中药缓释制剂体外释放度评价（三） 国际上采用指纹图谱对植物药进行质量控制的国家有韩国、日本、德国等。如德国用指纹图谱技术控制银杏制剂的质量。德国0．Sticher早在1993年发表的文章中指出银杏叶其主要成分是黄酮苷类与银杏内酯，采用十多种化学成分的高效液相色谱图作指纹图谱，同时用其中多个化学成分（指标成分）作为定量的标准。在大量基础研究及严格控制原料及生产全过程的条件下，对银杏叶制剂不仅控制总黄酮和总内酯的含量，而且对黄酮中槲皮素、山柰酚和异鼠李素的比例，总内酯中银杏内酯A. B. C.J和白果内酯的比例，规定了较为明确的范围，作为中药指纹图谱的范例。美国FDA对植物药的质量控制则要求必须控制指纹图谱的检测标准。我国申请FDA临床实验的天津天士力集团的复方丹参滴丸、北京华颐制药厂的威麦宁胶囊、上海史泰隆制药厂的杏林制剂等都制定了指纹图谱检测标准。对于中药缓控释制剂的研究，指纹图谱有巨大的现实意义。按照中医的观点，指标成分的控制，难以真正控制中药功效。中医辨证施治用的是药味而非某个化学成分。麻黄素与麻黄、甘草酸与甘草、人参皂苷与人参等在中医看来是两回事。中药的“补气”、“活血”、“温里”、“发表”、“滋阴”、“健脾”等功效，是药材饮片或成药方剂内含物质群的整体作用结果。所以要控制中药的功效，不仅只针对某几种化学成分，必须对方剂的物质群整体予以控制。在尚不清楚中药全体化学成分的情况下，用现代色谱、光谱、波谱、质谱等仪器分析所得的指纹图谱，实现对物质群整体的控制的思想应运而生。 周俊院士近年提出中药复方是天然组合化学库，周院士认为根据中医药理论和长期实践，筛选出来的中药复方是相对安全和有效的复方。中药复方由多味中药组成，一味 中药可能分离鉴定出100种左右化学成分，由多味中药组成的中药复方可能含有数百种至数千种化学成分。因此中药复方是一个根据中医理论和实践以及单味药功能主治性味，通过人工组合形成的、具有疗效的、相对安全的天然组合化学库。中药复方天然组合化学库中的化学成分大量是单味药本身含有的，少量是加工炮制过程中形成的，包括有效成分和无效化学成分两大类。有效成分是中药复方治疗疾病的药效物质基础，往往含有几种或一群有效成分或生物
兰索拉唑肠溶片体外释放度研究 摘要目的：对于兰索拉唑肠溶片体外释放度进行探讨。方法：通过查阅国内 外相关资料，整理归纳。结果：了解切实可行的测试兰索拉唑肠溶片体外释放度的方法。 关键词兰索拉唑；肠溶片；体外释放度。 相关背景 兰索拉唑为一选择性抑制胃壁细胞H+-K+-ATP酶从而抑制胃酸分泌的抗溃疡药物。它对各种原因引起的胃酸分泌均具抑制作用，具有保护和促进胃粘膜溃疡愈合的作用［1］。而且，兰索拉唑及其相关化合物有较强的抑制幽门螺杆菌的作用，在降低消化性溃疡复发率方面具有良好的作用［2］。临床上主要用于治疗胃及十二指肠溃疡，其疗效较H2受体拮抗剂法莫替丁、雷尼替丁强，毒副作用低，是一有发展前途的抗酸剂。兰索拉唑为一苯骈咪唑类化合物，其对酸不稳 定，为防止药物口服后受胃酸破坏失效，故制备为肠溶片剂。［4］兰索拉唑肠溶片在胃液中不溶解，到了肠道药物才溶解。对于肠溶片的定义据[3]描述如下： 肠溶片：系指用肠溶性包衣材料进行包衣的片剂。为防止药物在胃内分解失效、对胃的剌激或控制药物在肠道内定位释放，可对片剂包肠溶衣；为治疗结肠部位疾病等，可对片剂包结肠定位肠溶衣。肠溶片除另有规定外，应进行释放度检查。 研究方向 为了研究药物的体外释放度，首先了解释放度的概念。 释放度系指口服药物从缓释制剂、控释制剂或肠溶制剂在规定溶剂中释放的速度和程度。检查释放度的制剂，不再进行溶出度或崩解时限的检查。 肠溶制剂系指口服药物在规定的酸性介质中，不释放或几乎不释放，而在缓冲液中大部分或全部释放的制剂。