培养基得制备
培养基概念:
就是指以液体、半固体或固体形式,包含天然或合成成分，用于促进微生物得繁殖或保持其活力得物质组成。由于各类微生物对营养得要求不同,培养目得与检测需要不同,因而培养基得种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多得培养基划分为若干类型.
培养基得分类：
按功能分类：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基、特殊培养基.
按物理性状分类：液体培养基、固体培养基、半固体培养基。
液体培养基:所配制得培养基就是液态得,这种培养基被用来微生物得增菌与生长状态观察。
固体培养基与半固体培养基:在液体培养基中加入适量得凝固剂制成成固体培养基与半固体培养基。常用作凝固剂得物质有琼脂.固体培养基琼脂用量1、5－2％,半固体培养基琼脂用量在０、5~1％之间.固体培养基用作微生物得分离、鉴定、计数、保藏等.半固体培养基被用来观察微生物得动力与保藏菌种。
今天给大家展示一下各种培养基得制备。
培养基制备得基本过程：?调配成分、溶解、校正pH、分装、灭菌、质量检查与保存
所需物品：试剂、锥形瓶、天平、量筒、微波炉、高压蒸汽灭菌器、玻璃试管、玻璃平板、接种工具。
（1）调配成分：
在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水200ml, １％蛋白胨,0、5％NaＣL,0、3%牛肉膏(g/v),准确称取各种成分，使其充分混合.
［注意事项］
培养基调配溶解:
先在锥形瓶底加入少量得蒸馏水，再加入培养基成分，以防其粘在锥形瓶底部烧结。制备培养基时，除玻璃容器时，还可用铝锅,搪瓷桶，但不可用铁，铜等容器，以免铁与铜离子进入培养基（培养基中铁离子含量超过0、１4mg/L时抑制细菌毒素得产生，含铜量超过0、3m ｇ/L时抑制细菌得生长)。培养基中若需加入染料，胆盐，指示剂等,应在校正pH后加入。
（2）溶解：
将配制好得混合物微波炉加热8min，使其完全溶解,补足失水。（3）校正PＨ：?不同得细菌需要在含不同ｐＨ培养基上生长,一般将培养基得ｐH调至7、２～7、6。商品化得试剂配制后可省略该步骤，无需校正PH。根据所需得培养基用途不同分别加入不同含量得琼脂，制成半固体培养基与固体培养基.
（4）分装:(液体培养基、半固体培养基与部分固体培养基得分装可在灭菌钱也可在灭菌后)
①基础培养基:一般分装于容量为500ml锥形瓶灭菌后备用,以便随时分装倾注平板或配制营养培养基等；
②琼脂斜面：通常在融化后分装于试管,量约为试管高度得1／４～1/3，灭菌后倾斜放置.
③半固体培养基:分装量为试管容量得１/4～1/３，灭菌后直立放置。
④液体培养基：分装量为管长得1/５，灭菌后直立放置。
分装好得培养基常用高压蒸气灭菌，条件为103、4３kＰａ,温度1２1℃1５~2０ｍｉn；含糖培养基以68、95kＰa，１0～15min为宜,以免破坏糖类物质；不耐高热得物质配制成得培养基,常用流通蒸气灭菌或滤过除菌。
琼脂平板制备：先将灭菌琼脂融化后冷却至５0℃左右，以无菌操作倾注于灭菌平皿内(内径75mｍ得平皿约8—９ｍｌ),水平旋转平皿，待琼脂凝固后将平皿翻转，置４℃保存备用。
营养平板制备:先将灭菌琼脂融化后冷却至50℃左右，以无菌操作加入１0％无菌得脱纤维羊血（临用前置３7℃水浴预温30mｉn)，轻轻摇匀（避免产生气泡）,倾注于灭菌平皿内（内径75mm得平皿约８—9ml)，水平旋转平皿，待琼脂凝固后将平皿翻转,置4℃保存备用。[注意事项]
平板得浇注：倾注培养基时，切勿将皿盖全部开启，以免空气中尘埃及细菌等微生物得落入。倾注时若培养基温度过高,则冷凝水过多,易致污染，不易分离到菌落；若温度过低,部分琼脂凝固,倾注平板表面高低不平。可在无菌室或接种罩内倾注培养基后，将皿盖稍开一缝隙，在紫外灯照射下待凝,这样利于蒸气散发,减少平板内冷凝水。倾注血液琼脂时,由于加血时琼脂表面容易产生气泡,倾注时适时转动锥形瓶，使气泡附于瓶壁，以减少血平板表面得气泡。
（6）质量检查：?需做无菌试验与效果试验。
①无菌试验:将灭菌后得培养基置3７℃孵育２4h,无任何微生物生长为合格。?②效果试验:将已知得标准参考菌株接种于待检得培养基中，检查细菌得生长繁殖状况与生化反应就是否与预期得结果相符与。
经过质量检查合格得培养基注明名称，制作日期存放于冷暗处或４℃冰箱(固体培养基应将平皿得底朝上,盖朝下或用保鲜袋包裹，以减少水分蒸发,液体培养基应直立放置，以免污染)。
微生物得分离培养与接种技术
接种：将微生物接到适于它生长繁殖得人工培养基上或活得生物体内得过程叫做接种。将微生物混与培养物通过一定得接种技术接种到人工培养基中得到纯培养得过程称为分离纯化。今天给大家展示一下各种培养基得分离培养得接种技术与细菌得生长状态。
1、接种所需物品：接种工具（接种环、接种针等)、酒精灯、待接种菌种.接种环用于固体与液体培养基得接种,接种针用于固体培养基与半固体培养基得接种。接种技术要求：用灭菌得工具（如接种针与吸管等)在无菌条件下接种含菌材料(如样品、菌苔或菌悬液等）于灭菌培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。
接种工具得灭菌方法：通常接种环或接种针在火焰上外焰灭菌。灭菌后得接种工具在接种微生物前需先冷却，可接触一下培养基,待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体,迅速地接种到新得培养基上.接种后将接种工具再次灭菌才可放置。
２、接种环境:为避免接种过程中标本中得微生物污染环境及空气中得微生物污染培养物，微生物得接种应在特定环境内接种。常用得设备有接种罩、超净工作台或无菌室等.
3、接种方法：根据待检标本性质、培养目得与所用培养基得性质采用不同得接种方法。
（1）平板划线分离培养法：通过平板划线分离培养使混合细菌培养物在培养基表面分散生长,各自形成菌落,根据菌落得形态及特征，挑选单个菌落，经过移种而获得纯种细菌（纯培养）.平板划线分离培养法常用来分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等。根据划线得方式不同有连续划线分离法、分区划线分离法、棋盘划线分离法等.
a、连续环线分离法:
先将接种环火焰灭菌，待冷后取培养物少许.左手拿起平板,并用拇指与食指将平板盖打开，右手迅速将取有培养物得接种环从打开得空间插入平板内，使接种环与培养基表面呈45℃角，先在平板上1/5处轻轻涂布，然后即可左右来回以曲线形式作连续划线接种,线与线间留有适当距离，将整个平板表面划满曲线.注明标识后,置35℃培养箱中培养,一般在18～２４小时后观察结果。
b、分区划线分离法：
用接种环先将培养物涂布于平板1区并作数次划线,再在2、３……区依次划线。每划完一个区域,均将接种环灭菌一次，待冷后再划下一区域。每一区域得划线均接触上一区域得接种线1~２次，使接种量逐渐减少，以获得单个菌落。其她操作与上述曲线划线分离法相同。
c、棋盘格线划线分离法:
将培养物涂布于平板上1／５处,接种环经火焰灭菌后，自1/5划线处作平行划线5~6条，将接种环灭菌后,划垂直线5～6条，使呈正
方形格。其她操作同前.
（2)斜面接种培养法:
主要用于纯菌移种,以进一步鉴定或保存菌种.接种方法就是以灭菌得接种环挑取细菌后伸入斜面培养基管，在斜面底部向上划一条直线，然后从底部起向上作曲折连续划线，直至斜面上方顶端。取出接种环,火焰灭菌管口,加塞;最后将接种环经火焰灭菌放好。做好标识，置35℃培养箱中培养18～2４小时.
