河北大学
硕士学位论文
春兰内生细菌群落多样性及功能菌株筛选
姓名：邵红
申请学位级别：硕士
专业：微生物学
指导教师：孙磊
2011-06
摘 要
本研究将培养方法和构建16S rDNA克隆文库的方法相结合，研究了野生春兰根内生细菌的群落多样性，并从本实验室分离到的春兰内生细菌中筛选产铁载体和拮抗植物病原菌的功能菌株。
从野生春兰根内分离到了63株内生细菌，通过扩增rDNA限制性分析（ARDRA）和16S rDNA序列对其可培养细菌群落多样性进行了研究。分析结果显示：63株内生细菌分属于变形菌门的β-变形菌纲（31.75%）、γ-变形菌纲（7.94%）和厚壁菌门（60.31%）的5个属，最优势菌属为芽孢杆菌属。1个菌株可能为新属或新种。
构建了野生春兰根内生细菌16S rDNA克隆文库。16S rDNA克隆文库测序结果表明：188个克隆分别属于变形菌门的α-变形菌纲（5.85%）、β-变形菌纲（63.30%）、γ-变形菌纲（7.98%）和δ-变形菌纲（1.06%）；拟杆菌门（9.57%）、厚壁菌门（4.79%），放线菌门（1.60%）、酸杆菌门（0.53%）、门未定的纤线杆菌纲（1.06%），还有8个克隆未确定类群。变形菌门（78.19%）为最优势类群，伯克霍尔德氏菌属为最优势菌属。将培养方法和文库构建方法的结果相比较，发现克隆文库获得的群落结构信息更加丰富。
采用CAS检测法从春兰根内生细菌中筛选到了47株可产铁载体的功能菌，并结合16S rDNA系统发育分析对可产铁载体内生细菌多样性进行了研究。结果表明：这47株可产铁载体内生细菌分属于变形菌门的α-变形菌纲（17%）和β-变形菌纲（23.4%）、厚壁菌门（17.0%）、放线菌门（42.6%）的17个属。最优势菌属为芽孢杆菌属和贪噬菌属，并且贪噬菌属为高产铁载体的主体菌属。还有2个菌株可能为新属或新种。这些结果揭示春兰根内可分泌铁载体的内生细菌具有丰富的多样性，17个属中的类诺卡氏菌属、拟诺卡氏菌属、Solirubrobacter、Sphingopyxis、Pannonibacter、Alterierythrobacter等6个属的细菌还未见其可产生铁载体的报道。
通过平板拮抗法从459株春兰内生细菌中筛选出了1株对胶孢炭疽菌具有强拮抗作用的菌株。经过形态学观察和生理生化分析以及16S rDNA序列测定鉴定该菌株gt19-1为枯草芽孢杆菌。对gt19-1的无菌发酵液和粗提蛋白进行了胶孢炭疽菌抑菌活性的测定，无菌发酵液和粗提蛋白都具有抑菌作用，而发酵液中是否还有其他抑菌物质还需要进一步的研究。温室盆栽防效试验结果表明菌株gt19-1对辣椒炭疽病有一定的抑制作
用，防效达到了22%。
关键词内生细菌 ARDRA 16S rDNA克隆文库铁载体拮抗细菌
Abstract
In this study, the diversity of endophytic bacteria in the roots of wild Cymbidium goeringii was investigated by culture-dependent method and construction of 16S rDNA clone library. siderophore-producing and antagonist bacteria were screened from C. goeringii endophytic strains isolated in our laboratory.
A total of 63 strains were isolated from the roots of the wild C. goeringii. The diversity
of the culturable endophytic bacteria was analyzed by the amplified DNA restriction analysis (ARDRA) and 16S rDNA sequence analysis. The results showed that 63 strains belonged to 5 genera of proteobacteria (Betaproteobacteria, 31.75%; Gammaproteobacteria, 7.94%), Firmicutes, 60.31%); and the dominant genus was Bacillus. There may be one novel taxonomic unit.
The phylogenetic analysis of 16S rDNA clone library of endophytic bacteria in the roots
of wild C. goeringii revealed that 188 positive clones belonged to proteobacteria(Alphaproteobacteria, 5.85%; Betaproteobacteria, 63.30%; Gammaproteobacteria, 7.98%; Deltaproteobacteria, 1.06%), Bacteroidetes(9.57%), Firmicutes(4.79%), Actinobacteria(1.60%), Acidobacteria(0.53%), and Ktedonobacteria(1.06%). Eight clones could not be identified. The dominant phylogenetic group was proteobacteria(78.19%), Burkholderia was the dominant genus. The results suggested that the diversity of endophytic bacteria in C. goeringii roots obtained by the clone library was more abundant than it obtained by culture-dependent method.
