一造血干细胞分离 （一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备 1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法 抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。 2 percoll液密度梯度离心法 ①按体积比为(1.5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。 ②取鼠股骨和胫骨, 在两头关节处切开骨骼, 反复用培养基冲洗骨髓腔, 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上, 2 000 r / min 离心20 min。吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。 3 Ficoll分离法 方法一在15ml分离管中加7.5ml比重为1.017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。 方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM 洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。 取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼, 反复用PBS 缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。 （二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。 去除Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞, 包括T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞, 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。 （三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化 流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液, 加入2.5μL CD45- FITC和10μL CD34- PE充分混合, 避光孵育15 min。以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定, 上机检测。
干细胞知识小册子 一、干细胞的美好未来 二、干细胞-------神奇的“万能细胞” 三、干细胞衰老与疾病的发生 四、干细胞与疾病的治疗 五、干细胞与抗衰老 六、干细胞--无创逆龄，定格青春 七、Q＆A 一、干细胞的美好未来 2017年8月27日，湖南卫视原创科技栏目《我是未来》邀请干细胞领域大咖、中国科学院广州生物医药与健康研究院院长裴端卿教授等嘉宾，聚焦干细胞技术的发展及应用，为大家带来了一次生动趣味的生命科技知识科普。节目中，裴端卿教授以浅显易懂的语言，向大家着重介绍了什么是干细胞，干细胞的作用以及未来能给人类带来哪些前所未有的变化，让我们见识到了科学技术的发展带给生命的无限可能性。人们未来都可以活到100岁，120岁，150岁，200岁……这些都是干细胞带给我们的未来！ 1、细胞衰弱老化---衰老和死亡的真相 我们的身体是由数十万亿（40-60万亿）亿细胞构成的，随着时间的迁移，我们人体里面的细胞开始老化，这个衰老的过程，会使器官与组织在功能上的衰退，导致机体的死亡。 生命的起始从受精卵的分裂形成开始，胚胎干细胞分化发育成身体的各个组织器官，随着时间的迁移，胚胎干细胞彻底消失，人体内的干细胞种类只有成体干细胞。成体干细胞的最大作用就是在机体受到损伤时进行修复，替代凋亡的组织细胞。随着年龄的增长，成体干细胞的功能慢慢丧失，数量也逐渐减少，到最后完全消失，生命也就走向了终点。 2、干细胞——“长生不老”的秘诀 所谓干细胞，就是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生人体各种组织器官的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。
