实验限制性片段长度多态性
(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 一、实验目的
学习和掌握限制性片段长度多态性（RFLP）遗传标记的基本原理和检测方法。
二、实验原理
第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过PCR，酶切及琼脂糖凝胶电泳进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。
三、仪器、材料与试剂
（一）仪器：电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检测系统
（二）材料与试剂：Hind Ⅲ限制性内切酶，10×M Buffer，待分析的PCR产物，DL2000 DNA Marker，6×Loading Buffer（上样缓冲液）,灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶（注意：含溴化乙锭EB，致癌，请带手套操作），0.5%TBE（电泳缓冲液）。
四、实验步骤
1、Hind Ⅲ限制性内切酶酶切
反应体积（10μl），在0.2ml Eppendorf管中依次加样：
10xM buffer 1 μL
ddH2O 5.5 μL
Hind Ⅲ0.5 μL
PCR产物 3 μL
实验六■限制性片段长度多态性 （Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP） —、实验目的 学习和掌握限制性片段长度多态性（RFLP ）遗传标记的基本原理和检测方法。 二、实验原理 第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变,或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等,导致酶切片段大"俊生了变化,这种变化可以通过 PCR ,酶切及琼脂糖凝胶电泳逬行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因走位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。 三、仪器、材料与试別 （-）仪器：电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检测系统 （二）材料与试列：Hind JU限制性内切酶,10xM Buffer,待分析的PCR产物,DL2000 DNA Marker, 6xLoading Buffer （上样缓冲液），灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶（注意：含溟化乙锭EB ,致癌，请带手套操作）,0.5%TBE （电泳缓冲液1 四、实验步骤 1、Hind m限制性内切酶酶切 反应体积（10pl ）f在0.2ml Eppendorf管中依次加样： 10xM buffer i ML ddH2O 5.5 pL Hind 皿0.5 pL PCR产物 3 ML 37°C水浴消化2h ,消化产物全部用于琼脂糖检i则。 2、琼脂糖凝胶电泳 配置1.5%琼脂糖凝胶，取10pl酶切产物+1川上样缓冲液280V恒压电泳。DNA带负电荷, 电泳时
DNA从负极向正极泳动。待泳动至凝胶的1/2-2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。 五、作业 写出本实验的具体操作过程并描述你所观察到的结果。（画图） M12 34 5678 9 10 Hind HI内切酶识别位点：AIAGCTT TTCGATA
分子植物育种，２００６年，第４卷，第３期，第３２３－３２８页 ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００６，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．３，３２３－３２８ 研究报告 ＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｐｏｒｔ 一个内含子长度多态性标记与栽培稻Ｆ １ 花粉育性基因座连锁 吴海滨１，２朱汝财１李迪１赵德刚２＊白羊年１＊ １海南省热带农业资源开发利用研究所，三亚，５７２０２５；２贵州省农业生物工程重点实验室，贵州大学，贵阳，５５００２５ ＊共同通讯作者，ｄｅｇａｎｇｚｈａｏ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ；ｂａｉｙａｎｇｎｉａｎ＠ｈｉｔａｒ．ｏｒｇ 摘要本研究利用两份栽培稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）种质ＨＩＴＡＲ００５和ＩＲＧＣ２０５０９杂交建立了含有５００个单 株的Ｆ ２群体，采用内含子长度多态性标记对Ｆ ２ 群体中的１１７株进行了标记基因型分析。研究发现一个内含 子长度多态性标记，ＲＩ０１５９４，其标记座位上与父本（ＩＲＧＣ２０５０９）相同基因型的纯合植株完全消失，且母本纯合基因型植株与杂合基因型植株的比率符合１：１（!２ Ｃ ＝０．９０，"２Ｃ＜Ｘ２０．０５），表现出一种明显的偏分离现象。分析该分子标记所在的目的序列，ＲＩ０１９５４标记所位于的基因含有３个内含子是一个功能未知的转录因子，粳稻Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ（日本晴）在该基因的第３个内含子序列与籼稻９３１１的序列相比有２４个碱基的缺失。进一步分析ＲＩ０１９５４标记的ＰＣＲ产物表明，发现消失的纯合植株基因型偏向于粳稻Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ（日本晴）。结合供试 的Ｆ ２群体的花粉育性检测结果，初步表明ＲＩ０１５９４标记与栽培稻Ｆ １ 花粉育性基因座连锁，与Ｆ １ 花粉不育基 因座连锁的遗传距离小于０．