(3）液体接种法：
主要用于微生物得增菌与生长状态观察.接种方法就是以灭菌得接种环挑取细菌后伸入培养基管中,在接近液面得管壁上方轻轻研磨,并沾取少许培养基液体调与，使细菌混合于培养基得液体中.取出接种环,火焰灭菌管口,加塞；最后将接种环经火焰灭菌放好.做好标识，置３5℃培养箱中培养1８~24小时。
(４）半固体培养基穿刺接种法:
多用于保存菌种、观察动力及厌氧培养等也可以用于观察细菌得某些生化反应.以灭菌接种针挑取细菌后,垂直刺入培养基得中心(半固体或一般琼脂高层）直达近管底部(但不能完全刺到管底），接种针应沿原路退出.
细菌得生长现象
细菌在不同得培养基上接种后，在一定得培养条件下(通常为３5℃培养箱中培养18～２4小时)，可表现不同得生长现象。
（1）固体培养基：细菌在固体培养上生长后可表现出2种生长情况：
菌落与菌苔。
菌落:单个细菌分裂繁殖成一堆肉眼可见得细菌集团。菌苔：多个细菌分类繁殖后形成密集一片得细菌集团。
（2）液体培养基:细菌在液体培养基中生长后可表现３种生长情况:表面生长、均匀浑浊、沉淀生长。
(3）半固体培养基：细菌在液体培养基中生长后可表现２种生长情况:沿穿刺线呈羽毛状或云雾状混浊生长与沿穿刺线呈线性生长。
常用染色液配制
实验室观察微生物得形态结构主要通过一定得染色方法后在显微镜下，常用得染色方法有革兰染色、抗酸染色等.
革兰染色液配制
（1）结晶紫染液：
称取结晶紫4～8g,溶于1０0ｍl 95%乙醇中制成饱与液。取20ml饱与液与8０mｌ10ｇ／L草酸钾溶液混合即成，用滤纸过滤备用。（2）卢氏碘液：?先将2g碘化钾溶于10ｍl蒸馏水中,再加1g碘，待碘全部溶解后再加蒸馏水至3０0ｍl即成。
（3）95％乙醇或丙醇乙醇溶液(95％乙醇70ml＋丙醇30ｍｌ)
（4）稀释石炭酸复红液：?称取４g碱性复红溶解于10０mｌ95％乙醇，即成碱性复红乙醇饱与液，吸取1０ｍl饱与液与９0mｌ５0ｍgL石炭酸水溶液，混匀,即成石炭酸复红饱与液，再量取10ｍl石炭酸复红饱与液加90ml蒸馏水混匀即成。
抗酸染色液配制
（1）石炭酸复红液：碱性复红8g溶于１０0ml 95％乙醇制备成碱性复红饱与液,取１0ml饱与液与９０ｍl 5%石炭酸水溶液混匀。(２）盐酸酒精:5%盐酸乙醇液(5ｍl浓盐酸+95mｌ９５%乙醇)，使用时10倍稀释即可。
(3）亚甲兰液:0．３g亚甲蓝+5０ml 95%乙醇，待溶后，加蒸馏水10０ml,混匀,使用时10倍稀释.
细菌涂片制作、染色观察与细菌基本形态观察
所需物品：细菌培养物、革兰染色液、细菌接种工具、载玻片、生理盐水、光学显微镜。
1、细菌涂片标本得制作
细菌进行染色检查前首先要制备细菌涂片,制作细菌涂片一般包括涂片、干燥、固定三步。
（1)涂片:用灭菌得接种环挑取1—2环生理盐水涂于洁净得载玻片上,将接种环灭菌后挑取固体培养基上细菌培养物少许于生理盐水中磨匀，呈轻度混浊.涂好菌膜大小一般以1cｍ2左右为宜。
注意事项：
1)细菌涂片制作每次挑取细菌培养物前后都要注意无菌操作。
2)若就是细菌培养物在液体培养基（如肉汤、浓汁、痰液、咽拭子）
中，可用灭菌接种环直接挑取１-2环液体培养物涂布于洁净得载玻片上，不需要另外添加生理盐水.
3)若多个标本同时进行同样染色,可用蜡笔在玻片上画出数格,做好
标记再分别涂片,以免混淆。
4)用火焰烧灼沾有菌液得接种环时，为防止菌液受热溅散污染环境,
接种环灭菌前,须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干,然后再在外焰中烧红灭菌,杀死残留得细菌。
(2）干燥:涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于酒精灯火焰半尺高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干.
（3）固定:细菌得固定常用火焰加热法,即将上述已干得涂片在酒精灯火焰中通过3次。固定得目得在于杀死细菌，并使细菌菌体与玻片粘附牢固，染色时不致于被染液与水冲掉,同时固定可凝固细胞质，改变细菌对染料得通透性。
2、革兰染色法
（1)原理:
1)革兰阳性菌细胞壁结构较致密,肽聚糖层厚,脂质含量少,乙醇不易
透入，不易被脱色;而革兰阴性菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层少，脂质含量多，乙醇易透入,易被脱色。
2)革兰阳性菌等电点叫阴性菌低（PI2-3、ＰI４-5）,在相同条件下，
革兰阳性菌所带负电荷较阴性菌多，与带正电荷得染料（结晶紫）结合较牢固且不易脱色。
3)革兰阳性菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫与碘牢固
地结合成大分子复合物,不被乙醇脱色;而革兰阴性菌细胞内含有极少量得核糖核酸镁盐,吸附染料量少,形成得复合物分子也较少，易被乙醇脱色。
（2)方法:
1)初染:将结晶紫染液加于制好得涂片得菌膜上,染色1ｍin,用细水
流冲洗，甩去积水。
2)煤染:加卢戈碘液作用１miｎ,用细水流冲洗，甩去积水.
3)脱色：滴加９５％乙醇数滴,摇动玻片数秒钟，使均匀脱色，然后
斜持玻片，再滴加酒精，直至流下酒精无色为止（约0、5min)，用细水流冲洗，甩去积水。
4)复染:加稀释石炭酸复红染0、５ｍiｎ,用细水流冲洗，甩去积水，
用吸水纸吸干后，在涂片菌膜上滴加香柏油，置油镜下检查。
注意事项:
操作因素：涂片太厚或太薄,固定菌体过分受热或脱色时间长短,染液冲洗方法不同，都会影响染色结果.
细菌因素：细菌得菌龄不同,染色结果也有所差异。
染液因素:所有染液应防止染液蒸发而改变浓度,特别就是卢戈碘液久存或受光作用后易失去煤染作用,涂片积水过多会改变染液浓度，影响染色效果。
抗酸染色法
1、细菌制片：同革兰染色(但需厚涂片）。
２、抗酸染色
初染:将固定好得涂片置于染色架上，滴加饱与石炭酸复红染液，并于载玻片下方以弱火加热至出现蒸汽(勿煮沸或煮干)随时补充染液以防止干枯,持续5min，水洗。
脱色:3%盐酸酒精脱色，直至涂片无红色染液脱下为止，然后水洗。复染：美蓝染液复染1miｎ，水洗,印干(印干用得滤纸只能使用一次，以防止假阳性).印干后，在涂片菌膜上滴加香柏油,置油镜下检查. 3、细菌基本形态观察
革兰染色后得细菌涂片可在普通光学显微镜得油镜下观察细菌具体形态。
普通光学显微镜由光学方法系统与机械装置两部分组成，光学放大系统一般包括目镜、物镜、聚光器、光源等,机械装置一般包括底座、镜臂、镜台、物镜转换器、镜筒等。
普通光学显微镜油镜使用方法
普通光学显微镜得接物镜一般有3种，即低倍镜、高倍镜与油镜。检查微生物形态时常用得就是油镜。油镜得标志就是:①透镜直径最小;
②油镜长度大于低倍镜与高倍镜；③油镜头得下缘有一圈黑线或白线④有放大倍数1０0X得标记。当接目镜倍数为10X,接物镜用油镜时，显微镜放大倍数为1000倍,可观察到细菌得形态。
油镜观察得原理：油镜得透镜很小，自标本片透过得光线，因玻片与空气介质密度不同,而使部分光线经载玻片与空气折射后而不能进入接物镜,致使射入光线较少,物象不清晰。在油镜与标本之间滴加与玻璃折光率相近得香柏油,则使进入油镜得光线增多，视野光亮度增强,物象清晰。
1)显微镜在使用时应平放在实验台适宜得位置.用油镜时，勿使镜臂
与载物台倾斜,以免镜油流出,影响观察.