随着时间的迁移，人体细胞会开始老化，而衰老的过程会造成器官与组织在功能上的衰退，那么延缓细胞的衰老出发点就是干细胞，干细胞是生命的起源细胞。大量科学研究发现，干细胞的分化是一个可逆的过程，如果人体细胞能够逆转到干细胞的水平，那么人类的寿命将得以延长。 3、干细胞——再生医学的源泉 除了延长寿命，干细胞还可以培育和再生器官，这就意味着当人们身体的某一器官出现了问题，都可以用再生器官进行替换。 利用干细胞具有的向机体其他细胞分化转变的潜在能力，再生性和再造性地修复各种变性、坏死性、损伤性、代谢性和退行性病变，恢复病损或退化组织器官结构和功能的一系列临床干细胞移植治疗技术和再生保健技术被称为再生医学。通俗理解，再生医学就是让人类的组织或器官再生。 节目现场，教授们展示了由诱导多能干细胞培育出来的牙齿组织，现场的每一位观众都惊叹不已。教授们表示，目前我们可以通过牙齿的再生来了解细胞如何变成组织、组织又怎样变成器官，将来再发展到诸如肝脏的再生、肾脏的再生等等，可以在临床上得到应用。他们认为当拥有这些技术之后，人们未来都可以活到100岁，120岁，150岁，200岁……这些都是干细胞带给我们的未来。 4、我们没有理由质疑美好的未来 干细胞技术是攻克传统医学所不能及的重大疾病的一种全新医疗技术，是当今和未来再生医学的研究热点和发展方向，已被列入“人类十大科技进展”之首和国家重大科技专项。科学给予人们希望，而这种希望又不断激励着人们追求更美好的生活。随着科学界对于干细胞领域的深入研究，未来干细胞在治疗疾病与健康保障方面将有更大的作为。干细胞领域研究的不断前进将为人类带来更加美好的未来。 二、干细胞-------神奇的“万用细胞” 干细胞具有再生各种组织器官潜在功能，所以，其在医学界又被称为“万用细胞”。也正是因为干细胞这一特点，使其成为了21 世纪再生医学的基础，更是成为当前科技的前沿和热点。理论上来讲，干细胞可用于多种疾病的治疗，如糖尿病、心肌梗死、肝功能衰竭等。也正是干细胞这种潜在的价值，引起了各国学者研究探索的兴趣。
小鼠骨髓干细胞取样制备方法 Mouse SP protocol 1.水浴设置在37度，并用温度计量确认温度。预热DMEM+，预冷HBSS+ 2.使用 5-8 周龄雄性小鼠，取大腿骨和胫腓骨处的骨髓悬浮于HBSS+、 1)杀死小鼠，背朝下躺着，用70% 酒精喷洒腹部灭菌、 2)臀部稍下方用齿状刀口的剪刀水平切开腹部皮肤、 3)从此刀口同时向上向下同时撕裂皮肤，用钳子钳住膝盖骨扯下所有腿部皮肤、 4)从膝盖处剪断，取下胫腓骨，尽可能将肌肉组织剔除干净，剪掉脚，将其放于陪替 氏培养皿，其中放有5 ml左右预冷的HBSS+，置于冰上、 5)剔除干净大腿骨上的肌肉类组织，在臀部处剪掉大腿骨，骨髓细胞主要在这里，所 以尽可能取得更多的大腿骨，骨上组织尽可能剔出的越干净越好，以免骨髓细胞粘 附上面、将其置于培养皿、 6)一个小鼠取得四段腿骨, 用钳子固定垂直培养皿方向固定腿骨，用27-G 10ml注射 器打入HBSS+、骨髓细胞会从另一端推出，尽可能取得更多细胞，腿骨上下颠倒再 推打, 骨髓取出后腿骨会变白的、 7)用 18-G 针头反复推吸4-5次培养皿里的细胞，以打散团块细胞、但尽量不要打入 气体，因为气泡容易导致细胞死亡、将细胞转移到50ml的PP离心管里，同时用 70um的滤网过滤去处碎骨或团块, 计数有核细胞、 3.精确计数有核细胞、（平均5 x 107 有核细胞/6周龄的C57Bl/6 小鼠）、 4. 5 min 500g 4°C离心，弃上清，加溶血素裂解红细胞： 注：当红细胞较多时细胞悬液：红细胞裂解液＝1：8室温静置10min 当红细胞较少时细胞悬液：红细胞裂解液＝1：4室温静置5min 红细胞裂解液为10×，临用前用DDW稀释成1× 5.用HBSS+（2%FBS）洗细胞（5 min 500g 4°C离心） 6.用预热的DMEM(2%FBS)调整细胞浓度为106/ml 7.分两管，其中一管加入verapamil，verapamil的终浓度为100 μM，封口膜封好37度水 浴10min后，和另一管同时加入Hoechst 33342染色，终浓度5ug/ml ，37度水浴90min，
捐献造血干细胞知识问答 一、骨髓分布在人体的哪些部位？骨髓分为几种？ 骨髓分布人体大部分骨头的中央部分----骨腔内。骨髓分为红骨髓和黄骨髓两种。 二、红骨髓具有哪些功能？ 红骨髓中含有造血干细胞，因此具有造血功能。人体血液中的红细胞、血小板、淋巴细胞、粒细胞等都是经过造血干细胞多次分化发育而成的。 三、人体中有多少骨髓？ 人体中的骨髓含量与人的体重等因素有关，成年人一般骨髓在体内约为3千克（公斤）。 四、人体中的干细胞有哪几种功能？ 干细胞在人的生命成长和发育中起着“主干”作用的细胞，如同建筑中钢筋泥沙这样的基础材料。干细胞一般分为三种：全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。 全能干细胞可以分化成人体的各种细胞，这些分化出的细胞构成人体的各种组织和器官，最终发育成一个完整的人。例如，人类的受精卵就是一个最初始的全能干细胞，在分化的过程中可分化出许多的全能干细胞。 多能干细胞是全能干细胞进一步分化的结果。多能干细胞不再具