Forty-seven siderophore-producing bacteria were screened from root endophytic strains
of C. goeringii by using chrome azurol S (CAS) agar plate assay. The diversity of siderophore-producing endophytic bacteria was investigated by 16S rDNA sequence analysis. Sequence analysis revealed that 47 strains belonged to 17 generas of proteobacteria (Alphaproteobacteria, 17%; Betaproteobacteria, 23.4%), Firmicutes, 17.0%, Actinobacteria,
42.6%. The dominant genera were Bacillus and Variovorax, and the strains of Variovorax produced relatively high levels of siderophore. In addition, there might be two novel taxonomic units. The results showed that there was abundant species diversity of siderophore-producing endophytic bacteria in the roots of C. goeringii. It was the first report Nocardioides, Nocardiopsis, Solirubrobacter, Sphingopyxis, Pannonibacter, and
Alterierythrobacter were isolated as siderophore-producing endophytic bacteria.
Among 459 endophytic strains isolated from the C. goeringii, strain gt19-1 with high activity to inhibit the Colletotrichum gloeosporioides Penz was screened by plate antagonistic method. According to morphological observation, physiological characteristics tests, and 16S rDNA sequence analysis, gt19-1 was identified as a strain of Bacillus subtilis. Both the sterile fermentation broth and crude protein of strain gt19-1 could inhibit C.gloeosporioides Penz; whether there are other antibacterial substances in the sterile fermentation broth, it is still needed to study in the future. The greenhouse control effect experiment showed that strain gt19-1 had biocontrol effect on the pepper anthracnose, the control efficacy was 22%.
Keyword endophytic bacteria ARDRA 16S rDNA clone library siderophore antagonistic bacterium
第一章 前言
第一章 前言
1.1 植物内生细菌研究动态
1.1.1 植物内生细菌的定义及分布
内生菌（Endophyte）一词由De Bary（1866）首先提出，是指生活在植物组织内的微生物，用以区分那些生活在植物表面的表生菌（Epiphyte），按此定义植物的致病菌、菌根菌也归属于内生菌的概念范畴[1]。Petrini（1991）将内生菌定义为那些在其生命周期的某一时期生活在活的植物组织内的菌[2]。Kloepper（1992）第一次提出了植物内生细菌（Endophytic bacteria）的概念，植物内生细菌是指能够定殖于植物细胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立和谐联合关系的一类微生物[3]。目前被大多数研究者所认可的植物内生细菌概念是由Hallmann（1997）所提出的，Hallmann认为植物内生细菌是指能够从表面消毒后的植物组织内分离到或者从植物内提取到，并且对植物不造成可见危害的细菌[4]。
植物内生细菌广泛分布于多种植物体内，具有极其丰富的多样性。研究表明已经从多种农作物、树木、中药植物中分离到了内生细菌，如棉花[5]、油菜和玉米[6]、棕榈[7]、爵床[8]和桔梗[9]。几乎所有的植物体内均存在着大量的内生细菌，内生细菌能够在植物体内长期定殖，成为了植物微生态系统的重要组成成分。不同的内生细菌占据着不同的生态位，它们之间能建立一种动态的平衡体系，其中有些属于优势种，有些属于稀有种，有些是有益的，有些是中性的，有些则是有潜在危害的；内生细菌与内生细菌之间、内生细菌与宿主植物之间充满和谐与竞争的微生态系统是在长期发育过程中共同进化的结果[10]。
1.1.2 植物内生细菌的生物学作用
内生细菌可存在于植物细胞内[11]、细胞间隙[12]以及维管系统中[13]。一方面植物内生细菌生长在植物体内，具有充足的营养物质，同时还受到植物的保护，不受外部环境条件的影响；另一方面植物内生细菌通过自身代谢，合成植物生长所需物质和能够拮抗病原菌的抗生素，或者通过与病原菌竞争营养物质，以及信号传导作用促进植物的健康生长。内生细菌还能够促进重金属污染区域的超积累植物生长、提高重金属的吸收，从而提高植物对重金属污染土壤的修复效果[14]。植物内生细菌具有广泛的有益生物学作
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用，在农业、医药、环境治理等领域中具有巨大的应用潜力。
1.1.