５ｃＭ，推测与ＲＩ０１９５４标记连锁的栽培稻的Ｆ １ 花粉不育性基因座是一个新的杂种不育位点。 关键词栽培稻，内含子长度多态性，Ｆ１花粉育性，偏分离 ＡｎＩＬＰＭａｒｋｅｒＣｌｏｓｅＬｉｎｋｉｎｇｗｉｔｈｔｈｅＴｅｎｔａｔｉｖｅＮｏｖｅｌＦ１ＰｏｌｌｅｎＳｔｅｒｉｌｅＬｏｃｕｓｉｎＣｕｌｔｉｖａｔｅｄＲｉｃｅ ＷｕＨａｉｂｉｎ１，２ＺｈｕＲｕｃａｉ１ＬｉＤｉ１ＺｈａｏＤｅｇａｎｇ２＊ＢａｉＹａｎｇｎｉａｎ１＊ １ＨａｉｎａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｓａｎｙａ，５７２０２５；２ＧｕｉｚｈｏｕＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＧｕｉｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ，５５００２５ ＊Ｃｏ－ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｄｅｇａｎｇｚｈａｏ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ；ｂａｉｙａｎｇｎｉａｎ＠ｈｉｔａｒ．ｏｒｇ ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅＦ２ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ５００ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｕｓｉｎｇｔｗｏｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｒｉｃｅｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ（Ｏ－ｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．），ＨＩＴＡＲ００５ａｓｆｅｍａｌｅｐａｒｅｎｔｆｒｏｍＨＩＴＡＲａｎｄＩＲＧＣ２０５０９ａｓｍａｌｅｐａｒｅｎｔｆｒｏｍＩＲＲＩ，ａｎｄｔｈｅＩＬＰ（ｉｎｔｒｏｎｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）ｍａｒｋｅｒｓｗｅｒｅｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏｇｅｎｏｔｙｐｅｔｈｅ１１７ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓｏｆｔｈｅＦ２ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．ＲＩ０１９５４，ａｎＩＬＰｍａｒｋｅｒｍａｐｐｅｄｉｎｔｈｅ３ｒｄｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｉｔｓｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｌｏｃｕｓｆｏｒｍａｌｅｐａｒｅｎｔｗｅｒｅｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙａｂｓｅｎｔｉｎｔｈｅ１１７ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓａｎｄｔｈｅｒａｔｉｏｏｆＲＩ０１９５４ｌｏｃｕｓｂｅｔｗｅｅｎｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｏｆｆｅｍａｌｅｐａｒｅｎｔａｎｄｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓｗａｓ１：１（#２Ｃ＝０．９０，$２Ｃ＜Ｘ２０．０５），ｗｈｉｃｈｓｈｏｗｅｄｏｂｖｉｏｕｓｌｙｄｉｓｔｏｒｔｅｄｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＦ２ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇＲＩ０１９５４ｗａｓｄｅｅｐｌｙａｎａｌｙｚｅｄｔｈａｔｉｔｉｓｕｎｋｎｏｗｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｆａｃｔｏｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｒｅｅｉｎｔｒｏｎｓ．Ｔｈｅｒｅｉｓ２４ｂｐｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆｔｈｅ３ｒｄｉｎｔｒｏｎｉｎＪａｐｏｎｉｃａＮｉｐｐｏｎｂａｒｅｃｏｍｐａｒｉｎｇｗｉｔｈＩｎｄｉｃａ９３１１．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙｐｒｉｍｅｒｓｏｆＲＩ０１９５４ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｂａｎｄｓｆｏｒｍａｌｅｐａｒｅｎｔｄｉｓａｐｐｅａｒｅｄｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｃａｌｔｏＪａｐｏｎｉｃａＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ．ＣｏｍｂｉｎｉｎｇｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｐｏｌｌｅｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｉｎｔｈｅＦ２ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ，ｉｔｗａｓｐｒｉｍａｒｙｃｏｎ－ｃｌｕｄｅｄｔｈａｔＲＩ０１９５４ｍａｒｋｅｒｃｌｏｓｅｌｙｌｉｎｋｅｄｔｏｔｈｅｐｈｅｎｏｔｙｐｅｏｆｔｈｅＦ１ｐｏｌｌｅｎｓｔｅｒｉｌｉｔｙｌｏｃｕｓａｎｄｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｔａｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｍｗａｓｅｓｔｉｍａｔｅｄｌｅｓｓｔｈａｎ０．５ｃＭ．ＡｎｄａｌｓｏｉｔｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｌｏｃｕｓｌｉｎｋｅｄｗｉｔｈＲＩ０１９５４ｗａｓａｎｏｖ－ｅｌＦ１ｐｏｌｌｅｎｓｔｅｒｉｌｅｌｏｃｕｓｉｎｔｈｅｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｒｉｃｅ． ＫｅｙｗｏｒｄｓＣｕｌｔｉｖａｔｅｄｒｉｃｅ（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．），Ｉｎｔｒｏｎｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＩＬＰ），Ｈｙｂｒｉｄｓｔｅｒｉｌｉｔｙ，Ｄｉｓｔｏｒｔｅｄｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ
限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment of Length Polymorphism,RFLP) 一基本原理 各种限制性酶能识别特定的碱基序列，并将其切开。碱基的变异可能导致切点的消失或新切点的出现，从而引起DNA片段长度和数量的差异。用特定的限制性内切酶消化目标DNA并通过电泳将长度不同的片断分开，并印记于硝酸纤维滤膜上，再与相应的探针杂交，就可以检测限制性片段长度多态性(RFLP). 二主要材料 DNA抽提用试剂，限制性内切酶，dNTP及Taq聚合酶电泳用琼脂糖或聚丙烯酰胺配制试剂，PCR扩增仪，水浴锅，电泳仪和电泳槽，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，探针标记物等。 三方法步骤(图1) 图1
(一) 样本DNA制备 采用常规DNA抽提的方法或DNA抽提试剂盒提取样本DNA，置低温下保存。对大多数样本而言，用于分析的样本DNA片段须先从总DNA中分离获取，并制备足够的量。为此，RFLP分析常先用PCR方法扩增目标片段。无论怎么做，必须保证DNA样本的纯度，这一点是非常重要的。 (二) 限制性内切酶降解样本DNA 根据不同的目标DAN，选择合适的限制性内切酶。目前常用的限制性内切酶有EcoRⅠ和HindⅢ等。该步骤必须保证酶解完全。如果有必要，可以用琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭分析酶解结果。酶解的时间根据实际情况而定。 (三) 电泳 电泳的主要目的是把DNA片段按大小(长短)分离开来，得到一个根据分子量排列的连续带谱。电泳可采用琼脂糖凝胶电泳，也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。时间由几小时到24小时不等。 (四) 转印 所谓转印，就是将已经电泳的DNA片段通过一定的方法转到固相支持物上。常用的固相支持物有硝酸纤维素滤膜或尼龙膜。转印前需经过碱变性溶液处理，将双链DNA变性为单链DNA。转印的方法一般有三种。根据DNA分子的复杂度转移2―12小时。 1 盐桥法；也叫毛细管转移法。先把硝酸纤维素滤膜放在20×SSC 溶液中浸透，然后把滤膜平铺在凝胶上，再在滤膜上放上浸过20×
动物DNA限制性片段长度多态性分析 9.1 动物DNA限制性片段长度多态性基本概况 DNA限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，简称RFLP）是进行动物物种分化和群体遗传多样性研究的一项重要经典技术，而线粒体DNA和核糖体DNA 则是动物RFLP研究中最为常用的两种遗传标记（Nei，Tajima 1981）。 动物线粒体DNA是一种共价闭环的环状双链DNA，具有严格的母系遗传方式，每个细胞中有 1 000～10 000个拷贝，容易从组织中分离、提纯（Brown等 1979；Avise等 1983；Lansman 1983）。提取线粒体DNA的实验技术比较简单，且重复性好（王文，施立明 1993）。mtDNA的基因结构比较简单、稳定，分子量小（15.7～19.5kb），处于限制性内切酶分析范围，因此易于进行结果分析（Brown 1979）。在脊椎动物中，mtDNA无组织特异性，即个体内的线粒体DNA具有高度的均一性（Avise等 1983），这就有利于限制性内切酶分析。更为重要的是，mtDNA进化速度快，是单拷贝核DNA的5～10倍，因而是进行近缘种间和种内群体间分化关系研究的良好遗传标记（Brown等 1979，1983；Wilson 1985；Avise 1986；Harrison 1989）。生物多样性研究中基本保护单元----进化显著性单元（evolutionary significant units，简称ESUs）（Ryder 1989）的确定，就极大地依赖于不同动物群体线粒体DNA单倍型的系统发育关系（Moritz 1994）。 ESUs的定义为：在mtDNA单倍型上互为单系群（monophyly）、在核基因座位上等位基因频率有显著差别的群体即称为ESUs。强调mtDNA的互为单系群，不仅因为它在进化上的重要性，而且因为理论上和模拟实验均说明隔离群体在一定时间后能达到这种状态。生物ESUs已被证明是一个在保护中很有用的概念标准。例如，在我们最近的一项研究中，发现广西的白头叶猴（Trachypithecus francoisi leucocephalus）和黑叶猴（T．f．francoisi）在mtDNA序列上严格地互为单系群（Wang等 1996），这明确地说明了白头叶猴是保护中应受到重视的一个ESU S。 