2)油镜检查染色标本时,光线宜强，可将聚光器上升到最高位置,将光
圈全部打开，以获得最佳光度。
3)将染色后待检查得标本置于载物台上，用标本推进器固定,将待检
标本得菌膜移于接物镜下。
4)标本欲检部位滴一滴香柏油,然后转换成油镜,缓慢转动粗调节器，
使油镜头浸没在油滴中，当油镜头几乎接触玻片时停止转动。观察接物镜，缓慢调节粗调节器，使镜筒上升(不能下降,以免压碎标本片与损伤油镜），待瞧到模糊物象使,再调节细调节器，直至清晰瞧到细菌。调节过程中若油镜末端已离开油面,应按上述过程重复操作.
5)观察标本时应两眼同时睁开,以减少眼睛疲劳，同时调节两个目镜
之间得距离直至获得最佳视觉效果。
注意事项
1)显微镜就是精密得光学仪器，使用时应注意爱护,各部分结构不得
随意拆卸，以免损坏.
2)取送搬移显微镜时，要一手持镜臂，一手托镜底,平端在胸前，轻
拿轻放。
3)避免强酸、强碱、氯仿、乙醇、乙醚等化学药品与显微镜接触。
显微镜光学部分必须保持清洁,避免阳关直接照射。细调节器就是显微镜精细而脆弱得部分,不要向同一方向连续转动数周,应轻微地来回旋转。
4)镜头必须保持清洁,只能用软且无毛得擦镜纸擦拭.油镜使用后应
立即用擦镜纸拭去镜油,若油镜头得油迹未擦干净,应先将二甲苯滴在擦镜纸上擦拭镜头,再用干净擦镜纸擦去镜头上残留得二甲苯。
5)显微镜擦净后,接物镜转成“品”字形，下降聚光器,套上显微镜套，
放入实验柜中。
细菌得基本形态观察
经革兰染色后油镜观察:细菌染色可分为两种：革兰阳性(紫色)、革兰阴性（红色);细菌形态可分为3种:球形、杆形、螺形.
经抗酸染色后油镜观察：在淡蓝色背景下可见染成红色细长或略带弯曲得杆菌，并有分枝生长趋向,此为抗酸染色阳性菌。其她细菌与细胞均被染成蓝色。
细菌得生化反应
不同得细菌具有不同得酶系统,对底物得分解能力及代谢产物都不同.这些代谢产物具有不同得生物化学特性，可利用生物化学得方法测定这些代谢产物以鉴定细菌,称为细菌得生化反应。
生化反应得分类：1、碳水化合物得代谢试验（糖、苷、醇类发酵试验；氧化－发酵试验；七叶苷水解试验;甲基红试验；V-P试验）2、蛋白质与氨基酸得代谢试验(吲哚试验；硫化氢试验；尿素分解试验；苯丙氨酸脱羧酶试验；氨基酸脱羧试验)3、碳源与氮源利用试验（枸橼酸盐利用试验）4、细菌酶试验(凝固酶试验、过氧化氢酶试验、氧化酶试验、硝酸盐还原试验、CAMP试验、胆汁溶菌试验)5、抑菌试验（杆菌肽试验、0/１２9试验)。今天示教一下细菌常见得生化反应接种方法与结果。
1、糖发酵试验
组成：培养基＋糖（苷、醇）+指示剂（溴甲酚紫)
原理：各种细菌含有不同得分解糖(苷、醇）得酶,对糖(苷、醇）分解能力也各不相同，有得不分解，有得分解仅产酸,有得分解产酸又产气，故可用来鉴别细菌。
方法：将待检菌接种糖发酵管（液体培养基接种法),3５℃培养箱中培养18~2４小时,观察结果。
结果:见示教管。
2、甲基红试验
组成：葡萄糖蛋白胨水培养基+指示剂（甲基红)
原理:某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解为甲酸、乙酸等酸性物质，故培养基PH在4、５以下，加入甲基红试剂呈红色（阳性）。某些细菌分解葡萄糖产生得酸进一步转化为醇、酮等非酸性物质，使培养基PH在６、2以上,加入甲基红试剂呈黄色(阴性）。方法:将待检菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中（液体培养基接种法）,3５℃培养箱中培养18~24小时，加入甲基红指示剂2－３d,立即观察结果.
结果：见示教管.
３、Ｖ－P试验
组成：葡萄糖蛋白胨水培养基+NaＯH+α-萘酚—乙醇
原理：某些细菌分解葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸可进一步脱羧生成乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境下被氧化成二乙酰,后者与蛋白胨中得精氨酸所含得胍基起作用，生成红色胍缩二乙酰，为Ｖ—Ｐ试验阳性。不变红色为阴性。
方法：将待检菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中(液体培养基接种法)，35℃培养箱中培养２4~48小时，加入V－P试验甲液与乙液各１ｄ,立即观察结果(红色为阳性、不变色为阴性）.
结果：见示教管.
４、吲哚试验(靛基质试验）
组成：蛋白胨水培养基+吲哚试剂。
原理：细菌具有色氨酸酶,分解蛋白胨水中得色氨酸产生吲哚,与吲哚试剂形成红色化合物。
方法：将待检菌接种到蛋白胨水培养基中（液体培养基接种法)，3５℃培养箱中培养18－24小时，加入吲哚试剂数滴,静置半分钟，观察结果(培养物液面上层呈玫瑰红色为阳性,不变色者为阴性).
结果：见示教管。
５、苯丙氨酸脱氨酶试验
组成：苯丙氨酸培养基＋三氯化铁。
原理:某些细菌具有苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱氨生成苯丙酮酸,加入三氯化铁试剂螯合成绿色化合物.
方法:将待检菌接种到苯丙氨酸培养基中(液体培养基接种法)，35℃培养箱中培养1８－2４小时,加入三氯化铁试剂,观察结果(绿色为阳性，不变色为阴性）。
结果：见示教管。
6、尿素酶试验
组成:尿素培养基+指示剂(酚红）。
原理：具有尿素酶得细菌能分解尿素产氨，使培养基呈碱性,酚红指示剂变红色.
方法：将待检菌接种到尿素培养基中(半固体培养基接种法)，３５℃培养箱中培养18—２４小时,观察结果(培养基变红为阳性,反之为阴性)。
结果:见示教管。
７、枸橼酸盐利用试验
组成：枸橼酸盐＋指示剂(溴麝香草酚蓝)
原理：当细菌可以利用铵盐作为唯一得氮源，同时利用枸橼酸盐为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基生长，并分解枸橼酸盐为碳酸盐,使培养基产碱,指示剂溴麝香草酚蓝变色。
方法：将将待检菌接种到尿素培养基中（半固体培养基接种法),35℃培养箱中培养18—２4小时，观察结果（培养基由绿色变成蓝色，则为阳性，不变色则为阴性)。
结果:见示教管.
８、氧化发酵（O/F）试验
组成：无氧得葡萄糖发酵管。
原理:根据细菌在有氧与无氧情况下对葡萄糖代谢情况,确定细菌得代谢类型。O型（有氧情况下分解糖），F型（有氧与无氧情况下分解糖），Ｋ型（无氧与有氧情况下均不分解糖).
方法：取2支含葡萄糖培养管，置沸水中，驱除培养基中得氧气.冷却后，2只培养管均接种待检菌，１管加灭菌石蜡置于培养基上层隔绝空气,１管不加石蜡，３5℃培养箱中培养１８—2４小时,观察细菌在有氧与无氧情况下对葡萄糖分解能力。
结果:见示教管.
9、硝酸盐还原试验
组成：硝酸盐培养基+醋酸+对氨基苯磺酸+α—萘胺.
原理:某些细菌还原硝酸盐生成亚硝酸盐，与醋酸生成亚硝酸,与对氨基苯磺酸生成重氮苯磺酸，加入α—萘胺生成偶氮苯磺酸，形成红色化合物。
方法：将待检菌接种到硝酸盐培养基中,35℃培养箱中培养18-24小时，加入硝还试验甲与乙试剂,观察结果（红色为阳性，不变红为阴性）.
结果：见示教管。
注意事项：本试验阴性结果可能有两种情况：真阴性与假阴性，通常要用Zn粉还原试验验证就是否就是假阴性。
10、氧化酶试验
组成：氧化酶试剂（盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺)。原理:细菌具有氧化酶,可与氧化酶试驾反应生成红色化合物.
方法:用滤纸条沾取待检菌,吸管滴加氧化酶试剂，变红色为阳性，不变色为阴性。
结果:见操作.
11、触酶试验
组成：触酶试剂(H２Ｏ2)。
原理：细菌具有触酶(过氧化氢酶）,能分解Ｈ２Ｏ2，产生氧分子,出现气泡。
方法:挑取待检菌培养物于洁净玻片上，滴加3%H2O２数滴，观察结果，出现气泡为阳性，不出现气泡为阴性。
结果:见操作。
12、凝固酶试验
组成：新鲜抗凝血浆。
原理：金黄色葡萄球菌具有游离型凝固酶,可使新鲜抗凝血浆重新发
生凝固.