2.1 植物内生细菌的促生作用
内生细菌对植物促生作用的机制研究表明，植物内生细菌可以通过固氮作用[7]、溶磷[6]、铁螯合[15]、合成植物激素如吲哚乙酸（IAA）和细胞分裂素[16]以及合成某些酶如1-氨基环丙烷-1-羧基脱氨酶（ACC脱氨酶）[17]等方面来促进植物的生长。
近年来在多种农作物和牧草中发现了多种具固氮功能的内生细菌，成为生物固氮研究的新领域。Magnani等[18]从巴西甘蔗叶和茎中分离到了4株具有固氮活性的内生细菌，分别属于克雷伯杆菌属（Klebsiella）、肠杆菌属（Enterobacter）、泛菌属（Pantoea）和假单胞菌属（Pseudomonas）。多种植物生存于严寒、强风、高强度紫外辐射以及营养贫乏的极限环境下，Sheng等[19]从天山雪下植物中共分离到93株内生细菌，其中76.3%的细菌具有溶磷能力，这表明植物内生细菌能够促进宿主植物对土壤中磷的有效吸收。铁载体是一种能够高度结合铁离子的低分子量化合物，细菌合成的铁载体能够与植物病原菌竞争铁元素，从而达到抑制植物病害促进植物生长的作用。从香蕉[20]组织内分离得到一株能够拮抗香蕉枯萎病菌的内生细菌，经检测能够产生铁载体。
植物生长激素包括吲哚乙酸（Indole acetic acid）、赤霉素（Gibberellin）、细胞分裂素（Cytokinins）、脱落酸（Abscisic acid）、水杨酸（Salicylic acid）等。研究表明许多植物内生细菌可以合成植物生长激素，如从向日葵[21]中分离的两株属于芽孢杆菌属（Bacillus）的内生细菌能够合成大量的水杨酸，促进了秧苗的生长，还能够抑制植物病原菌Alternaria sp、Sclerotinia sp和Verticillum sp。Merzaeva等[22]从冬裸麦的根中分离到的杆状细菌能够合成IAA，用该杆状细菌与冬裸麦的种子混合种植后，提高了种子的发芽率，并且促进了幼苗的发育。
ACC脱氨酶能够催化ACC（合成乙烯的前体物质）转化，从而降低了植物体内乙烯的含量，促进植物的生长。Sgroy等[23]从盐培植物Prosopis strombulifera中分离耐高盐内生细菌，有6株细菌能合成ACC脱氨酶，能够降低根中乙烯的浓度，促进根的生长。
1.1.
2.2 植物内生细菌的生防作用
植物内生细菌的生物防治作用能够减少化学农药的使用，从生态和环境角度来说具有极大的应用潜力。植物内生细菌不仅对植物病原真菌、植物病原细菌具有防治作用，同时对植物虫害也具有一定的防治效果。其防治植物病原菌的机制主要有：①竞争生态
第一章 前言
位和营养。这些内生细菌进入植物体时,它们可以优先占据病原菌的入侵位点,与病原菌竞争营养物质,并可在入侵部位分泌产生抗菌物质,阻止病原菌的侵入,另外内生细菌也可产生嗜铁素类物质,与病原菌竞争铁离子,抑制病菌对铁的吸收,抑制病菌的生长[24]。
②产生抗生素。植物内生细菌产生的抗生素物质包括双乙酰藤黄酚（Phl）、吩嗪羧酸（PCA）、藤黄绿脓素（pyoluterin）、吡咯菌素（pyrolnitrin）、HCN和一类丁酰内酯（butyrolactones）[25]。由内生细菌合成的抗生素可以被植物体直接吸收，能够迅速拮抗植物病原菌的侵害。③合成水解酶。植物内生细菌能够合成胞外酶包括几丁质酶和葡聚糖酶，降解植物病原真菌的细胞壁来抑制植物病害。④诱导植物产生系统抗性(ISR，Induced systemic resistance)。许多研究表明能够诱导植物产生系统抗性的植物促生细菌包括植物根际细菌和植物内生细菌[26]。植物促生细菌诱导植物抗病性的可能机制为：产生抗微生物的低分子量化学物质；诱导一些水解酶类和氧化酶类；诱导病程相关蛋白的产生[27]。
研究表明植物内生细菌在防治植物病害的过程中，可能包含以上一种或者几种机制，如从不同生长阶段的棉花[28]根中共分离到537株内生细菌，筛选到了39株能够拮抗3种植物病原菌（Verticillium dahliae Kleb V107和V396，Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum）的细菌，这39株内生细菌都能够产生铁载体，其中18株能合成蛋白酶，15株能合成几丁质酶，1株能合成纤维素分解酶和果胶酶。
目前，植物内生细菌对植物害虫的防治研究还不多，利用植物内生细菌防治植物虫害是一个潜力巨大的新型领域。张雪兵[29]等从醉马草中分离到了1株对棉蚜虫有明显毒杀作用的内生细菌GA，属于链霉菌属（Streptomyces），为开发新的生物源农药提供了生物源物质。Ferreira[30]等发现一株gfp（绿色荧光蛋白）基因标记的植物内生细菌可以定殖于水稻幼苗内，同时在食用水稻幼苗的Spodoptera frugiperda幼虫内也发现了该gfp 基因标记细菌的存在，这表明植物内生细菌能够通过害虫噬咬宿主植物进入害虫体内，如果将gfp基因换成别的基因段如编码蛋白酶抑制剂的基因，这将为防治重要经济作物虫害提供了新的有效途径。
1.1.
