酵母菌的培养和观察 目的认识酵母菌的形态特征，了解培养酵母菌的方法。 实验前的思考人类认识和利用酵母菌的历史悠久，早在史前时期，先人们就学会酿酒。约在6000年前，就发明发面的方法。直到十九世纪有了显微镜，人们才窥探到醉母菌的真面目。对酵母菌做纯系培养分类研究的是与巴斯德同时代的丹麦人汉斯，他是为寻求酿造高品质啤酒的途径才去深入研究酵母菌的。 材料器具甜酒酿汁液，新鲜酵母，豆芽；显微镜，载玻片，盖玻皮，玻璃棒，镊子，滴管，吸水纸，酒精灯，石棉网，火柴，漏斗架，玻璃斗，量杯，三角烧瓶，烧杯，天平，量筒，棉絮；蔗糖，乳酸，碘液。 步骤 1．观察酵母菌 （1）用滴管从甜酒酿的汁液中吸取一滴汁液，滴在载玻片上，用针摊开，盖上盖玻片，在低倍镜下就能清楚地看到甜酒酿的汁液中悬浮着无数酵母菌。再换高倍镜仔细观察一个酵母菌，可以看到酵母菌是椭圆形的单个细胞，细胞中有许多小颗粒，也有几个大的液泡（图示）。有的酵母菌的一端长出大小不同的突起，这是酵母菌的芽体。芽体成长脱落，就成为新的个体，有的芽体在从母体脱落前又长出突起。这种繁殖方法叫出芽繁殖。 （2）在盖玻片一边加一滴碘液，从另一边用吸水纸把染液引入盖玻片下。不久就能看到被染成棕褐色的细胞核和变成蓝紫色的淀粉粒。 2．培养酵母菌 （1）用蔗糖液培养在盛有100毫升的三角烧瓶里加5克蔗糖，煮沸。等到溶液稍稍冷却，加一小块鲜酵母，用玻璃棒搅拌均匀；再用棉絮塞紧瓶口。然后把烧瓶放在25～30℃的温暖地方，数小时后就可见到溶液里有气泡产生，并散发出酒味。这是因为酵母菌正在把糖分解成乙醇和二氧化碳。 （2）二三天后吸取溶液在显微镜下观察，就可看到已培养出大量酵母菌。
BY4741酿酒酵母菌 BY4741Strain BY4741菌信息： 培养基：YPD 菌株类别：酵母菌 培养条件：28℃，有氧，YPD 质粒转化：电激 保存方式：30%甘油，-20℃ 基本应用：用于蛋白表达 BY4741菌使用说明： 四区划线培养，挑单菌落接种培养使用并保存甘油菌。 BY4741操作说明： 1，本品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数的增加，细菌的活力会逐渐下降。 2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆菌落进行后续操作。 冷冻管开封： 用浸过75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。 BY4741菌株复溶： 无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取1ml左右复溶液，加入到冷冻管中。轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。 BY4741菌株复壮： 用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培养。细菌在30-35℃培养箱中培养24-48h，真菌在23-28℃培养箱中培养24-72h（必要时，可适当延长培养时间）。 BY4741菌株传代： 将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量增大接种量：如用无菌吸管吸取≥50μl新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。 注意事项： 1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放置会导致
菌种衰退； 2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行； 3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能正常生长； 4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来电询问； 5、某些厌氧菌的培养，自开封到接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧状态；培养过程中亦要保持厌氧状态； 6、某些菌种，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要5-10%CO2促进生长； 7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。 8、部分菌种有致病性、扩散性，请专业人员在专业环境下有保护性操作。 BY4741菌保藏条件： -20℃保存（复溶液于2-8℃保存） 保藏时间： 2-10年，应根据菌种状况及时转接
