抗虫转基因植物的研究进展及前景
由害虫、真菌、病毒、细菌等有害生物因子引起的病虫害是森林树木死亡和产品减少的重要因素一个世纪以来,科学们应用常规育种的方法为林木抗性品种的选育做出许多努力,取得了不少可喜的成绩。但林木生长周期长,这是林木抗性育种工作一个最大障碍。基因工程的诞生给林木抗性育种带来了新的、突破性的方法。
林木抗病虫基因工程就是利用重组DNA技术,将抗性外源基因导入林木染色体,从而产生具有外源基因表达的转基因林木。80年代以来,随着基因分离、表达载体构建、植物遗传转化和外源基因在高等植物细胞中的表达等方面的深入研究,特别是利用真核基因启动子构建融合基因的工作解决了外源基因在植物转化细胞中的表达问题,加速了林木基因工程的进展。在近10余年里,已有20余种树木如杨树、火炬松、花旗松、白云杉、桤木、核桃、刺槐、麻栎、桉树、苹果、欧洲赤松、兰伯氏松、挪威云杉和思格曼云杉等先后进行了基因工程的研究,已获得转基因植株的有杨树、核桃、柳、松树、苹果、李和葡萄等。到目前为止,有些项目开始或已经进入商业化操作阶段。研究领域有抗虫、抗病、抗除草剂耐盐、耐高温、耐干旱、耐冻等基因工程。本文对国内外林木抗病虫基因工程的现状以及在其研究发展中存在的问题作一概述。
1 抗虫转基因植物的研究进展
害虫是林业生产上的大敌之一。化学药剂杀虫不仅成本高,且造成严重的环境污染和食品中的残毒。人们很早就知道可以利用生物防治的方法来控制虫害。现在利用基因工程可以有效地达到这个目的。目前,人们已从细菌、植物本身及昆虫体内发现并分离到许多抗虫基因,有的已导入植物获得了抗虫转基因植株。目前,研究的抗虫基因有以下几方面。
1.1苏云金杆菌毒蛋白基因
苏云金杆菌(Bacillusthurigiensis简称Bt)制剂长期以来用于多种害虫的生物防治,因其产生大量的伴胞晶体蛋白对昆虫幼虫有很强的毒杀作用。伴胞晶体由具有高度特异性杀虫活性的结晶蛋白组成。根据毒蛋白基因的序列同源性和它们编码蛋白的抗虫谱,可划分为四大
类及若干小类。类型Ⅰ(CryⅠ)对鳞翅目:类型Ⅱ(CryⅡ)对鳞翅目和双翅目:类型Ⅲ(CryⅢ)对鞘翅目:类型Ⅳ(CryⅣ)对双翅目有特异毒性。最近几年中,还发现类型Ⅴ(CryⅤ)既对鳞翅目又对双翅目有特异性。
首次报道获抗虫基因植株是在1987年,比利时Mentagn实验室的Veack等人,用CryⅠA[b]基因与NPTⅡ基因融合,转化烟草,结果得到转基因烟草植株。同年,美国MonsantoAgra-cetus和Agrige-netic公司分别获得抗虫转基因蕃茄和烟草植株。这些植株在实验室条件下用烟草天蛾幼虫检测抗虫性,结果证明虽有一定的抗虫性,但都难以或几乎检测不到晶体蛋白的表达。经分析,主要原因是在杀虫晶体蛋白的基因的编码区内有一些特殊序列存在,使杀虫晶体蛋白基因在植物体内转录后加工的效率不高,mRNA转运过快造成mRNA不稳定,或因含量过低而检测不到全长的mRNA。在国内,中国农业科学院生物技术研究中心、中国科学院微生物研究所、中国科学院上海植物生理研究所等单位,在80年代中后期,也将Bt杀虫晶体蛋白基因CryⅠA、CryⅠC 等基因进行了克隆和序列分析,并将3′端缺失基因导入水稻、棉花、烟草和甘蓝等,得到转基因植株。经生物杀虫检测,杀虫性与国外报道的基本相同。
1989年,Murray等人发现了Cry基因中存在着许多不稳定元件。因此,人们又把注意力集中在人工改造和人工合成Bt杀虫晶体蛋白基因上,Palak等部分改造了野生型的CryⅠA[b]基因序列,得到PmCryⅠA[b],转化烟草和蕃茄得到抗虫基因植株,其表达量提高了10倍。人工合成基因是将B杀虫体蛋白结构中的所有不稳定元件,几乎全部换掉。合成基因称为FmCryⅠA[b],在转基因植株内表达量提高30-100倍或更高。1991年开始,郭三堆等在国内首先合成了CryⅠA杀虫晶体蛋白结构基因,此后田颖川、白永延等也先后合成和部分改造了CryⅠA 基因,并导入烟草、甘蓝和棉花获得抗虫转基因植株。现在国内外利用修饰、改造、部分及全合成的Cry基因转化植物,得到抗虫转基因植物已达25种以上,取得了突破性进展。
在此基础上,林木抗性基因工程工作也同时开展起来。1990年中国农业科学院范云六等成功地将对鳞翅目昆虫有毒性的Bt毒蛋白基因用根癌农杆菌导入欧洲黑杨获得转基因植株。1991年McownB.H 等人利用电激法将抗虫Bt基因导入银白杨×大齿杨和欧洲黑杨×毛果杨杂种中,前者获得抗虫转基因植株。美国威斯康星大学等单位,已成功地将抗虫Bt基因与蛋白酶抑制剂基因导入云杉中,有效地防止了
卷叶蛾的危害。1994年KleinerK.W等人获得抗枯叶蛾毛虫和吉卜赛蛾的转基因杂种杨(NC5339)无性系。同年ShinD.I等将Bt基因转入欧洲落叶松,通过Southern,Northern和Westernblot分析以及生物测定证明该基因已得到表达。中科院上海植生所和南京林业大学合作,将Bt 基因导入毛白杨和美洲黑杨×小叶杨无性系NL-80106。中科院微生物所对Bt基因的5′端和3′端进行改造,构建了带有双转录的增强子,并植入翻译增强子TMV的Ω片段的中间载体,分别将有四种不同缺失长度的Bt基因载体,即含全长基因3·6kb、2·8kb、2·1kb和1·8kb 转入农杆菌LBA4404,并与中国林科院合作转化欧洲黑杨共获得54棵转基因植株,SouthernBlot证明该基因稳定地插入到杨树基因组中,虫试测定表明,其毒杀鳞翅目害虫舞毒蛾和杨尺蠖的能力高达76-100%。后来中国林科院又把上述Bt基因导入欧美杨和美洲黑杨,成功地获得转Bt基因抗叶部害虫植株。WangGejiao等也成功地获得转Bt基因的黑杨植株,经2~3年的抗虫测定和优良性状选择,有3个无性系即12、153和192在中国6个省种植进行评估。1998年Son-SukGyu等在杂种杨转基因研究时,发现PEHA101载体比LBA4404/PB121效率高达6倍。到目前为止,有表达Bt基因的树种有杨树、苹果、核桃、落叶松、花旗松、火炬松和云杉等。
1.2蛋白酶抑制剂基因
蛋白酶抑制剂(PI)是自然界含量最为丰富的蛋白种类之一,存在于所有生命体中。植物中存在三类,它们是丝氨酸蛋白酶抑制剂、疏基蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。前者与抗虫关系密切,疏基蛋白酶抑制剂对鞘翅目昆虫具有独特抗性。它们的杀虫机理就在于,它能与昆虫消化道内的蛋白消化酶相互作用,形成酶—抑制剂复合物(E Ⅰ),阻断或减弱消化酶的蛋白水解作用,所以影响外来蛋白的正常消化,同时它刺激消化酶的过量分泌,通过神经系统反馈,使昆虫产生厌食反应,最终造成昆虫的非正常发育或死亡。