2.3植物内生细菌促进植物修复作用
由于过度使用化学农药、直接排放重工业污水以及大量堆积生活垃圾等，大面积的土地和水源已经成为了各种有毒化学物质的聚集体，如果不加以治理，这些有毒物质的可扩散性会使污染范围逐渐扩大。植物修复技术，是以植物忍耐和超量积累某种或某些
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化学元素的理论为基础，利用植物及其共存微生物体系，清除环境中污染物的一门环境污染治理技术；根据其作用过程和机理，重金属污染土壤的植物修复技术可归为3种类型：（1）植物吸取（phytoextraction）；（2）植物挥发（phytovolatilization）（3）植物稳定（phytostabilization）[31]。
研究发现，一些植物内生细菌耐金属、能降解污染物，还能够促进超积累植物的生长，利用植物-内生细菌联合体修复污染成为植物修复新的研究开发领域。分离自耐金属鸭草[32]的49株抗铅内生细菌中，有7株可产生ACC脱氨酶、IAA和铁载体，鸭草接种这7株内生细菌后，地上组织的铅污染物含量增加了58%-62%。目前对于可挥发性污染物如三氯乙烯（TCE）的生物修复进展并不乐观，由于植物根际以及内生细菌无法降解这些物质，通过蒸腾作用挥发后污染周围的空气。Weyens[33]等将TCE代谢基因导入植物内生细菌Pseudomonas putida W619-TCE中，将该细菌接种到生长在TCE污染土壤中的白杨树根部，野外监测结果显示降低了90%的TCE蒸发量。Taghavi[34]等将甲苯代谢基因导入分离自黄白羽扇豆的Burkholderia cepacia VM1468，接种至处于甲苯污染区域的白杨树中，既促进了白杨树的生长，又大大降低了蒸腾作用所释放出的甲苯量。这些研究证明基因工程手段可以改造天然植物内生细菌，从而提高植物对污染环境的修复作用。
1.1.
2.4植物内生细菌合成天然活性物质
现在化学合成药物普遍存在副作用，且制造成本比较高，这些问题迫使人们将焦点转向了天然活性物质的开发。由于微生物资源丰富，且代谢产物繁多，利用微生物发酵产生代谢物已经成为获得天然活性物质的重要途径之一。而植物内生细菌多样性非常丰富，且一些内生细菌的宿主植物为药用植物，这些内生细菌可能具有同宿主植物相同的代谢产物合成途径。以植物内生细菌的代谢物进行天然活性物质的开发如今已成为研究热点。
目前发现多种植物内生细菌能够产生天然活性物质包括抗生素和抗肿瘤活性物质，其中多是植物内生放线菌。Bieber[35]等发现了一种新型萘醌抗生素—Alnumycin，是由一株属于链霉菌属的植物内生细菌所产生的。从药用植物Kennedia nigriscans中分离得到的菌株Streptomyces NRRL 30562，经研究发现其可产生一种广谱抗生素—Munumbicins A、B、C、D，对多种人类致病菌具有杀菌活性[36]。Castillo[37]等又从蕨类植物Grevillea pteridifolia中分离到一株内生细菌Streptomyces NRRL 30566，从代谢产物中筛选到一种
第一章 前言
新型抗生素Kakadumycins，对炭疽芽孢杆菌具有抗菌活性。分离自西双版纳药用植物的165株内生放线菌，经抗菌、抗肿瘤活性测定后，筛选出一株对真菌及肿瘤细胞均有高抑制活性的菌株D62，并从次级代谢产物中分离到了6种抗生素，其中一种经分析确定为新型化合物[38]。这些研究表明植物内生放线菌是产生抗生素和生物活性物质的重要微生物资源。随着研究领域的扩大，发现其他类群的植物内生细菌也可能具有合成抗肿瘤活性物质的潜力，李洁[8]等从西双版纳植物爵床中分离到了两株具有较强抗癌活性的内生细菌YIM 56077 和 YIM 56081，属于芽孢杆菌属。
1.1.3 植物内生细菌多样性的研究状况
目前植物内生细菌多样性的研究方法主要包括：需培养方法、非培养方法。而表面灭菌方法是培养方法和非培养方法成功的关键，植物组织经表面灭菌后，才能够应用于植物内生细菌的研究。目前研究证明，表面灭菌方法能够有效去除植物组织表面附着的所有微生物，所得到的菌株为内生细菌。国内外进行植物内生细菌研究时所使用的表面灭菌方法包括：利用表面消毒剂如次氯酸钠[39]、氯阿唑丁[40]、升汞[41]等杀死植物组织表面的微生物，或者利用物理除菌如紫外照射[42]等，表面消毒剂方法如今被广泛应用。表面灭菌的同时需要设置空白对照，以检测灭菌是否彻底。灭菌条件的强弱直接关系到分离的内生细菌的数量和种类，过弱则会导致表面灭菌不彻底，从而“扩大”内生细菌的多样性，过强则会导致内生细菌被大量杀死，从而丢失内生细菌，所以选择有效的灭菌条件对研究内生细菌的多样性及其相关功能至关重要[43]。
不同的研究目的选择不同的研究方法，如功能菌株筛选则采用需培养方法获得；而对植物内生细菌多样性的研究则可采用培养和非培养方法相结合、多种非培养方法相结合，从而获得更加全面的群落多样性和群落动态变化。
