1、酵母菌的定义
2、酵母菌的生理
3、酵母菌的生活形态与代谢
4、酵母菌的分类
酵母菌的定义
酵母菌是单细胞真核微生物，在自然界分布很广，主要生长在偏酸性的环境中，必须以有机碳化物为碳源和能源物质。
千百年来，酵母就和人类的日常生活有着紧密的联系，作为人类的一种“家养微生物”，酵母菌及其发酵产品大大改善和丰富了人类的生活。是目前人类直接食用量较大的一种微生物。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在分类学上属于真核生物界的真菌门、子囊菌亚门、半子囊菌纲、内孢霉目、酵母科的酵母属。
又称面包酵母或者出芽酵母，酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，不论在日常生活中，还是在现代分子和细胞生物学中，都具有重要意义。
革兰氏染色为阳性。
酵母菌的生理特性
酿酒酵母为单细胞，形态有卵圆形、球形或椭圆形，细胞大小为（2.5～10）×(4.5～21)μm，酿酒酵母细胞的大小与菌龄、环境有关。细胞壁厚0.1～
0.3μm,为三明治结构。
菌落中等大小,扁平,光滑,湿润,折光,乳酪色到淡棕色,在沙保平板上有酒酿气味。
酵母菌的生活形态与代谢酵母的细胞有两种生活形态，单倍体和二倍体。
单倍体的生活史较简单，通过有丝分裂繁殖。在环境压力较大时通常则死亡。
二倍体细胞（酵母的优势形态）也通过简单的有丝分裂繁殖，但在外界条件不佳时能够进入减数分裂，生成一系列单倍体的孢子。
酵母菌的代谢：主要包括酵母菌的糖代谢、苹果酸代谢、氮代谢和硫代谢。
酵母菌的分类按形态分类
以人类食用和作动物饲料的不同目的可分成食用酵母和饲料酵母。食用酵母中又分成面包酵母、食品酵母和药用酵母等。
还有人根据酵母菌的种繁殖方式，把只进行无性繁殖的酵母菌称作“假酵母”，而把具有有性繁殖的酵母菌称作“真酵母”。
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作者机构：珠海文琪生物科技有限公司
文章来源：摘抄自中国科学院微生物研究所
Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 甲醇酵母部分优点： 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达； 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平； 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系 统简单，非常适合大规模工业化生产； 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化； 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的
BY4741酿酒酵母菌 BY4741Strain BY4741菌信息： 培养基：YPD 菌株类别：酵母菌 培养条件：28℃，有氧，YPD 质粒转化：电激 保存方式：30%甘油，-20℃ 基本应用：用于蛋白表达 BY4741菌使用说明： 四区划线培养，挑单菌落接种培养使用并保存甘油菌。 BY4741操作说明： 1，本品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数的增加，细菌的活力会逐渐下降。 2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆菌落进行后续操作。 冷冻管开封： 用浸过75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。 BY4741菌株复溶： 无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取1ml左右复溶液，加入到冷冻管中。轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。 BY4741菌株复壮： 用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培养。细菌在30-35℃培养箱中培养24-48h，真菌在23-28℃培养箱中培养24-72h（必要时，可适当延长培养时间）。 BY4741菌株传代： 将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量增大接种量：如用无菌吸管吸取≥50μl新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。 注意事项： 1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放置会导致
菌种衰退； 2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行； 3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能正常生长； 4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来电询问； 5、某些厌氧菌的培养，自开封到接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧状态；培养过程中亦要保持厌氧状态； 6、某些菌种，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要5-10%CO2促进生长； 7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。 8、部分菌种有致病性、扩散性，请专业人员在专业环境下有保护性操作。 BY4741菌保藏条件： -20℃保存（复溶液于2-8℃保存） 保藏时间： 2-10年，应根据菌种状况及时转接
毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。 毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。利用含有α因子序列的分泌型载体即可。 翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。 菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts） 分泌型载体: pPICZα A,B,and C (5’AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签) 胞内表达型载体： pPICZ A,B,and C，