方法：将待检菌接种到1：4稀释得新鲜抗凝血浆，置３7℃水浴3—4h，观察结果，血浆凝固为阳性,不凝固为阴性。
结果:见示教管。
13、KIA复合试验(克氏双糖铁）
组成:培养基＋底物[乳糖、葡萄糖(1/１0）、酚红、硫代硫酸钠、FeSO4］。原理:该培养基使用酚红作为指示剂,酸性呈黄色，碱性呈红色。细菌若能发酵乳糖与葡萄糖产酸产气,则斜面与底层呈黄色，且有气泡.若只发酵葡萄糖不发酵乳糖,则斜面呈红色，底层呈黄色。若分解硫代硫酸钠产生硫化氢与铁生成黑色硫化铁，培养基变黑.
方法：将待检菌接种ＫIA培养基(固体斜面培养基接种法），35℃培养箱中培养18～２4小时,观察结果。
结果:见示教管.
１4、MIU复合试验
组成：半固体培养基+底物[色氨酸、尿素、酚红］
原理:细菌具有脲酶可分解尿素产碱酚红变色；细菌具有色氨酸酶分解色氨酸产生吲哚,加入吲哚试剂培养基变红,有动力得细菌在半固体培养基中沿穿刺线扩散生长)。
方法:将待检菌接种MIU培养基(穿刺接种）,35℃培养箱中培养１8~24小时,观察动力与脲酶反应后,再滴加吲哚试剂。
结果：见示教管.
消毒灭菌
消毒灭菌即就是用物理或化学方法来抑制或杀死外环境中及机体体表得微生物，以防止微生物污染或病原微生物传播得方法。实验室常用消毒灭菌方法主要为:紫外线杀菌与高压蒸汽灭菌.
１、紫外线杀菌试验
原理:波长2４0-30０nm得紫外线具有杀菌作用,其中以波长2６6ｎn 紫外线杀菌作用最强.紫外线作用生物细胞得DNA,使DNA链上两个相邻得T以共价键结合，形成二聚体，干扰ＤNA得复制与转录，导致细菌得变异或死亡。
特点：杀菌效果受紫外线照射波长、距离、时间得影响；杀菌效果得穿透力弱,易被物品遮挡;杀菌效果无选择性(生物核酸亦受影响)。
方法:将待检菌接种到无菌培养基(连续密集划线),使细菌均匀涂布于平板得表面,在紫外线灯下，开启平板盖得一半，距离紫外灯管１米以内,接受紫外线照射30mｉn,盖好平板，3５℃培养箱中培养1８～2４小时,观察结果。
结果：见示教平板。
2、药物敏感性试验（Ｋ-B法）
所需物品：细菌菌种、MＨ琼脂、无菌生理盐水、0、5麦氏标准比浊管(１、５X１０8ＣFU/mｌ）、抗菌药物纸片、无菌棉拭、镊子、毫米尺、接种环。
原理：含有定量抗菌药物得纸片贴在已接种测试菌得琼脂平板上,纸片中所含得药物吸收琼脂中得水分溶解后便不断地向纸片周围扩散,形成递减得梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内得细菌得生长受到
抑制，形成透明得抑菌圈.抑菌圈得大小反映测试菌对测定药物敏感程度，并与该药对测试菌得最小抑菌浓度（ＭIC）呈负相关，即抑菌圈越大,MIC越小。
方法：
（1）挑取孵育16—24h得血平叛上数个菌落置于生理盐水管中,校正浓度至0、5麦氏标准。
（2）无菌棉拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在MH 琼脂表面均匀涂布接种3次,每次旋转平板60度，最后沿平
板内缘涂抹1周。
（3）平板在室温下干燥3－5min，用无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面,各纸片中心相距应大于24mｍ，纸片据平板内缘
应大于1５ｍm，35℃孵育1６-１８h,量取抑菌圈直径。
结果:
（1）结果解释：用毫米尺量取抑菌圈直径,参照药敏试验纸片结果解释表得标准判读结果,按敏感(S)、中介(I）、耐药（R)报告。（2）质量控制:使用标准菌株进行药物敏感性试验药物得抑菌圈直径大小影落在质控标准菌株得抑菌圈预期值范围内。若超出该范围，应视为失控而不发出报告,须及时查找原因，予以纠正。（3）影响因素:多种因素影响试验结果。
1.培养基得质量（不同培养基营养成分差距颇大,不同得细菌需
要不同得培养基与培养条件，非苛养菌常用得培养基为ＭH琼
脂）
2.药敏纸片得质量（药敏纸片含有定量得抗菌药物，需避光冷藏，
具有一定得有效期)
3.接种菌量（必须定量,定量得抗菌药物抑菌效果有限，试验结
果才能具有可比性）
4.试验操作质量（平板得涂布、纸片得贴布）
5.孵育条件（依据细菌生长需不同培养条件而有所不同）
6.抑菌圈测量工具得精度（测量尺得精度应至少达到毫米）（4）注意事项
1.细菌对抗菌药物得敏感性常常发生变异，药物敏感性试验结果
仅供临床上选用药物参考。
2.药物敏感性试验结果应用临床治疗可能会出现体外敏感,体内
无效得情况.
3.药物敏感性试验结果应用临床治疗亦可出现体外中介，体内可
能有效得情况。
?常用仪器设备使用说明
1、高压蒸汽灭菌器使用说明
1、1构造高压蒸汽灭菌器就是一个双层得金属圆筒,两层之间盛水,外层坚厚，其上或前方有金属厚盖。盖旁附有螺旋，借以紧闭盖门,使蒸汽不能外溢.通过加热或通电得方式,使内部得蒸汽压力与温度升高，继而筒内得压力与温度也会升高.高压蒸汽灭菌器上装有排气阀、安全阀,以调节灭菌器内压力,装有得温度计及压力表以示内部温度与压力。灭菌器内装有带孔得金属搁板,用以放置带灭菌得对象。
实验室技术操作规范 一、无菌操作要求 食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因：一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。 1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 2. 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 3. 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 4. 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 5. 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 6. 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。 7. 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。 8. 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。 二、无菌间使用要求 1. 无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。 2. 无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 3. 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 4. 处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 5. 在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。 三、消毒灭菌要求 微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。 1．灭菌前准备 （1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 （2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。
目录 生物安全柜操作规程及维护 (3) 实验室高压蒸气灭菌器操作程序 (6) 物体表面细菌监测 (8) 医护人员手指细菌监测 (9) 空气中细菌含量的监测 (10) 环境卫生学监测质控标准 (12) 使用中消毒剂与无菌物品保存液的质控程序 (13) 一次性医疗用品微生物监测 (14) 紫外线消毒质量控制程序 (15) 污水的细菌监测(总大肠菌群) (16) 正确洗手的手法 (18)
生物安全柜操作规程及维护 1.目的： 为了满足生物安全操作的要求，并且达到在操作时保护操作人员的目的，使细菌操作达到无菌操作的要求，便于操作的标准化。 2.原理： 通过使用空气超高过滤器（ULPA）的过滤，使仪器内部的空气洁净度达到100级，使细菌的一般操作限制在一个相对密闭的环境中，不但保护操作人员，还可满足操作的标准化。 3.工作条件： 环境温度：18－30℃相对湿度：<80% 安装的环境必须达到一定的洁净度；远离人员通道及有潜在干扰气流的位置；柜后及两侧各留30cm的空隙，顶部30-35cm空隙。 环境必须有良好的通风设备。 4、操作步骤： 生物安全柜的设置已经设置完全，如果需要重新设置请参看HFsafe生物安全柜使用说明。具体操作步骤为： 4.1将电源插头插入准备好的固定插座，连通电源。 4.2有系统管理员(即本室负责人)开启玻璃门门锁，并将总开关置于开位置“！”，此时系统开始上电。 4.3检查显示及按钮的各项功能，具体见后附注（注意：UV灯的测试除外，开启UV灯时必须将前玻璃门关闭）。 4.4当系统稳定后，对设备进行安全性检查。（检查项目包括：工作室平均垂直风速；工作室内可操作区域洁净度达到100级；设备的密封有没有被破坏。所有的安全检查项目中的洁净度建议由当地卫生防疫部门来进行尘埃粒子数、沉降菌和菌落数的检测，看是否符合其工作室的洁净度要求）。 4.5如果安全性测试通过，系统已经可以使用，请在《使用记录》上写下相应的信息。在使用时需要注意的是，操作必须在工作台板无孔区域进行，物品也必须放置于无孔区域。 4.6操作者应先把手臂放进安全柜内大约1分钟，以使柜子适应并且让气流扫过手臂手臂移入移出柜内应保持前门气流的连续性，应缓缓移入移出，并且方向和前门垂直；为使跨越前门的动作量降低，在实验开始前应把所需的物品放入柜子；柜子在开始工作前以及完成后至少要运行5分钟是，使柜子净化，以便于污染空气从柜内排出。实验操作方向应从清洁区到污染区，一般要求为左→右。 4.7 当工作完成后需要关机前，将试验使用的所有材料和其他物品从设备中取出。