1.1.3.1需培养研究方法
分离培养方法对微生物群落结构的丰富以及新物种资源的发现起到了重要作用，同时还为微生物特性和功能应用研究提供了研究对象。但是由于不同环境中微生物生长繁殖的原位条件难以模拟，只能够获得有限微生物资源。为了能够客观的研究不同生境的微生物多样性，获得丰富的可培养微生物资源，许多研究人员对传统需培养研究方法进行了改进。微生物学研究者解决微生物可培养性低的策略包括：加富培养、混合培养、稀释培养、自然培养等[44]。戴欣[45]等采用普通和稀释培养基研究太湖沉积物可培养细菌
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的多样性，发现在稀释培养基上生长的细菌数量普遍是在普通牛肉汁琼脂培养基上生长的细菌数量的3-5倍，同时采用两种培养基有助于分离到更多种微生物。叶姜瑜[46]等设计出一种有孔培养皿，皿内覆盖有不允许细菌通过、但营养物质可以自由流动的微孔滤膜，研究结果表明近自然纯培养法在一定程度上有增强部分微生物可培养性的作用。
目前，研究者也对植物内生细菌分离方法进行了优化。利用不同的培养基能分离出多种内生细菌，但是由于培养基营养物质成分、离子浓度、氧化还原电位以及酸碱度等条件的不同，导致不同的培养基对于微生物具有不同的选择性；为了更客观全面的研究植物内生细菌的多样性，高效、系统的分离植物内生细菌，有必要选择出高效的分离培养基[47]。夏冬亮[48]等从8种培养基中筛选分离毛竹内生细菌的适宜培养基，结果表明R2A培养基、YG培养基和0.1×LB培养基分离毛竹内生细菌可以达到较为理想的分离效果。
通过需培养研究方法，研究人员已经从多种植物中分离到了内生细菌，并从中筛选出功能菌株。史应武[49]等采用植物组织研磨法对天山北坡甜菜内生菌进行了分离，得到的内生菌多为内生细菌，其中假单胞菌和芽孢菌类是优势内生细菌群。张国霞[50]等采用研磨法从野生稻中分离到了36株内生细菌，其中21株具有固氮和溶磷能力。田小曼[51]等以青蒿为植物材料分离到了43株内生细菌，从中筛选出9株对植物病原真菌具有较高抗菌活性的内生细菌。分离自桑叶的一株内生细菌L144经研究发现对多种植物病原真菌及病原细菌均有较强的抑制作用[52]。
1.1.3.2 非培养研究方法
通过培养方法分离得到的植物内生细菌仅涵盖了植物体中细菌总量的很少一部分，不足以反映其细菌群落多样性，同时人为培养条件会偏离植物内生细菌的生境，导致植物内生细菌群落结构改变。如今利用分子技术研究微生物多样性的非培养方法越来越多的应用到了植物内生细菌的研究中。植物内生细菌的非培养研究方法主要是基于PCR 的分子生物学方法，如限制性片段长度多态性分析（ARDRA）[53]、末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）[54]、变性梯度凝胶电泳（DGGE）[55]、核糖体内转录间隔区扩增序列长度多态性分析（ARISA）[56]、 16S rDNA克隆文库构建[57]和单链构象多态性（SSCP）[58]以及不依赖于PCR的分子生物学方法如基因芯片（Gene Chip）[59]。
1）限制性片段长度多态性分析（ARDRA）
限制性片段长度多态性分析（ARDRA）是用限制性内切酶消化扩增后的细菌16S
第一章 前言
rDNA，通过凝胶电泳分析微生物种群多样性的分子标记技术，该技术在微生物生态学领域有着广泛的应用[60]。ARDRA技术可在16S rDNA序列上区分细菌种（species）的差异，每一个特有的ARDRA类型代表了一个可操作分类单元OTU（operational taxonmic unit），用这种方法显示的OTUs多样性可以用于估计样品中存在的最低限度的细菌种的数目[61]。ARDRA主要应用于细菌鉴定及克隆文库分析，也可用于微生物群落的研究[62]。Santacruz[53]等采用克隆文库和ARDRA对墨西哥番茄根内生细菌以及根周围土壤细菌的多样性同时进行分析，在番茄根内生细菌和根周围土壤细菌中都发现了伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）、芽孢杆菌属、假单胞菌属和Stenotrophomonas这四个优势菌属，推断番茄根内生细菌来自于土壤中。De Los Santos[63]等应用ARDRA和DNA杂交对玉米和咖啡中伯克霍尔德氏菌属的内生细菌多样性进行了分析，结果发现该属细菌中除了唯一已知的固氮种Burkholderia vietnamiensis，还有其他种也具有固氮能力，同时证明了具有固氮能力的伯克霍尔德氏菌属内生细菌广泛存在于不同地理位置的不同植株内。2）末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）