1.酵母表达系统的特点大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统，人们已利用该系统表达了多种蛋白。大肠杆菌基因结构简单，易于进行基因操作，而且它生长迅速，周期短，营养需求简单，适于工业化生产。但同时该系统还存在很多缺陷。它是原核表达系统，缺少真核生物的翻译后加工过程，产生的外源基因产物往往无活性，它表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复性，过程复杂，它产生的杂蛋白较多，不易纯化，所以产物中有可能会含有原核细胞中的有毒蛋白或有抗原性的蛋白。昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是真核细胞表达系统，它们可以进行多种蛋白的转录后加工，很适合于真核基因的表达。但是，它们遗传背景复杂，操作困难，易污染，生产成本高，所以并不利于实际应用[2,3] 2.核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化[4]。所以近年来，酵母表达系统已广泛应用于工业生产，为社会创造了极大的经济效益 3.酵母一般可分成三大类：(1) 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母；(2) 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；(3) 非常规酵母(Nonconventional yeast)，是指除酿酒酵母和粟酒裂殖酵母外的酵母统称 4.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）又名面包酵母，它是单细胞真核微生物，一直以来酿酒酵母被称为真核生物中的―大肠杆菌‖。它是最早应用于酵母基因克隆和表达的宿主菌。自1981年Hitzemom等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后，人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白，目前科学家对酿酒酵母表达系统的研究已非常深入。 5.2.1.2 用于基因表达的宿主菌——酿酒酵母在遗传学方面，人们对酿酒酵母进行了广泛的研究，酿酒酵母基因组序列（约1.2×107bp）早在1996年就完成，它有16条染色体，约6000个ORF，仅4%的酵母基因有内含子。由于人们对酿酒酵母的遗传背景十分清楚，因此酿酒酵母是很理想的真核表达宿主菌。
pPIC9k-His 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT2430 pPIC9k--‐His 载体基本信息 出品公司: Invitrogen 载体名称: pPIC9k--‐His 质粒类型: 酵母表达载体 高拷贝/低拷贝: --‐--‐ 启动子: --‐--‐ 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: --‐--‐ 5' 测序引物及序列: --‐--‐ 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: Ampicillin 筛选标记: --‐--‐ 备注: --‐--‐ 产品目录号: --‐--‐ 稳定性: --‐--‐ 组成型: --‐--‐ 病毒/非病毒: --‐--‐ 载体质粒图谱和多克隆位点信息
其他酵母表达载体： p416GFD pPIC9 p53blue pPIC9K pACT2-AD pPIC9k-His pAD-GAL4-2.1 pPICZA pADH2 pPICZB pAUR123 pPICZC pBridge pPICZαA pCL1 pPICZαB pDEST32 pPICZαC pDisplay pPICZαD pDR195 pPICZαFC pESC-His pPICZαGB pESC-Leu pPink-HC pESC-TRP pPink-LC pESC-URA pPinkα-HC pFA6a-FGP(S65T)-kanMX6 pRS316 pFLD pRS403 pFLD/CAT pRS405 pFLDαpRS406 pGADT7-T pRS414 pGAG424 pRS415 pGAPZA pRS416 pGAPZB pRS41H pGAPZαB pRS426 pGAPZαC pRS426gal pGBKT7 pSEP1 pGBKT7-53 pSEP2 pGBKT7-Lam pSEP3 pHIC-PI pSos pHIL-D2 pSos-MAFB pHIL-S1 pUG66 pHis2 pYC2/CT pHisSi-1 pYC2/NTA
发酵乳中酵母菌和乳酸菌生长的相互影响 李先胜姜铁民陈历俊* (1 大连工业大学大连 116034 2 北京三元食品股份有限公司北京 100085) 摘要：探讨了乳酸菌和酵母菌之间的相互作用。在发酵过程中，酿酒酵母对乳酸菌的生长有抑制作用。乳酸菌能促进酿酒酵母和马克思克鲁维酵母的生长。酿酒酵母和乳酸菌共同接种有利于保持产品冷藏期间活菌数的稳定，菌株之间可能存在共生作用。 