一：分子克隆 1.设计引物 分泌型载体图谱： 见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B,p15-pPICZ C） 2.PCR扩增基因 PCR反应体系（50μl） 模板DNA 1μl Forward Primer（10μM）1μl Reverse Primer（10μM）1μl dNTP Mixture(各2mM): 4μl 5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μl PrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μl ddH O up to 50μl 2 PCR 反应流程 预变性98℃ 2min 变性98℃ 10sec 退火56℃ 10sec 30个循环 延伸72℃ 30sec 完全延伸72℃ 10min 保存4℃ 3.双酶切及其回收 双酶切反应体系（40μl） DNA(空载体或目的基因) 30μl BamHⅠ 1.5μl XholⅠ 1.5μl 10×Buffer K 4.0μl 4.酶连接 首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。 转化到克隆型感受态（DH5α和Top10），使用低盐LB培养基，加入25 μg/ml
精心整理 Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会 这个 是来中心（ 1. 3. 4. 5. 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由
于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-mycepitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alphafactor（α-factor）用以 的是系 PIC9K G418无 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微
镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等 有 的 余的 （起始密码子），有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利； ⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；
pESC-Leu 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT3040 pESC--‐Leu 载体基本信息 出品公司: Agilent 安捷伦 载体名称: pESC--‐Leu, p ESC L eu 质粒类型: 酿酒酵母蛋白表达载体 表达水平: 高拷贝 诱导方法: 半乳糖 启动子: GAL1和GAL10 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 7758 b p 5' 测序引物及序列: GAL1--‐F: A TTTTCGGTTTGTATTACTTC; GAL10--‐F: G GTGGTAATGCCATGTAATATG 3' 测序引物及序列: GALI--‐R: G TTCTTAATACTAACATAACT GAL10--‐R: G GCAAGGTAGACAAGCCGACAAC 载体标签: C--‐Flag, C--‐Myc 载体抗性: 氨苄 筛选标记: Leu2 备注: 利用半乳糖诱导，可以同时使两个基因在酿酒酵母中表达。 产品目录号: 217452 稳定性: 稳定 Stable 组成型/诱导型: 诱导型 病毒/非病毒: 非病毒 载体质粒图谱和多克隆位点信息
pESC--‐Leu多克隆位点 载体序列 LOCUS pESC-LEU 7758 bp DNA circular SYN ORIGIN 1 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 61 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 121 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 181 accatatcga ctacgtcgta aggccgtttc tgacagagta aaattcttga gggaactttc 241 accattatgg gaaatgcttc aagaaggtat tgacttaaac tccatcaaat ggtcaggtca 301 ttgagtgttt tttatttgtt gtattttttt ttttttagag aaaatcctcc aatatcaaat 361 taggaatcgt agtttcatga ttttctgtta cacctaactt tttgtgtggt gccctcctcc 421 ttgtcaatat taatgttaaa gtgcaattct ttttccttat cacgttgagc cattagtatc 481 aatttgctta cctgtattcc tttactatcc tcctttttct ccttcttgat aaatgtatgt 541 agattgcgta tatagtttcg tctaccctat gaacatattc cattttgtaa tttcgtgtcg 601 tttctattat gaatttcatt tataaagttt atgtacaaat atcataaaaa aagagaatct 661 ttttaagcaa ggattttctt aacttcttcg gcgacagcat caccgacttc ggtggtactg 721 ttggaaccac ctaaatcacc agttctgata cctgcatcca aaaccttttt aactgcatct 781 tcaatggcct taccttcttc aggcaagttc aatgacaatt tcaacatcat tgcagcagac 841 aagatagtgg cgatagggtc aaccttattc tttggcaaat ctggagcaga accgtggcat 901 ggttcgtaca aaccaaatgc ggtgttcttg tctggcaaag aggccaagga cgcagatggc 961 aacaaaccca aggaacctgg gataacggag gcttcatcgg agatgatatc accaaacatg 1021 ttgctggtga ttataatacc atttaggtgg gttgggttct taactaggat catggcggca 1081 gaatcaatca attgatgttg aaccttcaat gtagggaatt