有分化所有干细胞的能力，并不能发展成完整的人体。 专能干细胞是多能干细胞进一步分化的结果。专能干细胞只能分化成某一类型的细胞，如造血干细胞分化成各种血细胞；神经干细胞可以分化成各类神经细胞。 五、干细胞存在人体的哪些地方？ 经科学家研究表明，干细胞不仅存在于胚胎，而且存在于成人体内。目前已经可以从脐血、胎盘、骨髓甚至脂肪中分离出各种干细胞。 六、干细胞能治疗哪些疾病？ 用干细胞生物工程可以治疗几乎所有疾病。如白血病、再生障碍性贫血、重症免疫缺陷症、地中海贫血、急性放射病和某些恶性肿瘤等绝症。美国生物学家诺贝尔奖获得者吉尔伯特认为：“用不了50年，人类将能够培育出人体的所有器官。”那时，深度烧伤的病人有“脸”见人；瘫痪病人有望站起来；帕斤森病、糖尿病也可以根治。 七、什么是造血干细胞移植？ 当患者因病使机体造血功能异常或失去造血功能时，将他人的正常造血干细胞移植到患者体内，重建患者正常的造血功能和相关功能，达到治疗疾病的目的。 八、造血干细胞移植有几种类型？ 根据造血干细胞来源可分为：骨髓移植、外周血造血干细胞移植、脐带血造血干细胞移植和胎肝造血干细胞移植。 九、捐献造血干细胞会影响身体健康吗？ 人体内的造血干细胞具有很强的再生能力。正常情况下，人体的
大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。 心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！ ④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。 第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会： ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml 细胞生长液中大约需要4.5ml
造血干/祖细胞增殖与分化谱系 多能干细胞（HPSC）G0——G0期HPSC G1 淋巴干细胞高增殖潜能细胞（Blast CFCs） 前前B前T 多向性祖细胞（CFU—GEMM） ———————————————————————前B 粒-巨噬细胞爆式集落BFU-E BFU-MK （CFU—GM）未成熟B CFU-E CFU-MK CFU-G CFU-M 成熟B成熟T 原始红细胞原始巨核细胞原始粒细胞原始单核细胞原始浆细胞 早幼红细胞幼稚巨核细胞早幼粒细胞幼稚单核细胞幼稚浆细胞 中幼红细胞成熟巨核细胞 单核细胞浆细胞 中性中幼嗜酸性中嗜碱性中晚幼红细胞 粒细胞幼粒细胞幼粒细胞 成熟红细胞 中性晚幼嗜酸性晚嗜碱性晚 粒细胞幼粒细胞幼粒细胞 中性成熟嗜酸性成嗜碱性成 粒细胞熟粒细胞熟粒细胞
缺铁性贫血巨幼红细胞性贫血 再生障碍性贫血 珠蛋白生成障碍性贫血异常血红蛋白病 遗传性球形红细胞增多症遗传性椭圆形红细胞增多症遗传性口形红细胞增多症 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症丙酮酸激酶缺乏症 阵发性睡眠性血红蛋白尿症自身免疫性溶血性贫血冷凝集素综合征 高铁血红蛋白症硫化血红蛋白症 真性红细胞增多症 白细胞减少症中性粒细胞减少症和粒细胞缺乏症传染性单核细胞增多症 急性微分化性白血病（M0）急性粒细胞白血病未分化性（M1） 急性粒细胞白血病部分分化性（M2a）M2b
（M2b）急性颗粒增多的早幼粒细胞白血病（M3a） M3b 急性粒-单核细胞白血病（M4a M4b M4c M4EO） 急性单核细胞白血病（M5a）M5b 红白血病（M6）急性巨核细胞白血病(M7)
急性淋巴细胞白血病(ALL) T-细胞型：（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型） B-细胞型：前前B 、前B 、Common 型、B-ALL 急性混合细胞白血病(HAL) 浆细胞白血病 嗜酸粒细胞白血病 嗜碱粒细胞白血病 多毛细胞白血病(HCL) 慢性淋巴细胞白血病 (CLL)