目前,已有多种蛋白酶抑制剂基因或cDNA被克隆,并得到一批转基因植株,转基因植株表现出良好的抗虫效果,尤其是丝氨酸类蛋白酶抑制剂中的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CPTⅠ)和马铃薯蛋白酶抑制剂—Ⅱ(PⅠ—Ⅱ)。豇豆胰蛋白酶抑制剂具有广谱抗虫性,纯化的CPTⅠ对鳞翅目、鞘翅目及直翅目的害虫有毒性。1987年英国的Hilder首先获得转CPTⅠ基因烟草植株。刘春明等对鉴定出的转基因植株,用2—3龄的棉铃虫进行抗虫测试,4天后死亡率达50%,存活的虫生长发育也
明显受到了抑制。中科院遗传所对CPTⅠ基因转化杨树,也获得成功。在随后几年中,美国、英国和中国研究人员相继把CPTⅠ基因转入一些重要的经济植物中,包括苹果和杨树。PⅠ—Ⅱ是一类损伤诱导型表达的基因产物,主要成分是丝氨酸蛋白酶抑制剂。1988年美国依阿华大学林学系在林木方面首先利用PⅠ—Ⅱ基因,以根癌农杆菌Ti质粒为载体对杨树杂种无性系NL5339进行转化,获得卡那霉素植株。
蛋白酶抑制剂基因在抗性基因工程中突出的优点是抗虫谱广,对几个目的昆虫均有毒性作用,而Bt基因抗虫谱却十分有限;其次,它来自植物本身,比来源于细菌的转基因产品更易于被公众接受。问题在于,基因表达量还远远达不到要求,这给基因工程带来一定的难度。
1.3其它
淀粉酶抑制剂(aAl)、外源凝集素(Lectin)、几丁质酶(Chitinase)、核糖体失活蛋白(RIP)等基因也是丰富的抗虫基因,在基因工程中发挥作用。ALtabella等把菜豆aAl编码和种子特异性表达的蚕豆植物血凝素基因及其调控区融合在一起,插入到Ti质粒表达载体中转化烟草,发现aAl基因能稳定地表达。在Lectin基因转化方面,Maddock(1990)用基因枪转化玉米胚性悬浮细胞系获得成功,转化的植株对欧洲玉米螟具良好的抗性。此外还成功地将豌豆外源凝集素基因导入烟草和马铃薯,抗蚜虫效果明显。目前,在林木方向未见报道。应当指出,这些工作刚刚开始不久,获得的转基因植株是否对人、畜无害还有待进一步证实。
2抗虫转基因植物的研究前景
基因工程为林木抗病虫开辟了一条诱人的新的育种途径。林木生长周期长,用常规育种方法不仅时间长,见效慢,而且可操作性差。应用基因工程进行林木抗病虫育种有其显著的优越性,它可以大大地缩短育种周期,又可在基因水平上改造林木抗性遗传物质,更具科学性和精确性,提高了育种的目的性和可操作性。此外,还大大地扩大了育种的范围,打破物种之间的生殖障碍,实现基因的共同性。所以,只要我们面对存在的问题,加大研究投入,并有效地与常规的林业技术措施相配合,必将会培育出更多有价值的抗病虫基因工程树木。
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基因工程技术的现状和前景发展 摘要 从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。 基因工程应用于植物方面 农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。?在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战，耐涝、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种(系)也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增长，从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来，导入植物体可获得转基因植物，目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中。?随着生活水平的提高，人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明，利用基因工程可以有效地改善植物的品质，而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域，近几年利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展，如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获取蛋白质合成基因，成功地导入到马铃薯中，培育出高蛋白马铃薯品种，其蛋白质含量接近大豆，**提高了营养价值，得到了农场主及消费者的普遍欢迎。在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究。? 基因工程应用于医药方面 目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。?目前，应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。由中国、美国、德国三国科学家及中外六家研究机构参与研制的专门用于治疗乙肝、慢迁肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的体细胞基因生物注射剂，最终解决了从剪切、分离到吞食肝细胞内肝炎病毒，修复、促进肝细胞再生的全过程。经4年临床试验已在全国面向肝炎患者。此项基因学研究成果在国际治肝领域中，是继干扰素等药物之后的一项具有革命性转变的重大医学成果。 基因工程应用于环保方面
生物与环境工程学院课程论文 转基因作物的研究进展 学生姓名：魏斌聪 学号：200806016139 专业/班级：生物工程081班 课程名称：生物工程原理 指导教师：陈蔚青教授 浙江树人大学生物与环境工程学院 2011年5月
转基因作物的研究进展 魏斌聪 （浙江树人大学生物与环境工程学院生工081班浙江杭州310015） 摘要：人们将所需要的外源基因(如高产、抗病虫害优质基因) 定向导入作物细胞中, 使其在新的作物中稳定遗传和表现,产生转基因作物新品种, 是大幅度提高作物产量的一项新技术。本文先描述了转基因作物的发展进程，对其基因问题的研究作了讨论，并列出转基因作物目前存在的主要问题并作分析，最后对此项技术作出展望。 关键词：转基因作物；DNA技术；基因导入；安全性 前言 转基因植物（transgenic plant），是指基因工程中运用DNA 技术将外源基因整合于受体植物基因组、改变其遗传组成后产生的植物及其后代。转基因植物的研究主要在于改进植物的品质，改变生长周期等提高其经济价值或实用价值。[ 1 ]其主要范围是在作物方面，如可食用的大豆、玉米等，或者可投入生产的棉花等作物。 从表面上看来，转基因作物同普通植物似乎没有任何区别，它只是多了能使它产生额外特性的基因。从1983年以来，生物学家已经知道怎样将外来基因移植到某种植物的脱氧核糖核酸中去，以便使它具有某种新的特性：抗除莠剂的特性，抗植物病毒的特性，抗某种害虫的特性。[ 2 ]这个基因可以来自于任何一种生命体：细菌、病毒、昆虫等。这样，通过生物工程技术，人们可以给某种作物注入一种靠杂交方式根本无法获得的特性，这是人类9000年作物栽培史上的一场空前革命。[ 3 ] 1 转基因作物的发展进程 转基因作物的研究最早始于20世纪80年代初期。1983年，全球第一例转基因烟草在美国问世。1986年，首批转基因抗虫和抗除草剂棉花进入田间试验。1996年，美国最早开始商业化生产和销售转基因作物(包括大豆、玉米、油菜、