核糖体DNA（ribosomal DNA，简称rDNA）是一类中等重复的核内DNA序列，每个重复单元（repetype）由非转录间隔区（non-transcribed spacer，简称 NTS）、转录间隔区（internal transcribed spacer，简称 ITS）和3种RNA（18S RNA，5.8S RNA，28S RNA）基因编码区 组成。这3个区域的DNA序列有不同的进化速率，编码区非常保守，适合于构建生命系统树的基部分枝；转录间隔区则中度保守，适合于推断50×106年前左右的事件；非转录间隔区则进化速度较快，适合于种间和已有隔离的群体间关系的研究（Appels， Honeycutt 1986； Hillis，Davis 1986；Suzuki等 1990）。此外，rDNA以一种协同的方式进化，在个体内和群体内有着较好的均质性（homoplasmy）。因此，有人认为，少量个体的抽样就能有效地代表 本章作者：王 文，陈永久，兰宏
基因多态性 多态性（polymorphism）是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型（genotype）或等位基因（allele），亦称遗传多态性（genetic polymorphism）或基因多态性。从本质上来讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。对于一个体而言，基因多态性碱基顺序终生不变，并按孟德尔规律世代相传。 基因多态性分类生物群体基因多态性现象十分普遍，其中，人类基因的结构、表达和功能，研究比较深入。人类基因多态性既来源于基因组中重复序列拷贝数的不同，也来源于单拷贝序列的变异，以及双等位基因的转换或替换。按引起关注和研究的先后，通常分为3大类：DNA片段长度多态性、DNA重复序列多态性、单核苷酸多态性。 DNA片段长度多态性DNA片段长度多态性（FLP），即由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化，而导致DNA片段长度的变化。又称限制性片段长度多态性，这是一类比较普遍的多态性。 DNA重复序列多态性DNA重复序列的多态性（RSP），特别是短串联重复序列，如小卫星DNA和微卫星DNA，主要表现于重复序列拷贝数的变异。小卫星（minisatellite）DNA由15~65bp的基本单位串联而成，总长通常不超过20kb，重复次数在人群中是高度变异的。这种可变数目串联重复序列（VNTR）决定了小卫星DNA长度的多态性。微卫星（microsatellite）DNA 的基本序列只有1~8bp，而且通常只重复10~60次。 单核苷酸多态性单核苷酸多态性（SNP），即散在的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失和插入，但更多的是单个碱基的置换，在CG序列上频繁出现。这是目前倍受关注的一类多态性。 SNP通常是一种双等位基因的（biallelic），或二态的变异。SNP大多数为转换，作为一种碱基的替换，在基因组中数量巨大，分布频密，而且其检测易于自动化和批量化，因而被认为是新一代的遗传标记。 遗传背景知识遗传和变异各种生物都能通过生殖产生子代，子代和亲代之间，不论在形态构造或生理功能的特点上都很相似，这种现象称为遗传（heredity）。但是，亲代和子代之间，子代的各个体之间不会完全相同，总会有所差异，这种现象叫变异（variation）。遗传和变异是生命的特征。遗传和变异的现象是多样而复杂的，正因为如此，才导致生物界的多种多样性。
扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism)，是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的分子标记技术。文章主要讲述该技术的原理、流程及特点，并从以下三个方面讲述该技术的应用情况：动物学方面，讲述其在动物遗传学，动物系统学，性别鉴定与繁殖行为研究上的应用；植物学方面，讲述其在种质资源鉴定，作物育种上的应用；医学方面，讲述其在肿瘤，遗传病，流行病学方面的进展。文章还分析了AFLP技术的优缺点并展望了其应用前景。 关键词：AFLP，分子标记技术，应用 目前遗传标记主要有4种类型，即形态标记(Morphological Markers)、细胞标记(Cytological Markers)、生化标记(Biochemical Markers)和分子标记(Mo1ecular Markers) [1]。分子标记一般指DNA标记。分子标记依据所用的分子生物学技术,大致分为三大类：(Ⅰ)以电泳技术 （Ⅱ）和分子杂交技术为核心,其代表性技术有RFLP和DNA指纹技术(DNA Fingerprinting) 。 以电泳技术和PCR技术为核心,其代表性技术有RAPD( Random amplified polymorphism DNA) 、SSLP(Simple sequence length polymorphism ,或称Sequence-tagged microsatellitesite, STMS)和AFLP。（Ⅲ）基于DNA芯片技术的分子标记,即SNP[ 2-4 ]。其中，扩增片段长度多态性(AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism)，是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的方法，已获欧洲专利局的发明专利。该技术具有多态性丰富、灵敏度高、稳定性好、可靠性高、不易受环境影响等优点，近年来广泛应用于生命科学各项研究中。 1. AFLP分子标记技术原理、流程及特点 1.1. AFLP分子标记技术原理 AFLP技术是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。由于不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性[5]。Vos等(1995)曾对AFLP的反应原理进行了验证，结果检测到的酶切片段数与预测到的酶切片段数完全一致，充分证明了AFLP技术原理的可靠性。