微生物实验室安全操作规范 微生物实验室的布局和设计应考虑良好的微生物操作和安全。本质是最大程度的减少微生物菌种的交叉污染，微生物样本的处理环境也是重要，因为环境也能引起也污染的可能。规范微生物实验室内仪器、设备的安全操作及染菌的微生物培养物处理程序，保证微生物实验室安全操作意义重大。 一、员工安全操作规范 1、实验室主任（对实验室直接负责的人员）负责制订和采用生物安全管理计划以及安全或操作手册。 2、实验室安全主管（向实验室主任汇报）提供常规的实验室安全培训。 3、接触微生物或含有微生物的物品后，脱掉手套后和离开实验室前要洗手。 4、禁止在工作区饮食、吸烟、处理隐形眼镜、化妆及储存食物。 5、只有经批准的人员方可进入实验室工作区域。实验室的门应保持关闭。 6、实验过程中，严格按有关操作规程操作，降低溅出和气溶胶的产生。 7、每天至少消毒一次工作台面，活性物质溅出后要随时用75%乙醇或巴氏消毒液消毒。
二、高压灭菌锅的安全使用操作规范： 1、堆放：将需灭菌的物品予以妥善包扎，依次堆放在灭菌锅。需灭菌物品外需黏上高压指示胶带以检验灭菌温度是否达到要求。 2、加水：在锅体内注入生活用水，水位一定要超过电热管2厘米以上（不宜过多）；连续使用时，每次操作前，必须补足上述水位，以免烧坏电热管和意外发生。 3、密封：在每次使用高压锅前，都必须认真检查高压锅的出气伐和安全阀，确保其状态完好，如有故障，在故障排除之前不得使用高压灭菌锅。把堆放好物品的灭菌桶放在锅体内，盖上锅盖并锁紧。 4、加热灭菌：将灭菌器接通电源，指示灯亮，表示电源已正常输入，按下开始按纽电热管开始加热工作；灭菌期间工作人员需监视高压锅指示面板上的压力、温度和时间等。 5、开盖：灭菌结束后，切勿立即将灭菌锅内的蒸汽排出，应待压力表指针归零位后，方可开启锅盖。 三、电炉使用操作程序及注意事项： 1、将盛有液体的玻璃容器（应垫石棉网）或不锈钢器皿置于电炉上，方可打开电炉加热。
微生物实验室的安全操作规程 1 实验室安全 1.1 微生物实验室的生物安全性 1.2 科室安全文档 （a）生物危害防护：实际操作规程见（《实验室生物安全通用要求》，中华人民共和国国家标准GB19489-2004。2004-01-05发布，2004-10-01实施。） （b）实验室安全：原则和措施见（《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》，中华人民共和国卫生行业标准WS 233-2002。2002-12-03发布，2003-08-01实施。）1.3 应用： 以上的操作规程应用于微生物科室的所有部门。工作人员或访问人员必须遵守各项规定。 1.4 关于新规定或现行规定的修改案： 任何新规定或现行规定的修改案必须通知负责科室安全的人员及相关人员，他们将建议科室主任考虑实施。 1.5 生物性危害 1.5.1 与各种操作有关的生物危害水平取决于： a.处理的传染性物质的本身： 按照传染性物质对个人和社区的潜在危险性以及经空气传播的可能性，其划分成不同等级。所采用的等级划分详见＂《实验室生物安全通用要求》＂；原则和措施（见《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》）。 b.使用的设备和设施： 处理不同等级的传染性物质的要求在＂实验室安全＂中已规定。这些符合要求的设备都要承担重要临床工作，科室负责人必须保证中应污染物水平。 c.培训，特别是员工的安全性培训和安全性经验积累。所有员工应该接受一定训练，能安全处理任何实验室可能碰到的物质，避免将实验不能处理或规定之外的传染性物质暴露在实验室，即使暴露事故在实验室，即使暴露事故发生也要会正确处理。 1.5.2 传染性物质的分类 1.5. 2.1分类系统
表面微生物测试标准操作规程（接触平皿法） 1．目的 建立表面微生物测试标准操作规程，保证测试人员操作规范化、标准化。 2．依据《药品生产质量管理规范》（2010年修订本） 3．范围 本规程适用于本公司对洁净区的表面微生物的检测。 4．责任 质量控制化验员负责实施，QC主管负责监督执行 5．内容 洁净区微生物测试点选择表面微生物监测的采样点数目及其布局根据以下几个方面设置： 空调系统验证的结果 房间的大小和布局 房间的用途 与产品的距离 人流物流方向 如何布点：对于同一洁净区，每个相同的取样物体在其不同的地方采2个样。如墙面2个采样点，地面2个采样点，洁净区主要设备2个采样点。
注：表面微生物监测的取样点数应依下列因素确定： 1.洁净区（室）的大小； 2.设备、管路等的复杂程度； 3.生产活动的重要性； 4.易受污染的部位等。 应考虑包含以下部位：每扇门、每个门把手、地板（至少两点）、墙壁（不易被清洁/消毒的部位，至少两点）、公用介 质的管路（不易被清洁/消毒部位）、生产设备的关键性部位（如灌装针、易与人员接触的塑料帘膜、胶塞筒、传输带）等。根据洁净区内设施、设备等表面对产品和洁净室环境的影响程度，通常将表面分为三类：关键表面（与产品、容器及密封件直接接触或暴露于产品、容器及密封件的表面）一般表面（如设备的外表面、墙壁等）和地板，并且分别设定不同的微生物限度要求。 表面微生物的每点取样面积宜控制在25cm2左右。 为避免干扰，宜在生产活动结束后取样。 洁净区微生物测试频率和限度 日常监控一月一次 接触碟（55mm）50cfu/25cm2 ，警戒40cfu/25cm2 ，纠偏 45cfu/25cm2 。 洁净区表面微生物测试方法（接触平皿法）。 洁净区表面微生物测试必须在动态下监测。
微生物的接种技术 1 目的 1.1学习掌握微生物的几种接种技术 1.2 建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节 2 实验说明 将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠，影响下一步工作的进行。 3 实验器材 3.1 器械和用品 酒精灯，玻璃铅笔，火柴，试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、移液管、三角型接种棒等接种工具。 3.2 菌种和培养基 菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。 培养基：普通琼脂斜面和平板,营养肉汤,普通琼脂高层(直立柱)。 4 实验流程 斜面接种法→液体接种法→固体接种法→穿刺接种法。 5 操作步骤 5.1 斜面接种法 斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。 通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。 将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈45～0度角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。以右手在火焰旁转动两管棉塞，使其松动，以便接种时易于取出。
右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。 将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上做S形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。将接种管贴好标签或用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架，即可进行培养。 5．2 液体接种法 多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验，其操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同，仅将不同点介绍如下： 由斜面培养物接种至液体培养基：用接种环从斜面上沾取少许菌苔，接至液体培养基时应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次即可。如接种霉菌菌种时，若用接种环不易挑起培养物时，可用接种钩或接种铲进行。 由液体培养物接种液体培养基时，可用接种环或接种针沾取少许液体移至新液体培养基即可。也可根据需要用吸管、滴管或注射器吸取培养液移至新液体培养基即可（图4-5）。 接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器皿上，以免造成污染。如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净。凡吸过菌液的吸管或滴管，应立即放入盛有消毒液的容器内。 5.3 固体接种法 普通斜面和平板接种均属于固体接种，斜面接种法已讲了，不再赘述。固体接种的另一种形式是接种固体曲料，进行固体发酵。按所用菌种或种子菌来源不同可分为： 用菌液接种固体料，包括用菌苔刮洗制成的菌悬液和直接培养的种子发酵液。接种时按无菌操作将菌液直接倒入固体料中，搅拌均匀。但要注意接种所用水容量要计算在固体料总加水量之内，否则会使接种后含水量加大，影响培养效果。 用固体种子接种固体料。包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌。将种子菌于无菌条件下直接倒入无菌的固体料中即可，但必须充分搅拌使之混合均匀。一般是先把种子菌和少部分固体料混匀后再拌大堆料。
