实验一人外周血淋巴细胞总RNA的提取、电泳
一、实验目的
学习并掌握人外周血淋巴细胞总RNA的分离提取及琼脂糖凝胶电泳检测方法。
二、实验原理
细胞的总RNA主要由rRNA、tRNA及mRNA组成，其中rRNA含量最多（占80%~85％）。在pH 6.0微酸环境下，RNA相对稳定，碱性环境下，易分解。
RNA酶极为稳定且广泛存在于细胞内外，环境中存在大量RNA酶，极易降解RNA，因而在RNA提取及相关分析实验中，如何避免RNA酶的污染及抑制内源和外源性RNA活性,是实验成败的关键。
在RNA相关实验过程中，须树立RNase-free思想：1）样品新鲜，保存得当，以强变性剂，防止内源性RNase；2）人体上遍布RNase,养成操作时勤换一次性手套和口罩的好习惯；3）空气中灰尘和细菌含RNase，应建立干净的操作环境；
实验介绍如何使用Takara公司的RNAiso Plus试剂来分离人外周血淋巴细胞的总RNA。RNAiso Plus是一种酸性苯酚提取试剂，含有去垢剂，和使RNase 失活的异硫氰酸胍，它能在破碎和溶解细胞时保持RNA的完整性，防止RNA 降解。（注意：RNAiso Plus具有强烈腐蚀作用，小心操作。）
三、实验材料、试剂与器材
1、人外周血淋巴细胞（5х106）
2、DEPC水溶液，PBS，TAE
3、氯仿，异丙醇，乙醇均为分析纯
4、RNAiso Plus试剂购自Takara公司
5、无RNase的枪头（1000、200、20 ul），离心管(0.2ml、0.5ml PCR管,1.5ml、2ml、7ml离心管)。
6、PE手套、离心机
四、实验步骤
1.RNA提取前的准备
1）、塑料制品的处理：
0.05-0.1%的DEPC （焦碳酸二乙酯水）浸泡过夜：
●必须保证塑料制品被水浸透，内部没有气泡，对于小枪头、0.2ml、0.5ml PCR
管，必要时应用枪逐个的用水灌注（这一步对于以后的实验保证非常重要，须小心操作）。
●泡过夜后，用镊子逐个敲去管内的DEPC水，装于干烤过的烧杯，加锡箔纸
密封杯口；尽量敲去枪头内的水，装于处理过的枪头盒，报纸包好。
●121℃，30分钟高压灭菌，以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作
用而破坏mRNA活性，且抑制后继酶促反应，烘干，备用。
●DEPC是蛋白质强变性剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑
制酶活性。具强挥发性，致癌物,因而使用时应在通风橱操作，需戴一次性手套，一次性口罩，小心操作。
2）、试剂的配制：
试验所用试剂也可用DEPC处理过夜，再高压灭菌,但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理，可用DEPC处理的水配制，并尽可能用未曾开封的试剂，然后高压灭菌。
所需烧杯等必须干烤处理以后方可用。
0.05-0.1‰的DEPC水（三蒸水），磁力搅拌器搅拌过夜或者摇床低速振荡过
夜，121℃，30分钟高压灭菌。
2.RNA的提取：
用淋巴细胞分离液分离人外周血淋巴细胞（PBMC），体外培养
取5х106个体外培养的PBMC悬液置于EP管中，离心收集细胞沉淀
向EP管中加入1ml RNAiso Plus裂解细胞，用移液枪反复吹吸，直至裂解液中无明显沉淀
室温（15-30℃）静置5 分钟，然后从核蛋白中分离RNA
加入氯仿（RNAiso Plus 的1/5 体积量），盖紧离心管盖，混合至溶
液乳化呈乳白色，室温静置5 分钟
12,000 g 4℃离心15 分钟。从离心机中小心取出离心管，此时溶液分为三层，即：无色的上清液（含RNA）、中间的白色蛋白层（大部分为DNA）及带有颜色的下层
有机相。
小心吸取上层无色水样层转移至一新EP管中
向上清中加入0.5-1 倍RNAiso Plus 体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，
室温下静置10分钟。
12000g，4o C离心10min，轻轻倒去上清
加入与RNAiso Plus 等量的乙醇洗涤RNA沉淀一次，7500r/min，4o C离心5min
弃上清，倒置EP管，5-10min空气干燥（勿完全干躁，难再溶），加入20ul的DEPC水溶
解沉淀
注意：异硫氰酸胍是很强的蛋白变性剂，但它不能使RNA酶发生不可逆失活。因此，假如去蛋白后，样本被残余的RNA酶污染，这些酶会在变性剂去除后，重新恢复活性。因此，将水相中RNA彻底从有机相中分离出，并避免通过脏的容器和手套重新被蛋白污染，这点很重要。
3、琼脂糖凝胶电泳检测
1）、3%过氧化氢浸泡电泳槽、胶板、梳子30分钟以上后，以DEPC处理的水冲洗，备用；
2）、以DEPC处理的水稀释50хTAE（DEPC处理的水配制，高压灭菌）为1хTAE
备用；
3）、用以上1хTAE配制1%琼脂糖凝胶电泳胶；
4）、电泳5V/cm 电泳20min
5）、电泳完毕后，在凝胶成像系统上照相分析，电泳图谱：28s和18 s条带清晰、28s亮度是18s亮度的2倍以上
实验二反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增CCL-17基因
一、实验目的
通过本实验掌握RT-PCR工作原理及操作方法。
二、实验原理
逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR) 是间接对某一特定的RNA分子的扩增，可分作相对独立的两个步骤：即RT（将mRNA反转录成cDNA）和PCR（通过聚合酶链式反应扩增特定的cDNA）。其原理是：由总RNA或poly(A)+RNA(mRNA) 采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以此cDNA为模板以特定的寡核苷酸作引物进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因。
本实验通过RT-PCR法扩增的基因为人趋化因子17基因，即CCL-17，该基因编码的CCL-17蛋白是一种由人淋巴细胞分泌的细胞因子，具有趋化T淋巴细胞定向移动的生理功能，在抗肿瘤免疫中有重要作用。
（一）、反转录酶的选择：
1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H 活性相对较弱；2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性；3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构；4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
（二）、合成cDNA引物的选择：
1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物
在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA；
2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物得到的cDNA 在数量和复杂性方面均要小；
3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR 扩增。
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。起始RNA模板质量、纯度对本实验至关重要，必须完整，且不被基因组DNA污染。
三、实验材料、试剂与器材
1．第一链cDNA合成试剂盒（Takara公司）
2、模板RNA(上次实验提得)
3．包含Taq DNA聚合酶、dNTPmix及反应Buffer的PCRmix试剂盒（Takara）4、人CCL-17基因的特异性引物（委托广州英骏公司合成）
四、实验步骤
1. cDNA第一链的合成
目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以Takara公司提供的PrimeScript II RTase一链合成试剂盒为例。
（1）在Microtube 中配制下列混合液。
Oligo dT Primer（50 μM）1μl
dNTP Mixture（10 mM each）1μl
模板RNA Total RNA：5 μg 以下
RNase Free dH2O Up to 10 μl
（2）65℃保温5 min 后，冰上迅速冷却。
（3）在上述EP管中配制下列反转录反应液，总量为20 μl。
上述变性后反应液10μl