第十二章造血干细胞及免疫细胞的生成 免疫细胞都属于血细胞，所有血细胞都来源于造血干细胞。因此在一定意义 上讲，免疫细胞的发育分化就是造血干细胞分化成熟的过程。 第一节 造血干细胞的特性和分化 一、造血干细胞的起源和表面标记 （一）造血干细胞的起源 哺乳动物的造血最早发生在卵黄囊，随后转移到胎肝，胚胎发育中期以后以 及出生后，骨髓成为主要的造血场所，并为B细胞发育的中枢免疫器官；胸腺 是T淋巴细胞的分化成熟的中枢免疫器官。 早期的造血干细胞是多能造血干细胞（pluripotent hematopoietic stem cell）， 具有自我更新（self?renewing）和分化（differentiation）两种重要的潜能，赋予 机体在整个生命过程中始终保持造血能力。多能造血干细胞最初分化为共同淋巴 样祖细胞和共同髓样祖细胞等等。 （二）造血干细胞的表面标记 白细胞分化抗原和单克隆抗体技术的应用，为造血干细胞表面标记的研究及其分离纯化提供了重要的理论和实验依据。人造血干细胞的主要表面标记为CD34和c-kit （CD117），不表达谱系（lineage）特异性标记。 （1）CD34：CD34是一种高度糖基化跨膜蛋白，有1%~4%骨髓细胞表达 CD34，其中包括了造血干细胞，是造血干细胞的一种重要标记，应用CD34单 克隆抗体可从骨髓、胎肝或脐血中分离、富集造血干细胞。随着造血干细胞的分 化成熟，CD34表达水平逐渐下降，成熟血细胞不表达CD34。 （2）CD117：CD117是干细胞因子（stem cell factor，SCF）的受体，是原 癌基因c?kit的编码产物Kit。CD117是属于含有酪氨酸激酶结构的生长因子受体，胞膜外区结构属IgSF。CD117+细胞约占骨髓细胞的1%~4%，50%~70% CD117+骨髓细胞表达CD34，因此，CD117也是多能造血干细胞的重要标记。 （3）Lin－细胞：应用针对T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细 胞、巨核细胞、髓系以及红系等多种谱系相应单克隆抗体的混合抗体（CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b和血型糖蛋白A等抗体）结合免
造血干细胞捐赠相关知识介绍 一. 骨髓 1. 什么是骨髓 骨髓是存在于长骨（如肱骨、股骨）的骨骺和扁平骨（如髂骨）的骨髓腔中，是一种海绵状的组织。能产生血细胞的骨髓呈红色，称为红骨髓。人出生时，红骨髓充满全身骨髓腔，随着年龄增大，脂肪填充了所有的长骨的骨髓腔（呈淡黄色，称黄骨髓），最后几乎只有扁平骨和长骨骨骺中才有红骨髓。此种变化可能是由于成人不需要全部骨髓腔造血，部分骨髓腔造血已足够补充所需血细胞。当机体严重缺血时，部分黄骨髓可转化为红骨髓，骨髓的造血能力可显著提高。骨髓的造血功能极强，骨髓最高的造血能力可达到正常造血情况的9倍，如果只保留骨髓的1/10，就能完成正常的造血功能，所以少量骨髓捐献对身体没有什么影响。 2. 骨髓的作用 正常人体的血细胞维持数量和功能的相对恒定。这种恒定是新陈代谢的动态平衡，即衰老、死亡的细胞经常不断地被新生的细胞所取代。例如人类红细胞的平均寿命约为120天，血小板寿命约7-10天。一个正常成年人每天都有一定数量的红细胞衰老死亡，同样也有相同数量的红细胞新生。 成年人的造血器官主要局限在骨髓、脾脏以及淋巴结中。但脾脏和全身淋巴结在出生后主要作用是促使淋巴细胞的第二次增殖，即淋巴细胞在接触抗原后繁殖的免疫反应。所以骨髓造血功能显得尤其重要。出生后，骨髓在正常情况下是唯一产生红细胞、粒细胞和血小板的场所，骨髓也产生淋巴细胞和单核细胞。 3. 什么是造血干细胞 近三十年来，血细胞生成的研究发展很快，现已证明人类骨髓中存在造血多能干细胞，它们具有高度自我更新的能力，并且能分化为各血细胞系统的祖细胞（如淋巴系干细胞、粒系干细胞），再大量分化、增殖为各种原始和成熟血细胞，最后这些成熟的血细胞通过骨髓进入血液中，发挥各自的生理作用。人体造血干细胞的一半存在于干细胞池，是人体造血细胞的储备库，以适应和满足各种状态下造血的需要；另一半存在于增殖池，这些造血干细胞不断增殖、自我复制，以弥补因细胞衰老或丢失所致的血细胞不足，维持人体血细胞的平衡。 人体的造血组织有很强的代偿功能，当抽取部分骨髓后，造血干细胞会很快增殖，一般健康者在十天左右即可补足所捐的骨髓量。因此，捐献者不仅不会影响自身的造血功能，反而使自身的造血系统得到了锻炼，更具备了生命的活力。 二. 骨髓移植 1. 骨髓移植是一种治疗方法 骨髓移植是指将他人的造血干细胞移植到患者的体内，使其生长繁殖，重建免疫系统和造血功能的一种治疗方法。骨髓移植分为自身骨髓移植与异体骨髓移植，异体骨髓移植又分为同基因骨髓移植（同卵双胞胎之间）和异基因骨髓移植。