[3] 对于肠溶片的释放度测定，据照《中国药典》2005年版(二部)附录XD释放度测定法第二法[3]描述如下： 第二法用于肠溶制剂 (一) 酸中释放量 除另有规定外，量取0.1mol/L盐酸溶液750ml,注入每个容器，加温使溶液温度保持在37±0.5℃，调整转速并保持稳定，取6片(个)分别投入转篮或容器中,按各药品项下规定的方法，开动仪器运转2小时,立即在规定取样点吸取溶液适量,立即经0.8μm微孔滤膜滤过，自取样至滤过应在30秒钟内完成，滤液按各药品项下规定的方法测定，算出每片(个)的酸中释放量。 缓冲液中释放量
微脂体(又称脂质体)及其制备方法一二 微脂体(又称脂质体) 微脂体起源于1960 年代中期，Bangham博士等人首先提出，在磷酸脂薄膜上加入含盐分的水溶液后，再加以摇晃，会使脂质形成具有通透性的小球；196 8年，Sessa 和Weissmann 等人正式将此小球状的物体命名为微脂体（liposo me）并做出明确的定义: 指出微脂体是由一到数层脂质双层膜(lipid bilayer) 所组成的微小的囊泡，有自行密合（self-closing）的特性。微脂体由脂双层膜包裹水溶液形成，由于构造的特性，可同时作为厌水性（hydrophobic）及亲水性（hydrophilic）药品的载体，厌水性药品可以嵌入脂双层中，而亲水性药品则可包覆在微脂体内的水溶液层中。如同细胞膜，微脂体的脂质膜为脂双层构造，由同时具有亲水性端及厌水性端的脂质所构成，脂双层由厌水性端相对向内而亲水性端面向水溶液构成，组成中的两性物质以磷酸脂质最为常见。微脂体的形成是两性物质在水溶液中，依照热力学原理，趋向最稳定的排列方式而自动形成。微脂体的性质深受组成脂质影响，脂质在水溶液的电性，决定微脂体是中性或带有负电荷、正电荷。此外，磷酸脂碳链部分的长短，不饱和键数目，会决定微脂体的临界温度(transition temperature, Tc)，影响膜的紧密度。一般来说，碳链长度越长临界温度越高，双键数越多则临界温度越低，常见的DPPC(dipalmitoylp hosphatidylcholine)与DSPC(distearoylphosphatidylcholine)的临界温度分别是42℃与56℃，而Egg PC(egg phosphatidylcholine)与POPC(palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine)的Tc 则低于0℃。临界温度影响微脂体包裹及结合药物的紧密度，当外界温度高于Tc时，对膜有通透性的药物，较容易通过膜；此外，当外界温度处于临界温度时，微脂体脂质双层膜中的脂质，会因为流动性不一致而使微脂体表面产生裂缝，造成内部药物的释出。在磷脂质内加入胆固醇，会对微脂体性质产生下列影响：增加微脂体在血液中的安定性，较不易发生破裂；减少水溶性分子对微脂体脂膜的通透性；增加微脂体的安定性，使其在血液循环中存在的时间较长。 微脂体可依脂双层的层数或是粒子大小，加以命名或分类： (1) Multilamellar vesicle（MLV）是具有多层脂双层之微脂体，粒子大小介于100-1000 nm，特色是粒子内具多层脂质膜，一般而言，干燥后的脂质薄膜，