5×PrimeScript II Buffer 4μl
RNase Inhibitor （40 U/μl）0.5μl（20 U）PrimeScript II RTase（200 U/μl）1μl（200 U）
RNase Free dH2O Up to 20 μl
（4）缓慢混匀。
（5）按下列条件进行反转录反应：
42℃30～60 min
（6）95℃ 5 min （酶失活）后，冰上冷却。
2. PCR扩增CCL-17基因
（1）取PCR管，依次加入下列试剂：
2×PCR mix 12.5μl
上游引物（10pM）1μl
下游引物（10pM）1μl
第一链cDNA 1μl
ddH2O 9.5μl
Total 25μl
（2）轻轻混匀，离心；
（3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增30个循环。
条件： 1. 94℃5min
2. 94℃40sec
3. 55℃40sec
4. 72℃40sec
5. 72℃5min 10. 4℃
Forever
（4）电泳鉴定：进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；
（5）密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描,检测相对表达量。
30cycles
五、注意事项
1．逆转录反应过程，需建立无RNAase环境，以避免RNA的降解；
2．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；
3．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量，防止假阴性，常用的内参有G3PD （甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等；
4．防止DNA的污染：
（1）可采用DNA酶处理RNA样品。
（2）在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA 的共线性。
实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳
一、实验目的
学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测质粒DNA的纯度、浓度与分子量。
二、实验原理
琼脂糖（agarose）是一种直链多糖，是由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线型多聚糖。由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联，因此与琼脂一样能形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基团，不引起DNA 变性，不吸附被分离的物质，是一种很好的凝胶剂。45℃开始形成多孔性刚性滤孔，孔径大小决定于琼脂糖浓度。
DNA分子碱性环境下带负电荷，外加电场作用下，从负极向正极移动，兼具电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，以分出不同区带。
EB（溴化乙锭）为扁平状分子，与DNA分子形成EB-DNA复合物，在UV 照射下，发射荧光，且荧光强度与DNA质量成正比，以肉眼观察，可检测5ng 以上的DNA。（注意：EB分子具有强致癌性，请小心使用。）
三、实验材料、试剂与器材
质粒DNA、微波炉、电泳仪、微型电泳槽、天能凝胶成像系统、三角瓶（250ml）琼脂糖、50хTAE、6хloding buffer、EB母液（0.5mg/ml）
四、实验步骤
(一) 制胶
1．选择大小合适的电泳制胶板，选择孔径大小适宜的点样梳，水平而垂直地架在封好的电泳制胶板的一端，使点样梳底部离电泳槽水平面的距离为0.5－
1.0mm；
2．按被分离DNA分子的大小，确定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，
可参考下表：
琼脂糖的含量（%）分离线状DNA分子的有效范围（Kb）
0.3 60~5
0.6 20~1
0.7 10~0.8
0.9 7~0.5
1.2 6~0.4
1.5 4~0.2
2.0 3~0.1
称取适量琼脂糖，加入装有适量1х电泳缓冲液的三角瓶中，摇匀，置微波炉中加热，直至琼脂糖融化均匀（琼脂糖极易暴沸，加热时间不能过长，一般在加热一分钟后，数十秒地进行直至溶解均匀，沸腾时的琼脂糖溶液不能摇晃以免溶液扑出）, 加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发；
3．待凝胶溶液冷却至60℃左右时，加入最终浓度为0.5μg/ml的EB，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；
4．待凝胶冷却凝固后，小心拨出梳子,保证点样孔完好，将凝胶放入电泳槽内，加入电泳缓冲液至液面覆盖凝胶2-3mm，排出点样孔内气泡（制备琼脂糖凝胶和进行电泳所用的电泳缓冲液必须一致）。
(二) 点样
待测的DNA样品中加1/5体积的6x溴酚蓝指示剂，混匀后小心地进行点样，记录样品次序与点样量，点样量于点样孔大小匹配（如果DNA浓度较大，加的体积较小，就须加水或电泳缓冲液补足到规定体积，再加溴酚蓝指示剂混合均匀后点样），点样时枪头垂直，防止碰坏凝胶孔壁，带型不齐。
(三) 电泳
1．打开电源开关，DNA的迁移速度与电压成正比，与琼脂糖含量有关。根据需要设电压为1—5V/Cm，本实验选择5v，当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高，根据溴酚兰条带估计电泳位置；
2．电泳时间看实验的具体要求而异。在电泳中途可用紫外灯直接观察，待DNA 各条区带分开后，电泳结束。一般当溴酚蓝条带移动到胶全长的2/3左右时,可停止电泳，取电泳凝胶直接拍照或绘图（每次测定时，要有已知分子量的DNA片段作为标准，进行对照电泳）。
实验四PCR扩增产物DNA 片段的纯化
一、实验目的
通过本实验学习掌握PCR扩增产物DNA 片段的纯化及含量鉴定
二、实验原理
目前回收DNA片段的方法很多，常用的有冻融法，透析袋法，电泳回收法，玻璃孔回收法，本实验学习掌握低熔点琼脂糖法。平时可根据实验的需要选择合适的方法进行DNA片段的回收。
三、实验材料、试剂与器材
PCR产物，电泳仪，电泳槽，天能凝胶成像系统，1%琼脂糖胶，50хTAEbuffer，刀片，Ω凝胶回收试剂盒
四、实验步骤
(一) 从琼脂糖凝胶中分离DNA片段的操作步骤
将样品进行琼脂糖电泳，方法步骤见实验二，但注意下列不同：
1.先用去污粉清洗电泳槽、电泳制胶板和点样梳，清水冲净后，再用蒸馏水浸
泡备用；
2.选择点样孔大小可供20-50微升（较检测点样孔大）左右的样品量点样（如
无此长距离的点样孔，也可用透明胶封住2~3个点样孔）。
注：尽量挑选比较薄点样梳制备回收用的琼脂糖凝胶，这样跑出来的DNA条带较窄，利于减少下一步切下来的琼脂糖凝胶块的体积。
3.按常规方法制备琼脂糖凝胶，但在凝胶制备过程中要保持环境中没有DNA
污染；不同大小的DNA片段要选择适合的琼脂糖凝胶浓度，在允许的情况下，琼脂糖凝胶的浓度越低越好。
4.点样时尽量避免样品的外泄，所以点样孔的体积要比样品体积稍大，如果同
一块凝胶回收多个样品更要注意避免因点样过多而造成的样品彼此之间的污染。
5.用一只手拿住塑料板的一端，另一只手将电泳槽稍倾斜之，小心地把塑料板
插入琼脂糖凝胶下面，把胶铲起放在长紫外灯上；
(二)低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法
1．戴好手套，准备好已灭菌的Eppendorf管子、医用眼科解剖刀与小电泳槽宽度一致的铲板一块，要把以上用具清洗后才可使用，防止酶的破坏作用；2．在紫外灯下，用医用解剖刀在目的DNA片段的泳动方向正前方挖出一小块琼脂糖凝胶，挖块的大小与DNA样品量的多少有关；
注：DNA片段的回收一般在长波紫外下进行，因为紫外线对DNA的破坏随波长的增加而减少，但是本实验室只有混合波长的紫外灯，所以，在切胶的步骤上时间要尽量的短，以目的DNA片段的损伤。
3．在紫外等下用医用解剖刀尽量切除含DNA的凝胶，把含目的DNA区带的凝胶块放在Eppendorf管中；
4．大致估计凝胶块的体积，加5倍于凝胶块体积的20mMTris-HCl（pH8.0）、1mMEDTA缓冲液，将Eppendorf管子摇动数次。