末端限制性酶切片段长度多态性分析技术进展 李 红 (安庆市卫生学校,安徽安庆 246011) 摘 要:末端限制性酶切片段长度多态性分析(T erminal Restriction Frag ment Leng th Polymorphism,T -RFLP)是近年来发展起来的、不依赖于培养的微生物群落分析方法之一.由于 其在微生物群落结构分析方面的特点,包括分辨率高、易于实现自动化及互联网海量数据共享等优 势,自1997年最先被报道以来得到了广泛的应用,成为环境微生物群落分析的最强有力的工具之 一.类似于其他的分子微生物生态学技术,T -RFLP 也有自身的缺陷,本文详细介绍了T -RFLP 技术的原理及其解析环境微生物群落的基本流程,简述了近年来T -RFLP 技术在群落分析中的 研究进展,重点讨论了该技术的局限性及相应的解决办法. 关键词:微生物群落;末端限制性片段长度多态性分析;分子微生物生态学;生物多样性 中图分类号:O657.1 文献标识码:A 文章编号:1001-2443(2006)06-0582-04 引 言 环境中的微生物都不是单独存在的,总是通过各种作用形成微生物群落.分析微生物的群落结构,了解其与环境相互作用关系,有助于从种群和群落水平上深入理解环境中的微生物;了解环境污染物迁移转化的微生物学基础;更深刻地认识各种生物处理工艺的微观机理,从而为调控和优化微生物群落、提高处理效果提供理论指导. 传统的微生物群落分析方法建立在微生物纯种培养分离的基础上.而环境中微生物群落结构非常复杂、多样性极高,因此传统方法存在致命缺陷:无法培养自然界中所有微生物[1],也无法反映自然条件下微生物群落的真实情况[2].所以,有必要研究不依赖微生物培养的环境微生物群落分析方法.1986年Pace 等人利用核酸序列分析技术研究微生物的生态和进化以来,分子生物学技术已被广泛地应用于微生物群落分析,研究方法也层出不穷,包括荧光原位杂交法(Fluorescence In Situ Hybridization ,FISH )[3]、限制性酶切片段长度多态性分析法(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP) [4]、变性梯度凝胶电泳法(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)[5]等. 末端限制性酶切片段长度多态性分析(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,T -RFLP)是RFLP 基础上发展起来的新技术,相对于其它分子生物学技术具有分辨率高、易于实现自动化等特点,是分析复杂环境微生物群落的强有力的工具之一[6,7]. 1 T-RFLP 技术的基本原理 T -RFLP 技术以分子系统学原理为基础,综合运用了PCR 、限制性酶切、荧光标记和DNA 序列分析等技术,通过对特定核酸片段长度多态性的测定来分析微生物群落结构和功能.首先根据比较基因组学原理选取一段具有系统进化标记特征的DNA 序列作为目标分析序列.从原理上讲,微生物群落中任何具有特异性的DNA 片段都可以作为目标分析序列,包括微生物核糖体小亚基(SSU)16S rRNA(原核生物)和18S rRNA (真核生物)的基因序列[8] ,以及一些保守的功能基因序列等.之后根据目标基因序列的保守区设计引物,荧光标记.提取总DNA,PCR 扩增片段一端带有荧光标记.限制性内切酶对扩增的DNA 消化,产生长度不同的片段.电泳分离、荧光检测,检测带荧光标记的片段(Terminal Restriction Fragment,T -RF).通过分析,揭收稿日期:2006-03-16 作者简介:李红(1966-),女,安徽安庆人,讲师,硕士.第29卷6期 2006年12月 安徽师范大学学报(自然科学版)Journal of Anhui Normal University (Natural Science)Vol.29No.6Dec .2006
1、朊粒病的共同特征中不包括（） 1.潜伏期长，达数月、数年甚至数十年 2.一旦发病呈慢性、进行性发展，以死亡告终 3.表现为海绵状脑病或蛋白质脑病 4.产生严重反应和免疫病理性损伤 2、下面哪种酶是在重组DNA技术中不常用到的酶（） 1.限制性核酸内切酶 2.DNA聚合酶 3.DNA连接酶 4.DNA解链酶 3、长期接触X射线的人群，后代遗传病发病率明显升高，主要原因是该人群生 殖细胞发生（） 1.基因重组 2.基因突变 3.基因互换 4.基因分离 4、抗VD佝偻病属于：（） 1.常染色体显性遗传病 2.常染色体隐性遗传病 3.X连锁显性遗传病 4.X连锁隐性遗传病 5、法医DNA技术中的三大基本技术指（） ①DNA 指纹技术②荧光显微技术③PCR 扩增片段长度多态性分析技术④线 粒体DNA 测序 1.①②③ 2.②③④ 3.①②④ 4.①③④ 6、相互连锁的两个基因位于（）上 1.同源染色体 2.同一染色体 3.非同源染色体 4.不同对染色体 7、关于核糖体的移位，叙述正确的是（） 1.空载tRNA的脱落发生在“A”位上
2.核糖体沿mRNA的3’→5’方向相对移动 3.核糖体沿mRNA的5’→3’方向相对移动 4.核糖体在mRNA上一次移动的距离相当于二个核苷酸的长度 8、Western blot是（） 1.检测DNA的方法 2.检测RNA的方法 3.检测蛋白的方法 4.检测酶的方法 9、针对耐药菌日益增多的情况,利用噬菌体作为一种新的抗菌治疗手段的研究 备受关注。下列有关噬菌体的叙述,正确的是（） 1.利用宿主菌的氨基酸合成子代噬菌体的蛋白质 2.以宿主菌DNA为模板合成子代噬菌体的核酸 3.外壳抑制了宿主菌的蛋白质合成,使该细菌死亡 4.能在宿主菌内以二分裂方式增殖,使该细菌裂解 10、a和b是不同顺反子的突变，基因型ab/++和a+/+b的表型分别为（） 1.野生型和野生型 2.野生型和突变型 3.突变型和野生型 4.突变型和突变型 11、法医DNA科学涉及的学科有（） 1.分子遗传学 2.生物化学 3.生物统计学 4.以上都是 12、下列哪种碱基不属于DNA/RNA的碱基（） 1.腺嘌呤 2.鸟嘌呤 3.次黄嘌呤 4.胸腺嘧啶 13、要使两对基因杂合体自交后代群体纯合率达到96%以上，至少应该连续自交 （） 1.4代 2.5代 3.6代 4.7代