黄芩素脂质体的制备及体外释放的研究 姚亚红,张立伟3 (山西大学分子科学研究所,山西太原030006) 摘 要:目的:研究黄芩素脂质体的制备方法。方法:采用逆相蒸发法、薄膜-超声法制备黄芩素脂质体,利用紫外光谱测定包封率以及浆板法测定体外释放曲线。结果:逆相蒸发制备的脂质体平均粒径179nm ,包封率和载药量分别为92.57%和23.24%;薄膜超声法平均粒径257nm ,包封率和载药量分别为60.02%和7.70%,在PH7.4磷酸盐缓冲液中体外释药符合Higuchi 方程。结论:逆相蒸发法操作简单,重现性好,制备的脂质体粒径小、包封率高,药物具有一定的缓释性。 关键词:黄芩素;脂质体;包封率;制备 中图分类号:R944.9 文献标识码:A 文章编号:1002-2392(2006)03-0031-03 收稿日期:2005-09-02 资助项目:山西省自然科学基金(20041102) 作者简介:姚亚红,女,(1979-),硕士研究生,研究方向为天然药物提取 与分离与药物制剂。 3通讯作者:张立伟,E -mail :lwzhang @https://www.doczj.com/doc/ac16832271.html, 。 黄芩素(baicalein )为黄酮类化合物,是唇形科植物 黄芩(Scutellaria baicalensis G eorgi )的主要有效成分之 一。具有抗菌、抗病毒、抑制炎症反应、保肝、利胆、利 尿、抗癌等作用,具有很好的临床应用价值[1]。但是黄 芩素水溶性差,且易被氧化。大量研究表明,脂质体有 包封脂溶性药物或水溶性药物的特性,药物被脂质体 包封后,保护了药物免受降解,增加了其在水中的溶解 度,且在体内呈现出与药物本身不同的特点。另外,脂 质体作为药物的载体,具有靶向性、缓释性,可增加疗 效,降低药物的毒副作用[2]。根据黄芩素的性质,本研 究以包封率为评价指标,探讨了黄芩素脂质体的制备 方法,并对其体外释放进行考察。 1 实验材料 1.1 仪器 K Q3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公 司);HP 8453UV 一ViS 吸收光谱仪(美国惠普公司); 透射电子显微镜(H -600-2日本日立公司);激光粒 度分析仪(ZET ASIZER 3000HS A ,Malvern InstrumentsC o. L td ,UK );冷冻干燥机(ct60e Heto );旋转蒸发仪RE - 52A (上海亚荣生化仪器厂);TG L -16C 型台式离心机 (上海安亨科学仪器厂);FSH -2A 可调高速匀浆机(江 苏金坛医疗仪器厂)。 1.2 试剂 黄芩素为自制;蛋黄卵磷脂(E pc ,北京双旋微生物 培养机制品厂);胆固醇(Chol ,北京奥博星生物技术责 任有限公司);其它化学试剂均为分析纯。 2 方法和结果 2.1 黄芩素标准曲线的制作精密称取黄芩素10.4mg 置10ml 容量瓶中,用叔丁醇溶解并稀释至刻度。再分别吸取53、58、64、70、77、85、110、142μl ,用蒸馏水定容至10ml ,制成不同浓度的溶液,以蒸馏水为空白,测定各溶液在272nm 处的吸收值。结果表明,黄芩素在272nm 处的吸光度A 与其浓度C 呈良好的线性关系,线性范围为50～140Πml ,其线性回归方程为:C =0.73818+16.04372A (r =0.9998)。2.2 脂质体的制备2.2.1 逆相蒸发法 称取一定比例[3]的E pc 和Chol 溶于无水乙醚中,将适量黄芩素溶于10ml 磷酸盐缓冲液(P BS ,PH6.8)中。再将含有药物的P BS 与有机相混合,水浴超声处理,直至形成稳定的W ΠO 型乳剂,然后于旋转蒸发仪中减压蒸发除去乙醚,达胶态后再加入10mlP BS 水化,继续减压蒸发,即得淡乳黄色脂质体混悬液。2.2.2 薄膜-超声法[4] 称取同样比例的类脂溶于无水乙醚中,然后于旋转蒸发仪中减压蒸发除去乙醚,使类脂在圆底烧瓶内壁形成一层均匀薄膜。加入适量黄芩素磷酸盐缓冲液,水化脂膜,冰浴超声破碎一定时间,即得淡乳黄色脂质体混悬液。