固氮菌、解磷菌的分离筛选
一、目的要求:
1、掌握选择培养基的筛选原理。
2、掌握固氮菌、解磷菌的分离方法。
3、学习平板划线分离法。
二、实验原理：
选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理化学抗性而设计的培养基，利用这种培养基可以将所需的微生物从混杂的微生物中分离出来。固氮菌可以利用空气中的氮作为氮源进行自身代谢，根据这一原理可以利用无氮培养基将固氮菌从混合菌中分离出来。解磷菌可以在含有难溶性磷酸盐或有机磷的固体培养基产生溶磷圈，根据这一特性可以分离出解磷菌。同样，可以根据解钾菌的生理特性选择合适的培养基将其分离出来。
在本实验中，分离固氮菌我们采用阿须贝氏（Ashby）培养基，分离解磷菌采用无机磷培养基。
选择培养基的配方如下
Ashby培养基：
磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.2 g
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.2 g
氯化钠(NaCl) 0.2 g
碳酸钙(CaCO3) 5.0 g
甘露醇(C6H14O6) 10.0 g
硫酸钙(CaSO4·2H2O) 0.1 g
琼脂 18.0 g
蒸馏水 1000 mL
pH 6.8～7.0
无机磷培养基：
葡萄糖 10.0 g
(NH?)?SO? 0.5 g
NaCl 0.3 g
KCl 0.3 g
MgSO??7H?O 0.3 g
FeSO??7H?O 0.03 g
MnSO?? 4H?O 0.03 g
Ca?(PO?)? 10 g
琼脂 18 g
蒸馏水 1000 ml
三、实验材料:
1、试剂及样品：Ashby培养基、无机磷培养基、无菌水、土壤样品（自带）。
2、仪器及其它用具：培养皿、玻璃棒、烧杯、量筒、天平、高压蒸汽灭菌锅、
生化培养箱、超净工作台、接种环、酒精灯、PH试纸等。
四、方法步骤:
培养基的配制
1、根据要求，配置好三种培养基，115℃条件下高压灭菌25min。
2、将灭菌后的培养基在超净工作台倒平板，备用。
样品处理
3、在离心管中，将自带土壤样品按5g土样\10ml无菌水的比例溶解，土壤样品
要充分溶解，使土壤中的微生物全部溶解在无菌水中。
4、样品溶解后，将离心管放在离心机中，3000r\min，离心5min。
接种
5、在超净工作台，用灭菌的接种环蘸取离心后上清液，用平板划线分离法分别
在Ashby培养基和无机磷培养基上接种土样各一个平板。
6、接种完成后在培养基上贴上标签，注明培养基名称和样品编号，接种日期。
如Ashby①，2011.8.27；无机磷③2011.8.27。
7、将培养皿放在恒温培养箱中28℃培养。
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究 2.1引言 醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0 μm。醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。 本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。 2.2实验材料与方法 2.2.1材料与仪器 分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。 试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。 表2.2.1.a主要仪器设备 Tab 2.2.1.a Main instrument equipment 主要仪器型号厂家 生化培养箱 双目生物显微镜 分析天平 手提式不锈钢蒸汽灭菌锅 超净工作台 精密数字式酸度计 PYX-250S-A BME（BA/E3） BS224S DSX-280B SW-CJ-1FD pHS-3C 长沙科技 科力仪器 德国莱卡 北京化丰 上海南鹏 上海科技
试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。 2.2.2培养基[33-37] 表2.2.1.ｂ培养基成分表 Tab 2.2.1.ｂMedium composition 名称葡萄 糖 酵母 膏 无水乙醇 (v/v) 琼 脂 CaCO3备注 ⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5 ⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然 ⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然 ⑷液体保藏培养基1%1%1%pH自然 ⑸改进后的斜面液体 保藏培养基 1%1%3%2%1%pH自然 ⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5 ⑺Horyer-Frateur培养 基 3%pH自然 ⑻GYC培养基10%5%2% 2. 