植物转基因技术 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
生物工程的导论论文之植物转基因技术 生物1002班郭雅莉 201041006 摘要：目前，转基因技术已经成熟，转基因作物已进入产业化阶段，而且种植面积逐年扩大，呈直线上升趋势。世界上已通过转基因技术培育出许多产量高、品质好、抗性强的农作物新品种，生物技术产品已应用到医药，保健食品和日化产品等各个方面，生物制药产业已成为最活跃，进展最快的产业之一。为此，我将对植物转基因技术及其应用、和当代社会发展的概况进行系统阐述，同时对转基因食品的安全性问题进行系统的讨论。 关键词：国际状况转基因技术应用安全性问题 自1983年美国在世界上首次获得转基因烟草以来，植物转基因技术得到了迅速发展，在世界范围内得到了广泛的应用人们将以转基因技术为核心的生物技术上的巨大飞跃誉为第二次“绿色革命”。植物转基因技术巨大的生产潜力将为人类带来很大的经济效益和社会效益，并将辐射性地影响人类社会、经济、技术、生活、思想等方面的发展。 然而由于人们最初对转基因技术的认识不足或不理解，以至对转基因技术存在不同的态度和看法甚至偏见，使植物转基因技术面临着不少冲击。在20世纪末，转基因作物的安全性就在全球范围内引起了激烈的争论，反对者认为转基因作物具有很大的潜在危险，可能会对人类健康和生存环境造成威胁。在欧洲，转基因作物曾被一些媒体称之为“恶魔食 品”[1]。 一、国际植物转基因技术状况简介 转基因技术已在多种植物上获得成功，转基因的棉花、大豆、玉米、水稻、烟草、番茄、油菜等重要粮食作物和经济作物已作为商品投入市场。其进入田间实验的种类不断增加，除转基因粮食作物之外，转基因蔬菜、瓜果、牧草、花卉、林木及特用植物数量逐渐增加，基因种类和来源日益丰富，转基因性状日趋多样复杂。 在所涉及的转基因方法中，农杆菌介导法占50种，基因枪轰击法24种，DNA直接转移法2种，电击介导法2种，化学介导法1种[5]。已把一
蛋白酶抑制剂基因及转基因植物研究进展 摘要： 植物蛋白酶抑制剂是除Bt之外又一个愈来愈研究较多的抗虫基因资源，其分布广泛，在豆科、茄科、禾本科、葫芦科及十字花科等植物中存在较多。植物蛋白酶抑制剂抗虫基因主要通过2种途径获得并在多种植物中进行转化，获得抗虫转基因植株。植物蛋白酶抑制剂在基因工程中的应用已有很大的发现进展。 关键字：蛋白酶抑制剂基因作用机理转基因 正文： 一蛋白酶抑制剂作用机理 广泛存在于植物组织中的蛋白酶抑制剂是一种多肽物质, 对许多昆虫有防 卫作用。该基因及其编码区域较小、没有内含子。研究表明, 这些蛋白酶抑制剂在植物对危害昆虫以及病原体侵染的夭然防御系统中担当着重要角色。昆虫饲喂实验发现, 某些纯化的蛋白酶抑制剂具有明显的抗虫作用。利用蛋白酶抑制剂基因来提高植物的抗虫能力, 已成为植物基因工程研究的一个热门领域。在植物中发现有三类蛋白酶抑制剂: 丝氨酸蛋白酶抑制剂, 琉基蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中对丝氨酸类蛋白酶抑制剂的研究最为透彻, 目前在植物中至少已经发现有6 个家族, 其中的弧豆胰蛋白酶抑制剂, 马铃薯蛋白酶抑制剂兀的抗虫效果最为理想。蛋白酶抑制剂的杀虫机理蛋白酶抑制剂杀虫的机理在于: 它能与昆虫消化道内的蛋白消化酶相互作用形成酶抑制剂复合物( E l ) 阻断或减弱消 化酶的蛋白水解作用。所以, 一旦昆虫摄食进蛋白酶抑制剂, 就会影响外来蛋白的正常消化, 同时, 蛋白酶抑制剂和消化酶形成E l 复合物, 能刺激消化酶的过 量分泌, 通过神经系统的反馈, 使昆虫产生厌食反应。由于蛋白酶抑制剂抑制了昆虫的进食及消化过程, 不可避免地将导致昆虫缺乏代谢中必需的氨基酸, 最终造成昆虫的非正常发育或死亡。 二植物蛋白酶抑制剂基因作用机理及获得的途径 蛋白酶抑制剂基因的作用机理及其应用蛋白酶抑制剂( P l ) 是自然界含量 最为丰富的蛋白种类之一, 存在于所有生命体中。国内外有关抗虫的植物蛋白酶抑制剂基因的获得大多通过2种途径。一种通过从植物不同部位的组织或细胞中提取抗虫活性蛋白，然后分析其起作用的活性核苷酸序列，继而克隆和转化到寄主细胞，进行筛选和选育抗虫树种。利用该方法获得抗虫树种的研究越来越多，该方法中最为关键的环节是蛋白酶抑制剂提取和活性测定方法的选择和建立。植物蛋白酶抑制剂分离和纯化的策略主要依据不同植物中的蛋白酶抑制剂生理生
作物转基因技术的研究进展 摘要：作为生物技术领域的前沿，转基因技术已在多种植物上取得重大进展。本文主要介绍了当前作物转基因技术的三大主流方法：农杆菌介导法、基因枪介导法和花粉管通道法，并阐述了这几种转基因技术在水稻、小麦、棉花、玉米、大豆，甘薯等几种主要农作物的应用进展状况。 关键词：转基因技术、农作物、应用 Genetically Modified---转基因，简称GM，是指运用科学手段从某种生物体中提取所需要的基因，将其转入另一种生物中，使与另一种生物的基因进行重组，再从结果中进行数代的人工选育，从而获得特定的具有变异遗传性状的物质。而其衍生出的转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改造生物的目的，即把一个生物体的基因转移到另一个生物体DNA中的生物技术。 1983年比利时科学家Montagu 等人和美国Monsanto 公司Fraley等人分别将T- DNA上的致瘤基因切除并代之以外源基因,获得了世界上第一株转基因植株———转基因烟草。自此之后，作物转基因技术得到了迅速发展.截至目前,几乎所有的作物都开展了转基因研究,育种目标涉及到高产、优质、高效兼抗性及多用途等诸多方面.一批抗病、抗虫、抗逆、抗除草剂等转基因作物已进入商品化生产阶段. 国际农业生物技术应用服务组织2 月13 日在京发布的1 份报告显示，全球27 个国 家超过1800 万农民，2013 年种植转基因作物，种植面积比2012 年增加了500 万公顷。此外，首个具有耐旱性状的转基因玉米杂交品种亦于2013 年在美国开始商业化。 据该报告显示，全球转基因作物的种植面积于转基因作物商业化的18 年中增加了100 倍以上，从1996 年的170 万公顷增加到2013 年的1.75 亿公顷，其中美国仍是全球转基因作物的领先生产者，种植面积达7010 万公顷，占全球种植面积的40%。