5．把Eppendorf管子放在65℃水浴中，5~10分钟，使低熔点琼脂糖凝胶融化；6．在室温（20℃）下用等体积的的酚与氯仿（1:1）抽提一次，离心，吸出上层水相。
7．再用氯仿与异戊醇（24:1）抽提一次，离心，吸出上层水相。
8．加3MNaAC至最终浓度为0.3M，再用二倍体积的无水乙醇沉淀DNA，置-20℃约1~2小时，12，000rpm离心10分钟，弃去乙醇；
9. 75%乙醇洗涤沉淀后，离心，去乙醇，室稳烘干；
10.将DNA溶解在适量的无菌双蒸水中；
11.取0.5微升点样电泳，确定其浓度与纯度。
(三)各种柱回收法请严格按照试剂盒的说明书进行操作。
本实验采用Ω凝胶回收试剂盒，操作如下：
1.在紫外灯下将凝胶中的目的片段割下（不要在紫外线下暴露超过30秒），放
入1.5ml EP管（预先称重）中，称量凝胶的重量。
2.加入等体积binding buffer（1g加1ml），在55℃－65℃孵育7分钟（2－3
分钟晃一下，促进溶解）（溶液为桔红色就加5μl醋酸钠，浅黄色则不用）
3.10000g 离心1分钟
4.将离心管中的液体转入柱子上，10000g 离心1分钟，弃去废液
5.用300μl binding buffer洗柱，洗去非特异性吸附，10000g 离心1分钟
6.用700μl SPW washing buffer，室温放置2－3分钟，10000g 离心1分钟
7.重复步骤6
8.弃去收集管中的液体，重新放入柱子，10000g 离心1分钟
9.把柱放入干净的1.5ml的离心管中，加入30μl Elution buffer，室温放置2－3
分钟，10000g 离心1分钟，弃去柱子
10.把上步中的离心管－20℃保存（离心管中的得液体即为目的DNA溶液）。
注意：
a)从琼脂糖凝胶中回收DNA时，不容易做到彻底除净琼脂糖，这是因为
琼脂糖是从琼脂中提取的，而琼脂中的琼脂胶含有硫酸根和羟基的多糖，因此绝大多数的琼脂糖中都带有含硫酸根的多糖，这种物质与DNA一
起从凝胶中被抽提出来，它将强烈地抑制内切酶、连接酶、激酶、聚合
酶等活性。此外，从琼脂糖凝胶中回收DNA的效率与DNA分子量的大
小有关，当DNA分子量小于1kb时，可以绝大部分被回收，当DNA分
子量大于20kb时，回收率一般低于20%。
b)在凝胶电泳中观察DNA区带时，为了避免DNA样品受到损伤，要用
300~360nm长波长的紫外灯照射，尽量缩短照射时间，并使照射距离不
能太近。
11. 电泳检测回收到的目的DNA浓度。
实验五DNA的体外连接
一、实验目的
通过本实验学习DNA重组技术中的核心步骤，DNA片段之间的体外连接方法，即将实验回收的目的片断与载体质粒片段进行定向连接的工作原理及操作方法。
二、实验原理
在基因工程中，外源DNA片段和载体DNA的连接方法很多。如果不利用专一性的限制酶切点，而利用某些酶对DNA能切出平整的末端，然后利用T4DNA连接酶将两者连接，这就是平头末端（Blut end）连接法。但是它要求DNA的浓度高，连接酶的用量比粘性末端的连接大20~100倍，因此不普遍被利用。采用粘性末端进行基因连接是最普遍，最方便的一种方法。一般来说所采用的限制性内切酶也以方法成熟，价格便宜的为好。
T4 噬菌体DNA连接酶的作用：在有ATP存在的连接缓冲系统中，催化两个双链DNA片段5’端磷酸和3’端羟基之间形成磷酸二酯键。DNA连接酶的作用步骤有：
1)T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物（腺苷酰酶）。
2)酶-AMP复合物再结合到具有5ˊ磷酸基和3ˊ-羟基切口的DNA上，使DNA
腺苷化。
3)产生一个新的磷酸二酯键，将缺口封起来。
以上连接反应的最适温度为37℃。但是在这个温度下，粘性末端的氨键结合点是不稳定的。一般限制性内切酶作用所产生的末端，仅仅通过4-5个碱基对相结合，这不足以抵抗该温度下的热运动。因此在实际操作时，DNA分子粘性末端的连接反应，其最适温度是采取催化反应与末端粘合这两者反应温度的折中。一般采用16℃过夜（或者12℃）。也有人采用7--8℃，连接2~3天。
本实验采用promega公司的pGEM-T TA克隆试剂盒，严格按照试剂盒的说明书进行操作。pGEM?-T 和pGEM?-T Easy 载体系统可用于PCR 产物的克隆。这两种载体是通过EcoRⅤ酶切pGEM?-5Zf(+)和pGEM?-T Easy 载体，并在3’末
端加入胸腺嘧啶构建的。插入位点3’-T 突出端可提高PCR 产物的连接效率，与DNA 聚合酶在PCR产物末端加的A 尾配对。
三、实验材料、试剂与器材
PCR胶回收产物，promega公司的PGEM-T TA克隆试剂盒，低温水循环水浴锅
四、实验步骤
1.确定好载体DNA和片段DNA 的量，计算每微升DNA所含的摩尔数；
2.将载体DNA和片段DNA以摩尔数比约为1:3的比例混合，补无菌双蒸水至
9μl；
T载体的连接
①连接体系：2×buffer 5μl
DNA 3.5μl
T载体0.5μl
T4 DNA连接酶1μl
3.弹匀，短暂离心；
4.室温, 连接30min。
注意：影响连接反应效率的因素
1.连接酶的用量：在一般情况下，酶浓度高，反应速度快，产量也高。但是当使用的
连接酶单位下降时，要加入大量连接酶，而连接酶是保存在50%甘油中，因此在
连接反应系统中由于甘油含量的过高，会影响连接效果。如果连接酶的纯度欠佳，
加进的连接酶到达一定浓度后，再增加酶量对加快反应速度并不明显，而杂酶（如
降解酶）的作用变得明显，反而影响产率。
2.作用时间与温度：反应时间是与温度有关的，因为反应速度随温度的提高而加快。
在我们实验中，根据试剂盒要求，采用4℃，但是在选择反应的温度与时间关系时，
要考虑在反应系统中其他因素的影响。
3.底物的浓度问题：一般采用提高DNA的浓度来增加重组的比例，但当底物浓度过
高，反应体积太小（即浓度太大）时，连接效果也很差，这可能是分子运动受到阻
挠。
4.干扰因素：在酶切与连接反应中，除了要求有较高质量的纯酶以外，也要排除其他
干扰因素，如EDTA的存在会抑制酶的活性。DNA样品中有蛋白质、RNA存在，
也会妨碍与DNA的直接作用，因而影响酶切与连接效果。当酶切结束，为了去除加进去的内切酶（蛋白质），以及在终止酶切反应时加进去的EDTA，都需要进一步提纯DNA样品。
实验六大肠杆菌感受态制备与转化
一、实验目的
通过氯化钙法制备大肠杆菌的感受态，学习将体外重组的DNA（上次实验的连接产物）引入受体细胞，使细菌具有新的遗传特性，并从中筛选出转化子的常用方法。
二、实验原理
重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化（transformation）。常用的转化方法是使用0℃的低渗CaCl2溶液处理大肠杆菌，菌细胞膨胀成球形，细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化体系中加入适量的DNA后，形成DNA-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短暂热冲击，促使细胞吸收DNA复合物，转化成功的细菌，得到的外源DNA可复制表达，使获得新的遗传性状，载体中的抗生素基因得到表达，可在选择性培养基上筛选出来。
本实验所用重组DNA的载体带有E.coli中的β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和部分编码序列，编码区内插入了一个多克隆位点，进入宿主菌后可与宿主细胞之间实现α-互补而产生Lac+，在生色底物X-gal存在下形成蓝色菌落。如有外源DNA插入到质粒的该位点，则破坏了互补能力，菌落呈白色。
三、实验材料、试剂与器材
上次实验的连接产物（重组DNA）、受体菌（E.coli,DH5α）、LB平板、涂布棒、、恒温水浴锅、超净工作台、恒温摇床、恒温培养箱、冷冻高速离心机等。
四、实验步骤
1. 取4管30ul已制备好的感受态细胞，冰上自然融化。按照下面的设置分别加入空载体、ddH2O、连接产物和重组质粒。
2. 用移液器的吸头轻轻混匀。
3. 冰上放置30min。
4. 42℃热击90秒，保持静置。
5. 迅速放于冰上冷却2-3分钟。
6. 向转化管中加入800ul不含抗生素的预热的LB，37℃，120-160转/分钟，振摇45分钟复苏细菌。
7. 1,2000离心30 S，去除上清，留100ul菌液，混匀100ul转化混合物铺于含抗生素Amp的LB琼脂平板上，正面放置10分钟待液体吸干，倒置平板，于37℃培养过夜。
8. 16-18小时后观察转化结果。
五、注意事项
1、为避免对感受态细胞的破坏，制备感受态时吸管应剪去尖端扩大口径。