2.3 包封率和载药量的测定分别精密吸取2种不同方法制备的黄芩素脂质体混悬液1.0m1,进行离心(13000rpm ,30min ),取上清液于10ml 容量瓶,用蒸馏水和叔丁醇(2∶lv Πv )的混合溶剂定容。于272nm 处测定吸光度,代入标准曲线方程计算游离药物的量(W 游)。同时精密量取1.0ml 的混悬液于25ml 容量瓶中,同法处理,得总药物的量(W 总)。按下式计算包封率和载药量:包封率=(W 总-W 游)ΠW 总×100%;载药量=(W 总-W 游)ΠW 载× 100%,结果见表1。? 13?中医药学报2006年第34卷第3期
国外脂质体载药系统制备技术浅述[摘要]脂质体作为一种载药系统，具有靶向性和淋巴定向性、细胞亲和性和组织相容性、长效作用、降低药物毒性、提高药物稳定性等有优点，在国内外得到广泛的应用。 [关键词]脂质体；载药系统；制备； [abstract]liposomes as a drug carrier system has many merits,such as targeting and lymphatic orientation, cell compatibility and tissue compatibility, long-lasting effect, reduce drug toxicity, improve drug stability etc. so it is widely used at domestic and abroad. [key word]liposomes ;drug carrier system; manufacture; banghman在20世纪60年代中期发现了脂质体，这在药物载体方面是一个里程碑式的发明。[1]脂质体大多是由磷脂构成，因此他们具有高度的生物利用度和生物可降解性，脂质体作为载体的最大优势是能够承载酶、蛋白质和遗传物质等生物大分子。近年来，国外对脂质体制备研究进展较快，简要综述如下。 从形态上脂质体可以分为单室囊泡载药系统和多室囊泡载药系统，按照平均粒径可以分成小囊泡（粒径＜100nm）、中囊泡（粒径100-500nm）、大囊泡（粒径＞100um）。 1.脂质体的组成配方 脂质体最主要的成分为卵磷脂（lecithins）和胆固醇（cholesterol），其他组成成分还包括类固醇分子、负电荷磷脂、
药物释放度研究概述 药物释放度是指药物从缓释制剂、控释制剂、肠溶制剂及透皮贴剂等在规定条件下释放的 速率和程度，是 评价药物制剂质量的内在指标，是制剂质量控制的重要手段。释放度是随着科学技术和生物药剂学的发展而迅速发展起来的一种新的药品检验方法。20世纪70年代确立了溶出度在口服固体制剂中的重要地位，至20世纪80年代，缓释、控释技术发展迅速，释放的概念随之提出。美国药典1985年版（第21版）率先引入释放度检查法，对缓释制剂、肠溶制剂的溶出进行监控，2000年版（第24版）收载释放度检查品种36个。中国药典1995年版引入释放度检查法，2000年版收载释放度检查品种15个，2005年版收载释放度检查品种26个。 1释放度研究的意义 释放度研究的对象一般为半衰期相对较短（2～4h），首过效应明显，治疗剂量范围较窄， 在很广的pH值内较稳定，并经胃肠道充分吸收的药物。将此类药物制成缓、控释制剂，可通过控制释药速率来降低临床不期望的高峰血药浓度，减少“峰谷”现象，避免血药浓度频繁波动起伏或是控制血药浓度在一个较长的时间内维持在有效浓度以上，从而提高药物疗效，提高患者用药的顺应性。与普通制剂相比较，药物治疗作用持久，毒副作用低，用药次数减少，药物缓慢地释放进入体内，血药浓度“峰谷”波动小，能保持在有效浓度范围内以维持疗效。研究药物释放度，在有效控制制剂质量，指导制剂处方筛选和指导制剂制备工艺优化方面有着重要意义。 2体外药物释放度试验 体外药物释放度试验是在模拟体内消化道条件（如温度、介质的pH值、搅拌速率等）下，对制剂进行药物释放速率试验，以监测产品的生产过程与对产品进行质量控制，同时也是筛选缓、控释制剂处方的重要手段。 仪器装置 USP25共收录了7种装置用于释放度测定。装置1（转篮法）、装置2（桨法）、