. 人基因多态性分析 一、实验目的 1. 了解基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性中的重要作用。 2. 了解分析基因多态性的基本原理和研究方法。 二、实验原理 基因多态性（gene polymorphism）是指在一个生物群体中，同时存在两种及以上的变异型或基因型或等位基因，也称为遗传多态性（genetic polymorphism）。人类基因多态性对于阐明人体对疾病的易感性、毒物的耐受性、药物代谢差异及遗传性疾病的分子机制有重大意义；与致病基因连锁的多态性位点可作为遗传病的诊断标记，并为分离克隆致病基因提供依据；病因未知的疾病与候选基因多态性的相关性分析，可用于辅助筛选致病易感基因。 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction—Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)分析是一种常用的DNA分子标记。原理是通过PCR扩增获得目的基因。若目的基因存在等位变异（多态性），且变异正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，则酶切结果就会产生大小不同的片段，即片段长度多态性，再利用琼脂糖凝胶电泳分离，可呈现出多态性电泳图谱。若将患者与正常的多态性图谱比较，可确定是否变异。应用PCR-RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。 三、器材与试剂 1. 器材 ⑴离心机。 ⑵DNA扩增仪。 ⑶电泳仪。 ⑷水平电泳槽。 ⑸紫外检测仪。 ⑹移液器。 2. 试剂 . . ⑴口腔拭子DNA抽提试剂盒。 ⑵琼脂糖。 ⑶1×TAE电泳缓冲液：980ml蒸馏水中加入50×TAE母液20ml。 ⑷50×TAE母液：Tris 121g，0.5M EDTA（pH8.0）50ml，冰醋酸28.55ml，定容至500ml。
实验六、限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 一、实验目的 学习和掌握限制性片段长度多态性（RFLP）遗传标记的基本原理和检测方法。 二、实验原理 第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过PCR，酶切及琼脂糖凝胶电泳进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。 三、仪器、材料与试剂 （一）仪器：电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检测系统 （二）材料与试剂：Hind Ⅲ限制性内切酶，10×M Buffer，待分析的PCR产物，DL2000 DNA Marker，6×Loading Buffer（上样缓冲液）,灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶（注意：含溴化乙锭EB，致癌，请带手套操作），0.5%TBE（电泳缓冲液）。 四、实验步骤 1、Hind Ⅲ限制性内切酶酶切 反应体积（10μl），在0.2ml Eppendorf管中依次加样： 10xM buffer 1 μL ddH2O 5.5 μL Hind Ⅲ0.5 μL PCR产物 3 μL 37℃水浴消化2h，消化产物全部用于琼脂糖检测。 2、琼脂糖凝胶电泳
配置1.5%琼脂糖凝胶，取10μl 酶切产物+1μl 上样缓冲液,180V 恒压电泳。DNA 带负电荷，电泳时DNA 从负极向正极泳动。待泳动至凝胶的1/2~2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。 五、作业 写出本实验的具体操作过程并描述你所观察到的结果。（画图） M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hind Ⅲ内切酶识别位点：A ↓AGCTT TTCGA ↑A AB AA BB 2000 750 500 250 1000 100
人基因多态性分析 一、实验目的 1. 了解基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性中的重要作用。 2. 了解分析基因多态性的基本原理和研究方法。 二、实验原理 基因多态性（gene polymorphism）是指在一个生物群体中，同时存在两种及以上的变异型或基因型或等位基因，也称为遗传多态性（genetic polymorphism）。人类基因多态性对于阐明人体对疾病的易感性、毒物的耐受性、药物代谢差异及遗传性疾病的分子机制有重大意义；与致病基因连锁的多态性位点可作为遗传病的诊断标记，并为分离克隆致病基因提供依据；病因未知的疾病与候选基因多态性的相关性分析，可用于辅助筛选致病易感基因。 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction—Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)分析是一种常用的DNA分子标记。原理是通过PCR扩增获得目的基因。若目的基因存在等位变异（多态性），且变异正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，则酶切结果就会产生大小不同的片段，即片段长度多态性，再利用琼脂糖凝胶电泳分离，可呈现出多态性电泳图谱。若将患者与正常的多态性图谱比较，可确定是否变异。应用PCR-RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。 三、器材与试剂 1. 器材 ⑴离心机。 ⑵DNA扩增仪。 ⑶电泳仪。 ⑷水平电泳槽。 ⑸紫外检测仪。 ⑹移液器。 2. 试剂