异基因骨髓移植又可分为：有血缘关系（即：同胞—兄弟姐妹之间）的骨髓移植与非血缘关系（志愿捐髓者）的骨髓移植。自身骨髓移植容易复发，在临床中较少采用。目前骨髓移植主要还是异基因骨髓移植。 2. 骨髓移植的过程 常规的骨髓移植前，只需HLA—A、B、DR三个座位六个基因相同即可。由于HLA—A、B 的多样性最明显，所以上海骨髓库原先是对志愿者先做HLA—A、B分型，待检索后供、受者HLA—A、B相配后，再对供者作HLA—DR分型检测，看是否相配。现在已采用基因检测法，不分一、二类了。如果供、受者HLA完全相配，同时供者健康检查合格，就可以着手准备移植手术。先用化学药物和放射治疗摧毁患者身上癌细胞，这时患者体内的造血干细胞也会被杀死，人体的免疫力下降，易发生感染，必须在无菌病房（层流室）中接受移植。移植方法
动物骨髓干细胞细胞分离液试验方法 货号：P8600 规格：200mL 保存：常温保存，有效期2年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启 封后置常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 产品内容： 名称规格 动物骨髓干细胞分离液200mL 匀浆冲洗液200mL 样本稀释液200mL 清洗液200mL 洗涤液200mL 无菌硅化离心管5支 实验前准备： 1、适用仪器 最大离心力可达1200g的水平转子离心机 骨髓单细胞悬液的制备： 1.以适当方式处死动物，剥离出股骨或胫骨，用剪刀剪断骨头两端，露出内腔。 2.用注射器吸取适量（根据动物大小）的匀浆冲洗液冲洗出内腔中的骨髓。 3.收集悬液到合适离心管中，反复吹打成单细胞悬液，以70μm细胞筛网（随试剂盒附赠5个）过滤。 4.450g，离心10min，弃上清。 5.用样本稀释液重悬细胞浓度为2×108-1×109/ml的单细胞悬液备用（以小鼠为例，一般使用1ml样本稀释液重悬骨髓细胞）。 检验方法： 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。 1.取一支离心管，加入与骨髓单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于3ml）。
2.用吸管小心吸取骨髓单细胞悬液加于分离液液面上，400-550g，离心20-30min。（注：根据骨髓单细胞悬液量确定离心条件，骨髓单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。 3.离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色目的细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。 4.用吸管小心吸取第二层环状乳白色目的细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入5-10ml洗涤液，混匀细胞。 5.400g，离心10min。 6.弃上清。 7.用吸管以5ml清洗液重悬所得细胞。 8.250g，离心10min。 9.重复7、8、9，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 差异贴壁法纯化细胞： （1）用干细胞无血清培养基或干细胞完全培养基以1.5-3×106个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于一次性细胞板或细胞瓶中，放于37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。 （2）2-4小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。 （3）10-24小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。 （4）不贴壁的为淋巴细胞。