5%pH自然 ⑼高糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3% ⑾产5-酮基葡萄糖酸 盐培养基 3%1%2%2%pH自然 ⑿氧化乙酸培养基1% 1% 2% 乙酸钙1% pH 7.2 ⒀氧化乳酸培养基1% 1% 2% 乳酸钙2% pH7.0-7.2 ⒁乙醇培养基1% 3% 2% pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，KH2PO40. 01%，0.025%，FeCl30. 0005%；以上培养基均以121℃灭菌20 min。 2.2.3醋酸菌的分离纯化 2.2. 3.1分离纯化实验 称取醋醅样品5g，液态增殖培养48h后，按照浓度梯度10-6、10-7和10-8，
精心整理 乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 时，SL 培养基、MS 对乳酸菌无害。一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH 。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h →挑选产生溶
钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。 2.溴甲酚绿指示剂法： 培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液） 筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。 二.菌种的分离筛选 1.培养基： ★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用） ★★1.2吐温 ★1.3 酵母膏（分离用） 1.4 1.5 MgSO 4 1.6 ★★1.7 蛋白胨 葡萄糖、琼 脂18.0g 酸钙, 1.8BCP 乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000ml pH6.5-7.0（分离用） 1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒 精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏 1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀， 倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。
实验十、土壤中芽孢杆菌的分离与筛选 ——培养基配制及样品采集 一、实验目的 学习和掌握菌种选育技术中从自然界中采样的技术，掌握芽孢杆菌筛选的特异性培养基配制方法。 二、实验原理 自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多，土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。 三实验材料 1. 采样器具：灭菌的牛皮纸袋、小铲刀（或不锈钢勺）、温度计、pH试纸、 记号笔等。 2. 筛选培养基：肉汤琼脂培养基 四、操作步骤 1. 采样： 用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好，或事先灭菌处理的牛皮纸袋、玻璃器皿内。北方的干燥土壤，可在10～30cm处取样。给牛皮纸袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。 （注意：一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。 从土层的纵剖面看，1～5cm的表层土由于阳光照射，蒸发量大，水分少，