2、制备感受态细胞的培养时间最好以OD值来决定，细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
3、用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。此外，对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。
4、防止杂菌和杂DNA的污染，整个操作过程均应在无菌条件下进行。整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
分子生物学 1.ORF 答:ORF是open reading frame的缩写，即开放阅读框架。在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为止的一个连续编码列，叫做一个开放阅读框架。 2.结构基因 答：结构基因（structural genes）可被转录形成mRNA,并翻译成多肽链，构成各种结构蛋白质或催化各种生化反应的酶和激素等。 3.断裂基因 答：基因是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，一个基因不仅仅包括编码蛋白质或 RNA 的核酸序列，还包括保证转录所必需的调控序列、位于编码区 5 ' 端与 3 ' 端的非编码序列和内含子。真核生物的结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因（split gene）。 4.选择性剪接 答：选择性剪接（也叫可变剪接）是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接异构体的过程，而最终的蛋白产物会表现出不同或者是相互拮抗的功能和结构特性，或者，在相同的细胞中由于表达水平的不同而导致不同的表型。 5.C值 答：基因组的大小通常以其DNA的含量来表示，我们把一种生物体单倍体基因组DNA的总量成为C值（C value）。 6.生物大分子 答：生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。 7.酚抽提法 答：酚抽提法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。 8.凝胶过滤层析 答：凝胶过滤层析也称分子排阻层析或分子筛层析，利用凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。 9.多重PCR 答：多重PCR技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等技术加以鉴别。 10.荧光域值 答：荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值的设置是基线荧光信号的标准偏差的10倍。 11.退火 答：温度突然降至37-58℃时，变性的DNA单链在碱基互补的基础上重新形成氢
现代分子生物学 复习提纲 第一章绪论 第一节分子生物学的基本含义及主要研究内容 1 分子生物学Molecular Biology的基本含义 ?广义的分子生物学：以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究 对象，从分子水平阐明生命现象和生物学规律。 ?狭义的分子生物学：偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调控 等过程，也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 1.1 分子生物学的三大原则 1) 构成生物大分子的单体是相同的 2) 生物遗传信息表达的中心法则相同 3) 生物大分子单体的排列（核苷酸、氨基酸）的不同 1.3 分子生物学的研究内容 ●DNA重组技术（基因工程） ●基因的表达调控 ●生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学） ●基因组、功能基因组与生物信息学研究 第二节分子生物学发展简史 1 准备和酝酿阶段 ?时间：19世纪后期到20世纪50年代初。 ?确定了生物遗传的物质基础是DNA。 DNA是遗传物质的证明实验一：肺炎双球菌转化实验 DNA是遗传物质的证明实验二：噬菌体感染大肠杆菌实验 RNA也是重要的遗传物质-----烟草花叶病毒的感染和繁殖过程 2 建立和发展阶段 ?1953年Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑。 ?主要进展包括： ?遗传信息传递中心法则的建立 3 发展阶段 ?基因工程技术作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。 ? 第三节分子生物学与其他学科的关系 思考 ?证明DNA是遗传物质的实验有哪些？ ?分子生物学的主要研究内容。 ?列举5～10位获诺贝尔奖的科学家，简要说明其贡献。
《高级计算机图形学》实验报告 姓名：学号：班级： 【实验报告要求】 实验名称：高级计算机图形学室内场景 实验目的：掌握使用OpenGL生成真实感复杂对象的方法，进一步熟练掌握构造实体几何表示法、扫描表示法、八叉树法、BSP树法等建模方法。 实验要求：要求利用OpenGL生成一个真实感的复杂对象及其周围场景，并显示观测点变化时的几何变换，要具备在一个纹理复杂的场景中漫游功能。要求使用到光线跟踪算法、 纹理映射技术以及实时绘制技术。 一、实验效果图 图1:正面效果图
图2：背面效果图 图4：背面效果图
图4：室内场景细节效果图 图5：场景角度转换效果图
二、源文件数据代码： 共6个文件，其实现代码如下： 1、DlgAbout.cpp #include "StdAfx.h" #include "DlgAbout.h" CAboutDlg::CAboutDlg() : CDialog(CAboutDlg::IDD) { } void CAboutDlg::DoDataExchange(CDataExchange* pDX) { CDialog::DoDataExchange(pDX); } BEGIN_MESSAGE_MAP(CAboutDlg, CDialog) END_MESSAGE_MAP() 2、FormCommandView.cpp #include "stdafx.h" #include "Tool.h" #include "MainFrm.h" #include "FormCommandView.h" #include "ToolDoc.h" #include "RenderView.h" // Download by https://www.doczj.com/doc/b214892987.html, #ifdef _DEBUG #define new DEBUG_NEW #undef THIS_FILE static char THIS_FILE[] = __FILE__; #endif // CFormCommandView IMPLEMENT_DYNCREATE(CFormCommandView, CFormView) CFormCommandView::CFormCommandView() : CFormView(CFormCommandView::IDD) { //{{AFX_DATA_INIT(CFormCommandView)
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