转基因技术与动物育种 高彩霞，张永升，周天野 甘肃农业大学动物科学技术学院甘肃兰州（730070） E-mail：gcx.815@https://www.doczj.com/doc/ac16832271.html, 摘要：随着转基因技术的不断发展，其在动物育种中取得了很大成果。因此，转基因技术具有诱人的前景和发展前途。本文简要综述了转基因技术的原理、方法、研究前沿领域以及应用于动物育种中的进展情况。 关键词：转基因技术转基因动物动物育种 远缘生物之间的杂交是极其困难的，有些甚至是不可能的，这就是众所周知的种间生殖隔离。那么能否打破这种隔离，使一种生物同时具有一种或几种生物的优良性状，进而培育符合人们意愿的生物新品种，更好地服务于人类呢?科学家们经过多年艰苦的努力和探素，终于使这一愿望变为现实，这就是在基因工程发展的基础上融基因工程和胚胎工程为一体的转基因技术。由于这一技术能够实现基因的种间转移，用于动物育种将大大提高育种的目的性，加快育种进程。自Palrniter等1982年将大白鼠生长激素基因显微注射到小白鼠受精卵，获得比正常小鼠大1倍的“超级巨鼠”以来，世界各国科学家竞相开展转基因技术研究，通过多种转基因方法在猪、牛、鸡、兔、羊等动物上获得成功。如今，转基因技术正在对动物育种产生一场新的革命[1]。 1转基因技术的概述 1.1转基因技术的概念 转基因技术起始于20世纪70年代的高新技术，是按照科研或生产需要在分子水平上用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质（DNA片段），然后在体外切割，并连接形成重组DNA，重组DNA再与载体的遗传物质重新组合，将其引入到没有DNA的受体细胞中，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并使之能稳定地遗传给下一代[2]。简要地说是指将体重组DNA外通过显微注射或载体系统导入胚胎细胞中，并整合到基因组中，得到稳定地表达的技术[3]。 1.2 转基因动物技术的概念 转基因动物技术是在20世纪80年代初发展起来的。从这项技术诞生的那天起，它就在改良畜禽生产性状、提高畜禽抗病力以及利用转基因畜禽生产非常规畜牧产品(如人药用蛋白和工业用酶)等方面显示了广阔的应用前景[4]。它是将外源基因或体外重组的基因转移到动物的受精卵内，使其在随后发育的动物体内得到整合和表达，以产生具有新的遗传特征或性状的动物个体的过程，或者是将外源基因在特定调控元件作用下在某些宿主组织中进行独立的复制，并在一定的时间内表达外源蛋白的过程[1]。 1.3 转入基因的选择 目前在转入基因的选择上主要有四类：1）编码蛋白基因，这类基因参与机体组织生长发育的调节，如生长激素基因等；2）抗性基因；3）经济性状的主效基因，如猪和绵羊的高繁殖力基因和肉牛的“双肌”基因等，这些基因与动物的生产力密切相关；4）治疗人类疾病所需的蛋白质基因[5]。