国际农业生物技术应用服务组织创始人兼荣誉主席、本年度报告作者Clive James 表示，目前排名前10 位的国家种植转基因作物的面积均超过100 万公顷，这为将来转基因作物的多样化持续发展打下了广泛基础。在种植转基因作物的国家中，有19 个为发展中国家，8 个为发达国家；发展中国家的种植面积连续2 年超越发达国家。 目前，作物遗传转化的方法有农杆菌介导法、基因枪法、电激法、PEG 法、脂质体法、低能离子束法、超声波介导法、显微注射法、花粉管通道法等.但在当前作物基因工程研究中,主要采用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法,这三种转基因技术也相对较为成熟. 一、农杆菌介导法 农杆菌介导法是指农杆菌侵染植物时，受到植物受伤后释放的酚类物质的刺激，活化质粒上Vir 区基因的表达，将质粒上的另一段DNA（T-DNA）共价整合到植物基因组上，在植物体内表达而改变植物的遗传特性。农杆菌介导法的转化效率受众多因素影响，如农杆菌侵染外植体的影响因素、外植体再生能力的内在因素和环境条件（pH、温度和光照条件）等[32]，此法具有流程简单、仪器设备便宜、拷贝数低[33]，且基因沉默少，转移的基因片段长等优点。 农杆菌介导法是获得第一个转基因植物的方法，迄今为止，农杆菌介导法获得的转基因植物占转基因植物总数85%，已成为植物基因转化首选方法。 二、基因枪介导法 基因枪法又称微弹轰击法，是将外源基因包裹在直径1~2 nm的钨或金颗粒表面，加速轰击植物外植体靶组织，穿过植物细胞壁和细胞膜而将外源基因带入植物细胞。因此，通过该方法进行DNA的转移过程不受外植体基因型的限制，可以将外源基因转移至几乎所有的植物细胞、组织器官和原生质体中。 最早的基因枪是由美国Cornel 大学的Sanford 等在1987 年研制成功的。目前基因枪介
课程名称：转基因植物及其生物安全性主讲教师：曹前进 学号 2010212569 姓名凌泽广成绩： 谈谈学习本课程后的心得及有关转基因 争论的看法 摘要：从2012年2月15日开始本学期“转基因植物及其生物安全性”的第一堂课，到即将结束于6月13日的最后一堂课，在这段时间里，我没有翘过一节课，在曹老师的指引下，我深刻的学习并了解了许多关于转基因的知识，不仅如此，也锻炼了我上课时积极思考的能力以及增添了敢于发言的勇气。对有关于转基因的利弊争论，我也有了自己的看法。我坚信，在未来的世界里，随着人们的需要，很多有限资源都满足不了，而唯有靠着科技的力量解决一系列随之产生的需要。 关键词：转基因植物心得争论 本文我将会从俩个方面进行解读，第一，关于学习本课程后的心得；第二，对于有关转基因争论，我提出了些自己的看法。 （一）学习本课程后的心得 在选修这门课之前，我完全是因为它是上午的第一节课，在有些人眼中，也许不会选择在上午的第一节课，因为好多人在早上是不愿意起床的，他们更愿意选择在床上度过自己美好的早晨，而我却认为，学习应该就从早上开始，因此在周一至周五的第一节课里，我都是有课程安排的。早上也是一天中最清醒的时候，我庆幸自己选修了这门课程，更加庆幸的是有一个好老------曹老师。 尽管从第一节课里面的位置坐得满满，到以后上课的稀稀疏疏，但这丝毫没有削落我对这门课程的喜爱，我只能说，他们不来上课是他们的损失，因为他们没有了解到曹老师的课堂是多么的有意思。她不仅给大家时间在课堂里讲解自己感兴趣的话题，还组织我们辩论，那次的题目是化学合成剂（如农药）弊大于利，还是利大于弊。大家查阅资料后，在课堂里纷纷得提出自己的见解，从各个角度进行阐述，大家讨论激烈，但这也没有影响我们课后的朋友关系。 每次上课的时候，我都坐在第二排的位置，好像那已经成为了我的专座，也许是因为大家都不喜欢坐在前面吧，这样也好，上课我就可以听老师讲得更清楚了。几乎每节课，老师都会提前十几分钟到达教室，当我发现还没有多少人来时，老师就已经把多媒体打开了。我觉得老师用实际行动在告诫我们这些年轻人，一天之计在于晨。老师在上每堂课之前，我都可以感受到老师准备了很长时间。她的认真负责的教学态度，值得我去学习！ 我清晰的记得，老师在讲各种各类的花时，列举了很多花的图片，然后让我们一一识别，老师的讲解弥补了我有些关于生活中常见的花的知识。老师还顺便提到了华师目前开放的石楠花，还跟我们解释了石楠花为什么有一种臭味。我也清晰的记得，老师在讲解各种转基因食品时，给我们阐述了我国现阶段是用于商业用途的转基因植物，她还让我们自己去商店里寻找一些关于添加了转基因植物的食品。我还清晰的记得，老师给我们讲解各种疾病时，提到了狂犬病（又叫恐水症），然后她也解答了我的一些疑问。因为在小时候我也被狗咬过，但并没有出血，只是有点痕迹，然后老师告诉我那并不会影响你今后的生活。我还清晰的
植物叶绿体基因工程发展探析(一) 摘要从叶绿体的概念、转化优点、转化主要过程及方法等方面概述了叶绿体基因工程的发展情况,介绍了叶绿体基因工程的应用,包括提高植物光合效率、合成有机物质、生产疫苗、增强植物抗性及在系统发育学中的应用等,并提出叶绿体基因工程存在的问题,对其未来发展进行了展望。 关键词植物叶绿体;基因工程;发展;应用;存在问题;展望叶绿体作为植物中与光合作用直接相连的重要细胞器,其基因组的功能也因此扮演着十分重要的角色。1882年Straburger观察到藻类叶绿体能分裂并进入子代细胞;1909年Baur和Correns通过在3种枝条颜色不同的紫茉莉间杂交得出,质体是母本遗传的。人们便开始对叶绿体遗传方面产生了浓厚的兴趣1]。1988年Boynton等首次用野生型叶绿体DNA转化了单细胞生物衣藻突变体(atPB基因突变体),使其完全恢复光合作用能力,标志着叶绿体基因工程的诞生2]。叶绿体基因工程作为一种很具有发展前景的植物转基因技术,在植物新陈代谢、抗虫性、抗病性、抗旱性、遗传育种等方面都将有着越来越重要的意义。 1叶绿体基因工程概述 1.1叶绿体简介 叶绿体是植物进行光合作用的重要器官,是一种半自主型的细胞器,能够进行自我复制,含有双链环状DNA。叶绿体DNA分子一般长120~160kb。叶绿体DNA有IRA和IRB2个反向重复序列(分别位于A链和B链),两者基因大小完全相同,只是方向相反,它们之间有1个大的单拷贝区(大小约80kb)和1个小的单拷贝区(大小约20kb)。 1.2叶绿体基因组转化优点 叶绿体基因具有分子量小、结构简单、便于遗传的特点,故相对于传统的细胞核遗传更能高效表达目的基因,这是因为叶绿体基因本身拥有巨大的拷贝数3]。叶绿体基因可实现外源基因的定点整合,避免位置效应和基因沉默;遗传表达具有原核性;安全性好,叶绿体属于母系遗传,后代材料稳定;目的基因产物对植物的影响小。利用叶绿体基因转化的这些优点,可以加快育种速度和效率,节约育种时间。 