硕士研究生分子生物学复习（JUJU） 一、名词解释 1. 基因（gene）：是指核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，是指贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。 2. 基因组（genome）:是指细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和。基 因组的结构主要指不同的基因功能区域在核酸分子中的分布和排列情况，基因组的功能 是储存和表达遗传信息。 3. 基因家族（gene family）:是指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的一组基因。同一个家族的基因成员是由同一祖先基因进化而来。 4?假基因（pseudogene）：在多基因家族中，某些成员并不能表达出有功能的产物，这些基因称为假基因，用书表示。假基因与有功能的基因同源，原来也可能是有功能的基因，由于缺失、倒位或点突变等原因失去活性，成为无功能的基因，它们或者不能转录，或者转录后生成无功能的异常多肽。 5. 质粒（plasmid ）:是存在于细菌细胞质中的一类独立于染色体的遗传成分，它是由 环形双链DNA组成的复制子。质粒DNA分子可以持续稳定的处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆的整合到宿主染色体上，随染色体的复制而复制，并通过细胞 分裂传递到后代。 6. 基因超家族（gene superfamily ）:是指一组由多基因家族及单基因组成的更大的基因 家族。它们的结构有程度不等的同源性，可能是由于基因扩增后又经过结构上的轻微改变，因此它们可能都起源于相同的祖先基因。但是它们的功能并不一定相同，这一点正 是与多基因家族的差别。这些基因在进化上也有亲缘关系，但亲缘关系较远。如免疫球蛋白超家族。 7. 卫星DNA（satellite DNA ）为非编码区串联重复序列。通常存在于内含子和间隔DNA 内。重复次数从数次至数百次，甚至几十万次，串联重复单位从最短的2bp起，长短 不等。这类重复顺序组成卫星DNA的基础。可分为三类：大/小/微卫星DNA。8.基因多态性：是指由于等位基因间在特定位点上DNA序列存在差异造成的，一般发生在基因序列中不编码蛋白质的区域和没有重要调节功能的区域。 9. 操纵子（operator）:是阻遏蛋白识别与结合的一小段DNA序列，转录过程存在阻遏调控机制的基因中均含有这样的序列。操纵子紧接在启动子下游，通常与启动子有部分重叠。 10. 顺式作用元件（cis-acting elements ）:是指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的DNA序列。原核生物中主要是启动子、阻遏蛋白结合位点、正调控蛋白结合位点、增强子等。真核生物中包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。 11. 反式作用因子（trans-acting elements ）:在真核生物中，基因特异性转录因子称为 反式作用因子，这些因子通常是通过与增强子或上游启动元件结合而发挥作用。反式作 用因子通过与通用转录因子及RNA聚合酶相互作用而刺激转录，这些相互作用促进前起始复合物的形成。 12. 增强子（enhancer）:是一种较短的DNA序列，能够被反式作用因子识别与结合。反式作用因子与增强子元件结合后能够调控（通常为增强）临近基因的转录。增强子序列通常是数个形成一簇，位于转录起始点上游-100~-300bp处，但在基因之外或某些内含子中也有增强子序列。 13. 启动子(promoter ):是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。启动子具有
实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取 一、实验目的 学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。 二、实验材料、设备及试剂 1、实验材料 大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株：R-，M-，Amp- 2、实验设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅 3、试剂 酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素 三、实验步骤 液体LB（Luria-Bertain）培养基配方： 蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml） 酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml） 氯化钠 1.0% （1 g/100 ml） PH 7.0 固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉 请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！ (1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。 (2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容 至100ml。 (3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。 (4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。 (5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培 养基。 (6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。 (7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加 热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。当高压锅温度（气压）指示器指示锅温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压
第一章绪论 2.写出DNA和RNA的英文全称。 答：脱氧核糖核酸（DNA, Deoxyribonucleic acid），核糖核酸（RNA, Ribonucleic acid）4.早期主要有哪些实验证实DNA是遗传物质？写出这些实验的主要步骤。 答：一，肺炎双球菌感染实验，1，R型菌落粗糙，菌体无多糖荚膜，无毒，注入小鼠体内后，小鼠不死亡。2，S型菌落光滑，菌体有多糖荚膜，有毒，注入到小鼠体内可以使小鼠患病死亡。3，用加热的方法杀死S型细菌后注入到小鼠体内，小鼠不死亡； 二，噬菌体侵染细菌的实验：1，噬菌体侵染细菌的实验过程：吸附→侵入→复制→组装→释放。2，DNA中P的含量多，蛋白质中P的含量少；蛋白质中有S而DNA中没有S，所以用放射性同位素35S标记一部分噬菌体的蛋白质，用放射性同位素32P标记另一部分噬菌体的DNA。用35P标记蛋白质的噬菌体侵染后，细菌体内无放射性，即表明噬菌体的蛋白质没有进入细菌内部；而用32P标记DNA的噬菌体侵染细菌后，细菌体内有放射性，即表明噬菌体的DNA进入了细菌体内。 三，烟草TMV的重建实验：1957年，Fraenkel-Conrat等人，将两个不同的TMV株系（S株系和HR株系）的蛋白质和RNA分别提取出来，然后相互对换，将S株系的蛋白质和HR株系的RNA，或反过来将HR株系的蛋白质和S株系的RNA放在一起，重建形成两种杂种病毒，去感染烟草叶片。 6.说出分子生物学的主要研究内容。 答：1，DNA重组技术；2，基因表达调控研究；3，生物大分子的结构功能研究----结构分子生物学；4，基因组、功能基因组与生物信息学研究。 第二章染色体与DNA 3.简述真核生物染色体的组成及组装过程 真核生物染色体除了性细胞外全是二倍体，DNA以及大量蛋白质及核膜构成的核小体是染色体结构的最基本单位。核小体的核心是由4种组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）构成的扁球状8聚体。 蛋白质包括组蛋白与非组蛋白。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体，含有大量赖氨酸核精氨酸。非组蛋白包括酶类与细胞分裂有关的蛋白等，他们也有可能是染色体的结构成分 由DNA和组蛋白组成的染色体纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。 1.由DNA与组蛋白包装成核小体，在组蛋白H1的介导下核小体彼此连接形成直径约10nm的核小体串珠结构，这是染色质包装的一级结构。 2.在有组蛋白H1存在的情况下，由直径10nm的核小体串珠结构螺旋盘绕，每圈6个核小体，形成外径为30nm，内径10nm，螺距11nm的螺线管，这是染色质包装的二级结构。 3.由螺线管进一步螺旋化形成直径为0.4μm的圆筒状结构，称为超螺线管，这是染色
研究生综合实验报告 姓名： 专业：市政工程 学号： 日期：2014-5-16