葡萄酒与醋酸菌 梁曼发酵工程2011050783 摘要：葡萄酒是一种成分复杂的胶体溶液，从葡萄汁酿成葡萄酒以后，不管是在酒厂的贮藏阶段，还是装瓶以后，它总是在一刻不停地变化着。由于各种微生物在葡萄酒中的生长繁殖，使得葡萄酒失去了原有的风味，这种现象称为葡萄酒的病害。在酿酒学领域，醋酸菌几乎不受关注，可能是因为醋酸菌是严格好氧菌，因此人们认为该类菌在葡萄酒中不能生存，除了葡萄酒表面能够永久的与空气接触。醋酸菌是葡萄酒酿造中的大敌。凡是有酒花生长之处，就有醋酸菌在一起繁殖；一旦条件具备，会迅速把酒精氧化变成醋酸，使葡萄酒产生醋酸气味，有刺舌感，严重破坏酒质。在发酵过程中，可通过合理措施来防治醋酸菌的污染。 关键词：醋酸菌；醋酸菌污染；防治措施 1葡萄和葡萄酒相关的醋酸菌 1.1醋酸菌的分类 醋酸菌是能够将酒精氧化成醋酸的一类微生物的总称。醋酸菌是多种形态，细胞椭圆到杆状，0.5-0.8×0.9-4.2微米。单个，成对或成链，不形成孢子。革兰氏染色阴性。醋酸菌是专性好氧菌。有的醋酸菌不会运动，也有具极生或周生鞭毛的运动型。 醋酸菌被分为醋杆菌属（Acetobacter）、酸单胞菌属(Acidomonas)、葡糖醋杆菌（Gluconobacter）、葡糖酸醋酸杆菌（Gluconacetobacter）( Ruiz et al., 2000)。其中关于各属醋酸菌间的不同（表1），主要区别是葡糖杆菌不能将乙醇最终氧化生成CO2和H2O，而其他属均可。 1.2与葡萄和葡萄酒相关的醋酸菌 与葡萄和葡萄酒相关的醋酸菌一般有下列几种：氧化葡糖杆菌、纹膜醋杆菌、巴士醋杆菌、Gluconacetobacter liquefaciens（原来一直被认作是液化醋杆菌）、Gluconacetobacter hansenii（以前一直被认作汉生醋杆菌）。 在未损坏葡萄上发现的醋酸菌主要是氧化葡糖杆菌，菌体数量一般为 102-105cells/mL( Du Toit and Lambrechts, 2002)。人们认为氧化葡糖杆菌低耐酒精能力，所以在酒精发酵过程中很快就死了，在酒中分离得到其细胞数量为104cells/mL(Drysdale and Fleet, 1985)。一般在酒精发酵结束后其细胞数目会减少，为0-102cells/mL( Du Toit and Lambrechts, 2002)。 腐烂或感染灰霉菌的葡萄上醋酸菌数量会大幅度增加，细胞数目由每毫升很少到106cells/mL(Barbe et al., 2001)。葡萄刚污染醋酸菌时，醋杆菌属为优势菌。可能是由于受损葡萄污染了的野生酵母产生的酒精的原因，醋杆菌属能够优先利用酒精作为碳源。 当压榨完的葡萄带皮在较低温度下放置几天，冷浸渍用来在酒精发酵开始前浸提更多色素(Ribéreau-Gayon et al., 2000)。在这段时期内，发酵液的微生物学状态会发生变化，尽管会添加SO2来防止危害酵母菌和细菌的生长。在该过程中，发酵液的pH也会影响醋酸菌的数量：较高pH，细菌数量增加，在这种状况下，较少SO2会产生抗菌作用，而是在较低pH下（pH＜3.5）保持最初的浓度(Du Toit and Lambrechts, 2002)。 由于对酒精耐受力和把酒精作为碳源和能源的偏好的不同，多种醋杆菌经常从葡萄酒中分离得来，而葡糖杆菌常从葡萄汁中分离得到。氧化葡糖杆菌是葡萄与葡萄汁的混合液中主要的菌种。汉生醋杆菌和液化醋杆菌最近被重新指定为汉生氧化葡糖杆菌和液
从土壤中分离和筛选产淀粉酶活性的芽孢杆菌及部分鉴定 试验 一、实验目的 1、通过本实验的学习，学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法； 2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定,对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练； 3、培养综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。 4、根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株。 二、实验原理 1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。待实验前取样即可。 2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。 3、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。细菌富集一段时间后，生长环境不利，会产生芽孢，再在80-90℃温度下杀死菌体，可使芽孢得到富集。 4、芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养