2015 版微生物限度检验操作规程 目的建立微生物限度检查操作规程，规范操作，保证结果的准确性。范围成品、辅料、内包装袋及纯化水的检验。 内容概述：本检验操作规程依据中国药典2015 年版四部《通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。 微生物计数法 一、计数方法 1．微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。 3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查供试品微生物计数中所使用的 培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。 4、菌种及菌液的制备试验用菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 袋)，并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验见表 1。 菌液制备按表 1 规定培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含％(ml/ml )聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含%(ml/ml )聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉抱子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8 C,可在24小时内使用。黑曲霉抱子悬液可保存在2-8 C,在验证过的贮存期内使用。 表 1 试验菌液的制备和使用 阴性对照为确认试验条件是否符合要求,应进行对照试验,阴性对照试验应无菌生长。培养基适用 性检查按照表1规定,接种不大于100cfu 的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板,置规定的条件下培养。每一试验菌株平行制备 2 管或 2 个平皿。同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在范围内,且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。被检 液体培养基管与对照培养基管比较,试验菌应生长良好。 5、计数方法适用性检查
微生物实验室的基本要求 实验室总体面积应在70平米以上，要求水、电供应充足，畅通，排污设施与安全措施齐备。 一、选址： 1. 实验室应选择在清洁安静的场所，远离生活区，锅炉房与交通要道； 2. 实验室应选择在光线充足，通风良好的场所，要与生产加工车间有一定距离； 3. 实验室应选择在方便取样与检验，距离车间较近的工作场所。 二、结构和布局： 应设置细菌与理化检验兼有的综合实验室，主要包括以下三大部分：细菌实验室、理化实验室、办公室。 1. 办公室 2. 理化分析实验室：（或者和细菌检验操作室合并） ①理化分析室（兼作感观检验室） ②仪器室（兼放细菌室显微镜等少量仪器） 3．细菌实验室： ①细菌检验操作室； ②无菌室； ③培养基制作室； ④洗涮消毒室； 一般布局要求如下： 1. 办公室：办公室是化验人员进行原始记录等各项工作的场所，是与非化验室人员交往较多的场所，因此，应设在整体综合化验室的最外层，只需有桌、椅等简单设施即可。 2. 细菌检验操作室（常规操作）细菌检验操作室是细菌培养与检验主要操作室，主要设施是实验台。 对实验台的要求： a.实验台面积一般不小于2.4×1.3m； b.实验台位置应在实验室中心位置，要有充足光线；也可以做边台。
c.实验台两侧安装小盆与水龙头； d.实验台中间设置试剂架，架上装有日光灯与插座； e.实验台材料要以耐热、耐酸碱为宜； f. 实验室围护结构采用彩钢板材料，表面光滑、耐腐蚀、防水，所有缝隙可靠密封，便于清洁消毒，且防震、防火； g. 墙面、吊顶：彩钢板：钢板厚度0.426，15克覆膜。 3. 无菌室：无菌室是处理样品和接种培养的主要工作间，应与细菌检验操作室紧密相连。为满足无菌室无菌要求，无菌间应满足以下布局： a.入口避开走廊，设在细菌检验操作室内； b.与操作室用两道缓冲间隔开； c.无菌室与缓冲间均装有紫外灯，要求每3平米安装30ｗ紫外灯一盏； d.无菌室内设有工作台（中心与边台皆可），紫外灯距工作台面要小于1.5m； e. 微生物室结构应坚固、严密、防尘、光线明亮，地面应光滑，并应有缓冲间，设双层传递窗传递物件； f.门窗应是不锈钢的； g．室内温度18～26℃，相对湿度为45～65%，室内必须保持整洁； h．墙面、吊顶：彩钢板：钢板厚度0.426，15克覆膜； i. 地面采用PVC材料，防渗漏、无接缝、光洁、防滑。 4. 培养基制作室：培养基室是制作、配制微生物培养所需培养基及检验用试剂的场所，其主要设备应为边台与药品橱。 a.边台上要放置电炉，以满足熔化煮沸培养基时用； b.边台材料要耐高热、耐酸碱； c.药橱分门别类存放一些一般药品及试剂； d.危险、易腐易燃有毒有害药品单独设保险柜存放； e.边台上要放天平，以称取药品用。 5. 洗涮消毒室：洗涮消毒室用以消毒洗涮待用与已用之玻璃器皿，培养基及污物，其面积应大于10平米。 为满足洗涮消毒的功能，洗涮消毒室应设有： a.1-2个洗涮池，洗涮池上下水网要畅通；
微生物实验室安全及操作规定 1目的：为规范微生物实验操作，确保操作安全有效，制定本规定。 2.适用范围：化验室的微生物检测。 3.要求： 3.1无菌室的门要随手关闭，以防外界微生物的进入。 3.2微生物室内应保持清洁，不得存放与实验室无关的物品。 3.3进入无菌室前要更换经过灭菌的专用工作衣.帽.鞋。 3.4无菌室内应备有体积分数为0.1%的新吉尔灭溶液.体积分数为70~75%的酒精棉球，以便样品表面及意外污染消毒。 3.5无菌室内应备有镊子.剪刀.接种针.接种环，每次使用前后应在酒精灯火焰上灼烧至无菌。 3.6检验人员在操作过程中需严格按照要求进行操作，不得随意减少工序。 3.7无菌室禁止交谈，操作过程中不得用手触摸其它未消毒.灭菌的区域，与该工作无关人员不得随便出入无菌室。 3.8微生物（无菌室.缓冲间）每次使用前，用紫外灯照射30min，要每周检测一次室内空气清洁度，确保其符合实验条件。每周对微生物室进行至少一次2h以上紫外灯消毒。微生物室内的的菌种总数>5cfu/平皿时，需要对无菌室.缓冲间用85~95%乳酸熏蒸1h，熏蒸结束后（必要时可以将空间密闭整晚），用体积分数为0.1%的新吉尔灭溶液或体积分数为70~75%的酒精棉彻底对洁净室.缓冲间及其内所有设备.物品进行清洗；后对无菌室.缓冲间进行半小时以上紫外线消毒，结束后，验证室内空气清洁度是否合格，仍不合格，则可加大乳酸熏蒸时间及紫外线灭菌时间。 3.9每次微生物试验紫外灯灭菌前，需将所用的吸头.剪刀.纱布等物品浸泡于消毒剂中。 3.10接种前所用的试管.平皿及培养基必须经消毒灭菌，打开包装未使用完毕的器皿，不能再继续使用，金属用具应高压灭菌或用酒精灯过火三次后方可使用。 3.11切忌用手直接接触标本及已灭菌的器材内部，打开瓶塞或管塞时，应夹持在手中适当位置，避免污染。使用完毕的吸管.三角瓶.样品等应及时撤离，不可随意放在洁净工作台内。 3.12微生物检验每批必须做空白.对照试验（菌落总数做1个盐水对照.1个琼脂对照，大肠菌群做单料.双料各1个琼脂空白培养，整个检验过程超净台内的环境空白），同时记录。当有菌生长时必须保留样品及时汇报，分析原因再做处理，如果空白试验不符合要求，微生物结果不能出具。 3.13每次微生物实验结束后，所有物品及时撤离无菌室，并用体积分数为0.1%的新洁尔灭溶液将超净台内清理干净，酒精灯、剪刀等物品上的样品擦拭干净，用体积分数为0.1%的新洁尔灭溶液浸手或以肥皂洗手，再用清水冲洗干净。 3.14凡要丢弃的培养物，必须进行妥善处理，培养霉菌的培养物和玻璃器皿要先高压灭菌、再洗刷干净，然后再进行灭菌处理。 3.15严格控制培养箱温度以及培养时间，对培养箱的温度每个班至少监控两次。 3.16每周进行消毒剂擦拭一次培养箱内金属孔架及内壁，再有平皿破碎的情况时必须马上进行清理消毒，防止污染。
1.目的：建立表面微生物测试标准操作规程，保证测试人员操作规范化、标准化。 2.范围：适用于洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面的微生物量的测试。 3.责任：表面微生物检测员。 4.内容： 4.1基本概念： 4.1.1菌落:细菌培养后,由一个或几个细菌繁殖而形成的一细菌集落,简称CFU.通常用个数表示。 4.1.2表面微生物： 4.1.3表面微生物菌落数: 规定面积的洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面，用接触平皿法或擦拭法检测的微生物的菌落数目，以个/皿表示。 4.2测试原理: 本测试方法利用接触平皿法或擦拭法收集洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面的微生物，经若干时间，在适宜的方法和条件下让其繁殖到可见的菌落数，以平板培养皿中的菌落数来评定洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面的微生物数，并以此来评定洁净区的洁净度。 4.3测试方法： 4.3.1使用的仪器设备和培养基: 高压消毒锅:使用时应严格按照操作规程进行。 恒温培养箱:必须定期对培养箱的温度计进行检定。 培养皿:一般采用φ90mm×15mm玻璃培养皿。使用前将培养皿置于160℃干热灭菌120min。 接触碟：一般采用φ55mm无菌接触碟。 培养基:胰酪大豆胨琼脂培养基。 将培养基加热熔化，冷却至约45℃在无菌操作条件下将培养基注入培养皿，每皿约15ml。待琼脂培养基凝固后，将培养基平皿放入32℃恒温培养箱中培养