脂质体及其制备方法的选择 1.脂质体概述 1965年，英国学者Bangham和Standish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现了脂质体。磷脂分散在水中自然形成多层囊泡，每层均为脂质的双分子层；囊泡中央和各层之间被水相隔开，双分子层厚度约为４纳米。后来，将这种具有类似生物膜结构的双分子小囊称为脂质体。此两位学者曾获得过诺贝尔奖提名。 某些磷脂分散在过量的水中形成了脂质体，该脂分子本身排成双分子层，在磷脂的主要相变温度(Tm)以上，瞬间形成泡囊，且泡囊包围水液，根据磷脂种类及制备时所用温度，双分子层可以是凝胶或液晶状态。在凝胶态时磷脂烃链是一种有规律的结构，在液态时烃链是无规律的，每一种用来制备脂质体的纯磷脂由凝胶状态过渡到液晶状态时均具有特征的相变温度。这种相变温度(Tin)是根据磷脂性质而变(见下表)，它可在-20～+90℃之间变化，双分子层的不同成分混合物可引起相变温度的变化或相变完全消失，当双分子层通过相变温度时，被封闭的水溶性标示物的漏出量增加。 脂质体的相变行为决定了脂质体的通透性、融合、聚集及蛋白结合能力，所有这些都明显影响脂质体的稳定性和它们在生物体系中的行为。
脂质体根据其脂质膜的层数和腔室的数量，可以分为单层脂质体，多层脂质体和多囊脂质体，单层脂质体。不同类型的脂质体其结构特点各不相同，见下图表。 1971年，英国Rymen等人开始将脂质体用作药物载体。所谓载体，可以是一组分子，包蔽于药物外，通过渗透或被巨嗜细胞吞噬后载体被酶类分解而释放药物，从而发挥作用。它具有类细胞结构，进入动物体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。脂质体技术是被喻为“生物导弹”的第四代靶向给药技术，也是目前国际上最热门的制药技术。至于药物在脂质体中的负载定位，其取决于所载药物的性质，见下图。
实验十五脂质体的制备 一、实验目的 1. 掌握注入法制备脂质体的工艺。 2. 掌握脂质体包封率的测定方法。 二、实验原理 60年代初 Banghan 等发现磷脂分散在水中可形成多层囊,并证明每层囊均为双分子脂质膜组成且被水相隔开,称这种具有生物膜结构的囊为脂质体。197l 年Ryman 等人提出将脂质体作为药物载体, 即将酶或药物包囊在脂质体中。近年来脂质体作为药物载体在传递给药系统中的研究有了迅速的发展。 脂质体系一种人工细胞膜, 它具有封闭的球形结构, 可使药物被保护在它的结构中, 发挥定向作用。特别适于作为抗癌药物载体,以改善药物的治疗作用,降低毒副作用等。脂质体系由磷脂为骨架膜材及附加剂组成。用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂, 如豆磷脂,卵磷脂等;合成磷脂,如二棕榈酰磷脂酰胆碱,二硬脂酰磷脂酰胆碱等。磷脂在水中能形成脂质体是由其结构决定的。磷脂具有两条较长的疏水烃链和一个亲水基团。当较多的磷脂加至水或水性溶液中, 磷脂分子定向排列, 其亲水基团面向两侧的水相, 疏水的烃链彼此对向缔合形成双分子层, 并进一步形成椭圆形或球状结构——脂质体。常用的附加剂为胆固醇,它也是两亲性物质,与磷脂混合使用,可制备稳定的脂质体,其作用是调节双分子层流动性,减低脂质体膜的通透性。其它附加剂有十八胺,磷脂酸等,这两种附加剂可改变脂质体表面电荷的性质。 脂质体可分为三类:小单室(层脂质体,粒径在 20~50nm,凡经超声波处理的脂质体混悬液, 绝大部分为小单室脂质体; 多室(层脂质休, 粒径约在 400~1000nm; 大单室脂质, 粒径约为 200~1000nm,用乙醚注入法制备的脂质体多属这—类。 脂质体包封率的测定包封率的定义可用下式表示: 包封率% =(W总 - W游离 / W总 x 100