明胶（22℃）7天内液化1厘米或1厘米以上。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源。 5、在含有淀粉的鉴别培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。 二、实验材料 1、土壤样品 实验前三天在距土壤表层5-8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样 2、药品 可溶性淀粉、蛋白胨、Nacl、牛肉膏、琼脂粉、碘、碘化钾、磷酸氢二钠、柠檬酸、盐酸 3、试剂： （1）配制稀碘液： 原碘液：称取碘和碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500ml，贮存于棕色瓶中。 稀碘液：吸取原碘液，加入碘化钾用水溶解定容至500ml，贮存于棕色瓶中。 （2）可溶性淀粉溶液：称取2.00g可溶性淀粉于烧杯中，用少量水调成浆糊状，边搅拌边缓慢加入70ml沸水中，然后用水冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100ml。（溶液现配现用） （3）磷酸缓冲液（pH=）：称取45.23g磷酸氢二钠和8.07g柠檬酸，用水溶解并定容到1000ml，用pH计校正后使用
关于硫酸还原菌的特性及运用 [ 06-03-06 16:02:00 ] 作者：鄢卫东编辑：studa9ngns 摘要：本论文主要论述硫酸还原菌的特性及运用。硫酸还原菌自然界的作用是非常重大的，我们可以利用它的生态特性来改善我们的环境，研究开发以硫酸还原菌为基质的新工艺处理废水、废物，造福人类。 关键词：硫酸还原菌特性及运用 硫酸盐还原菌(ＳＲＢ)是一类形态各异、营养类型多样、能利用硫酸盐或者其他氧化态硫化物作为电子受体来异化有机物质的严格厌养菌。常见属有脱硫弧菌属，脱硫肠状菌属.因其参与自然界中的多种反应，所以愈来愈得到人们的关注。 1 ＳＲＢ的生活环境和条件 1.1 ＳＲＢ在环境中的分布 自然界中最常见的ＳＲＢ是嗜温的革兰氏阴性、不产芽孢的类型.在淡水及其他含盐量较低的环境中，易分离到革兰氏阳性、产芽孢的菌株。此外，在自然界中存在的还有革兰氏阴性嗜热真细菌、革兰氏阴性古细菌。ＳＲＢ是严格的厌氧菌。但是它分布广泛，ＳＲＢ可以存在于土壤、水稻田、海水、盐水、自来水、温泉水、地热地区，油井和天然气井,含硫沉积物,河底污泥、污水,绵羊瘤胃、动物肠道等。还可以从一些受污染的环境中检测到它 的存在,如厌氧的污水处理厂废物,被污染的食品中。 1.2 基本环境因子 ＳＲＢ可以在-5～75℃条件下生存，并能很快适应新的温度环境,。某些种可以在-5℃以下生长，具有芽孢的种可以耐受80℃的高温；在ｐＨ为5～9.5的范围内生存，最适ｐＨ值为7.0～7.8。盐分：在一些高盐的生态环境中，也能检测到它们的存在,如盐湖、死海等。在实验室中分离到的嗜盐菌多数是轻度嗜盐菌（适宜盐度范围为1%～4%），分离到中度嗜盐菌的报道不多，最适盐度为10%左右。Ｅｈ：其生长要求Ｅｈ低于-150ｍＶ。 1.3 ＳＲＢ生长所需的碳源、氮源 碳源：ＳＲＢ的不同菌属生长所利用的碳源是不同的，最普遍的是利用Ｃ3、Ｃ4脂肪酸,如乳酸盐、丙酮酸、苹果酸；此外还可以利用一些挥发性脂肪酸,如乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐；醇类，如乙醇，丙醇等；氮源：铵盐是大多ＳＲＢ
醋酸菌分离及鉴定 一、培养基 1、分离培养基（溴甲酚紫显色平板）:葡萄糖1%、酵母膏1%、无 水乙醇3%（体积分数）、0.04%溴甲酚紫5%（体积分数）、琼 脂1.8%、水100 mL，0.1 Mpa 灭菌20 min，无水乙醇在灭菌 后培养基温度降到75 ℃左右时加入。 2 、保藏培养基: 葡萄糖1%、酵母膏0.5%、琼脂2%、丙三醇2.5% （体积分数）、水100 mL，121℃灭菌20 min 备用。 3、液体培养基:葡萄糖1%、酵母膏0.5%、丙三醇2.5%（体积分 数）、水100 mL，调节pH 至6.30，121 ℃灭菌20 min 备用。 二、醋酸菌分离纯化流程 样品→醋酸菌发酵液中富集培养→稀释分离→纯化→斜面试管 保藏→产醋酸定性测试。 三、步骤 1 、菌株分离 取1g 醋醅样品置入无菌试管，装入9 mL 无菌水，振荡均匀后得到10-1 的稀释液，之后10 倍梯度稀释直到10-6 稀释度。取 10-2至10-6 稀释度的样品稀释液分别涂布溴甲酚紫显色平板，每个稀释度涂布2 个平板，每个平板涂布0.2 mL 的样品稀释液，涂布完成后30 ℃倒置培养48 h左右。选取菌落数在30~50 个左右的平板，挑取该平板上的所有单菌落转入斜面保藏培养基中， 30 ℃培养24 h 左右后保存于4 ℃冰箱。
2 、菌株纯化将试管斜面中的菌株平板划线分离后再转接试管斜面， 4℃冰箱保存。 3、菌株归类以上述各菌株划线分离的平板为基准，将形成菌落极 其相似的菌株归为一大类。 4 、菌悬液的制备用接种环挑取新鲜培养的斜面菌株半环，溶于 装有200 μL 无菌超纯水的Eppendorf 管中，于试管振荡器上 混匀后得到菌悬液。 四、鉴定 1、菌株形态特征:镜下细胞呈短杆状,革兰阴性,无芽胞,单个或成 对、成链排列,个体大小为（0.5～0. 7)μm ×(1. 0～1. 5)μm。 2、培养特征:在葡萄糖、酵母膏、乙醇、CaCO3平板培养基上生 长旺盛,菌落圆形、油脂状,表面光滑、凸起,边缘整齐,培养2 d能 产酸,使CaCO3 溶解形成透明圈,继续培养将乙酸氧化分解产生 CO2 和水,菌落周围出现白色透明圈。在斜面培养基上生长良好, 培养2 d后呈油脂状,并产酸。在10% ( v / v)乙醇的培养基上、 Hoyer2Frateur培养液中、30%葡萄糖培养基上均不生长。 五、测试 1、产酸量的测定方法取1 mL 发酵液, 加入10 mL 蒸馏水, 3 滴～ 5 滴0.02 %酚酞酒精溶液, 用标定的0.1 mol/L NaOH 溶液滴定 至浅粉色。由所耗的NaOH 溶液的量来计算样品中的含酸量(以 醋酸计)。 产酸量( %) =( V- V0) ×CNaOH×0.06×100 %