cgttcttgat ggtttcctcc 1141 acagtttttc tccataatct tgaagaggcc aaaagattag ctttatccaa ggaccaaata 1201 ggcaatggtg gctcatgttg tagggccatg aaagcggcca ttcttgtgat tctttgcact 1261 tctggaacgg tgtattgttc actatcccaa gcgacaccat caccatcgtc ttcctttctc 1321 ttaccaaagt aaatacctcc cactaattct ctgacaacaa cgaagtcagt acctttagca 1381 aattgtggct tgattggaga taagtctaaa agagagtcgg atgcaaagtt acatggtctt 1441 aagttggcgt acaattgaag ttctttacgg atttttagta aaccttgttc aggtctaaca 1501 ctaccggtac cccatttagg accagccaca gcacctaaca aaacggcatc aaccttcttg 1561 gaggcttcca gcgcctcatc tggaagtggg acacctgtag catcgatagc agcaccacca 1621 attaaatgat tttcgaaatc gaacttgaca ttggaacgaa catcagaaat agctttaaga
酿酒酵母INO1基因的克隆 黄贞杰1,2,3，叶冰莹1,2,3，陈由强1,2,3★ （1.福建师范大学生命科学学院，福建福州350108；2.农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室，福建福州350108；3.发育与神经生物学福建省高等学校重点实验室，福建福州350108） 摘要利用PCR扩增技术，以酿酒酵母S288C的基因组DNA为模板，扩增得到酿酒酵母的结构基因，大小为1537bp的序列。利用NCBI对此序列进行比对，发现此序列与酿酒酵母S288C的催化葡萄糖-6-磷酸生成肌醇-3-磷酸的肌醇-3-磷酸合成酶的编码基因INO1的第41到1577位序列有100％的同源性，而INO1的完整CDS是1602bp。由此可见克隆得到的结构基因是酿酒酵母S288C的肌醇-3-磷酸合成酶的编码基因INO1，但不是全长。 关键词INO1;酿酒酵母；基因克隆 Cloning of INO1 Gene from Saccharomyces cerevisiae S288C Abstract The Saccharomyces cerevisiae inositol-3-phosphate synthase encodes gene( INO1) is amplified from a genomic DNA of S.ce s288c by PCR. sequence amplified size is 1537bp.It have 100% homology with INO1 gene complete sequence from 41 to 1577 had reported. but not complete cds. Keywords INO1 ;Saccharomyces cerevisiae ;cloning of gene 0 引言 随着石油能源日益耗竭，国内外许多科学家开始研究利用生物质生产燃料乙醇。乙醇被公认为不仅是一种可以代替汽油的优良液体燃料，而且是很好的燃油品质改善剂。利用非粮生物质原料生产燃料乙醇对于我国现状来说将成为一项迫切、具有重要现实意义的任务。利用甘蔗生成燃料乙醇可以充分弥补利用粮食作为原材料的不足，巴西利用甘蔗生产燃料酒精的成功充分说明了这一点。然而,发酵终点高浓度的乙醇对酵母细胞生长和乙醇发酵具有强烈抑制作用,而提高酵母菌的乙醇耐受性可以保证酵母菌发酵过程中较好的细胞活性和较高的发酵性能,因此酵母菌的乙醇耐性重新成为世界范围内的研究热点。采用分子遗传与代谢控制育种的方法筛选高产燃料乙醇的酿酒酵母具有重要的意义。 肌醇对真核生物细胞的生长是必需的。它不仅是磷脂酰肌醇(PI)合成的前体，而且对磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰胆碱(Pc)和心磷脂(CL)合成有关酶类的表达具有调控作用[1]。池振明等研究[2]发现，在培养基中添加肌醇在某种程度上可以对耐酒精酵母菌W4的蔗糖酶分泌和细胞的生长起解葡萄糖阻遏的作用。在乙醇胁迫下，Ino1的表达被证明不可缺少[3],低的肌醇量影响细胞内物质的泄漏，从而影响细胞内PH、H+—ATPase的活性，改变细胞质离子稳态，进而影响膜透性屏障。高的肌醇量使ATPase的活性提高，抵偿质子流入量，触发改变脂质组成，最终提高乙醇耐受性。Min-Eui Hong等[4]通过反向代谢工程发现过表达酿酒酵母四个内源基因（INO1, DOG1, HAL1,MSN2）可以促进乙醇的耐性。而过表达INO1的酵母菌具有最高的乙醇耐性，在高浓度葡萄糖下发酵具有较高的效价和体积产率。 综上，为了进一步提高甘蔗等生物质发酵燃料乙醇的效率，本研究试图通过构建整合表达载体过表达催化葡萄糖6-磷酸生成肌醇-3-磷酸的肌醇-3-磷酸合成酶的编码基因INO1，得到能够耐高乙醇，较强细胞活力，发酵甘蔗汁产较高乙醇量的工程菌株。本实验首先利用PCR扩增技术，以酿酒酵母S288C的基因组DNA为模板，克隆INO1基因，为下一步在工业酿酒酵母中过表达，构建工程菌株奠定基础。
Pichia酵母表达系统使用心得 摘要：Pichia酵母表达系统广泛应用于外源基因表达。 生物通编者按：甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 + 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多 EasySelect Pichia Expression System
产品性能： 优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化 缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题 全面产品报告及心得体会： 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K 无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因