造血干细胞移植 适应症 造血干细胞移植迄今仍然是一种高风险治疗方法，目前主要用于恶性血液疾病的治疗，也试用于非恶性疾病和非血液系统疾病，如重症难治自身免疫性疾病和实体瘤等。 （1）血液系统恶性肿瘤：慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征等。 （2）血液系统非恶性肿瘤：再生障碍性贫血、可尼贫血、地中海贫血、镰状细胞贫血、骨髓纤维化、重型阵发性睡眠性血红蛋白尿症、无巨核细胞性血小板减少症等。 （3）其它实体瘤：乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、神经母细胞瘤、小细胞肺癌等。 （4）免疫系统疾病：重症联合免疫缺陷症、严重自身免疫性疾病。 由于移植存在致命性合并症，因而非血液系统疾病的造血干细胞移植治疗还未被广泛接受。 分类 （1）按照采集造血干细胞的来源不同分为：骨髓移植、脐血移植、外周血造血干细胞移植等。 （2）按照供体与受体的关系分为：自体骨髓移植/脐血移植/外周血造血干细胞移植、异体骨髓移植/脐血移植/外周血造血干细胞移植。异体移植又称异基因移植，当供者是同卵双生供者时，又称同基因移植。 （3）根据供者与受者HLA配型相合程度，异体骨髓移植/脐血移植/外周血造血干细胞移植分为：HLA全相合移植、不全相合移植、单倍体相合移植。 （4）根据供者与受者的血缘关系分为：血缘相关移植、非血缘移植即骨髓库来源供者。 （5）根据移植前的预处理方案强度可分为：清髓性造血干细胞移植和非清髓性造血干细胞移植（减低预处理剂量的造血干细胞移植）。 一般根据患者的疾病种类、疾病状态及预后、HLA配型结果及供者年龄等因素综合考虑来选择造血干细胞移植方式。目前异基因造血干细胞移植绝大多数为配型相同的同胞间、半相合父母与子女间、不全相合同胞间的移植，而随着全世界及我国骨髓库的增加，非血缘供者的异基因造血干细胞移植数量也在不断增加。不同移植类型各自优劣不同，自体造血干细胞移植的优点在于不受供者的限制，移植后不发生移植物抗宿主病，不需要使用免疫抑制剂，严重并发症较少，费用较低，缺点是复发率高。异基因造血干细胞移植治疗恶性疾病，植入的供者细胞有持久的抗肿瘤作用，复发率低，但严重并发症多，费用相对较高。
捐献造血干细胞知识问答 1、干细胞存在人体的哪些地方？ 经科学家研究表明，干细胞不仅存在于胚胎，而且存在于成人体内。目前已经可以从脐血、胎盘、骨髓中分离出各种干细胞。 2、干细胞能治疗哪些疾病？ 用干细胞生物工程可以治疗几乎所有疾病。如白血病、再生障碍性贫血、重症免疫缺陷症、地中海贫血、急性放射病和某些恶性肿瘤等绝症。 3、什么是造血干细胞移植？ 当患者因病使机体造血功能异常或失去造血功能时，将他人的正常造血干细胞移植到患者体内，重建患者正常的造血功能和相关功能，达到治疗疾病的目的。 4、造血干细胞移植有几种类型？ 根据造血干细胞来源可分为：骨髓移植、外周血造血干细胞移植、脐带血造血干细胞移植。 5、捐献造血干细胞会影响身体健康吗？ 人体内的造血干细胞具有很强的再生能力。正常情况下，人体的各种细胞每天都在不断地新陈代谢，进行生成、衰老和死亡的循环，捐献造血干细胞后，可刺激骨髓加速造血，1—2周内，血液中的各种血细胞就能恢复到原来的水平。因此，捐献造血干细胞与献血一样不会影响身体健康。 6、捐献造血干细胞的身体健康条件？ 造血干细胞捐献者的身体必须是健康的，因此，经下列血液检查合格者，才能成为造血干细胞捐献者。 7、登记捐献和采集造血干细胞有年龄限制吗？ 凡年龄在18—45岁的健康者均可登记成为捐献造血干细胞的志愿者；采集造血干细胞的最佳年龄为18—55岁。因为捐献者登记入库后找到相合适的患者需要一定的时间，为减少资源流失，所以登记捐献的年龄不超过45岁。 8、捐献者一次需采集多少造血干细胞？ 捐献者一次只需采集10克的造血干细胞，成人体内的骨髓重量约有3000克，因此不会影响健康。 9、志愿者报名登记后，是否马上就要捐献造血干细胞？ 志愿中报名登记后，首先要安排你抽取5毫升血做HLA分型检验，数据储存到中国造血干细胞捐献者资料库中备查。当某一位患者需要进行造血干细胞移植时，由移植中心将患者的HLA分型数据传送到资料库，如果检索结果得只你的HLA正好与患者吻合时，省级管理中心将通知你做捐献的准备。这个过程可能很短，也可能要等若干年。而大部分志愿者可能没有捐献的机会。 10、志愿捐献者到哪里登记报名？ 中国造血干细胞捐献者资料库浙江分库设在浙江省红十字会，我县的捐献者服务中心设在县红十字会。如果，您年龄合适、身体健康，志愿捐献造血干细胞，可以通过热线电话或到县红十字会登记报名，填写志愿者捐献书及有关表格，然后将会抽取5毫升血液，进行HLA分型等检验，并将您的所有相关资料输入中国造血干细胞捐献者资料库的计算机数据库，这样您就成为一名光荣的捐献造血干细胞志愿者，有望为渴望进行移植治疗的患者配对。