菌种筛选方法 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。 1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremoth ecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberell a fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的
"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就
醋酸菌培养条件的优化及醋酸分批发酵 来源：生物化学资料网 摘要:目的醋酸菌培养条件的优化与醋酸发酵实验。方法通过正交试验确定最佳培养条件,并在优化条件下进行分批发酵。结果优化培养条件为:葡萄糖10 g/L,酵母膏10 g/L,乙醇10%(v/v),pH 5.5,装量50 mL/500 mL,静置培养5 d。在优化条件下,醋酸产量比用普通产酸培养基提高了36.4%。应用于分批发酵试验产酸较高。结论优化培养条件适合醋酸菌生长与醋酸发酵。 关键词:醋杆菌属巴氏醋杆菌;培养条件;正交设计;分批发酵 山西老陈醋不仅是具有“绵、酸、香、甜、鲜”独特风味的调味品,还因其富含多种氨基酸、维生素和微量元素而作为保健品得到广泛使用。近年山西醋业发展迅猛,生产规模日渐扩大,生产技术日新月异,促进了山西老陈醋的发展。在食醋生产中,菌种起着至关重要的作用。一株优良的生产菌株能起到提高产量、稳定质量的目的。本实验室从醋醅中分离到一株醋杆菌属巴氏醋杆菌S12,经N+离子注入诱变获得高产突变株SM12-87。对其培养条件进行了优化设计,得出了最佳培养条件。在正交试验对醋酸菌发酵条件掌握的基础上,通过液态分批发酵对优化后的培养条件进行检验。在67 h生产出92.8 g/L的醋酸,乙醇转酸率达到90.08%,极大地缩短了生产周期,减少了成本。 1仪器与材料 1.1材料 山西老陈醋醋醅(由山西老陈醋集团有限公司提供);醋杆菌属巴氏醋杆菌(Acetobacter past-eurianus)SM12-87(本实验室保存)。 1.2主要设备仪器 全自动式 5 L发酵罐(Edison.N.J.,USA);GC9800型气相色谱仪(上海科创公司);HQL150B型恒温摇床(中科院武汉科学仪器厂)。 1.3培养基 1.3.1产酸培养基葡萄糖10 g/L,酵母膏10 g/L,pH 5.5,分装于500 mL三角瓶,每瓶100 mL,121 ℃灭菌20 min,使用前加入7%(v/v)无水乙醇。 1.3.2发酵培养基葡萄糖10 g/L,酵母膏10 g/L,磷酸二氢钾0.5 g/L,硫酸镁0.5 g/L,pH 5.5,121℃灭菌20 min,冷却至60 ℃以下加入10%(v/v)无水乙醇。
土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研 【】究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽 【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属 是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的要求 1．了解生物分离提纯的原理和方法技术 2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法 3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 三、实验原理 自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的 【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