酿酒酵母 酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）又称麫包酵母或者出芽酵母。 形态及大小：是一种直径为5微米 所属分类 域：真核域(Eukarya) 界：真菌界(Fungi) 门：子囊菌门(Ascomycota) 纲：半子囊菌纲(Hemiascomycetes) 目：酵母目(Saccharomycetales) 科：酵母科(Saccharomycetaceae) 属：酵母属(Saccharomyces) 种：酿酒酵母(S. cerevisiae) 酿酒酵母介绍 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称麫包酵母或者出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，不仅因为传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。酿酒酵母是发酵中最常用的生物种类。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5–10 μm。其繁殖的方法为出芽生殖。 酵母生活史 酵母的细胞有两种生活形态，单倍体和二倍体。单倍体的生活史较简单，通过有丝分裂繁殖。在环境压力较大时通常则死亡。二倍体细胞（酵母的优势形态）也通过简单的有丝分裂繁殖，但在外界条件不佳时能够进入减数分裂，生成一系列单倍体的孢子。单倍体可以交配，重新形成二倍体。酵母有两种交配类型，称作a和α，是一种原始的性别分化，因此很有研究价值。 酿酒酵母基因组 酿酒酵母是第一个完成基因组测序的真核生物，测序工作于1996年完成。 酿酒酵母的基因组包含大约1200万碱基对，分成16组染色体，共有6275个基因，其中可能约有5800个真正具有功能。据估计其基因约有23%与人类同源。酵母基因组数据库包含有酵母基因组的详细注释(annotation)，是研究真核细胞遗传学和生理学的重要工具。另一个重要的酿酒酵母数据库[1]由慕尼黑蛋白质序列信息中心维护。 在科学中的作用 因为酿酒酵母与同为真核生物的动物和植物细胞具有很多相同的结构，又容易培养，酵母被用作研究真核生物的模式生物，也是目前被人们了解最多的生物之一。在人体中重要的蛋白质很多都是在酵母中先被发现其同源物的，其中包括有关细
CHO细胞表达系统与酵母细胞表达系统比较 CHO细胞表达系统与毕赤酵母表达系统是当前发展前景看好的两个表达系统，为了能够更加直观地对两个表达系统有一定的认识，特意在此篇中对两个表达系统作一定的比较，从而能够更进一步的对两个表达系统有更深的了解 1．CHO细胞表达系统 （1）优点 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM 中生长良好。与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； (2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定； (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； (5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。 （2）存在的问题 在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题： ①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低； ②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化； ③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少； ④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。 2．毕赤酵母细胞表达系统 （1）特点 自1987年Gregg等首次在毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)到1995年，已有四十多种外源蛋白在毕赤酵母宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，与其它表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下优势： 1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达； 2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l，一般大于1g/l。绝大多数外源基因比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化； 3）发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/l 以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000升； 4）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲
pYES2/CT 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT2850 pYES2/CT 载体基本信息 出品公司: Invitrogen 载体名称: pYES2--‐CT, p YES2/CT 质粒类型: 酿酒酵母表达载体 表达水平: 高拷贝 诱导方法: 半乳糖 启动子: GAL1 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5963 b p 5' 测序引物及序列: GAL1--‐F: A ATATACCTCTATACTTTAACGTC 3' 测序引物及序列: CYC1--‐R: G CGTGAATGTAAGCGTGAC 载体标签: C--‐His, C --‐V5 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: URA3报告基因 克隆菌株: TOP10, E .coli 表达菌株: INVSc1, S accharomyces c erevisiae 备注: 酿酒酵母表达载体pYES2/CT 含有URA3报告基因； GAL1启动子驱动目的基因高水平表达； 半乳糖诱导目基因表达，葡萄糖阻遏目的基因表达，二者起到分子开关作用。 产品目录号: --‐--‐ 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 诱导型 病毒/非病毒: 非病毒 载体质粒图谱和多克隆位点信息
pYES3--‐CT多克隆位点 pYES2--‐CT 载体特征