第1 单元气相色谱与气相色谱-质谱联用实验技术 1、实验目的 (1)掌握GC 和GCMS 工作原理和基本操作 气相色谱之所以能有效的对各组分实现有效的分离，主要依据分配原理，分配原理 是指各种组分在流动相（载气）和固定相之间的分配系数不同，从而达到不同组分的分离目的。气相色谱仪主要由载气系统、进样系统、分离系统、检测系统和记录系统。质谱分析法是通过对样品离子的质荷比和强度的测定来进行定性和定量分析的一 种分析方法。质谱分析法的过程是：首先将样品气化为气态分子或原子，然后将其电离失去电子，成为带电离子，再将离子按质荷比（即离子质量与所带电荷之比，以m/z 以表示）大小顺序排列起来，测量其强度，得到质谱图。 质谱分析的基本过程可以分为四个环节：（1）通过合适的进样装置将样品引入并进 行气化；（2）气化后的样品引入到离子源进行电离，即离子化过程；（3）电离后的离子经过适当的加速后进入质量分析器，按不同的质荷比（m/z）进行分离；（4）经检测、记录，获得一张谱图。根据质谱图提供的信息，可以进行无机物和有机物定性与定量分析、复杂化合物的结构分析、样品中同位素比的测定以及固体表面的结构和组成的分析等。典型的质谱仪一般由进样系统、离子源、分析器、检测器和记录系统等部分组成，此外，还包括真空系统和自动控制数据处理等辅助设备。 (2)了解GC 和GCMS 测定样品的基本前处理方法 一般情况下，进入GC 和GCMS 的样品只能是在有机溶剂中，而且由于不同的检测 器的灵敏度都有一定的限制，因此需要对监测样品就行前处理。常规的预处理方法有：
分子生物学Ⅱ 专题一细胞通讯与细胞信号转导（一）名词解释 （1）信号分子(signal molecule)：是指在细胞间或细胞内进行信息传递的化学物质。 （2）受体（receptor）：是指细胞中能识别信息分子，并与之特异结合、引起相应生物效应的蛋白质。 （3）蛋白激酶（protein kinase）：是指使蛋白质磷酸化的酶。 （二）简答分析 （1）细胞通讯的方式及每种作用方式的特点。 答： （2）膜受体介导的信息传递途径的基本规律。
答：配体→膜受体→第二信使→效应蛋白→效应。（3）试以肾上腺素、干扰素、胰岛素、心纳素为例，阐述其信息转导过程。 答：①肾上腺素：cAMP-PKA途径； 过程：首先肾上腺素与其受体结合，使G蛋白被激活；然后G蛋白与膜上的腺苷酸环化酶相互作用，后者将ATP转化为cAMP；最后cAMP磷酸化PKA，从而产生一系列生物学效应。 ②胰岛素：受体型TPK途径； 过程：胰岛素与其靶细胞上的受体结合后，可使其受体中的TPK激活，随后通过下游的Ras途径继续传递信号，直至发生相应的生物学效应。 ③干扰素：Jak-STAT途径； 过程：首先干扰素与受体结合导致受体二聚化，然后受体使JAK（细胞内TPK）激活，接着JAK将下游的STAT磷酸化形成二聚体，暴露出入核信号，最后STAT进入核内，调节基因表达，产生生物学效应。 ④心钠素：cGMP-PKG途径； 过程：心钠素与其受体结合，由于该受体属于GC型酶偶联受体，具有鸟苷酸环化酶的的活性，因此结合后可直接将GTP转化为cGMP，进而激活下游的PKG，最终产生一系列的生物学效应。
（4）类固醇激素是如何调控基因表达的？ 答：类固醇激素穿膜后与细胞内（或核内）受体结合，使受体变构形成激素受体活性复合物并进入细胞核中，然后以TF的形式作用于特异的DNA序列，从而调控基因表达。 专题二基因分析的策略 （一）名词解释 （1）分子杂交（molecular hybridization）：是指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA）在一定条件下，按碱基互补配对原则经退火处理，形成异质双链的过程。（2）核酸分子杂交技术：是指采用杂交的手段（方式），用一已知序列的DNA或RNA片段（探针）来测检样品中未知核苷酸顺序。 （3）探针（Probe）：是指用来检测某特定核苷酸序列的标记DNA或RNA片段。 （4）增色效应：是指DNA变性时260nm紫外吸收值增加的现象。 （5）解链温度（Tm）：是指加热DNA溶液，使其对260nm 紫外光的吸光度达到其最大值一半时的温度，即50%DNA 分子发生变性的温度。 （6）转基因：是指是借助基因工程将确定的外源基因导入
1.定义重组DNA技术 将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，然后在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。 2.说出分子生物学的主要研究内容 1.DNA重组技术 2.基因表达研究调控 3.生物大分子的结构功能研究 4.基因组、功能基因组与生物信息学研究 3.简述DNA的一、二、三级结构 一级：4种核苷酸的连接及排列顺序，表示了该DNA分子的化学成分 二级：2条多核苷酸连反向平行盘绕所形成的双螺旋结构 三级：DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定的空间结构 4.原核生物DNA具有哪些不同于真核生物DNA的特征？ ①DNA双螺旋是由2条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成，多核苷酸的方向由核苷酸间的磷酸二酯键的走向决定，一条是5---3，另一条是3---5②DNA双螺旋中脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧构成基本骨架，碱基排在内侧③两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对 5.DNA双螺旋结构模型是由谁提出的？沃森和克里克 6.DNA以何种方式进行复制，如何保证DNA复制的准确性？ 线性DNA的双链复制：将线性复制子转变为环状或者多聚分子，在DNA末端形成发卡式结构，使分子没有游离末端，在某种蛋白质的介入下在真正的末端上启动复制。环状DNA 复制：θ型、滚环型、D型 ①以亲代DNA分子为模板进行半保留复制，复制时严格按照碱基配对原则 ②DNA聚合酶I 非主要聚合酶，可确保DNA合成的准确性
③DNA修复系统：错配修复、切除修复、重组修复、DNA直接修复、SOS系统 7.简述原核生物DNA复制特点 只有一个复制起点，复制起始点上可以连续开始新的DNA复制，变现为虽只有一个复制单元，但可以有多个复制叉 8.真核生物DNA的复制在哪些水平上受到调控？ 细胞生活周期水平调控；染色体水平调控；复制子水平调控 9.细胞通过哪几种修复系统对DNA损伤进行修复？ 错配修复，恢复错配；切除修复，切除突变的碱基和核苷酸片段；重组修复，复制后的修复；DNA直接修复，修复嘧啶二聚体；SOS系统，DNA的修复，导致变异 10.什么是转座子？分为哪些种类？ 是存在于染色体DNA上可自主复制和移动的基本单位。可分为插入序列和复合型转座子11.什么是编码链？什么是模板链？ 与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链，另一条根据碱基互补配对原则指导mRNA 合成DNA链称为模板链 12.简述RNA的种类及其生物学作用 mRNA：编码了一个或多个多肽链序列。 tRNA：把mRNA上的遗传信息变为多肽中的氨基酸信息。 rRNA：是核糖体中的主要成分。 hnRNA：由DNA转录生成的原始转录产物。 snRNA：核小RNA，在前体mRNA加工中，参与去除内含子。 snoRNA：核仁小RNA，主要参与rRNA及其它RNA的修饰、加工、成熟等过程。scRNA：细胞质小RNA在蛋白质合成过程起作用。
化学综合和设计实验 实验报告 姓名：李玲云 学号：2014332036 专业：无机化学
扫描电子显微镜和EDS能谱演示实验 一、实验目的 1、初步了解扫描电子显微镜的工作原理、基本构造、操作及用途 2、掌握样品的制备方法 二、扫描电子显微镜的工作原理及用途 从电子枪阴极发出的直径20cm~30cm的电子束，受到阴阳极之间加速电压的作用，射向镜筒，经过聚光镜及物镜的会聚作用，缩小成直径约几毫微米的电子探针。在物镜上部的扫描线圈的作用下，电子探针在样品表面作光栅状扫描并且激发出多种电子信号。这些电子信号被相应的检测器检测，经过放大、转换，变成电压信号，最后被送到显像管的栅极上并且调制显像管的亮度。显像管中的电子束在荧光屏上也作光栅状扫描，并且这种扫描运动与样品表面的电子束的扫描运动严格同步，这样即获得衬度与所接收信号强度相对应的扫描电子像，这种图象反映了样品表面的形貌特征。第二节扫描电镜生物样品制备技术大多数生物样品都含有水分，而且比较柔软，因此，在进行扫描电镜观察前，要对样品作相应的处理。扫描电镜样品制备的主要要求是：尽可能使样品的表面结构保存好，没有变形和污染，样品干燥并且有良好导电性能。 在高压（2~20kV）的作用下，利用聚焦得到非常细的高能电子束，使其在试样上扫描（电子束与试样表层物质相互作用），激发出背散射电子、二次电子等信息，通过对上述信息的接收、放大和显示