06级研究生班分子生物学期终考试试卷（A卷）标准答案 一、名词解释： 1、基因家族：是指核昔酸序列或编码产物具有一定程度同源性的一组基因. 2、m RNA的选择剪接：是指真核细胞基因表达所转录出的前体mRNA的剪接过程中，参加拼接的外显子可以不按其在基因组的线性分布次序拼接，内含子也可以不被切除而保留，即一个外显子或内含子是否出现在成熟的mRNA中是可以选择的。这种剪接称mRNA选择剪接。 3、R NA干涉技术是指由短的双链RNA诱导的同源RNA降解的过程，可使基因的表达受到抑制。它是在基因的转录后水平抑制基因表达的一种研究基因功能的方法。 4、基因定点诱变：指将基因的某一个或某些位点进行人工替换或删除的过程, 称为基因定点诱变. 5、错义突变：指DNA分子中碱基的取代，经转录产生的mRNA后，相应密码子发生改变，编码另一种氨基酸，使蛋白质屮的氨基酸组成和排列顺序发生改变。传基因技术是指将外源基因导入受精卵细胞或胚胎干细胞中，通过外源基因与 细胞染色体DNA之间随机重组的发牛:而将外源基因插入到受体细胞染色体DNA 上的过程。 .填空题：每空1分，共25分 1、获得启动子、增强子；基因易位；原癌基因扩增；点突变 2、同义突变；错义突变；无义突变；移码突变 3、限制性片段长度多态性；微卫星序列；单核昔酸多态性 4、一条多肽链；编码序列；两侧的侧翼序列；插入序列
5、基因添加（增补）；基因干预；基因置换:导入白杀基因；基因修饰 6、点突变；DNA多态性 7、旁观者效应 8、核酸分子杂交；PCR技术 三?单项选择题（每题1分，共15分?） 1-5 （ABBBA）6-10 （ CACDC）11-15 （ ADDDA） 四、问答题 一、简述转座作用的遗传学效应（4分） 1、转座引起插入突变（1分） 当插入序列或转座子插入某个基因的操纵序列前时，可引起操纵子后的结构基因表达失活。 2、转座可产生新基因（1分） 如杲转座子上带有某些抗药性基因，它一方面会造成靶位点DNA突变，同吋会使该位点产生抗药性。 3、转座可出现染色体畸变发生（1分） 当转座发生在宿主DNA原有位点吋，往往导致转座子两个拷贝之间的同源重组，引起DNA的缺失或倒位。 4、转座可以引起生物进化（1分） 由于转座作用，使一些原来在染色体上相距甚远的基因组合到一起，构建成一个操纵子或表达单元，也可能产生上些具有新的生物学功能的基因和新的蛋白质分子。
王义权老师（6题） 1、什么是DNA分子标记？ DNA是生物遗传信息的载体，任何生物的遗传信息都具有种属特异性。生物体一切具有其种属特异性的特征，均可作为标记。DNA分子标记是DNA分子中能够反映生物种属特异性的序列特征，这种特征可以用多种方法揭示。 2、DNA分子标记的种类有哪些？ DNA分子标记有：限制性长度多态性RFLP、PCR-RFLP、CAPS、DNA指纹、随机扩增多态性RAPD、序列特征扩增区SCAR、位点特异性PCR（AS-PCR）、单链构象多态性SSCP、扩增片段长度多态性AFLP、序列分析、单核苷酸多态性SNP、表达序列标签EST、序列标签位点STS、简单序列重复SSR、简单序列长度多态性SSLP、微卫星序列DNA、VNTR等。 3、DNA分子标记有哪些用途？ 在基因组研究中的作图； 动植物遗传育种中的应用； 医学遗传学和疾病的诊断； 传染病的病原生物检测：如SARS，禽流感病毒； 生物样品的检验如海关检疫、法医鉴定、中药材鉴定等； 在动物学研究中的应用。 4、简要说明RFLP的原理并举例说明其应用。 RFLP的原理是限制性内切酶（II型酶）对特定序列的识别，并在识别位点专一性地将双链DNA切开。多数限制性内切酶识别的是DNA分子中4~6 bp的特征序列，而基因组DNA分子中散布着多种内切酶的识别序列，故可将不同生物的DNA分子切成长短不一的DAN片段。每4n bp处有一切点，理论上切点的频率为基因组总长/ 4n bp，因此对某一特定基因组，识别位点碱基数多的限制酶，在该基因组中的识别位点数就少；反之就多。切点的多少可由酶切后的DNA片段长度检验。可以应用于物种遗传多样性分析。 5、举例说明DNA分子标记在动物学研究中的应用。 DNA分子标记在动物学研究中的应用包括估算遗传距离、重建系统发生树、分析种群结构及分子生态学、测定种群遗传多样性及应用于保护生物学、系统地理学、鉴定物种或种群等。 例：厦门海域文昌鱼的研究：通过设计Cytb和12S rRNA基因扩增引物，PCR扩增，测序和序列比对、MEGA数据分析，得出结论厦门有2种文昌鱼，二者的遗传距离达到21.13%；其中有一种(来自黄厝)与来自日本海域的文昌鱼的遗传距离只有0.56%；详细的观察、测量与比较，进一步确定其作为2个不同的物种在厦门海域的存在。 6、名词解释 随机扩增多态性RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)：根据在庞大的基因组DNA中存在的许多短的颠倒重复序列。用单一引物，在较低的复性温度下，可以将基因组中两个相邻的颠倒重复序列间的DNA片段扩增出。通过琼脂糖凝胶电泳等分离手段，可将扩增产物按片段大小分离，形成特定的电泳谱带。 单链构象多态性SSCP(Single Strand Conformational Polymorphism)：DNA单链在变性凝胶电泳中的迁移速率不仅与DNA片断长度有关，还与特定序列形成的特定空间构象有关。 扩增片段长度多态性AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)：用限制酶切基因组DNA后，装上适当接头，再用选择性引物扩增，可得到长度多态性很好的DNA片段。 表达序列标签EST(Expressed Sequence Tag)：从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端