末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）是以荧光标记引物PCR为基础，根据末端限制性片段长度区分出微生物群体组成的一种微生物群体图谱法[64]。它建立在PCR的基础上，可以检测到环境中所有的菌，包括活菌（可培养的和不可培养的）和未降解的死菌[65]。T-RFLP在电泳中采用荧光作为检测对象，是一种比较灵敏的分析方法，同时，可使用多种酶进行酶切，有效地提高了识别能力；另外，T-RFLP拥有丰富的网络共享资源，可以使分析更为高效[66]。Rasche [67]等通过T-RFLP和构建16S rDNA克隆文库相结合研究低温和品种对于甜椒内生细菌群落多样性的影响，结果表明相对于低温，甜椒品种对于其内生细菌群落多样性的影响更大。
3）变性梯度凝胶电泳（DGGE）
变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术在含有浓度线性递增的变性剂（尿素和甲酰胺的混合物）的聚丙烯酰胺凝胶电泳中对PCR产物分离，部分解链的双链DNA分子的电泳迁移率降低；而序列不同的DNA分子有着不同的解链行为，它们在凝胶的不同位置停止迁移从而使长度相同而序列不同的DNA片段分离[68]。DGGE技术具有可靠、可重复、快速和容易操作等特点，结合PCR扩增标记基因或其转录物（rRNA和mRNA）的DGGE 能直接显示微生物群落中优势组成成分；由于它可同时对多个样品进行分析使之非常适合调查微生物群落的时空变化，而且可能通过序列分析切下的带或通过与独特的探针杂
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交鉴定群落成员[69]。Andreote[70]等将一株对马铃薯晚疫病菌具有抑制作用的内生细菌Pseudomonas putida P9接种在马铃薯上，采用DGGE技术研究菌株P9对马铃薯内生细菌种群的影响。
4）核糖体基因间隔区自动分析（ARISA）
核糖体基因间隔区分析（ribosomal intergenic spacer analysis, RISA）方法是利用细菌群落概览图谱间的相似度对生态系统的空间异质程度进行定量分析[71]。细菌16S和23S rDNA间隔片段（ITS）是编码决定细菌种类tRNAs的区域，长度和核苷酸序列具有极大多样性，RISA方法是对细菌总DNA中的ITS片段进行扩增，扩增混合物电泳后经银染色法获得图谱[72]。ARISA是在RISA的基础上经过改进形成的更加方便、准确的方法。ARISA方法与RISA的不同之处在于PCR引物是荧光标记的寡核苷酸引物，通过自动化毛细管电泳系统对扩增产物进行分析，即使样品数量很多也能够快速的分析其细菌群落结构[73]。Manter[56]采用ARISA和焦磷酸测序两种分子技术对马铃薯内生细菌群落进行研究，ARISA结果显示不同品种的马铃薯内生细菌群落结构具有显著差异。
5）16S rDNA克隆文库
目前，环境16S rDNA序列比对已经成为获得自然及人工系统细菌多样性非培养方法的金则[74]。不同种的16S rDNA在结构上具有特异性，依据其保守性和特异性可确定它们系统发育的相关性或进化距离，以16S rDNA为模板，使用特异性引物对未知样品的总DNA进行16S rDNA扩增，将产物克隆到载体，通过构建克隆文库分离不同的序列，再通过测序与GeneBank数据库中已知菌种的16S rDNA序列比对，鉴定其分类地位[75]。Sagaram[57]等通过16S rDNA克隆文库研究感染黄龙病柑橘的内生细菌多样性，结果表明Candidatus Liberibacter asiaticus是引起柑橘黄龙病的病菌。
6）单链构象多态性（SSCP）
单链构象多态性（SSCP）是一种建立在单链DNA片段形成的二级结构微分迁移基础之上的指纹识别方法。在非变性条件下，单链DNA片段会依据其核苷酸序列和物化环境（温度和离子强度）聚合成二级结构[58]。将研究样品的PCR扩增产物的双链DNA 变性，接着形成二级结构的样品在非变性凝胶上进行电泳所产生的带型能够反映该样品的细菌群落结构[76]。SSCP技术多应用于基因变异或者土壤微生物的研究，近几年来已经被应用到植物内生细菌研究领域。Widayati[77]等利用SSCP技术检测甘蔗内生细菌的存在，结果表明甘蔗组织内存在着内生细菌，并且在不同的发育阶段（外植体、分化组
第一章 前言
织、愈伤组织）中都存在内生细菌。
7）基因芯片（Gene Chip）