成像，对试样表面进行分析。 根据量子力学理论，物质中存在着隧道现象，电子可以通过隧道穿过一个能级高度大于其总能量的势垒而出现在势垒的另一侧。因此，物质的表面电子可以借助隧道作用散逸出来，在物质表面附近形成电子云。在导体表面电子云中某位置的电子几率密度，会随着此位置与表面距离的增大而以指数形式迅速衰减。 扫描电子显微镜被广泛应用于材料科学、生物医学、信息产业、地质、石油化工和其它相关学科领域。是在微观尺度范围内，对样品的形貌进行观察、分析和测量的工具。现在的扫描电子显微镜，在配备相应附件后，可以获得试样表面的化学成分，晶体缺陷、电势、磁场及晶体取向等信息，是对固体物质表层进行综合分析的仪器。 吉林大学无机合成与制备化学国家重点实验室拥有场发射扫描电子显微镜。该显微镜通过接收二次电子信息来对样品表面形貌进行分析。显微镜的扫描倍数从25到650000倍，最大分辨率可达到1nm。显微镜有Oxford的能谱附件，可以进行样品的能谱测试。该显微镜不能对具有较强磁性的物质进行分析。 三、扫描电子显微镜的构造 1、电子光学系统（镜筒） 电子枪、三个电磁透镜、扫描线圈、试样室 电子枪中的灯丝产生高能电子束，电子枪的引出电压直接反映了灯丝状态的好坏（5kV~8kV不等）。每次实验都必须注意并记录电子枪引出电压。
安徽工业大学 分子生物学实验讲义 主编：谢峻 2013-8-20
目录 目录 (2) 实验一分子生物学常用到的仪器及使用方法 (3)
实验一分子生物学常用到的仪器及使用方法 一、实验目的 1. 了解分子生物学实验的常规仪器、设备、耗材； 2. 掌握常用仪器的功能和使用方法； 3. 掌握单道移液器的使用方法和技巧；掌握移液器的使用和维护保养注意事项。 二、实验内容 常规仪器： （一）温度控制系统： 1. 冰箱：根据药品、试剂及多种生物制剂保存的需要，必须具备不同控温级别的冰 箱，最常使用的有：4℃、-20℃、-80℃冰箱。 4℃适合储存某些溶液、试剂、药品等。 -20℃适用于某些试剂、药品、酶、血清、配好的抗生素和DNA、蛋白质样品等。 -80℃适合某些长期低温保存的样品、纯化的样品、特殊的低温处理消化液等的保存。 0-10℃适合低温条件下的电泳、层析、透析等实验。 2. 液氮罐：有些实验材料、某些器官组织、细胞株、菌株及纯化的样品等，要求速 冻和长期保存在超低温环境下，就需要一个液氮罐（-196℃）具有经济、 省力和较好地保持细胞生物学特性的优点。 3. 培养箱： 37℃生化恒温培养箱：用于细菌的固体培养。 CO2培养箱：适用于培养各种细胞，可恒定地提供一定量的CO2（通常5%），用 来维持培养液的酸度（pH值）。 37℃恒温空气摇床：可进行液体细菌的培养。 4. 水浴锅：用于保温。 25-100℃水浴摇床可用于分子杂交试验，各种生物化学酶反应等试验的保温。 25-100℃水浴箱用于常规试验。 5. 烘箱：主用于烘干实验器皿，有些需要温度高些，有些需要温度低些。用于RNA 方面的实验用具，需要在250℃烤箱中烘干，有些塑料用具只能在42-45℃的烤 箱中进行烘干。 （二）水的净化装置：随着分子生物学的飞速发展，许多实验对水纯度的要求越来越高。 1. 蒸馏水皿：单蒸水常难以满足实验要求。双蒸水、三蒸水配液，许多实验要去离 子水。多次蒸馏水可除去水中挥发性杂质，不能完全除去水中溶解的 气体杂质（Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等）。 2. 离子交换器：用离子交换法制取的水，称去离子水。去离子不能除去水中的非离 子型杂质，其中常含有有机物。 3. 超纯水：采用多级过滤、高性能离子交换单元、超滤过滤器、反渗透技术、紫外
分子生物学考研参考 习题
分子生物学考研习题 一、名词解释 1.中心法则（Central Dogma） 2.反向重复序列（IR） 3.DNA链的呼吸作用 4.Cot曲线(Cot1/2) 5.DNA变性，复性 6.DNA的熔解温度(Tm) 7.基因组 8.C-值矛盾 9.基因家族 10.基因簇 11.割裂基因，Intron 内元，Exon 外元 12.卫星DNA 13.半保留复制 14.岗崎片段 15.复制单位replicon 16.复制体replisome 17.先导链，后随链 18.突变（mutation） 19.移码突变(frame-shift mutation) 20.无义突变（nonsense mutation），错义突变（missense mutation)，同义突变（samesense mutation) 21.组成型突变（constitutive mutation) 22.突变热点（Mutation Hotpoint） 23.增变基因（mutator gene ） 24.限制-修饰系统（restriction and modificaion） 25.光裂合酶修复（photo reactivation Repair） 26.切除修复（Excision Repair） 27.重组修复（Recombinative—Repair） 28.SOS修复（SOS Repair） 29.转录(transcription) 30.有义链(sense strand) ，反义链(antisense strand) 31.启动子(promoter) 32.终止子（terminator） 33.核酶（ribozyme）； 34.核内不均一RNA（hnRNA） 35.反式拼接（trans-splicing）
《分子生物学》复习题 1、染色体：是指在细胞分裂期出现的一种能被碱性染料强烈染色，并具有一定 形态、结构特征的物体。携带很多基因的分离单位。只有在细胞分裂中才可见的形态单位。 2、染色质：是指细胞周期间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白和少量RNA 组成的复合结构，因其易被碱性染料染色而得名。 3、核小体：染色质的基本结构亚基，由约200 bp的DNA和组蛋白八聚体所组 成 4、C值谬误：一个有机体的C值与它的编码能力缺乏相关性称为C值矛盾 5、半保留复制：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中， 一条链来自6、亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制 6、DNA重组技术又称基因工程，目的是将不同的DNA片段（如某个基因或基 因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。 7、半不连续复制：DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的 合成是不连续的，故称半不连续复制。 8、引发酶：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引 物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。 9、转坐子：存在与染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。 10、多顺反子：一种能作为两种或多种多肽链翻译模板的信使RNA，由DNA 链上的邻近顺反子所界定。 11、基因：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核甘酸序列。 12、启动子：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 13、增强子：能强化转录起始的序列 14、全酶：含有表达其基础酶活力所必需的5个亚基的酶蛋白复合物，拥有σ因子。 （即核心酶+σ因子） 15、核心酶：仅含有表达其基础酶活力所必需亚基的酶蛋白复合物，没有σ因子。 16、核酶：是一类具有催化功能的RNA分子 17、三元复合物：开放复合物与最初的两个NTP相结合，并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后，转变成包括RNA聚合酶，DNA和新生的RNA的三元复合物。 18、SD序列：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。30S亚基通过其