关键词：乳酸菌，酵母菌，相互作用 The growth interaction between lactic acid bacteria and yeast in fermentation milk LI Xian-Sheng JIANGTie-Min CHEN Li-Jun* （1. Dalian Polytechnic University, Dalian 116034; 2. Beijing Sanyuan Foods CO., Ltd, Beijing 100085）Abstract：Various interactions between lactic acid bacteria and yeasts yeasts were investigated.In details,the growth of lactic acid bacteria during fermentation was inhibited by the addition of Saccharomyces cerevisiae．The addition of lactic acid bacteria advanced the growth of Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces marxianus.A positive interaction between Saccharomyces cerevisiae and lactic acid bacteria was observed during cold storage to improve the viability of each other. Key word：lactic acid bacteria;yeast;interaction 酵母菌广泛存在于自然界中，它们经常存在于商业和传统的发酵乳制品中。有研究报道在发酵乳制品中酵母菌的数量在103-107之间[1-5]。在酸奶中酵母菌被认为是污染物，它们是酸奶变质的主要原因[6]，但在一些商业化的乳制品（kefir和koumiss）中，酵母能够为产品带来期望的香气和风味[7]。在发酵乳制品生产加工过程中起主要作用的是乳酸菌的乳酸发酵，酵母菌所产生的风味物质等代谢产物也能影响乳制品的品质。近年来，不断发现酵母菌作为附属发酵剂对乳制品发酵和成熟过程中的风味影响、抑制有害菌的生长及对人体的潜在益生 基金资助：国家科技部“十一五”支撑计划（2009BADB9B06）； 国家“863”计划(2011AA100903)； 北京市科技计划(D10110504600000)。 作者简介：李先胜，男，硕士 *通讯作者：陈历俊，chlj@https://www.doczj.com/doc/b116205994.html,
霉菌和酵母菌介绍及检测方法 一、霉菌和酵母菌介绍： 霉菌和酵母菌及其检验酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。 霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。长期以来，人们利用某些霉菌和酵母加工一些食品，如用霉菌加工干酪和肉，使其味道鲜美；还可利用霉菌和酵母酿酒、制酱；食品、化学、医药等工业都少不了霉菌和酵母。但在某些情况下，霉菌和酵母也可造成中腐败变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。 二、检验方法： 霉菌和酵母的计数方法，与菌落总数的测定方法基本相似。主要步骤为：将样品制作成10倍梯度的稀释液，选择3个合适的稀释度，吸取1mL于平皿，倾注培养基后，培养观察，计数。对霉菌的计数，还可以采用显微镜直接镜检计数的方法。 具体检测标准参见： GB4789.15-94，《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物检验霉菌和酵母计数》三、说明： 1．样品的处理。为了准确测定霉菌和酵母数，真实反映被检食品的卫生质量，首先应注意样品的代表性。对大的固体食品样品，要用灭菌刀或镊子从不同部位采取试验材料，再混合磨碎。如样品不太大，最好把全部样品放到灭菌均质器杯内搅拌2min。液体或半固体样品可用迅速颠倒容器25次来混匀。 2．样品的稀释：为了减少榈稀释倍数的误差，在连续递增稀释时，每一稀释度应更换一根吸管。在稀释过程中，为了使霉菌的孢子充分散开，需用灭菌吸管反复吹吸50次。 3．培养基的选择：在霉菌和酵母计数中，主要使用以下几种选择性培养基。 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA）：霉菌和酵母在PDA培养基上生长良好。用PDA作平板计数时，必项加入抗菌素以抑制细菌。 孟加拉红（虎红）培养基：该培养基中的孟加拉红和抗菌素具有抑制细菌的作用。孟加拉红还可抑制霉菌菌落的蔓延生长。在菌落背面由孟加拉红产生的红色有助于霉菌和酵母菌落的计数。 高盐察氏培养基：粮食和食品中常见的曲霉和青霉在该培养基上分离效果良好，它具有抑制细菌和减缓生长速度快的毛霉科菌种的作用。 4．倾注培养。每个样品应选择3个适宜的稀释度，每个稀释度倾注2个平皿。培养基熔化后冷却至45℃，立即倾注并旋转混匀，先向一个方向旋转，再转向相反方向，充分混合均匀。培养基凝固后，把平皿翻过来放温箱培养。大多数霉菌和酵母在25－30℃的情况下生长良好，因此培养温度25~28℃。培养3d后开始观察菌落生长情况，共培养5d观察记录结果。 5．菌落计数及报告：选取菌落数10~150之间的平板进行计数。一个稀释度使用两个平