基因芯片是采用原位合成或者直接点样的方法将DNA片段或寡核苷酸片段排列在滤膜、硅片、玻璃等介质上形成微矩阵，待检样品用同位素或荧光分子标记后，与微矩阵杂交，通过扫描及计算机分析即可获得样品中大量的基因序列及表达信息，以达到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的[59]。Sagaram[57]等通过高密度进化16S rDNA 基因芯片对染黄龙病柑橘的内生细菌进行研究。Wang[78]等将一株内生细菌Pseudomonas fluorescens FPT9601-T5定殖于拟南芥的根部，通过基因芯片技术来统观内生细菌与拟南芥之间基因的交流，结果发现拟南芥假定生长素调控基因和结瘤素类基因表达升高，而乙烯反应基因表达降低。
1.2 本研究立题依据和研究内容
植物内生细菌是植物微生态系统的重要组成成分，具有广泛的有益生物学作用如促生、生防、促进植物修复、合成天然活性物质等，在农业、医药、环境治理等领域中具有巨大的应用潜力。目前植物内生细菌在农业应用方面的研究主要集中在促进植物生长和拮抗植物病害等方面。植物内生细菌通过产铁载体可向植物提供可利用的铁元素，或者减少环境中病原菌可利用的铁而降低病原菌的竞争力，从而达到促进植物生长的作用；而植物内生细菌对于植物病原菌的拮抗作用则促进了新型农药的开发利用。
兰花被孔子誉为“王者香”，而兰属中的春兰一直是观赏花卉中的上品。野生春兰（Cymbidium goeringii）由于其花形独特具有更大的观赏价值和经济价值，对野生春兰资源的开发利用成为当务之急。目前对于野生春兰植物内生细菌群落多样性的研究还处于空白状态。本实验选用浙江天目山的野生春兰作为材料，通过分离培养方法和构建16S rDNA克隆文库对野生春兰根内生细菌的群落多样性进行研究；还对本实验室分离到的春兰内生细菌进行可产铁载体和拮抗植物病害功能菌株的筛选。这有利于阐明内生细菌与野生春兰的互作关系，从而更好的开展野生春兰驯化以及栽培繁育技术的研究工作。同时丰富了植物内生细菌资源库，为有益内生细菌的综合利用提供科学依据。
本论文研究内容主要包括：
1）采用扩增rDNA限制性分析（Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis, ARDRA）及16S rDNA序列分析对野生春兰根可培养内生细菌的群落多样性进行研究。
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2）构建16S rDNA克隆文库对野生春兰根内生细菌群落多样性进行研究，并与分离培养方法的研究结果进行比较。
3）从本实验室分离到的春兰根内生细菌中筛选可产铁载体菌株，并结合16S rDNA系统发育分析对可产生铁载体的春兰根内生细菌群落多样性进行研究。
4）从本实验室分离到的春兰内生细菌中筛选出分别对8种植物病原菌有拮抗作用的菌株，对拮抗活性较高的菌株鉴定其种属，并进行温室防效实验。
第二章 野生春兰根可培养内生细菌群落多样性
第二章 野生春兰根可培养内生细菌群落多样性
随着对植物内生细菌的深入研究，通过分离培养方法已经从不同种类的植物中分离到了内生细菌，这既丰富了微生物群落结构，还对新物种资源的发现起到了重要作用。可培养内生细菌是宝贵的菌种资源库，为我们提供了微生物特性和功能应用的研究对象，需要进一步的开发和深一步的研究。我们选用野生春兰的根进行内生细菌的分离培养，通过扩增rDNA限制性分析（Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis, ARDRA）及系统发育分析对其可培养内生细菌群落多样性进行了研究。这有利于阐明内生细菌与野生春兰的互作关系，同时丰富了植物内生细菌资源库，为有益内生细菌的综合利用提供科学依据。
2.1 材料与方法
2.1.1 植物材料
植物材料于2009年3月采集自浙江省天目山。放于4℃冰箱中保存。
2.1.2 分离培养基
R2A培养基：酵母浸粉0.5g，示蛋白胨0.5g，酸水解酪素0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，K2HPO4 0.3g，MgSO4 0.05g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH为7.2±0.2，121℃灭菌20 min。
TSA培养基：胰蛋白胨17.0g，大豆蛋白胨3.0g，葡萄糖2.5g，NaCl 5.0g，K2HPO4 0.5g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH为7.3，121℃灭菌20 min。
2.1.3 主要试剂及仪器
引物由北京英骏生物技术有限公司合成；Taq DNA聚合酶、dNTP购自北京天根生化科技公司；限制性核酸内切酶购自TaKaRa 公司；PCR仪（Biometra，Germany），电泳仪（BG-power 600，Baygene）。
2.1.4 野生春兰根内生细菌的分离
取采集的野生春兰根进行表面灭菌。无菌水冲洗根表面土壤，1 g样品用100 mL的75%乙醇浸泡3 min，100 mL3%的次氯酸钠溶液浸泡2 min，75%乙醇清洗30 s，无菌水冲洗5 次，无菌滤纸吸取多余水分[43]。将根置于无菌研钵中，加入10 mL无菌生理盐