72小时若培养基平皿上确无菌落生长即可供采样用，制备好的培养基平皿应在2-8℃的坏境中存放。 4.3.2采样点选择： 洁净区微生物测试点选择表面微生物监测的采样点数目及其布局根据以下几个方面设置： 空调系统验证的结果 房间的用途 与产品的距离 人流物流方向 如何布点：对于同一洁净区，每个相同的取样物体在其不同的地方采2个样。如墙面2个采样点，地面2个采样点，洁净区主要设备2个采样点。 注：表面微生物监测的取样点数应依下列因素确定： 1.洁净区（室）的大小； 2.设备、管路等的复杂程度； 3.生产活动的重要性； 4.易受污染的部位等。 应考虑包含以下部位：每扇门、每个门把手、地板（至少两点）、墙壁（不易被清洁/消毒的部位，至少两点）、公用介质的管路（不易被清洁/消毒部位）、生产设备的关键性部位（如灌装针、易与人员接触的塑料帘膜、胶塞筒、传输带）等。根据洁净区内设施、设备等表面对产品和洁净室环境的影响程度，通常将表面分为三类：关键表面（与产品、容器及密封件直接接触或暴露于产品、容器及密封件的表面）一般表面（如设备的外表面、墙壁等）和地板，并且分别设定不同的微生物限度要求。 表面微生物的每点取样面积宜控制在25cm2左右。为避免干扰，宜在生产活动结束后取样。 4.3.3采样方法： 洁净区表面微生物测试方法。 4.3.3.1接触平皿法： 取样：表面微生物监测用于表面菌监测，接触平皿法广泛应用。取样时，打开碟盖，无菌培养基表面与设备直接接触，均匀按压接触碟底板，确保全部琼脂表面 取样后，需要立即用75%酒精擦拭被取样表面，以除去残留琼脂。 收好的营养琼脂接触碟在32℃培养72小时。 4.3.3.2棉签擦拭法：
微生物实验室操作规程【SOP 】?细菌室工作守则（微生物室SOP 之一） ?细菌室消毒隔离措施（微生物室SOP 之二） ?微生物实验室安全与防护（微生物室SOP 之三） ?细菌室内质控制度（微生物室SOP 之四） ?细菌室操作技术规范（微生物室SOP 之五） ?无菌间规章制度（微生物室SOP 之六） ?菌（毒种）管理办法（微生物室SOP 之七） ?细菌室仪器维护保养及质控措施（微生物室SOP 之八）?标准菌株保存及使用（微生物室SOP 之九） ?细菌室内务管理规定（微生物室SOP 之十） ?标本采集及保存要求（微生物室SOP 之十一） ?室内质控失控处理程序（微生物室SOP 之十二） ?标本拒收标准（微生物室SOP 之十三） ?温度失控处理措施（微生物室SOP 之十四） ?超净工作台作业指导（微生物室SOP 之十五） ?标本的接种和移种法（微生物室SOP 之十六）
细菌室工作守则 （微生物室SOP之一） 1.每日工作前用紫外线照射实验室半小时以上。 2.入室前应穿工作服，并做好实验前的各项准备工作。 3.实验室内应保持肃静，不准吸烟、吃东西及用手触摸面部。尽量减少室内活动，以免引起风动，无关人员禁入。 4.非必要物品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。 5.做好标本的登记、编号及试验记录。未发出报告前，请勿丢弃标本。 6.标本处理及各项试验应在操作间进行，接种环用完后应立即火焰灭菌，沾菌吸管、玻片等用后应浸泡在消毒液内。 7.实验时手部污染，应立即用过氧乙酸消毒或浸于3%来苏儿溶液中5-10分，再用肥皂洗手并冲洗干净；如误入口内，应立即吐出，并用1:1000 高锰酸钾溶液或3%双氧水漱口，根据实际情况服用有关药物。 8.实验过程中，如污染了实验台或地面，应用3%来苏儿覆盖其上半小时，然后清洗；如污染工作服，应立即脱下，高压灭菌。 9.若出现着火情况，应沉着处理，切勿慌张，立即关闭电闸，积极灭火。易燃物品（如酒精、二甲苯、乙醚和丙酮等）必须远离火源，妥善保存。 10.工作结束时检查电器、酒精灯等是否关闭，观察记录培养箱、冰箱温度及工作情况，用有消毒液的抹布将操作台擦拭干净，并将试剂、
微生物实验室操作规程 1.工作人员加强有菌观念，无菌操作。 2.每日工作前用紫外线照射实验室半小时以上。 3.入室前应穿工作服，并做好实验前的各项准备工作。 4.实验室内应保持肃静，不准吸烟、吃东西及用手触摸面部。尽量减少室内活动，以免引起风动，无关人员禁入。 5.非必要物品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。 6.做好标本的登记、编号及试验记录。未发出报告前，请勿丢弃标本。 7.标本处理及各项试验应在操作间进行，接种环用完后应立即火焰灭菌，沾菌吸管、玻片等用后应浸泡在消毒液内。 8.实验时手部污染，应立即用过氧乙酸消毒或浸于 3%来苏儿溶液中 5-10分，再用肥皂洗手并冲洗干净；如误入口内，应立即吐出，并用 1:1000高锰酸钾溶液或 3%双氧水漱口，根据实际情况服用有关药物。 9.实验过程中，如污染了实验台或地面，应用 3%来苏儿覆盖其上半小时，然后清洗；如污染工作服，应立即脱下，高压灭菌。 10.使用后的载玻片、盖片、平皿、试管等用消毒液浸泡，经煮沸后清洗或丢弃。 11.所有微生物培养物，不管标本阳性或阴性均用消毒液浸泡后，经煮沸消毒，才能清洗或丢弃。 12.取材、最好采用一次性工具，不能采用一次性工具者，每次取材前均应彻底消毒。 13.若出现着火情况，应沉着处理，切勿慌张，立即关闭电闸，积极灭火。易燃物品（如酒精、二甲苯、乙醚和丙酮等）必须远离火源，妥善保存。 14.工作结束时检查电器、酒精灯等是否关闭，观察记录培养箱、冰箱温度及工作情况，用浸有消毒液的抹布将操作台擦拭干净，并将试剂、用具等放回原处，清理台面，未污染的废弃物扔进污物桶，有菌废弃物应送高压灭菌后处理。 15.离室前工作人员应将双手用消毒液消毒，并用肥皂和清水洗净。 16.爱护仪器设备，遵守仪器使用规范，经常清洁，注意防尘和防潮。每天观察培养箱、冰箱、干燥箱的温度，并做好记录。 17.发出的微生物报告应认真复审，分析报告、评价报告。
微生物检验的基本操作技术 一、无菌操作技术 1、定义 是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法； 无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。 2、内容 无菌操作技术主要包括两方面： 1）创造无菌的培养环境。包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等； 2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施。包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。 3、无菌操作原则 1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时必须穿工作服、戴工作帽，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净； 2）在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等； 3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或平皿边； 4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒； 5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处； 6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。 二、无菌操作的环境要求 1、无菌室 （1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；
微生物实验注意事项 一、无菌操作要求 1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 2.进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 3.接种食品样品时， 4.进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 5.从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 6.接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。 7.接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。 8.吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。 二、无菌间使用要求 1.无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有 0.5- 0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。
