样品加入装有90mL 无菌水和玻璃珠的三角瓶中，室温震荡30min 使样品充分打散，静置获得样品悬液。 收稿日期：2012-11-17 基金项目：湖北省教育厅项目(B20114607);武汉市教育局项目 (2010085) 作者简介：阎贺静（1987-），女，博士，讲师，E-mail ：yanhejing@ji https://www.doczj.com/doc/b35002547.html, 广东农业科学2012年第24期 161
固氮菌筛选及鉴定 实验原理 农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。将用表土制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离开来。 目的要求 1．初步学会从土壤中分离自生固氮菌的方法。 2．初步学会制作临时涂片的方法。 材料用具 农田的表层土壤(土壤溶液的pH不低于6.5)。 无菌研钵，无菌玻璃棒，接种环，天平，存放有载玻片的酒精缸，盖玻片，显微镜，酒精灯，火柴，镊子，恒温箱，量筒，玻璃铅笔。 灭过菌的、盛有无氮培养基的培养皿，结晶紫染液，无菌水。 方法步骤 一、接种 1．接种前，将灭过菌的、盛有无氮培养基的培养皿，放在37℃的恒温箱中一两天。随后，选取培养基上没有生长任何微生物的培养皿供实验用。 2．取10g土壤，放在无菌研钵中，注入5mL无菌水，并用无菌玻璃棒搅拌均匀，备用。 3．将接种环放在酒精灯的火焰上灭菌。略微打开培养皿盖，将接种环放在培养基边缘处冷却。然后，用接种环蘸取少许稀泥浆，轻轻地点接在培养基的表面上，共点接15～20处(注意：接种时手和衣袖不要碰到火焰，以免烧伤)。 4．接种后，轻轻地盖上培养皿盖，将培养皿放在实验桌上，并在顶盖上写明实验内容、接种人的姓名和接种日期。 二、培养
将接过种的培养皿放入恒温箱内，在28～30℃的温度下培养3～4d。 三、观察 3～4d后，取出培养皿，仔细观察培养基上稀泥浆周围长出的培养物——黏液。黏液初为无色透明，以后为乳白色，最后变成褐色，表明含有自生固氮菌。 四、镜检 1．制作临时涂片 (1)用镊子从存放载玻片的酒精缸中夹取一片载玻片，将载玻片放在酒精灯火焰的上方缓缓烘烤，以便除去上面的酒精。将载玻片放在实验桌上，待载玻片冷却后，在载玻片的中央滴一滴无菌水。 (2)在火焰旁，按照接种的要求，用灭过菌的接种环从培养基上挑取少许黏液，将黏液涂在载玻片上的水滴中，加1滴结晶紫染液，混合均匀，染色1min。 (3)另取一片载玻片作推片。将推片自液滴左侧向右侧移动，使液滴均匀地附着在两片之间。然后，将推片自右向左平稳地推移(两片之间呈30～45°夹角)，推出一层均匀的菌膜。 2．干燥 让临时涂片自然干燥(自生固氮菌的临时涂片不用加热固定，以免破坏荚膜)。 3．在显微镜下观察 依次通过低倍镜和高倍镜观察临时涂片，可以看到染成紫色的自生固氮菌。 结论 通过显微镜能够看到几种自生固氮菌？它们在形态上各有什么特点？将得出的结论写在《实验报告册》上。 讨论 1．为什么盛放无氮培养基的培养皿应当是灭过菌的？ 2．假如黏液中有三种自生固氮菌，你能不能想出一种办法，将这三种细菌分离开来？