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水（浓度0.85%）及少量的无菌石英砂研磨，取匀浆液梯度稀释后，涂布R2A和TSA 培养基平板，各设三个平行，28℃培养5 d。挑取不同形态的菌落，平板划线法纯化后于4℃冰箱中保存。
将表面灭菌中最后一次冲洗的水取300 μL涂布于TSA平板上，并且将表面灭菌后的根在TSA平板上按压涂布，各设三个平行。培养5 d，检测表面灭菌是否彻底。如平板上无菌落，则证明材料表面灭菌彻底。否则，分离结果不可用。
2.1.5 根内生细菌的16S rDNA序列扩增
菌落裂解法[79]制备反应模板：无菌牙签挑取单个菌落到PCR管中，悬浮于无菌ddH2O中，煮沸5 min，冰浴5 min，循环2次，5000 r/min离心1 min，吸取8 μL上清液作为PCR扩增的DNA模板。
采用细菌16S rDNA通用引物27F[80]:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R[80]: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行扩增。
PCR反应体系（50 μL）为10×PCR buffer，5 μL；dNTP(2.5 mmol/L)，4 μL；27F(10 μmol/L)，2 μL；1492R(10 μmol/L)，2 μL；Taq DNA polymerase(5 U/μL)，0.6 μL；Target DNA，10-100ng；ddH2O加到50 μL。
PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，54℃退火45 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
2.1.6 根内生细菌的ARDRA分型
以限制性核酸内切酶HaeⅢ、RsaⅠ对PCR产物进行酶切分型，酶切体系（20 μL）为10× buffer，2 μL；HaeⅢ，0.5 μL（ RsaⅠ，0.5 μL）；PCR产物，5-10 μL； ddH2O 加到20 μL。
37℃酶切4h，酶切产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳，1×TAE电泳缓冲液，80V电泳1h。分析酶切电泳图谱。
2.1.7 根内生细菌的16S rDNA序列测定及系统发育分析
将2种酶切图谱完全相同的菌株划分为一个组，每组随机挑选代表菌株进行16S rDNA序列测定。
测序结果利用BLAST软件（https://www.doczj.com/doc/b53457032.html,/blast/Blast.cgi）与GenBank 数据库中的序列进行比对分析，选取同源性最高的且有效发表的菌株序列，利用
第二章 野生春兰根可培养内生细菌群落多样性
MEGA4.1软件（https://www.doczj.com/doc/b53457032.html,/mega4.1.htmL）进行分析，用Clustal W按照最大同源性的原则进行排序，采用Kimura-2计算核苷酸差异值，最后用邻接法（neighbor-joining method）构建系统发育树[81]。
2.2 结果
2.2.1 野生春兰根内生细菌的种群数量
将采集的野生春兰根样品进行表面灭菌后进行内生细菌的分离培养，同时对表面灭菌效果进行检测。5 d后检测平板无菌落形成，证明表面灭菌彻底，分离结果可用。根据菌落形态进行分类，编号，纯化，最终从野生春兰根中共得到内生细菌63株，其中R2A培养基中得到56株，TSA培养基中得到7株。R2A培养基获得的内生细菌种群数量为4×104 cfu/g fw，TSA培养基获得的细菌种群数量为0.5×104 cfu/g fw。
2.2.2 野生春兰根内生细菌的16S rDNA序列扩增
将分离到的63株内生细菌以细菌16S rDNA通用引物27F和1492R 进行PCR 扩增，得到的扩增片段长度约为1500bp。部分结果如图2-1：
1500bp
图2-1内生细菌16S rDNA片段的扩增产物
Fig.2-1 16S rDNA PCR amplification of the endophytic bacteria
Marker: 100bp Marker
2.2.3 野生春兰根内生细菌的ARDRA分型
以限制性核酸内切酶HaeⅢ、RsaⅠ分别对16S rDNA序列扩增产物进行酶切，经HaeⅢ酶切得到12种酶切图谱，RsaⅠ酶切得到11种酶切图谱，将两酶的酶切图谱完全相同的菌株划分为一个组，部分酶切图谱如图2-2，63株内生细菌划分为12个组（表2-2）。