酵母菌在人类生活中的应用 摘要：涉及到人类食品中的酵母菌种类繁多，其中不同种类有不同的功能，这使得酵母菌在食品中有着广泛的用途，与人类的生活息息相关，随着科学技术的发展，酵母菌一定可以为人类的生活做出更大的贡献。 关键字：酵母菌应用前景 酵母菌是子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称。依照荷兰科学家Loddoy在1970年提出的分类系统，将有无形成有性孢子作为分类的起点，属上的分类主要依据形态，种的规划主要依据生理的特性，将酵母菌分为三个亚门：1.能形成子囊孢子的酵母属子囊亚门，共4个科22个属139种酵母。2.能产生冬孢子和担孢子的酵母菌，属于担子菌亚门、冬孢子纲、黑粉菌目、黑粉菌科共9个科。3.能产生掷孢子的酵母菌，属于担子菌亚门、东孢子纲、掷包酵母科、科内有三属。4.不能产生有性孢子，尚未发现有性过程的酵母属于半知菌亚门，共12个属170个种。但就我国目前所常用的分类是将酵母菌分为：鲜酵母、活性干酵母、即发酵母。酵母菌在生物界中的种类繁多，其在人类生活中也得到广泛的应用。据科学家推测，早在史前三千多年，人类就已经懂得酵母的发酵技术，虽不知原理，但却已有相当丰富的经验。据考古学家考证，在史前2500年的埃及Theban法王填墓内找到经发酵的面包实体和证明酒和啤酒酿造的壁画和宝物，以及在公元前2698年中国史记记载了自黄帝开始已有教民烹煮面食的记载，都证明人类在这之前就已懂得种植稻米、小麦以及储存、磨粉和利用酵
母调制不同的食物。由此看来，酵母菌的利用已深入人类的发展史。 1.酵母菌在发酵乳制品中的应用 随着科学技术的发展，酵母菌在酿造、奶制品、焙烤食品等有着飞速的发展。内蒙古农业大学的贺银风教授探究了国内外传统的发酵乳制品中乳酸菌和酵母菌的相互作用关系，指出了酵母菌在发酵品中的与乳酸菌有着同样的作用，菌种间相互促进和相互制约控制产品的风味特点、营养特征、医疗和保健作用。这为研究酵母菌在乳制品中的应用提供了理论的参考，不同的乳制品中的酵母菌存在着多样性，往往是多种酵母菌的共同作用形成不同的风味，不同的品质，而不同地区也有着自己特有的酵母菌，这是由于酵母菌的多样性所决定的。酵母菌在发酵乳制品中存在着许多的优点，主要是对于干酪的成熟有着诸多作用，例如：“（1）酵母菌能利用凝乳中由于乳酸菌的乳糖发酵所产生的乳酸，使凝乳的pH值有所提高，由起初的5到6左右。酸度的降低，刺激了对干酪成熟也有促进作用的细菌的生长繁殖；（2）某些酵母菌能产生胞外蛋白分解酶和脂肪分解酶，分解干酪中的蛋白质和脂肪，加速干酪的成熟，使干酪中可溶性含蛋物和辛酸、癸酸等其他高级脂肪酸增加L3J，对干酪的风味和结构起着至关重要的作用；（3）干酪内部的某些酵母菌能发酵牛奶中的乳糖，产生少量的CO，影响干酪的组织结构；（4）某些酵母菌能影响干酪某些风味物质如甲基酮的形成[IJ]；(5)酵母菌能产生多种水溶性维生素，增加干酪的营养价值；（6）酵母菌在干酪中的生长繁殖和代谢作用，还能抑制腐败微生物和梭状芽孢杆菌的生长LIJ5。酵母菌在乳制食品中的主要
毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。 毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。利用含有α因子序列的分泌型载体即可。 翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。 菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts） 分泌型载体: pPICZα A,B,and C (5’AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签) 胞内表达型载体： pPICZ A,B,and C，
一：分子克隆 1.设计引物 分泌型载体图谱： 见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B,p15-pPICZ C） 2.PCR扩增基因 PCR反应体系（50μl） 模板DNA 1μl Forward Primer（10μM）1μl Reverse Primer（10μM）1μl dNTP Mixture(各2mM): 4μl 5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μl PrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μl ddH O up to 50μl 2 PCR 反应流程 预变性98℃ 2min 变性98℃ 10sec 退火56℃ 10sec 30个循环 延伸72℃ 30sec 完全延伸72℃ 10min 保存4℃ 3.双酶切及其回收 双酶切反应体系（40μl） DNA(空载体或目的基因) 30μl BamHⅠ 1.5μl XholⅠ 1.5μl 10×Buffer K 4.0μl 4.酶连接 首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。 转化到克隆型感受态（DH5α和Top10），使用低盐LB培养基，加入25 μg/ml