基因多态性的检测方法 多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(site polymorphism)和长度多态性 (longth polymorphism)。 基因多态性的主要检测方法简述如下： 1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多态性，致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时， 钠 问 亢兔扛銎 蔚某ざ染筒煌 此 降南拗菩云 纬ざ榷嗵 裕 贾孪拗破 纬ざ确⑸ 谋涞拿盖形坏悖 殖莆 嗵 晕坏恪Ｗ钤缡怯肧outhern Blot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。 2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。在电泳时泳动的速度不同。将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。 3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。其原理是：用PCR 扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。突变碱基及对应的正常碱基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。若与已知的突变基因的寡核苷探针匀不能杂交，提示可能为一种新的突变类型。 4. PCR-SSO法：SSO技术即是顺序特异寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。探针与PCR产物在一定条件下杂交具有高度的特异性，严格遵循碱基互补的原则。探针可用放射性同位素标记，通过放射自显影的方法检测，也可以用非放射性标记如地高辛、生物素、过氧化物酶等进行相应的标记物检测。 5. PCR-SSP法：序列特异性引物分析即根据各等位基因的核苷酸序列，设计出
1.限制性内切酶一般保存在（50%）浓度的甘油溶液中。 2.限制性图谱与限制性片段长度多态性（RFLP）图谱的最显着区别在于（A） 3.A.前者是物理图谱后者是连锁图 4.迄今为止所发现的限制性内切核酸酶可以作用于（C） C.只能作用于双链DNA 5.已知某一内切酶在一个环状DNA上有4个切点，当用此酶切割该环状DNA，可以得到（4）个片段 6.甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变，是导致一些酶星星活性的主要原因之一，防止的办法是在酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在（5%）以下 7.在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制哪一项最好（D）D.酶量 8.DNA被某种酶切割后，电泳得到的电泳带有些扩散，下列原因中，哪一项不太可能（C） A.蛋白质（如BSA）同DNA结合 B.有外切核酸酶污染 C.酶失活 D.酶切条件不适合 切口与gap缺口的区别在于（A） A.前者是断开了一个磷酸二酯键，后者是指DNA的单链中有较小的缺失 9.限制酶的命名遵循一定的原则，涉及来源（宿主），菌株或生物型。命名时（A） A.属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字） 10.以下对同裂酶的描述中，哪一项是正确的（A） A.识别相同序列的限制酶称同裂酶 B.可以产生相同的粘性突出末端的限制酶称同裂酶 C.同裂酶的切割位点一定相同 D.同裂酶的切割位点不相同 11.下列哪一种酶作用时需要引物（B） A.末端转移酶 B.反转录酶连接酶D.限制酶 12.关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下述描述中只有（C）不恰当 A.由作用于同一DNA序列的两种酶构成 B.这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰 C.不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统 D.这一系统的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶 13.限制性内切核酸酶可以特异性地识别（C.双链DNA的特定碱基序列） 14.在大肠杆菌中，大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶，以下选项中哪一种酶不包括在内（D） A.dam B.dcm（） C.EcoKⅠ D.SssⅠ 15.在大肠杆菌中，至少有3种依赖于甲基化的限制系统，以下选项中不属于这3种的为（C） A.mcrA B.mcrBC C.mcrD D.mrr 16.下面有关限制酶的叙述哪个是错误的（A） A..限制酶是外切酶而不是内切酶 B.同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是相同的 C.一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链DNA，产生粘末端 D.一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA，产生平末端 连接酶在体内的主要作用是在DNA复制、修复中封闭缺口，下列对DNA连接酶的描述中，哪项是正确的（A） A.将双链DNA分子中的5'磷酸基团同3'－OH末端重新形成磷酸二酯键 B.作用时不消耗能量 C.需要Mn2+等二价辅助离子 D.也可以连接RNA分子 1.氨苄青霉素的工作原理为（A） A.可以抑制细胞壁肽聚糖的合成 3.载体所具备的特点中，以下描述不恰当的是（B） A.必须具备复制起点，能够自主复制 B.必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入 C.有一定的筛选标记，用于筛选 D.必须具有较高的拷贝数，便于制备 4.复制子由三部分组成，以下不属于的为（D）（）