细胞的脂质体转染法和电穿孔转染法 （一）脂质体转染 一、实验试剂及器材 Lipofectamine? 3000 Transfection Reagent，质粒DNA(0.5-5 μg/μL储液)，Opti-MEM?减血清培养基，培养板，酒精灯，离心机，微量移液器，离心管等。 二、实验步骤 1. 接种细胞至70－90%汇合度时转染； 2. 使用Opti-MEM?减血清培养基稀释Lipofectamine? 3000试剂（2管），充分混匀（6孔板Opti-MEM?培养基为125 μL× 2，Lipofectamine? 3000为 3.75和7.5 μL）； 3. 在每管已稀释的Lipofectamine? 3000试剂中加入稀释的DNA（用P3000TM试剂稀释）（1:1比例）； 4. 室温孵育5分钟； 5. 加入DNA－脂质体复合物至细胞中； 6. 37°C(PK-15在39°C下培养)孵育细胞2–4天，然后分析转染细胞。 三、注意事项 1. 在无血清培养基（如Opti-MEM?减血清培养基）中制备DNA－Lipofectamine? 3000脂质体复合物，直接将其加入含细胞培养基的细胞中（在血清／抗生素存在或不存在时均可）； 2. 转染后无需去除转染复合物或者更换／添加培养基；
3. Lipofectamine? 3000试剂用量各有不同，测试推荐的两种浓度的Lipofectamine? 3000试剂，以确定最佳用量，开始新的转染； 4. Lipofectamine? 3000试剂应放在4℃储存（切勿冷冻）。 附上Lipofectamine 3000 REagent Protocol：
半固体制剂体外释放研究需注意细节 半固体制剂包括油膏剂、眼膏剂、凝胶剂，常常是经皮用药，其体外释放在处方筛选中非常有用，可用于预测基质的释放行为，比较药物的释放速率。但至今为止，在各国药典中对于半固体制剂的体外释放均没有做具体规定。垂直扩散池法是半固体制剂的体外释放最常用的方法，目前美国食品药品管理局（FDA）的SUPAC-SS指导原则中规定的半固体制剂释放方法也是垂直扩散池法。此方法操作简便，结果重现性好，有人认为，垂直扩散池法有望成为半固体制剂质量控制的法定标准之一。在应用垂直扩散池法研究药物的释放行为时，人工合膜的选择、接受介质、释放曲线等是值得关注的细节。 ▲合理选择人工合成膜 人工合成膜主要作为一惰性支持物而存在，膜置于制剂与接收介质之间作为支撑以保持制剂的形态完整性。膜应是多孔的，膜的孔隙间充满接受介质，药物从半固体制剂中转移到膜中分配进入膜间的接受介质，最终药物分子扩散通过膜的孔隙进入接受介质本体。膜的选择常需符合以下几个要求：保证膜性质的重复均一性；不与药物发生结合；不与
释放介质发生作用；不存在扩散滞留现象。目前，FDA实验室常用惰性、低扩散滞留的聚砜膜。但聚丙烯膜、纤维素膜、聚酰胺膜、聚丙烯酸酯膜、聚乙烯膜等也有人在使用，些膜在测定药物的释放时均得到了满意的结果。 国外学者研究了萘普生通过不同人工合成膜的释放 行为，所用样品包括萘普生饱和溶液和市售制剂（Reuxen.凝胶和Naprosyn.凝胶），通过比较样品的释放行为来选择合适的人工合成膜，以便研究出可靠的、重复性好的体外释放方法用于研究萘普生的体外释放动力学。实验者釆用改良垂直扩散池，所用的膜包括0.2μm醋酸纤维素膜、0.45μm聚醚砜膜、聚硅酮和EVA。结果表明用多孔型人工合成膜醋酸纤维素膜和聚醚砜膜进行释放研究时，测得的萘普生饱和溶液和市售制剂的释放量对时间的平方根作图均呈良好的线 性关系，这表明释放的控速步骤是药物在饱和溶液或凝胶中的扩散，说明在控制产品的质量方面膜醋酸纤维素膜和聚醚砜膜能用来评价产品的特性。 而用固态膜聚硅酮进行药物的释放研究时，用测得的释放量对时间的平方根作图均未呈现良好的线性关系，而是释放量与时间成线性关系，表明制剂与固态膜聚硅酮和EVA 发生相互作用，药物在膜中的分配和扩散是限速步骤。因此这两种膜在控制产品质量上不能用来评价产品的释放特性。 ▲选择接受介质是关键