★根据能否进行有性繁殖，可将酵母菌分为： ●假酵母：只有无性繁殖过程。 ●真酵母：既有无性繁殖，又有有性繁殖过程。 1、芽殖 是yeast无性繁殖的主要方式。 一个酵母能形成的芽数是有限的，（平均24个） 出芽方式： 多边出芽、两端出芽、三边出芽、单边出芽。 环境适宜时，可出现假菌丝 芽殖过程： 母细胞形成小突起（A—D） 核裂（E—G） 原生质分配（H—I） 新膜形成（J—K） 形成新细胞壁（L） 出芽痕和诞生痕： 酵母出芽繁殖时，子细胞与母细胞分离，在子、母细胞壁上都会留下痕迹。在母细胞的细胞壁上出芽并与子细胞分开的位点称出芽痕，子细胞细胞壁上的位点称诞生痕。由于多重出芽，致使酵母细胞表面有多个小突起。 ◆芽痕 ◆假菌丝: Saccharomyces cerevisiae的芽殖过程 有的酵母菌进行芽殖后，长大的子细胞不与母细胞立即分离，并继续除芽，细胞成串排列，这种菌丝状的细胞串就称为假菌丝。假菌丝的各细胞间仅以狭小的面积相连，呈藕节状。而霉菌的菌丝为真菌丝，即相连细胞间的横隔面积与细胞直径一致，呈竹节状的细胞串，称为真菌丝。 借细胞横分裂法繁殖,与细菌类似.如Schizosaccharomyces octosporus（八孢裂殖酵母）。进行裂殖的酵母菌种类较少. 2、裂殖； 掷孢子（ballistospore）是掷孢酵母属等少数酵母菌产生的无性孢子，外形呈肾状。这种孢子是在卵圆形的营养细胞上生出的小梗上形成的。孢子成熟后通过一种特有的喷射机制将孢子射出。因此，如果用倒置培养皿培养掷孢酵母并使其形成菌落，则常因其射出掷孢子而可在皿盖上见到由掷孢子组成的菌落模糊镜像。 此外，有的酵母如Candida albicans等还能在假菌丝的顶端产生厚垣孢子。产生掷孢子等无性孢子 适宜的条件下，二倍体细胞减数分裂形成子囊孢子殖。 1、有性繁殖的过程：一般通过邻近的两个性亲和性不同的细胞各自伸出一根管状的原生质突起，随即相互接触、局部融合并形成一个通道，再经过质配、核配形成双倍体细胞——接合子。接合子进行减数分裂，形成4个或8个子核，每一个子核和周围的细胞质一起，在其表面形成孢子壁后就形成子囊孢子，形成子囊孢子的细胞称为子囊。一般一个子囊可产生4-8个子囊孢子。孢子数目、大小、形状因种而异。 酵母的二倍体营养体细胞
精心整理 Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会 这个 是来中心（ 1. 3. 4. 5. 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由
于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-mycepitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alphafactor（α-factor）用以 的是系 PIC9K G418无 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微
镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等 有 的 余的 （起始密码子），有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利； ⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；
酵母 英语名称：yeast 酵母菌是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。目前已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子(子囊孢子和担孢子)的能力，可将酵母分成三类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过芽殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫“假酵母”。目前已知大部分酵母被分类到子囊菌门。酵母菌主要的生长环境是潮湿或液态环境，有些酵母菌也会生存在生物体内。 【生理】 和乙醇来获取能量。 酵母营专性或兼性好氧生活，目前未知专性厌氧的酵母。在缺乏氧气时，发酵型的酵母通过将糖类转化成为二氧化碳 C6H12O6 （葡萄糖）→2C2H5OH + 2CO2 在酿酒过程中，乙醇被保留下来；在烤面包或蒸馒头的过程中，二氧化碳将面团发起，而酒精则挥发。 【特征】 多数酵母可以分离于富含糖类的环境中，比如一些水果（葡萄、苹果、桃等）或者植物分泌物（如仙人掌的汁）。一些酵母在昆虫体内生活。酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为1~5微米′5~30微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌具有典型的真核细胞结构,有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，有的还具有微体。酵母菌的细胞形态酵母菌的细胞形态酵母菌细胞结构的显微照片酵母菌的菌落。 大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。啤酒酵母的菌落红酵母的菌落各种酵母菌的菌落。 【生殖】 酵母可以通过出芽进行无性生殖，也可以通过形成子囊孢子进行有性生殖。无性生殖即在环境条件适合时，从母细胞上长出一个芽，逐渐长到成熟大小后与母体分离。在营养状况不好时，一些可进行有性生殖的酵母会形成孢子（一般是四个），在条件适合时再萌发。一些酵母，如假丝酵母（或称念珠菌，Candida）不能进行无性繁殖。 【酵母菌的生长条件】