载体简介 pYES2/CT酿酒酵母表达载体 pYES2/CT载体大小为6.0 k b左右，用于重组蛋白在酿酒酵母细胞中的诱导型表达。诱导剂为半乳糖。重组蛋白的C--‐端融合了6XHis标签，用于重组蛋白的纯化和检测。 pYES2/CT载体含有以下元件： 1.Yeast GAL1 promoter for high level inducible protein expression in yeast by galactose
pRS414 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT2350 pRS414 载体基本信息 出品公司: Stratagene（Agilent） 载体名称: pRS414 质粒类型: 酿酒酵母载体；酵母着丝粒质粒；穿梭载体 克隆方法: --‐--‐ 高拷贝/低拷贝: 多拷贝 启动子: --‐--‐ 载体大小: 4788 b p 5' 测序引物及序列: --‐--‐ 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: Ampicillin 筛选标记: TRP1 克隆宿主: --‐--‐ 备注: 着丝粒: C EN6；含a b eta--‐gal报告基因；宿主菌株YPH499，YPH500，YPH501 产品目录号: --‐--‐ 稳定性: --‐--‐ 组成型/诱导型: 诱导型 病毒/非病毒: 非病毒 载体质粒图谱和多克隆位点信息
载体序列 LOCUS pRS414 4788 bp DNA SYN ORIGIN 1 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 61 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 121 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 181 accataaacg acattactat atatataata taggaagcat ttaatagaca gcatcgtaat 241 atatgtgtac tttgcagtta tgacgccaga tggcagtagt ggaagatatt ctttattgaa 301 aaatagcttg tcaccttacg tacaatcttg atccggagct tttctttttt tgccgattaa 361 gaattaattc ggtcgaaaaa agaaaaggag agggccaaga gggagggcat tggtgactat 421 tgagcacgtg agtatacgtg attaagcaca caaaggcagc ttggagtatg tctgttatta 481 atttcacagg tagttctggt ccattggtga aagtttgcgg cttgcagagc acagaggccg 541 cagaatgtgc tctagattcc gatgctgact tgctgggtat tatatgtgtg cccaatagaa 601 agagaacaat tgacccggtt attgcaagga aaatttcaag tcttgtaaaa gcatataaaa 661 atagttcagg cactccgaaa tacttggttg gcgtgtttcg taatcaacct aaggaggatg 721 ttttggctct ggtcaatgat tacggcattg atatcgtcca actgcatgga gatgagtcgt 781 ggcaagaata ccaagagttc ctcggtttgc cagttattaa aagactcgta tttccaaaag 841 actgcaacat actactcagt gcagcttcac agaaacctca ttcgtttatt cccttgtttg 901 attcagaagc aggtgggaca ggtgaacttt tggattggaa ctcgatttct gactgggttg 961 gaaggcaaga gagccccgaa agcttacatt ttatgttagc tggtggactg acgccagaaa 1021 atgttggtga tgcgcttaga ttaaatggcg ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg 1081 agacaaatgg tgtaaaagac tctaacaaaa tagcaaattt cgtcaaaaat gctaagaaat 1141 aggttattac tgagtagtat ttatttaagt attgtttgtg cacttgccta tgcggtgtga 1201 aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg aaattgtaaa cgttaatatt 1261 ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa 1321 atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca 1381 gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc 1441 gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg 1501 aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg 1561 ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg 1621 gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg 1681 ccgctacagg gcgcgtcgcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 1741 tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 1801 ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgag 1861 cgcgcgtaat acgactcact atagggcgaa ttgggtaccg ggccccccct cgaggtcgac 1921 ggtatcgata agcttgatat cgaattcctg cagcccgggg gatccactag ttctagagcg 1981 gccgccaccg cggtggagct ccagcttttg ttccctttag tgagggttaa ttgcgcgctt 2041 ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 2101 caacatagga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgaggtaact 2161 cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 2221 gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 2281 ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 2341 ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg
酵母表达系统的研究进展和前景 ( XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX学院) 摘要：酵母表达系统在表达真核生物蛋白方面已经得到广泛而成功的应用，表达出的重组蛋白表现出较高甚至比原物种体内的蛋白质更高的生物活性。近年来，利用酿酒酵母和毕赤巴斯德氏酵母表达人源蛋白或肽类活性物以及其它中间体取得了新的进展。本文主要从上游设计，重组表达，分离纯化和活性验证等方面进行了总结，并且对未来更好的利用酵母生产药物等活性物质作出展望。 关键词：酵母表达系统；蛋白分泌：异源基因；糖基化修饰；人源活性药物 引言 酵母作为一种表达外源基因的宿主菌, 既具有操作简单, 生长快等特点, 又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。在表达某些基因工程产品时, 可以大规模生产, 从而有效地降低成本。常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统, 甲基营养型酵母表达系统和裂殖酵母表达系统。酿酒酵母（Saccharomyces. cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。但由于酿酒酵母的局限，1983 年美国Wegner 等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统。其中毕赤酵母（P. pastoris）是继S. cerevisiae之后被迅速推广的一种外源基因表达的宿主菌。 酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。但是，可以通过基因敲除或改造用酿酒酵母表达亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)或非蛋白活性物质及其中间体（如青蒿素，色素）。 与原核和其它真核表达系统相比，巴斯德毕赤酵母作为重组蛋白表达系统有以下优点[1]：（1）生长速率快，易于高密度培养（2）在几乎不含蛋白质的培养基中具有高水平产率（3）消除了内源毒性和噬菌体感染（4）易于对具有明确特征的酵母表达载体进行操作（5）对毕赤酵母的噬菌体对人没有病原性（6）具有多种翻译后修饰包括多肽折叠，糖基化，乙酰化，甲基化，蛋白质降解调控以及定位至亚细胞结构（7）能够构建分泌的蛋白，这样只需从生长培养基中提纯而不必收集酵母本身细胞。
pYES2 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT2980 pYES2 载体基本信息 出品公司: Invitrogen 载体名称: pYES2 质粒类型: 酿酒酵母蛋白表达载体 表达水平: 高拷贝 诱导方法: 半乳糖 启动子: GAL1 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5857 b p 5' 测序引物及序列: T7: T AATACGACTCACTATAGGG 3' 测序引物及序列: CYC1 T erminator: G TGACATAACTAATTACATGATG 载体标签: / 载体抗性: 氨苄 筛选标记: URA3 备注: 利用半乳糖诱导蛋白在酿酒酵母中表达。 产品目录号: --‐--‐ 稳定性: 稳定 Stable 组成型/诱导型: 诱导型 病毒/非病毒: 非病毒 载体质粒图谱和多克隆位点信息
pYES2多克隆位点 载体简介 pYES2的是一个5.9 kb的载体，设计用来在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中诱导表达重组蛋白。载体的特点在于基因插入载体的构建简单，以及能够使用原养型尿嘧啶进行转化株的筛选。 该载体包含以下元素： 1. 酵母GAL1启动子，能够在酿酒酵母中被半乳糖高水平的诱导蛋白表达目的蛋白，同时能够被葡萄糖抑制表达 2.多克隆位点可以使用的很多限制酶切位点，便于基因插入。
3.CYC1终止子能够有效终止mRNA的转录。 4.能够利用URA3基因筛选带有ura3基因型的酵母宿主菌株转化子。 5.氨苄抗性基因能够方便在大肠杆菌中的进行载体筛选。 载体序列 LOCUS pYES2 5857 bp DNA circular SYN DEFINITION pYES2 ACCESSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM other sequences; artificial sequences; vectors. COMMENT This file is created by Vector NTI FEATURES Location/Qualifiers source 1..5857 /organism="pYES2" /mol_type="other DNA" terminator complement(12..251) /label="CYC1_terminator" misc_feature 218..236 /label="pYESTrp_rev_primer" misc_feature 218..236 /label="CYC1_primer" promoter complement(368..386) /label="T7_promoter" promoter complement(410..861) /label="GAL1_promoter" misc_feature complement(424..447) /label="GAL1_primer" rep_origin complement(1402..2873) /label="2micron_origin" rep_origin 1404..2283 /label="2micron2_origin" promoter 2876..3101 /label="URA3_promoter" gene 3103..3903 /label="URA3" /gene="URA3" CDS 3103..3906 /label="ORF frame 1" CDS complement(3138..3614) /label="ORF frame 3"