2.无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W 3.无菌间使用前后应将门关紧，紫外灯，距离在 1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 4.处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 5.在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置 三、消毒灭菌要求微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。 （一）干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法 1．灭菌前准备（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 （2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。 2．装放（1）干热灭菌器： 装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。 （2）大型高压蒸气锅： 放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。 3．设备检查（1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。
& 修订记录 修订次数修订日期修订容 Prepared by/编制者：R eviewed by/审阅者：Authorized by/批准者： ALTECH ALTECH ALTECH Date/日期Date/日期Date/日期SCMC SCMC SCMC Date/日期Date/日期Date/日期
1.0目的 确保微生物室有一个良好的环境，以便准确完成常规微生物分析实验，以对生产环境、设备的清洗消毒和人员卫生进行有效的监控。 2.0围 适合微生物实验室人员，环境卫生，设备，试剂、培养基及常规操作的各项要求及管理 3.0职责 3.1微生物品控员负责具体工作的执行。
3.2QA主任负责监督本文件的有效执行。 4.0程序 4.1人员 4.1.1微生物操作人员需要有相关的工作经验，并且具备微生物操作的基本技能，如铺平板，菌落计数，无菌操作等 4.1.2应确保微生物操作人员接受足够的微生物操作专业的培训，以保证其能独立的进行操作，准确的完成测试，并保持好记录 4.2环境 4.2.1微生物操作室配置超净工作台 4.2.2微生物操作室的墙壁，地板，天花板光滑平整无缝隙，易于清洁消毒 4.2.3工作区域里有方便使用电源，抽滤系统，便于取用培养基和实验用品 4.2.4有适当的通风条件，在空调处安装空气过滤器，确保空气质量达到10.000级，平时关闭门窗，尽量减少空气对流引起的扬尘 4.2.5微生物操作辅助区域有足够的空间处理样品，存放培养基，玻璃器皿和小型仪器设备；有空间安装固定的仪器设备（如培养箱，冰箱）等。工作区域要有充足的灯光，光强不小于3001um。实验室应保持整洁 4.2.6在进行实验前必须打开无菌室和超净工作台紫外线消毒30分钟，并且让超净工作台进入工作状态。实验室完成后及时整理和清洗台面 4.2.7实验室必须考虑实验室外环境污染的可能性，并进行有效的监控，监控的方法如下： 1.每周做一次空气的微生物测试或视实验室使用状况相应地增加测试频率。测试 方法参见空气的微生物测试 2.每天用粒子记数仪测定微生物室空气的尘埃粒子数，应达到10,000级，超过 标准时则需更换过滤器 3.每半年更换紫外线灯管，以确保紫外灯的杀菌效果 4.3卫生 4.3.1配备实验室专用服装、鞋，实验室工作服避免在实验室以外区域穿着，要定期更换，清洗，杀菌 4.3.2实验室人员要注意个人卫生，应形成经常洗手的习惯，手指甲要剪短，实验前用70%酒精消毒双手 4.3.3不得在微生物测试区域吸烟，吃，喝食品，不得在微生物室做与微生物实验无关的事情和实验
实验室操作规 本规程中列出了最基本的实验室操作和程序，他们是微生物学操作技术规的基础。在规划实验室和国家级实验室项目时，可以根据这些规程来制订实验室安全操作的书面程序。每个实验室都应该采用“安全手册”或“操作手册”，其中定义了已知的和潜在的危害，并规定了特殊的操作程序来避免或尽量减小这种危害。规的微生物学操作技术是实验室安全的基础，而专门的实验设备仅仅是一种补充，绝不能替代正确的操作规。下面列出了一些最重要的 概念。 进入规定 1、在处理危险度2 级或更高危险度级别的微生物时，在实验室门上应标有国际通用的生物危害警告标志（图1）。 2、只有经批准的人员方可进入实验室工作区域。 3、实验室的门应保持关闭。 4、儿童不应被批准或允许进入实验室工作区域。 5、进入动物房应当经过特别批准。 6、与实验室工作无关的动物不得带入实验室。 人员防护 1、在实验室工作时，任何时候都必须穿着连体衣、隔离服或工作服。 2、在进行可能直接或意外接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性的材料或感染性动物的操作时，应戴上合适的手套。手套用完后，应先消毒再摘除，随后必须洗手。 3、在处理完感染性实验材料和动物后，以及在离开实验室工作区域前，都必须洗手。 4、为了防止眼睛或面部受到泼溅物、碰撞物或人工紫外线辐射的伤害，必须戴安全眼镜、面罩（面具）或其他防护设备。 5、严禁穿着实验室防护服离开实验室，（如去餐厅、咖啡厅、办公室、图书馆、员工休息室和卫生间）。 6、不得在实验室穿露脚趾的鞋子。 7、禁止在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化妆和处理隐形眼镜。 8、禁止在实验室工作区域储存食品和饮料。 9、在实验室用过的防护服不得和日常服装放在同一柜子。 操作规 1、严禁用口吸移液管。 2、严禁将实验材料置于口。严禁舔标签。 3、所有的技术操作要按尽量减少气溶胶和微小液滴形成的方式来进行。 4、应限制使用皮下注射针头和注射器。除了进行肠道外注射或抽取实验动物体液，皮下注射针头和注射器不能用于替代移液管或用作其他用途。 5、出现溢出、事故以及明显或可能暴露于感染性物质时，必须向实验室主管报告。实验室应保存这些事件或事故的书面报告。 6、必须制订关于如何处理溢出物的书面操作程序，并予以遵守执行。 7、污染的液体在排放到生活污水管道以前必须清除污染（采用化学或物理学方法）。根据所处理的微生物因子的危险度评估结果，可能需要准备污水处理系统。 8、需要带出实验室的手写文件必须保证在实验室没有受到污染。
目录 生物安全柜操作规程及维护............................................................................错误 ! 未定义书签。实验室高压蒸气灭菌器操作程序....................................................................错误 ! 未定义书签。物体表面细菌监测. .............................................错误 ! 未定义书签。医护人员手指细菌监测. .........................................错误 ! 未定义书签。空气中细菌含量的监测. .........................................错误 ! 未定义书签。环境卫生学监测质控标准. .......................................错误 ! 未定义书签。使用中消毒剂与无菌物品保存液的质控程序. .......................错误 ! 未定义书签。一次性医疗用品微生物监测. .....................................错误 ! 未定义书签。紫外线消毒质量控制程序. .......................................错误 ! 未定义书签。污水的细菌监测(总大肠菌群) . ..................................错误 ! 未定义书签。正确洗手的手法................................................错误 ! 未定义书签。
连续加样移液器标准操作规程 1．目的 规范连续加样移液器的操作规程，确保正确使用连续加样移液器。 2．授权操作人 经培训并通过考核的检验科微生物实验室工作人员。 3．适用范围 微生物实验室连续加样移液器。 4．工作环境 相对湿度：10％～85％；运行温度：10～30℃。 5．操作程序 5.1 移液器针筒的选择和安装 5.1.1 根据移液体积，选择移液器针筒，将移液器针筒的活塞(内芯)推到最低端。 5.1.2 将移液器前下方的蓝色按钮推至最低端。 5.1.3 按住移液器下方左右两侧的蓝色按钮，将移液器针筒插入移液器主体，然后松开两个按钮，移液器上方显示窗显示数值即完成安装。 5.2 每次释放液量的调节旋转调节移液器顶部调节拨盘，显示框内显示的数字即为每次释放的液量。 5.3 吸液 5.3.1 右手握住移液器，左手拇指将移液器前面的蓝色按钮推至最低端。 5.3.2 把针筒吸头插入液体，左手将移液器前下方的蓝色按钮慢慢推至顶端，此时显示框内的数字闪动，表示尚不能准确度量释放的液量。 5.4 释放液体 5.4.1 右手拇指按一次移液器前上方的蓝色按钮，排空气泡，此时显示框内的数字不再闪动，表示已经能够准确度量释放的液量。 5.4.2 右手拇指按移液器前上方的蓝色按钮释放液体。每按一次释放的液量即为显示框显示的液量。连续释放直到显示框内显示的数字闪动，表示针筒内的液体已经不够下次释放，如需继续加样，应再次吸液。继续加样时，应将移液器前下方的蓝色按钮推至最低端排尽余液，再吸液。 5.5 移液器针筒的卸载 5.5.1 工作完毕，将移液器面前下方的蓝色按钮推至最低端，排尽余液，按住移液器下方左右两侧的蓝色按钮，卸下针筒。 5.5.2 松开两个按钮，移液器显示窗内显示的数值消失，即完