目录 1酵母菌的种类 (3) 2 选育技术 (4) 2.1 自然选育 (4) 2.2杂交育种 (4) 2.3原生质体融合育种 (4) 2.4诱变育种 (4) 2.5分子生物学育种 (5) 2.6基因工程育种 (5) 3鉴定及筛选 (5) 3.1 传统鉴定 (5) 3.2 现代分子鉴定 (5) 4 酵母的应用 (5) 4.1 食品工业上的应用 (6) 4.1.1 传统食品 (6) 4.1.2 调味剂 (6) 4.2医疗保健行业上的应用 (6) 4.2.1保健品和营养品 (6) 4.2.2制药 (6) 4.3饲料工业上的应用 (6) 4.3.1酵母培养物 (6) 4.3.2单细胞蛋白 (7) 4.3.3生产食用色素 (7) 4.4酿造工业上的应用 (7) 4.4.1酿酒 (7) 4.4.2制酱油、醋 (7) 5.展望 (7) 参考文献 (8)
酵母菌的研究概况 摘要：对酵母的种类及其育种技术、鉴定及筛选方法、行业中的应用情况等方面作了综述。 关键词：酵母菌；选育；鉴定筛选；生产应用 酵母菌(Yeast)是一类单细胞微生物,但不同于细菌,是一类以出芽生殖为主要繁殖方式的真菌,属真核微生物,yeast源自希腊语zestos,意思是“沸腾”，指酵母利用糖发酵产生二氧化碳形成泡沫的现象。 “酵母菌”这一名词不是分类学上的名词，而是一种习惯上的叫法。酵母菌这一微生物最早是由列文虎克在1680年观察酒精发酵液时发现的。1938年Schwann将此微生物命名为糖真菌(Sugerfungus)。1937年Meyen将葡萄酒酵母命名为Sacharomyces，迄今沿用为酵母属。在分类学上酵母菌属于子囊菌亚门(Ascomycotina)、担子菌亚门(Basidiomycotina)和半知菌亚门(Deuteromycotina)[l,2]。因此,给酵母菌下一个定义很难，目前认为具有以下特点的真菌即为酵母菌：(l)个体一般以单细胞状态存在；(2)多数出芽繁殖，少数裂殖；(3)能发酵糖产能；(4)细胞壁常含甘露聚糖；(5)喜在含糖量高、酸度大的水生环境中生活。 酵母菌广泛分布于自然界，主要生长在偏酸性含糖丰富的环境，必须以有机碳化物，主要是葡萄糖等单糖为碳源物质[3]，特别喜欢聚集于植物的分泌液中，如水果、蔬菜、花蜜、蜜饯上，在果园的土壤中也大量存在[4]。数千年来，酵母就和人类的日常生活有着紧密的联系，人们虽然没有见过酵母是什么样子，但却利用酵母的发酵能力来酿酒、发面。早在史前时期，人类祖先就从成熟的落果自然发酵现象中学会了酿酒，6000年前埃及人就有利用酵母菌生产酸啤酒的记载，公元前1200年，埃及建立了酿酒和制作面包的工艺技术。公元前1000年，我国已有蒸馏乙醇饮料的记载[5]。随着现代微生物学和生物技术的发展,酵母菌在我们的生活中变的越来越重要。 1酵母菌的种类 目前，国内外一般按产品的用途进行分类。根据酵母产品分为以下几大类： （一）面包酵母类 包括鲜酵母（压榨酵母）和活性干酵母两类。根据面团含糖量的不同，又可分压榨酵母、活性干酵母和快速活性干酵母。 1.压榨酵母：采用酿酒酵母生产的含水分70～73%的块状产品。呈淡黄色，具有紧密的结构且易粉碎，有强的,发面能力。在4℃可保藏1个月左右，在0℃能保藏2～3个月产品最初是用板框压滤机将离心后的酵母乳压榨脱水得到的，因而被称为压榨酵母，俗称鲜酵母。 2.活性干酵母：采用酿酒酵母生产的含水分8%左右、颗粒状、具有发面能力的干酵母产品。采用具有耐干燥能力、发酵力稳定的醇母经培养得到鲜酵母，再经挤压成型和干燥而制成。发酵效果与压榨酵母相近。 3.快速活性干酵母：水分含量为4～6%。它是在活性干酵母的基础上,采用遗传工程技术获得高度耐干燥的酿酒酵母菌株，经特殊的营养配比和严格的增殖培养条件以及采用流化床干燥设备干燥而得。与活性干酵母相同，采用真空或充惰气体保藏,货架寿命为1年以上。 （二）酿酒用活性干酵母类 按产品的用途分为：酒精活性干酵母，白酒活性干酵母，葡萄酒活性干酵母，黄酒活性干酵母和啤酒活性干酵母等。其中白酒活性干酵母分为很少产酯的酒精活性干酵母和产酯能力较强的生香活性干酵母两类。 按发酵温度，酿酒酵母又可分为两类：常温活性干酵母，耐高温活性干酵母。 （三）药用酵母类 用糖蜜，粮食为原料，经啤酒酵母，葡萄酒酵母或产沅假丝酵母发酵，未经提取其他成分，