第一章、基因的结构和功能实体及基因组 1、基因定义 基因（遗传因子）是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，携带有遗传信息的DNA序列，是具有遗传效应的DNA分子片段，是控制性状的基本遗传单位，通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。 2、DNA修复 DNA修复（DNA repairing）是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来（如细胞的癌变等），但如果细胞不具备这修复功能，就无法对付经常在发生的DNA损伤事件，就不能生存。对不同的DNA损伤，细胞可以有不同的修复反应。3、DNA损伤 DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变，并导致遗传特征改变的现象。情况分为：substitutation （替换）deletion （删除）insertion （插入）exon skipping （外显子跳跃）。 DNA损伤的改变类型：a、点突变：指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤（A与G之间的相互替代）、嘧啶替代嘧啶（C与T之间的替代）称为转换（transition）；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换（transvertion）。b、缺失：指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。c、插入：指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动（reading frame shift），使其后所译读的氨基酸序列全部混乱，称为移码突变（frame-shift mutaion）。d、倒位或转位：（transposition）指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。 e、双链断裂：对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。 4、同源重组 同源重组，（Homologus Recombination)是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday 结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。 a、基因敲除 基因敲除（geneknockout），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 b、因转移法 同源重组(homologousrecombination)是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换有缺陷的基因片段，达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点；attachmentsite，att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组，因而重组具有特异性和高度保守性。
内部编号：AN-QP-HT619 版本/ 修改状态：01 / 00 In Order T o Standardize The Management, Let All Personnel Enhance The Executive Power, Avoid Self- Development And Collective Work Planning Violation, According To The Fixed Mode To Form Daily Report To Hand In, Finally Realize The Effect Of Timely Update Progress, Quickly Grasp The Required Situation. 编辑：__________________ 审核：__________________ 单位：__________________ 考研初复试高分规律实验报告书通用 范本
考研初复试高分规律实验报告书通用范 本 使用指引：本报告文件可用于为规范管理，让所有人员增强自身的执行力，避免自身发展与集体的工作规划相违背，按固定模式形成日常报告进行上交最终实现及时更新进度，快速掌握所需了解情况的效果。资料下载后可以进行自定义修改，可按照所需进行删减和使用。 一、实验目的： 如今关于考研的话题还在继续，考研如何顺利通过复试？考研er面对众多选择和重重困难又何去何从呢？我们针对这些问题进行了调查。 二、实验原理：人生在世，俯仰之间，自当追其卓越，但有尽其所能。 三、实验背景： (1)研究生招考热确需一盆冷水,研究生招考遇冷，让人们能够清醒下来，正视一度飞速发展的研究生教育所患的狂热病症，其症结究竟
肿瘤分子生物学讲义 第一节概述 (1) 第二节肿瘤的发生机制 (4) 第三节癌基因及其致癌的分子机制 (5) 第四节抑癌基因及其抑癌的分子机制 (9) 第五节肿瘤转移相关基因 (11) 第六节肿瘤的预防和治疗 (13) 第一节概述 一、肿瘤及肿瘤分子生物学的概念 肿瘤（tumor）是一类疾病的总称，它们的基本特征是细胞增殖与凋亡失控，扩张性增生形成新生物。肿瘤可分为良性肿瘤（benign tumor）和恶性肿瘤（malignant tumor）。 良性肿瘤生长缓慢，虽可增长至相当大的体积，但仍保留正常细胞的某些特性，通常在瘤体外有完整的包膜，手术切除后患者预后良好。绝大多数良性肿瘤基本上是无害的，不引起或很少引起宿主损伤。不过有极少数良性肿瘤因其靠近生命中枢或能合成大量生物活性物质也可能杀伤宿主。例如，脑膜上生长缓慢的良性肿瘤通过压迫使得生命中枢萎缩破坏，最终导致宿主死亡；胰岛细胞良性肿瘤可以分泌大量胰岛素而引起体内胰岛素过量，导致低血糖和死亡。 恶性肿瘤统称为癌症（cancer），它不同于良性肿瘤的最重要的特性是能侵袭周围组织，疾病晚期癌细胞发生远端转移，破坏受侵袭的脏器，最终使机体衰亡，但如能在侵袭转移前切除癌瘤，一般预后明显改善。由于技术水平的限制，目前临床诊断的癌症患者多处于中晚期。加上不良生活方式如吸烟、过度饮酒、不合理饮食习惯，以及环境污染增加等因素，在刚过去的20世纪，世界各国许多常见癌症的发病率在总体上呈上升趋势，或维持在高水平，在我国的情况亦大致如此。目前除几种较少见的癌症如妇科的宫颈癌、绒癌等的死亡率有明显下降外，多数常见恶性肿瘤死亡率还处于令人忧心的高位态势下。有研究者预测，在21世纪癌症仍将是危害人类健康的主要疾病之一，故应引起预防、临床和基础研究者的高度关注。 恶性肿瘤几乎在所有类型的细胞中均可发生。根据组织学来源，癌症的起源可分为三种：癌（carcinoma）起源于上皮细胞，大部分成人癌症属此类；淋巴瘤起源于脾和淋巴结等的淋巴细胞；肉瘤（sarcoma）起源于间叶组织如结缔组织、骨和肌肉等。以上在各种实质性组织、脏器中发生的癌症属实体肿瘤（solid tumor）。白血病起源于骨髓造血细胞，恶性细胞存在于流动的血液中，属液体肿瘤（liquid tumor）。 肿瘤分子生物学，就是用分子生物学的理论和技术来研究肿瘤的一门科学，是医学和生物学的一门交叉学科 二、肿瘤的生物学特征 1、癌症是体细胞遗传病 就本质而论，癌症是一种遗传学疾病或体细胞遗传学疾病，可简称为遗传病。在癌细胞中发生的遗传学变异有：基因内的碱基替代、缺失、插入和基因扩增等，以及染色体的数量和结构的改变，如非整倍体、易位等；表遗传学改变有：DNA甲基化型式改变、组蛋白修饰和染色质改型等。这些改变引起了肿瘤抑制基因灭活和原癌基因的活化，它们所产生的恶性表型通过有丝分裂能在细胞世代间传递。上述过程均发生在体细胞，这是占全部癌症中绝大多数的、散发性癌症的发生模式。遗传性癌综合征不同于其他一些遗传病，它遗传的仅是癌易感性，还需要体细胞的多次击中才能产生恶性表型。 基因组内存在两类癌相关基因：一类基因直接调控细胞增殖与凋亡、运动与黏着，以及细胞基质的改型等，并参与细胞的信号转导，结果得以维持正常组织细胞的自稳性。当这些基因缺陷造成上述过程失衡，随着细胞各种恶性特征的积累，最终癌症发生。这些基因包括癌基因、肿瘤抑制基因中把关基因（gatekeeper gene）；另一类基因并不直接调控细胞的增殖和凋亡，而是影响第一类癌相关基因的突变速率的管护基因（caretaker gene），这包括各类DNA修复基因，还包括代谢酶多态性在内的一组修饰基因（modifier gene）。 2、癌细胞的恶性生物学特征