1.3叶绿体转化的主要过程 叶绿体转化过程通常分4步:一是转化载体携带外源目的基因通过基因枪法或其他转化体系导入叶绿体;二是将外源表达框架整合到叶绿体的基因组里;三是筛选具有转化的叶绿体细胞;四是继代繁殖得到稳定的叶绿体转化植物4]。 1.4叶绿体转化的主要方法 依据叶绿体转化的主要过程,生物学家相应地研究若干种叶绿体基因转化的方法,其中常用的叶绿体转化方法:一是微弹轰击法。将钨粉包裹构建完整的质粒载体,用基因枪轰击植物的各种组织、器官,然后对重组叶绿体进行连续筛选,不断提高同质化水平,最后获得所需的转基因植株5]。二是农杆菌T-DNA介导的遗传转化法。将外源目的基因、选择标记基因等构建到农杆菌的Ti质粒上,然后通过与植物组织或器官共培养,最后把所需外源基因转化到叶绿体并获得表达。三是PEG处理法。只需将构建好的质粒(含外源基因、标记基因、同源片断、启动子、终止子等)在一定的PEG浓度下与植物原生质体共培养。 2叶绿体基因工程的应用 2.1提高植物光合效率 植物的光合效率非常有限,太阳能的很小一部分可以转化为植物所需要的能量,从而转变为人类需要的产品。植物光合效率取决于Rubisco酶的丰富度。Rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制CO2合成。人们可以通过2种直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循环过程;二是提高酶的特性,减少光呼吸浪费的能量6]。很多科学家正试图通过提高Rubisco酶来提高植物的光合效率,而其中拟南芥和水稻的定点整合试验取得了重大突
植物抗虫基因工程研究进展 摘要植物抗虫基因工程为防治农业害虫提供了一条崭新途径。本文对植物抗虫基因工程近年来所取得的某些研究进展，包括目前已发现和利用的抗虫基因、提高抗虫基因在植物体内表达的方法以及防止或延缓害虫产生抗性的策略等方面进行了综合评述，并对植物抗虫基因工程中有待解决的问题和发展前景提出了自己的看法。 关键词植物，抗虫基因，基因工程 虫害是造成农业减产的重要原因。据统计，各种作物因虫害而遭受的经济损失平均达30％以上。化学农药和生物农药的使用虽然可以减轻害虫对农作物的危害，但长期而大量的使用农药已使害虫产生了极高的抗性。同时，化学农药的过量使用，还带来了严重的人畜中毒和环境污染等问题。植物抗虫基因工程的诞生，为防治害虫提供了一条崭新的途径。由于该方法具有安全、有效、可降低投资和减少环境污染等诸多优点，因而，自1987年首次报道抗虫转基因植物以来，植物抗虫基因工程的研究取得了迅猛发展。一方面，已经发现了大量可利用的抗虫基因，并有40多种抗虫基因已被导入植物体。另一方面，对于如何提高抗虫基因的表达以及防止害虫产生抗性的问题日益受到重视，并进行了多方面研究，已经取得许多重要的研究成果。本文试图对上述几个方面的进展作一综述。 ⒈微生物来源的抗虫基因 苏云金芽孢杆菌的毒蛋白（简称Bt-toxin)基因是目前世界上应用最为广泛的抗虫基因，Bt-toxin是是苏云金芽孢杆菌在孢子形成时期所产生的一种杀虫毒素，是一类分子量为130~160KD的蛋白质。当被昆虫吞食后，在昆虫中肠碱性环境下，经蛋白酶的作用Bt-toxin 被讲解产生的60KD左右的毒性小肽，并和中肠上皮细胞纹缘膜上的受体特异结合，然后插入细胞膜造成细胞膜穿孔，破坏细胞内外的渗透平衡，导致细胞膨胀而裂解，使得昆虫停止取食并最终死亡。 第一个Bt-toxin基因是1981年由Schnepf和Whiteley分离克隆的，到目前为止，已经有近180个不同的Bt-toxin基因被克隆和测序，并且新的Bt-toxin基因还在不断的被克隆和分析。根据Crickmore等人（1998）所提出的新的命名法则，这些已克隆的基因被划分为30大类，不同的Bt-toxin基因具有不同的杀虫谱。截止1999年7月，在所发现的Bt-toxin基因中，已有40余种获得了专利。 自第一次分离克隆到Bt-toxin基因以后，人们一直在试图将该基因转移进植物体并实现表达，以获得能够抗虫的转基因植物。1987年，世界上有四家实验室首次获得了转Bt-toxin基因的烟草或番茄（Barton等，1987；Fischhoff等，1987；Hilder等，1987；Vaeck 等，1987）。由于所用的基因是完整的野生型Bt-toxin基因或截短了3’端的野生型基因，所获得的转基因植株抗虫性都很弱，在转基因植物中毒蛋白的表达量只有0.001％或几乎检测不到毒蛋白的表达。进一步的研究发现，Bt-toxin基因在植物体内表达量过低是由于野
国家转基因植物研究与产业化专项 课题申请指南 为充分发挥科学技术第一生产力作用，依靠科技进步加速我国农业结构调整，提高农业整体效益，增加农民收入、加快实现转基因植物研究及其产业化进程、提高我国农业国际竞争力，科技部决定启动“国家植物基因研究中心”、“国家转基因棉花中试与产业化基地”、“转基因林草新品种培育与示范”等项目的申报工作，特制定本指南。 第一章申请须知 一、申请要求 （一）申请范围与组织申报原则 1、“国家植物基因研究中心”项目由2000年初步进行论证的上海、广州、北京和武汉4家单位分别申请，其所在省、直辖市科技厅（科委），国务院有关部门科技司为该项目申报组织单位。各组织单位只准上报一份，组织单位应提出申报意见，并由省、部级政府部门推荐。 2、“国家转基因棉花中试与产业化基地”项目由主产棉区有关省、自治区、直辖市、新疆建设兵团科技厅（科委）为申报组织单位，并根据指南要求，组织区域内专业研究单位进行申报。各组织单位只准上报一份，组织单位提出申报意见，并由省级人民政府推荐。 3、“转基因林草新品种培育与示范”项目由各有关省、自治区、直辖市科技厅（科委），国务院有关部门科技司为申报组织单位，根据指南要求组织本地区（部门）有关单位进行申报。 （二）具体要求 1、申报工作自本公告公布之日起开始，欲申报单位必须根据《申请指南》要求参与申报活动。 2、申请单位所在省（自治区、直辖市、新疆建设兵团、国务院有关部委）和申请单位应按国拨经费的1：1提供配套资金。申请单
位可以通过企业投资、银行贷款等方式（必须出据证明）自筹部分经费。国拨经费的使用按《国家转基因植物研究与产业化专项暂行管理办法》有关规定执行。 3、寄送申请文件的截止日期为2002年9月25日，逾期到达的申请文件恕不接受。 （三）项目实施期限 本项目实施年限为2年。 （四）申请人资格 凡在中华人民共和国境内注册，在上述申请范围之内，具有独立法人资格的事业单位均可根据《申请指南》的要求申请。 二、申请文件的编制 1、申请文件编写 以中文编写，语言要求精练，所提供的数据真实、可靠。 2、申请文件的格式要求 所提供的申请文件一律用A4纸装订。 3、申请文件构成 ——申请函 ——申请人资格审查文件 ——申请书 ——附件 三、申请文件的递交 1、申请书及有关资料应有法定代表人（或委托授权人）签字并加盖公章，全部申请文件须包装完好，并注明申请项目、申请单位名称、地址、邮政编码、电话及联系人。 2、申请文件一式10份，正本1份，副本9份，在每份申请书上要注明正本和副本，正、副本分别封装，并在封面上注明。一旦正本和副本不符，则以正本为准。 3、递交申请文件的截止日期为2002年9月25日。 4、“国家植物基因研究中心”项目申请文件寄送地点为：中国生物工程开发中心。 地址：北京市海淀区皂君庙乙七号（北京8118信箱)