干细胞概述 干细胞的定义 干细胞（Stem cell，SC）是一类具有自我更新（self-renewing）能力的多潜能细胞，即干细胞保持未定向分化状态和具有增殖能力，在合适的条件或给予合适的信号，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”，也有人通俗而形象地称其为“干什么都行的细胞”。干细胞来源于胚胎、胎儿组织和成年组织。来自胚胎和胎儿组织的胚胎干细胞具有多潜能分化特性，可分化为成熟个体体内几乎全部200多种以上的成熟细胞类型。而成年个体组织来源的成体干细胞（adult stem cell）有造血干细胞、神经干细胞和胰腺干细胞等。 人类很多疾病诸如心肌梗塞、糖尿病、帕金森病等，均涉及细胞(如脑细胞、心肌细胞、胰岛细胞)的死亡。干细胞技术最显著的作用就是：能再造一种全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官，用以治疗诸如脑瘫、中风、白血病、心肌梗塞、糖尿病、帕金森氏病等多种用传统方法难以治愈的疾病，具有不可估量的医学价值，给人们带来了希望。 干细胞的分类 干细胞具有自我更新(self-renewing)的能力，在一定条件下下，它可以分化成各种功能细胞。按分化潜能的大小，干细胞基本上可分为以下三种类型。 (1)全能性干细胞(Totipotent stem cells) 它具有形成完整个体的分化潜能。如胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESC)，具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织、器官。 (2)多能性干细胞(Pluripotent stem cells) 这种干细胞具有分化出多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少12种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。 (3)单能干细胞也称专能或偏能干细胞(Unipotent stem cells)。这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞或叫卫星细胞。 从干细胞到成熟细胞有许多分化阶段：最原始的干细胞是全能性干细胞，具有自我更新和分化为任何类型组织的能力。迄今为止，只在受精卵才符合这样的定义，囊胚期的胚胎干细胞是否具有全能性仍存在很大争议。分化方向已确定的干细胞叫做多能干细胞，它们将分化为特定的组织，例如造血干细胞将分化为血细胞，肝脏干细胞将分化为肝细胞。这些多能干细胞继续向前分化则成为定向祖细胞(Committed progenitor)。持续停留在某种组织中的干细胞被称为组织特异性干细胞，如造血干细胞(Hematopoietic stem cell，HSC)、肌肉干细胞、表皮层干细胞等都属于此类。随着机体的发育，干细胞逐渐分化为特定类型并行使特定功能。很多成年人组织含有干细胞，当组织受到外伤、老化、疾病等的损伤时，这些细胞就增殖分化。产生新的组织来代替它们，以保持机体的稳态平衡。 干细胞是一类特殊的细胞，它们最显著的生物学特性是既具有自我更新的能力 (Self-renewal)，又具有多向分化的潜能(Multilineage differentiation)。根据其组织发生的名称亦可进行分类。目前，已经从许多组织或器官中成功地分离出干细胞，其中包括：胚胎干细胞、造血干细胞、骨髓间质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSCs)、神经干细胞(Neural stem cell，NSCs)、肌肉干细胞(Muscle stem cell)、成骨干细胞(Osteogenic stem cell)、内胚层干细
第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述 doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011） 2 南方医科大学在读博士（南宁530011） *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸
壹、計畫說明 長期以來造血幹細胞捐贈的傳統觀念中，認為骨髓捐贈是「抽龍骨水」，以至於願意捐贈造血幹細胞的民眾並不多，然而，骨髓捐贈並非抽龍骨水，而現在更有一種新的捐贈方式－週邊血幹細胞捐贈，是多數民眾所不知。台灣每年仍有約300位血癌患者需要尋找非親屬捐贈者，在血液病患日漸增加的情況下，我們更需要持續不斷推廣捐贈造血幹細胞的正確認知，讓民眾在正確的認知下，重新思考捐贈造血幹細胞的意義。 為推動造血幹細胞捐贈，希望透過宣導進而達到提升捐贈率的效果，並藉此將辦理「因為有愛-微電影創意影片」之徵選活動，向民眾徵求創意，吸引更多人加入捐贈行列。 貳、報名資格 一、一般民眾、不限年齡。(歡迎學校及社團踴躍參加) 二、個人或組隊報名均可，一組最多五人。 三、為符合公平原則，已獲得國內外獎項之作品，均不得參賽，違者取消參賽 資格。 四、不拘任何表現方式，發揮創意用5分鐘以內影片投稿參賽。 五、參賽作品不得使用非法取得下載之音樂、影像或影片片段。參賽者若有抵 觸任何著作權之法律，一切法律責任由參賽者承擔。 六、參賽者之作品如涉及智慧財產權者，主辦機關取得全部權利。 七、本活動之參賽作品，無論入選與否，一經送件即視為同意本活動評審所有 規則，並同意授權主辦單位得自行運用相關業務範圍內，對所有參賽作品 之公開發表、公開展示、公開播放、影像及圖文宣導、攝影、重製、改作、 編輯、印製、散布、出版、網頁製作、下載傳輸等相關非商業行為之用途， 日後不得有異議。且不另支付稿費及版稅，參賽者無異議亦不另行索取費 用。
參、徵件期間： 一、報名收件日期：即日起至6月30日止。以郵戳為憑，逾期恕不受理。 二、初審結果公佈：102年7月15日(一) 三、網路投票期間：102年8月1日～8月31日 請上「骨髓幹細胞中心Facebook粉絲團」投票 四、決審：102年9月 五、公布優勝結果：102年9月 六、頒獎典禮：102年本中心週年慶活動(預計9月) 七、成績公佈：公布於活動網站及慈濟骨髓幹細胞中心網站 肆、創作主題 須與造血幹細胞捐贈方式緊密連結，且畫面上需呈現自行設計的標語。 伍、作品規格： 一、類型：不限(劇情片、紀錄片、動畫短片皆可) 二、相關規格： 1.片長：嚴格規範5分鐘以內(包含片頭與片尾) 2.拍攝工具：不限 3.影片格式：像素至少720(W)x480(H)的avi/mov/mpg格式。 4.輸出格式：mpeg格式 5.參賽影片畫面大小至少720x480，最大不得超過1,920x1,080。 6.請將原始影片格式及輸出之mpeg格式，以數位檔案存於隨身碟中或以 CD/DVD-R片燒錄轉檔成之作品繳交。 7.提交作品不予退還，未符合作品競賽規格者不另行通知與退件。
造血干细胞 一定义 造血干细胞是骨髓中的干细胞，具有自我更新能力并能分化为各种血细胞前体细 胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板。也是存在于造血组 织中的一群原始多能干细胞。可分化成各种血细胞，也可转分化成神经元、少突胶 质细胞、星形细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞和肝细胞等。 干细胞可以救助很多患有血液病的人们，最常见的就是白血病。虽其配型成功率相 对较低，且费用高昂，但其治疗效果好且捐献造血干细胞对捐献者的身体并无很大 伤害。 二特征 人体内所有的血细胞都来自造血干细胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＨＳＣ）的定向分化。ＨＳＣ又称多能干细胞，是存在于造血组织中的一群原始造血细胞，有两个重要特性： （１）高度的自我更新或自我复制能力； （２）可定向分化、增殖为不同的血细胞系，并进一步生成血细胞。造血干细胞采用不对称的分裂方式：由一个细胞分裂为两个细胞。其中一个细胞仍然保持干细胞的一切生物特性，从而保持身体内干细胞数量相对稳定，这就是干细胞自我更新。而另一个则进一步增殖分化为各类血细胞、前体细胞和成熟血细胞，释放到外周血中，执行各自任务，直至衰老死亡，这一过程是不停地进行着的。 三造血干细胞的造血原理 1 造血干细胞具有多潜能性，即具有自身复制和分化两种功能。在胚胎和迅速再生的骨髓中，ＨＳＣ多处于增殖周期之中；而在正常骨髓中，则多数处于静止期，当机体需要时，其中一部分分化为成熟血细胞，另一部分进行分裂增殖，以维持ＨＳＣ的数量相对稳定。人类ＨＳＣ首先出现于胚龄第２～３周的卵黄囊，在胚胎早期（第２～３个月）迁至肝、脾，第５个月又从肝、脾迁至骨髓。从胚胎末期一直到出生后，骨髓成为ＨＳＣ的主要来源。造血干细胞进一步分化发育成不同血细胞系的定向干细胞。定向干细胞多数处于增殖周期之中，并进一步分化为各系统的血细胞系，如红细胞系、粒细胞系、单核-吞噬细胞系、巨核细胞系以及淋巴细胞系。2由造血干细胞分化出来的淋巴细胞有两个发育途径，一个受胸腺的作用，在胸腺素的催化下分化成熟为胸腺依赖性淋巴细胞，即T细胞；另一个不受胸腺，而受腔上囊（鸟类）或类囊器官（哺乳动物）的影响，分化成熟为囊依赖性淋巴细胞或骨髓依赖性淋巴细胞，即B细胞。并分别由T、B细胞引起细胞免疫及体液免疫。如机体内造血干细胞缺陷，则可引起严重的免疫缺陷病。