毕赤酵母表达系统步骤 （参考Invitrogen公司说明书）： 一、pPICZαA、B、C质粒以及DH5α菌株的保存 1取0.5μl pPICZα A、B、C质粒，热击转化DH5α，在低盐LB（含有25μg/ml Zeocin）的平板上37℃培养过夜。 2挑取转化子，甘油保存。 二、载体构建 1将目的基因构建到pPICZα载体上，转化DH5α，用Zeocin筛选转化子。 2提质粒酶切鉴定或PCR鉴定 3载体测序 测序可用α-Factor引物或5’AOX1引物，3’AOX1引物 三、线性化DNA 1提取足够量的质粒DNA（一次转化至少需要5-10μg质粒） 2 酶切线性化10μg构建好的载体，同时酶切空载体做对照，根据载体选择线性化酶切位点（样品分管酶切），pPICZα载体在5’AOX1区域有三个酶切位点可选择：SacI、PmeI、BstXI 3 取1-2μl酶切产物跑电泳，确定是否酶切完全； 4 过柱纯化线性化质粒（用50μl EB洗脱）； 四、线性化DNA的去磷酸化处理 线性化质粒43μl CIAP Buffer 5μl
CIAP酶2μl 四、总体积为50μl的样品37℃ 1h，过柱纯化，用30μl ddH2O洗脱； 五、感受态细胞的制备 实验前准备：无抗性YPD平板一个、无抗生素液体YPD培养基，100μg/ml Zeocin YPD 平板和液体、50ml离心管两个、500ml预冷的无菌水、20ml 1M 山梨醇（灭菌预冷的），0.2cm预冷的电击杯； 1YPD平板划线培养菌，30℃培养2-3d； 250ml三角瓶中，加入5ml YPD，挑取酵母单菌落，30℃培养过夜；3吸取0.5ml菌液，加入至含有200ml新鲜YPD的1L三角瓶中，30℃，225rpm/min培养至OD值1.3-1.5； 41500g，4℃离心5min收集菌体； 540ml冰预冷的无菌水重悬沉淀； 61500g，4℃,5min； 730ml无菌水重悬； 81500g，4℃,5min； 910ml 1M 山梨醇重悬； 101500g，4℃,5min； 11加入1ml山梨醇，重悬冰上放置，直接做转化，或加入灭菌甘油每管80ul分装，冻存于-80℃(长时间保存会影响转化效率)； 六、电击转化 15-10μg线性化DNA（20μl<）与80ul上述感受态细胞混合，转移
酵母的营养价值及在水产养殖中的应用 一、营养价值 酵母含有水分、矿物质和有机物。矿物质占干酵母菌含量的6.0％-10.0％，包含钾、镁、钙、铁、硅、硫、磷等元素。有机物占干酵母的90％-94％，蛋的质是其中最主要的成分，一般占细胞干物质的30％-50％，蛋白质中含有鱼类、甲壳类等所需的10种必需氨基酸，脂类中含有较丰富的不饱和脂肪酸，此外，有机物中还包括生长刺激素、维生素、助消化的酶类等，因而酵母是一种营养丰富的活饵料。 二、酵母在水产名的应用 酵母中水产动物养殖中的应用价值主要体现在苗种培育上，酵母菌个体为4x5微米，粒径大小适合于各类育苗幼体作为早期开口饵料或整个幼体时期的饵料。此外，其营养丰富，运输、保藏和使用都比较方便，无毒副作用。目前已在河蟹、海参、对虾、海湾扇贝等育苗生产中得到了应用。从使用效果来看，酵母主要有如下四大功效： （一）强化营养 酵母菌体内各种营养成份非常丰富，其蛋白质除色氨酸和甲硫氨酸含量略低外，其它氨基酸都非常丰富，为鱼类和甲壳类所必需。它还含有一般饵料所缺少的必需脂肪酸，维生素和矿物质的含量也较为丰富。酵母所具有的这些营养成分弥补了其它常规
饵料的不足，对鱼、虾、蟹早期幼体和贝类、海参等浮游期幼体起到重要的营养强化作用。 （二）净化水质 酵母是活的菌体，投入水体中可继续进行新陈代谢活动，育苗水体中的有机物、氨态氮、硫化氢等对幼体有害的物质能够被酵母菌迅速降解利用，从而保证了育苗水体水质理化指标的稳定。 （三）抑制病害 酵母作为幼体饵料，它在育苗水体中是占有绝对优势的种群，致使其它微生物被排斥和抑制，防止了有害细菌的繁殖，起到生物抑制作用。除此以外，酵母体内含有丰富的免疫活性物质，幼体摄食酵母后，能够增强对外界恶劣条件和病害的抵抗力，有利于提高幼苗的成活率。 （四）培养饵料生物 轮虫、丰年虫、水等是水产动物苗种培育过程中不可缺少的活饵料。因酵母菌大小适宜，又含有丰富的氨基酸、脂肪酸、维生素等生理活性物质，在培养这些活的饵料生物过程中投喂酵母菌，对这些饵料生物的生长繁殖有明显的促进作用。 三、酵母在水产养殖中的使用方法 在河蟹育苗中，Z1-Z2变态阶段对营养十分苛求，如果在Z1期开始使用酵母，直到幼体变成Z2期，保持酵母在水中的密度为每毫升7-10万个菌体，并搭配投喂藻粉5-10ppm，蛋黄1-2ppm，
电转法 设计方案一： 感受态制备： 1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜； 2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm 培养约16-18h(OD:1.3-1.5)； 3.于4℃离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水 重悬，可换成较小的离心管； 4.加入1ml，pH7.5，10×TE缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml 10×LiAc，旋转摇 匀，于30度轻轻摇动45min； 5.