关于植物转基因技术的一些读书报告 在生物工程导论课上，我了解到了一些关于植物转基因技术的知识，对此产生了浓厚的兴趣，加上自己的专业在以后会有这方面的学习和发展，所以查阅了一些相应的资料，有了一些感想。 世界上首次使用植物转基因技术是1983年美国获得了转基因烟草，自 此以后，植物转基因技术得到了迅速发展，在世界范围内得到了广泛的应用。目前，转基因技术已经成熟，转基因作物也已进入产业化阶段，而且种植面积逐年扩大，呈直线上升趋势。植物转基因技术主要应用于农业，生物和医学等领域。进行植物品种的改良，新品种的培育以及作为生物反应器生产生物药物和疫苗等。世界上已通过转基因技术培育出许多产量高、品质好、抗性强的农作物新品种，生物技术产品已应用到医药，保健食品和日化产品等各个方面，生物制药产业已成为最活跃，进展最快的产业之一。因此，人们将以转基因技术为核心的生物技术上的巨大飞跃誉为第二次“绿色革命”。这次技术革命将使全球农业生产发生深刻的变革，使人们看到消除饥饿与贫穷的希望。植物转基因技术巨大的生产潜力将为人类带来很大的经济效益和社会效益，并将辐射性地影响人类社会、经济、技术、生活、思想等方面的发展。 但是，像其它新生事物的发展过程一样，由于人们最初对转基因技术的认识不足或不理解，以至对转基因技术存在不同的态度和看法甚至偏见，使植物转基因技术面临着不少冲击。在20世纪末，转基因作物的安全性问题 就在全球范围内引起了激烈的争论，反对者认为转基因作物具有很大的潜在危险，可能会对人类健康和生存环境造成威胁。在欧洲，转基因作物曾被一些媒体称之为“恶魔食品”。甚至当前，一些电视、广播、报纸等新闻媒体为了某些利益也对公众进行炒作和误导，夸大转基因作物的风险，使人们对转基因技术及其转基因食品由最初的争论演变为恐慌甚至存在一定的抵触 情绪。如某电视广告中所提到的：某某食用油，不含转基因成分，为健康加油；某网站新闻报道：湖北某超市惊现转基因大米等等，使人们对当前社会上对转基因技术存在的一些偏见。 在此我希望可以尽量避免偏见，对植物转基因技术的应用和当代社会发展的概况进行一些比较系统的阐述，对植物转基因技术与当代社会发展的关系进行一点探讨。 植物转基因技术的基本概念和原理 基因是生命体具有的特定遗传信息和遗传效应的核苷酸序列，存在于DNA （脱氧核糖核酸）上，是控制生物性状遗传的结构和功能单位。转基因是指利用分子生物学手段，将人工分离和修饰过的某些生物的基因转移到其它物种，以改造该物种的遗传特性。植物转基因技术又称植物基因工程，是把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因转移到植物的基因组中，即对植物进行遗传转化，使其在性状、营养和消费品质等方面满足人类需要的技术。应用转基因技术构建的植物为转基因植物，又叫基因修饰植物，其中发展最快的是转基因植物食品。 植物转基因技术的内容包括：目的基因的分离和鉴定、植物表达载体的构建、植物细胞的遗传转化、转化细胞的筛选、转基因植物细胞的鉴定以及外
雪花莲凝集素转基因抗虫植物的研究进展 摘要：近年来雪花莲凝集素（GNA）基因已成为国内外在植物抗虫基因工程中应用较为广泛的基因。目前已在小麦、大豆、水稻等农作物上的研究获得成功，并有相当规模的种植。另外在烟草、马铃薯、地瓜、莴苣、棉花、甘蔗、油菜等经济作物也已经试验成功.GNA转基因抗虫植物的培育为减少杀虫剂的使用和提高产量以及环境保护方面起到了巨大的作用。本文就GNA的分布、来源、杀虫机理、GNA转基因抗虫植物的发展况以及种植GNA抗虫植物的安全性进行了概述。 关键词:GNA基因;转基因植物;抗虫;安全 Research advances in GNA transgenic anti-insect plants Abstract:in recent years the snowdrops lectin gene(GNA)become insect-resistant genes in plants at home and abroad in engineering application a wide range of genes. Currently on wheat,soy and rice crops in research,and has won initial success of comparable size planting.Other tobacco potatoes sweet potato lettuce in economic crops such as cotton and sugar cane rape trial has success.GNA genetically modified insect resistance plant cultivation to reduce the use of pesticides and increase production and environmental protection has played a great role.This paper the distribution insecticidal mechanism GNA GNA genetically modified insect resistance plant development status and planting GNA insect resistance plant impact on environment were summarized. Keywords:GNA genes;transgenic plants;anti-insect;safety 雪花莲凝集素（Galanthus nivalis agglutinin简称GNA）是植物外源激素的一种，成熟的GNA是四聚体蛋白，且蛋白质分子未被糖基化，同时含有12个甘露糖专一性结合位点，属整体凝集素类。可特异性地结合糖蛋白末端甘露糖残基[1]。因其能结合到昆虫消化道上皮细胞糖蛋白受体上，对昆虫产生局部或系统的毒害作用，从而抑制其生长，甚至将其杀死；它还能在昆虫消化道内诱发病灶，促进消化道中细菌的繁殖，对害虫本身造成伤害，抑制害虫生长发育繁殖，抑制逆转录病毒和老鼠小肠中的大肠杆菌的繁殖等研究表明GNA分子对蚜虫飞虱叶蝉粉虱等刺吸式害虫及线虫有强烈的毒性，对鳞翅目等咀嚼式口器的害虫具有中等毒性，但对高等动物安全。 目前，转雪花莲凝集素基因的小麦水稻和大豆已经在国内外较为广泛地进行了种植，效果很好。其他新的转基因抗虫植物也在研究中，一些也在逐渐推广种