亚硫酸盐还原菌及检测 一、生物学特性与卫生学意义 亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌是梭状芽胞杆菌属的一群细菌，而不是一个生物学分类单位。多指厌氧芽胞杆菌，代表性菌株是致黑梭状芽胞杆菌，其他常见的还有产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌等。此类细菌的主要特征是将亚硫酸盐还原为硫化物，多为有动力的革兰氏阳性菌，可形成芽胞，厌氧生长。 厌氧亚硫酸盐还原菌的孢子在自然环境中广泛存在，通常出现在人和动物的粪便排泄物，废水和土壤中。与大肠杆菌和其它杆菌不同的是，由于它们的孢子比营养体对物理和化学因子具有更强的抵抗力，所以可以在自然环境中存活很大时间。因而，通常将他们作为长期污染或间断污染的指示菌。它们甚至可以抵抗正常水处理所用氯的工作浓度，因此，它们对判断是否已达到控制目的非常有用。 由于此类细菌抵抗力强，即使在经适当加工处理的加工食品中其芽胞仍会存活，条件适宜时又会生长繁殖，造成食品品质降低或腐败，甚至会引起食物中毒的危险。因此在食品的制备、贮存以及食品加工厂环境卫生控制上颇受重视，作为食品、矿泉水、加工设备卫生、生产环境的卫生状况的评估指标，正确得到越来越广泛的应用。 该类细菌的检测多用于环境水质和生活饮用水污染状况的评估，在九十年代中后期开始在食品卫生领域中有所要求，但多局限于欧洲国家和地区，如法国、瑞士、英国、捷克等欧盟成员国。到目前为止，该菌一般不被作为食品卫生常规检测项目和致病菌检测内容，我国和美国未将该检测项目列入食品微生物检测项目和要求中。 二、检测方法 由于此类细菌以形成芽胞、厌氧生长和还原亚硫酸盐为硫化氢为主要特征，往往无需作进一步实验验证，因此在检测中将满足以上三个条件的一群细菌全部认定为厌氧亚硫酸盐还原菌。 检测方法一般包括以下三部分：检样在接种前在80-100℃水浴中处理10-15分钟，以杀灭抵抗力弱的芽胞细菌的营养体，同时刺激芽胞的繁殖；通过选择性培养如亚硫酸铁盐琼脂等判定是否具有还原亚硫酸盐的能力，如果有则进一步与培养基中的亚铁盐如枸橼酸铁反应，使菌落呈现黑色；培养基接种后置于厌氧环境中培养确认厌氧特征。也可在培养基中加入抗生素等抑制剂抑制其它非亚硫酸盐还原菌的生长。 下面详细介绍亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌的检验方法。 1.培养基和试剂
乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状， 一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常 添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸， 以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
工业微生物菌种得分离与筛选 来源:青岛海博 一、微生物工业对菌种得要求 (一)、微生物工业得生产水平由三个要素决定:生产菌种得性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种得性能就是最重要得因素。 (二)、微生物工业对菌种得要求就是: (１)菌株高产,在较短得时间内发酵产生大量发酵产物得能力; (２)在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近得副产品及其她产物; (3)生长繁殖能力强,较强得生长速率,产孢子得菌种应该具有较强得产孢子能力; (4)能够高效地将原理转化为产品; (５)能利用广泛得原材料,并对发酵原料成分得波动敏感性小; (６)对需要添加得前体物质有耐受能力,并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用; (7)在发酵过程中产生得泡沫要少; (8)具有抗噬菌体得能力; (9)遗传稳定性, 二、工业用微生物菌种得来源及选育 (一)微生物菌种得来源 一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品与分离筛选: (1)就是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买; (２)从大自然中采集样品分离; (3)从一些发酵制品中分离筛选目得菌株、 当前发酵工业所用菌种总趋势就是从野生菌转向变异菌,自然选用转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组得定向育种。 (二)微生物工业菌种得分离 1、野生菌株得分离、筛选过程 (１)新菌种分离与筛选得步骤 菌种分离得流程如下: 标本采集→标本材料得预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏 ①采样 采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。 