再加入0.4ml 1 mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min； 6.于4℃离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤； 7. 2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）； 8.每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70℃冰箱保存。 电转化： 1．向感受态细胞中加入约5～10ug（体积小于10 ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min； 2．擦干电转杯，电击，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆； 3．立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h； 4．离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培养2h； 5．离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。 说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。 设计方案二： 感受态制备： 1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜； 2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm 培养约16-18h(OD:1.3-1.5)； 3.于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬 于8ml处理液中（处理液配方：100 mM LiAc，10 mM DTT，0.6 M山梨醇， 10 mM Tris-HCl，pH 7.5），室温静置30min； 4.4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用1.5mL 1mol/L预冷的山梨醇洗涤三 次，离心条件一样； 5.每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山 梨醇），最后以80 ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70℃冰箱保存。 电转化： 1.向感受态细胞中加入约3ug（体积小于10ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移 至预冷的电转杯中，静置5min； 2.擦干电转杯，电击，电击参数：2.0KV，25uF，200欧姆； 3.立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；
毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主．1981年
酵母菌的生活史 上代个体经一系列生长、发育阶段而产生下一代个体的全部过程，称为该生物的生活史或生命周期。 各种酵母的生活史可分为三种类型： 1. 单倍体型 2. 双倍体型 3. 单双倍体型 1、单双倍体型 单双倍体型 以啤酒酵母为代表 特点：单倍体营养细胞和双倍体营养细胞均可进行芽殖。营养体既可以单倍体形式也可以双倍体形式存在；在特定条件下进行有性生殖。 单倍体和双倍体两个阶段同等重要,形成世代交替 2、单倍体型 单倍体型 以八孢裂殖酵母为代表 特点:营养细胞是单倍体；无性繁殖以裂殖方式进行；双倍体细胞不能独立生活，因为双倍体阶段短，一经生成立即减数分裂。 3、双倍体型 以路德类酵母为代表 特点：营养体为双倍体，不断进行芽殖，双倍体营养阶段长，单倍体的子囊孢子在子囊内发生接合。单倍体阶段仅以子囊孢子形式存在，故不能独立生活。 （六）上面酵母与下面酵母 并非分类学上的名称，而是在啤酒酿造业中根据酵母菌在容器内的情况而对酵母菌株进行的分类： 上面酵母——在发酵过程中细胞浮游在液体上层，是较活跃的发酵剂； 下面酵母——在发酵过程中细胞沉于容器底层，是较缓慢的发酵剂。 （七）噬杀酵母 噬杀酵母——是指某些在其生长繁殖过程生长能向菌体外分泌一种称作噬杀毒素的毒性蛋白的酵母菌株。噬杀酵母对噬杀毒素具有免疫力。噬杀酵母能杀死同族及亲缘酵母，这种特性为一般物质抗生物质所没有。 中性菌株——既不能杀死别的酵母，也不能被噬杀酵母杀死的酵母菌株。 敏感酵母——可以被噬杀酵母杀死的酵母菌株。 酵母菌的代表属 1、酵母菌属 例：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) 2、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces spp.) 3、假丝酵母属(Candida spp.) 例：热带假丝酵母(Candida tropicalis)、解脂假丝酵母和产朊假丝酵母 4、球拟酵母属 5、红酵母属