转基因研究的现状及发展 转基因作物是当今世界各国现代生物技术产业研究的热点，中国的转基因生物技术发展一、我国转基因作物的发展现状迅速，由于科学界对转基因作物对人类及生态环世界上最早的转基因作物诞生于年，是一境利与弊的争论，措政府应制定相应的政策、施对到种含有抗生素药类抗体的烟草。世纪年代，其进行安全管理。本文论述了转基因作物在国际农业生物技术已逐渐成为各国现代生物技术产业研国内的发展现状，分析了转基因作物对人类及生态环境的利与弊以及关于我国转基因作物安全管究的热点。 转基因技术的应用 1．在畜牧兽医中的应用 应用于动物抗病育种转基因技术可以用于动物抗病育种，通过克隆特定基因组中的某些编码片段，对之加以一定形式的修饰以后转入畜禽基因组，如果转基因在宿主基因组能得以表达，那么畜禽对该种病毒的感染应具有一定的抵抗能力，或者应能够减轻该种病毒侵染时对机体带来的危害。（其用于遗传育种，不仅可以加速改良的进程，使选择的效率提高，改良的机会增多，并且不会受到有性繁殖的限制。）例如Clements等将绵羊髓鞘脱落病毒的表壳蛋白基因转入绵羊，获得的转基因动物抗病力明显提高；丘才良把一种寒带比目鱼抗冻基因成功地转移到大西洋鲑中，为提高某些鱼类的抗寒能力做了积极的尝试。 2．在医学领域中的应用 用于生产药用蛋白用转基因动物的乳腺生产重组蛋白（乳腺生物反应器）可能是转基因动物的最大应用，这也是世界范围内转基因研究的热点之一。Swamdom （1992）用β-球蛋白的4个核酸酶I的高敏位点与人的两个基因相连，融合基因产生的转基因猪与鼠的原型相似。目前，把转基因动物当作生物反应器来生产药用蛋白已经受到国际社会的极大关注，不仅各国政府投资，一些私人集团也不惜投入大量资金加以研究和开发。 3．转基因的应用存在的问题及展望 （1）转基因表达水平低，许多转基因的表达强烈地位受着其宿主染色体上整合位点的影响，往往出现异位表达和个体发育不适宜阶段表达，影响转基因表达能力或基因表达的组织特异性，从而使大部分转基因表达水平极低，极少部分基因表达水平过高。 （2）难以控制转基因在宿主基因组中的行为，转基因随机整合于动物的基因组中，可能会引起宿生细胞染色体的插入突变，还会造成插入位点的基因片段丢失，插入位点周围序列的倍增及基因的转移，也可能激活正常状态下处于关闭状态的基因。 （3）不了解哪些基因控制多数生理过程，不了解基因表达的发育控制和组织特异性控制的机制。 （4）制作转基因动物的效率低，这是目前几乎所有从事转基因动物研究的实验室都面临的问题，也是制约着这项技术广泛应用的关键。 （5）对传统伦理是一种挑战，对人类的生存有一定的负面作用等。 当然，我们不能因为这些缺点的存在就否定转基因技术的研究价值。因为它作为一种新兴的生物技术，配合其他相关的生物技术将具有广阔的应用前景。随着这一技术日趋成熟，许多问题有望逐步得到解决。
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 〖实验目的〗 1．了解创建烟草突变体库的方法； 2．理解每种方法的基本原理； 3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。〖实验原理〗 随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。 烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数
据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。 T-DNA 载体构建 转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子 筛选T2，获突变子，应为3:1分离 确定T-DNA与突变型共分离的个体 产生纯合后代 克隆T-DNA两侧的植物DNA（Tail PCR) 利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因 基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能）图实验4-1 T-DNA标签克隆基因的基本流程 TAIL-PCR分离法是利用多个嵌套的T-DNA插入序列特异性引物（根据T-DNA中靠近右边界处的核苷酸序列设计的引物，Tm值57-62℃和一个短的随机简并引物（AD，Tm值44-46℃）组合，以突变体基因组DNA为模板，进行多次PCR反应，采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进行的方法，最后获得T-DNA插入侧翼区特异性扩增片段（实验图4-2），可作为探针，筛选分离基因。 TAIL-PCR分离法可以降低非侧翼区特异产物的背景，同时它可以产生2个以上嵌套的目的片段，与其它方法相比TAIL-PCR方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点，已经在拟南芥和水稻等植物中获得了成功及广泛的应用。
种植与养殖 植物作为生物反应器为人类提供了一个更加安全和廉价的生产体系。与所有的生物反应器相比，植物是最廉价的“工厂”。植物所需要的仅是阳光和土壤及水分。另外，植物细胞中绝对不会含有潜在的动物或人类病原。自从1983年Fraley等[1]首次报道将细菌基因导入植物细胞获得成功表达以来，至今已有多种蛋白质在不同植物中成功表达[2-4]。研究表明植物生物反应器具有广阔的应用前景。 1植物生物反应器的表达系统 植物生物反应器主要有两大表达系统，既稳定表达系统和瞬时表达系统。稳定表达系统是利用稳定遗传转化方法表达和生产重组蛋白质，特点是操作简便，重组蛋白质产物置于种子或块茎中易于保存。如将抗癌基因p53克隆到表达载体，农杆菌遗传转化并在受染植物中表达[5]。由于外源性目的基因整合入植物基因组中，因此外源基因可以在后代中稳定表达。 以植物病毒为载体的瞬时表达系统具有快速的优势。不需要稳定遗传转化，从病毒侵染到高量表达仅需要7-14天。这种表达系统是应用植物病毒在植物中复制、转录和传播。其技术具有简单、快速和产量高等优点。 2植物瞬时表达系统的研究进展 2.1病毒表达载体 常用的植物病毒载体包括多烟草花叶病毒(TMV)、豇豆花叶病毒(CPMV)、马铃薯X病毒（PVX）等。Lim等[6]通过TMV和ORSV的启动子分别控制外源性基因和ORSV衣壳基因的表达，提高了重组蛋白质的表达量。