采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5—1５cm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。为了使土样中微生物得数量与类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离、 ②标本预处理 ④纯种分离:采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落、 ⑤高产菌株得筛选:这一步就是采用与生产相近得培养基与培养条件,通过三角瓶得容量进行小型发酵试验,获得适合于工业生产用菌种。还要对菌种进行发酵性能测定,
常用的菌种的筛选方法如下： （1）施加选择性压力分离法 主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势。而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。 （2）随机分离方法 有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。 A、抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。 B、抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的?-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的?-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。 C、生长因子产生菌的分离以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中，培养2-3天后，用紫外线杀司长好的菌落，再往此平板上面铺一层相应营养缺陷型菌株菌悬液，培养16小时后，被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈。 （3）目的微生物分离 A、根据形态筛选突变株 B、根据平板菌落生化反应筛选变株透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、浑浊圈法等。①透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。在分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法进行初筛。在选择性培养
芽孢杆菌的分离与鉴定 实验器材：铲子（1）,盆（1）,电子天平（1），洗耳球(1)，接种勾和环（1）,1ml吸管（7）,玻璃涂棒（1）,平皿（12）,250ml带玻璃珠三角瓶（1）,双层纱布（1）,试管（7），标签纸（1）,恒温箱，显微镜（4）。 实验试剂：无菌水，1mol/L NaOH、1mol/L HCL、草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、复红液、5%孔雀绿、沙黄、乙醚、吲哚试剂、40%NaOH、肌酸 牛肉蛋白胨培养基：牛肉膏1g，蛋白胨2g，Nacl 1g，水200ml，ph7.2，琼脂3.0-4.0g；生孢培养基：0.1%蛋白胨，0.1%葡萄糖，0.07%酵母粉，0.02%硫酸镁晶体（七水），0.02%硫酸铵，0.1%磷酸氢二钾（3水），1.5%琼脂； 一、土壤中芽孢杆菌的筛选 A.培养基配置步骤：（1）称量：按比例称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠，共置于烧杯中； （2）溶解：先加入适量无菌水，加热使其溶解，再补足水至总量； （3）调pH：用1mol/L NaOH或1mol/L HCL调PH至7.6； （4）过滤：用滤纸过滤； （5）融化琼脂：加入3.5克琼脂，继续加热至完全溶解，补足因加热蒸发失去的水分； （6）分装与包扎：摆斜面 （7）灭菌：121℃，灭菌20min B.实验步骤： （一）采集土样: 每个采样点选取土壤较肥沃、有代表性的地块约0．2 cm2，五点法采集。取5～10cm深土壤，每一个土样约500 g。将土样放入无菌的纸袋中，并记录采集的时间、地点、植被类型，4℃保存备用。 （二）土壤悬液制备：称取10g土样，放入盛有99ml无菌水并带有玻璃珠的250ml三角瓶中，振荡摇晃20min，使土样与水充分混合，将细胞分散，两层纱布过滤，然后将锥形瓶置于90℃水浴锅，加热20min，制备成土壤悬液。 （三）土壤悬液稀释：用一支1ml的无菌吸管从锥形瓶吸取过滤的土壤悬液1ml加入盛有9ml 无菌水的大试管中，震荡均匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一只盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1 、 10-2 、 10-3、 10-4、10-5、 10-6 不同的稀释度。 （四）倒平板：将牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，冷却至45-50度倒平板，每个梯度两个平行，共12个，每皿15ml左右。平皿凝固后，在平皿底部分别用记号笔用：10-1 、 10-1、10-2、 10-2 、 10-3、 10-3、10-4、 10-4、10-5、 10-5、10-6、10-6。 （五）涂布：用无菌吸管分别将10-1 、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤稀释液各吸取0.2ml，将菌悬液小心的对号滴入已写好稀释度的平皿表面中央，再用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻的涂布均匀，倒置放置，待培养。 （六）培养：将接种好的平皿倒置于37℃温箱中培养，大约1-2天。 （七）平板划线分离纯化：将培养好的单个菌落分别挑取少许细胞接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面培养基上，置于37℃温箱中培养24小时左右，待长出菌苔，镜检其特征是否一致，有杂菌，需再一次分离纯化，直至获得纯培养。 (八)生孢培养：再分别挑取单个菌落划线接种于生孢培养基，于37度培养箱培养，直至长出单个菌落。 二、纯化菌株的鉴定： （一）观察菌落形态：观察平板菌落形态：菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，（二）观察菌体形态：
硫酸盐还原菌(SRB) 1 SRB的分类 硫酸盐还原菌种类很多，广泛分布于土壤、海水、淡水和适宜的陆地环境中。据不完全统计，SRB己有15个属40多种，其中参与废水处理的有9个属。同时SRB也是一类代谢谱较宽的菌群，可作为其生长底物的物质有氢、甲醇、C1-C18的脂肪酸、芳香族化合物等。 2 SRB的生理特性 SRB的一个重要生理特征是生长力强。它广泛存在于水田、湖、沼泽、河川底泥、石油矿床、反当动物的第一胃等地方。SRB生长速度快，含有不受氧毒害的酶系，因此可以在各种各样的环境中生存，保证了SRB有较强的生存能力。 SRB的另一生理特性是硫酸盐的存在能促进其生长，但不是其生存和生长的必要条件。在缺乏硫酸盐的环境下，SRB通过进行无SO42-参与的代谢方式生存和生长:当环境中出现了足量的流酸盐后，SRB则以SO42-为电子受体氧化有机物，通过对有机物的异化作用，获得生存所需的能量，维持生命活动。 3 SRB的代谢机理 一般来说，硫酸故还原菌的代谢过程分为以下三个阶段: (1)分解阶段在厌氧条件下，有机物被分解，并产生少量ATP。 (2)电子传递阶段前一阶段产生的高能电子通过SRB具有的电子传递链(如细胞色素C3等)逐级传递，产生较多的ATP。 (3)氧化阶段电子传递给氧化态的硫元素，将其还原为硫离子，同时消耗ATP提供能量。 4 SRB生长所需的碳源、氮源 SRB的不同菌属生长所利用的碳源是不同的，最普遍的是利用C3,C4脂肪酸，如乳酸盐、丙酮酸、苹果酸。近20余年来，由于选用不同碳源的培养基，SRB利用的有机碳源和电子供体的种类不断扩大，发现SRB还能利用乙酸、丙酸、丁酸和长链脂肪酸及苯甲酸等。SRB在利用多种多样的化合物作为电子供体时表现出了很强的能力和多样性，迄今发现可支持其生长的基质己超过lao种。另外，SRB除了能利用单一有机碳化物作为碳源和能源(化能有机生长)外，还可利用不同的物质分别作为碳源和能源。 不同的污泥来源，不同的驯化条件得到的生态系统中利用各种碳基质的SRB的分布必然有较大差别，从而表现为污泥对于各种碳源具有不同的消化能力，进而影响到它们对硫酸盐的还原速率。据研究报道，SRB利用乳酸、丙酸、丁酸、乙酸的硫酸盐还原速率依次降低。按盐是大多数SRB生长所需的氮源。据一些报道，某些SRB还能够固氮。一些菌种能够利用氨基酸中的氮作为氮源，少数菌种能通过异化还原硝酸盐和亚硝酸盐提供氮。1992, Boopathy分离出一株脱硫弧菌(Desccl fovibrio)能够利用硝酸盐，亚硝酸盐和2, 4, 6一三硝基苯(TNT)作为氮源和电子受体. 5 SRB还原硫酸盐的影响因子 (1)pH值 pH值是影响SRB的活性及发挥最佳代谢功能的重要生态因子之一，主要体现在: a ) pH值引起细胞膜电荷的变化，从而影响SRB对底物的吸收; b)影响SRB代谢过程中各种酶的活性与稳定性，改变生态环境中底物的可给性以及毒物的毒性: c)透过细胞膜的有机酸在SRB细胞内重新电离，改变胞内的pH值，影响许多生化反应的进行及ATP的合成。