Gleba等研究表明，外源蛋白表达量最高 植物瞬时表达系统的研究进展 （吉林师范大学生命科学学院136000） 【摘要】利用植物作为生物反应器是一个新兴的研究领域。本文概述了植物生物反应器的两 个主要的表达体系、病毒载体介导的植物瞬时表达系统在表达外源方面的优势，以及植物瞬时 表达侵染技术的研究进展，并阐述了植物生物反应器的发展趋势。 【关键词】植物生物反应器；转基因植物；重组蛋白质 杨丽萍 Research Progress of Plant transient expression system Yang Liping [Abstract]The use of plant as a bioreactor is a new research field.In this paper,the two main expres? sion systems of plant bioreactor,the advantages of virus vector-mediated transient expression system in expressing exogenous genes,and the research progress of plant transient expression infection tech? nology were reviewed.The development trend of plant bioreactor was also described. [Keywords]plant bioreactor;transgenic plant;recombinant protein (School of Life Sciences,Jilin normal University,Siping,Jilin136000) *基金项目 基金项目：：吉林省教育厅“十三五”科研规划项目，名称：《基因沉默抑制子HC-Pro在植物基因组中的表观遗传调控作用》，编号：JJKH20191013KJ。 作者简介 作者简介：：杨丽萍（1974.-），女，汉族，吉林省吉林市人，植物学博士，吉林师范大学，副教授，从事植物学、遗传学教学和研究。 现代农业研究
五种常用的植物转基因技术 植物转基因技术是通过各种物理的、化学的和生物的方法将从动物、植物及微生物中分离的目的基因整合到植物基因组中，使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物预期性状的一种生物技术方法。1983年，首例抗病毒转基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技术改良农作物。目前，植物转基因技术已在作物改良和育种领域发挥了重要作用。通过植物转基因技术，一些来自于动物、植物及微生物的有益基因如抗病／虫基因、抗非生物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以改良现有的农作物和培育新的农作物品种。以DNA重组技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的来源，打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障。植物转基因技术已应用到玉米、水稻、小麦、大豆和棉花等许多农作物。同时，该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中‘1’纠。目前，根据转基因植物的受体类型，植物转基因方法可以分为3大类：以外植体为受体的基因转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法和超声波介导法；以原生质体为受体的基因转化方法，如聚乙二醇法、电击法、脂质体法及磷酸钙-DNA共沉淀法；以种质系统为受体的基因转化方法，如子房注射法和花粉管通道法。由于以原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大，培养过程繁杂，培养工作量大且培养技术不易掌握；原生质体再生植株的遗传稳定性差、再生频率低并且再生周期长；相关的转化方法的转化率低、效果不理想等缺点，所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用。本文将对农杆菌介导法、基因枪法、超声波介导法、子房注射法和花粉管通道法的原理、基本步骤和优缺点作以简要介绍。 1 以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法 农杆菌介导法是最早应用、最实用有效并且具有最多成功实例的一种植物转基因方法。农杆菌是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。目前，用于植物转基因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌。某些根癌农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200 -800bp的结构和功能相似的Ti质粒和Ri质粒。Ti质粒和Ri质粒含有3个功能区：参与农杆菌侵染植物过程的vir区、参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区、在农杆菌中启动质粒复制的ori区。在vir区上的vir操纵子群作用下，Ti质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内，而后将T-DNA整合到植物基因组中。T—DNA是质粒上一段10—30kb 的序列，它的两端各有一段高度保守的25bp的同向重叠序列。由于T-DNA转化无序列特异性，因此可用任何基因片段代替原来的T-DNA基因片段进行。 农杆菌介导法的原理是：在农杆菌基因ehvA，chvB，pscA，and att家族所编码的蛋白和植物伤口产生的酚类物质和糖类物质的共同作用下，农杆菌识别并附着在宿主细胞壁上。virD4和virB基因编码蛋白组成的type IV分泌系统将单链VirD2-T-DNA复合体运送到宿主细胞内。此外，VirE3、VirE2和VirF蛋白也通过该系统进入宿主细胞质中。在宿主细胞质中，VirE2蛋白与VirD2-T-DNA复合体结合。在V irD2核定位信号、某些农杆菌蛋白和宿主细胞蛋白的共同作用下，VirD2-T-DNA复合体进入细胞核。在VirD2、VirE2、某些宿主细胞核蛋白如AtKu80和DNA连接酶的作用下，T-DNA被整合到宿主基因组中，但具体过程不详。 农杆菌介导法的基本步骤是：(1)诱导目标植物外植体；(2)构建含有目的基因的质粒；(3)质