2.2zIP中空微球体外释放度测定方法的建立 2.2.1释放度测定方法 按照中国药典2005年版第二部附录XC溶出度测定法第三法装置，照XD第 一法测定微球的释放度。精密称取z1P中空微球适量(约相当于zIP1omg)装入2 号胃溶胶囊，置于250mL释放介质中进行释放度测定，温度为(37士0.5)℃，转速为150rpm。分别于l，2，4，8，12，20，24h各取样smL(同时补加相同温度相同体积的相应释放介质)，用0.8林m微孔滤膜过滤。将胶囊壳分别溶于相应的释放介质作为空白对照，于315nm波长处测定紫外吸收度。 2.2.2放介质的选择 分别以250mL的O.lmol.L一’盐酸溶液、1%吐温80o.lmol.L一’盐酸溶液、20% 异丙醇0.lmol·L一’盐酸溶液、200，0乙醇o.lmol·L一‘盐酸溶液、o.250，ososo.lmox·L一‘盐酸溶液、pBS(PH=6.8)溶液和0.25%sDS的pBS(pH=6.8)溶液为释放介质，按本章2.2.1项进行释放度测定，计算药物的累计释放度， 2.2.3标准曲线的制备 精密称取干燥至恒重的ZIP对照品12.50mg，加入适量无水乙醇于烧杯中溶解，转移至50mL容量瓶中，定容，摇匀，配制成250.00pgmL一’的储备液。分别取储备液适量于lomL容量瓶中，用0.25%sDso.lmol·L一’盐酸溶液定容，分别配制成浓度为1.00，2.00，4.00，5.00，16.00，32.00，so.oopg·mL一’的zIP标准工作液，于315nm处测定其吸收度，以吸收度(A)对浓度(C)进行线性回归， 2.2.4回收率 分别精密吸取2.2.3项下250.00此·mL一’ZIP储备液适量，加入相应比例的空白微球，溶解后转移至50mL容量瓶中，用。，25%sDSO.1mol.L一‘盐酸溶液定容，摇匀，配制成低、中、高(4.00，16.00，32.00林g·mL一’)3种浓度的zIP溶液，0.5林m微孔滤膜过滤，于315nm处测定吸收度，计算ZIP的回收率， 2.2.5精密度 分别吸取适量250.00陀·mL一’ZIP储备液，用0.25%sDso.lm。卜L一’盐酸溶液配制成低中高(4.00，16.00，32.00陀·mL一’)3种浓度的zIP溶液，一天内各测定5次，计算日内精密度;连续测定5天，计算日间精密度， 2.2.6稳定性 取处方量辅料，分别加入适量zIP对照品，置0.25%sDso.lm。卜L一’盐酸溶液250mL中，配制成低中高三种浓度的溶液。按本章2.2.1项释放度测定方法，在温度为(37士0.5)oC，转速为15orpm条件下，分别于。、4、s、12、24h各取样smL，用0.8林m微孔滤膜过滤后，于31snm波长处测定其吸收度，计算RSD 值，
实验十五 脂质体的制备
一实验目的 1.了解脂质体（liposome）在细胞 工程技术中的应用及其制备方法。 2.掌握采用超声波法、冰冻干燥法 和冻融法三种不同的方法制备脂 质体的方法并了解该技术在细胞 工程中的应用。
二实验原理 脂质体（liposome）的制备技术，一般采用超声波法、振荡法、乙醚蒸发法、去污剂透析法、冰 冻干燥法和冻融法等。制备方法 不同，所得脂质体结构、大小不 同，性质和用途也就不同（表15-1）。
种类制备方法大小(m) 特性 多层大脂质体(MLV) 乙醚蒸发法、醇醚水 法、振荡法、液相快 速混合振荡法 0.1~50 易制备，包被物释放 速度慢 单层小脂质体(SUV) 直接超声波法、溶剂 超声波法、乙醚注射 法 0.02~0.05 体积小，适合包被离 子、小分子药物等 单层大脂质体(LUV) 递相蒸发法、去污剂 （胆酸纳等）透析法、 冰冻干燥法 0.05~0.5 适合包被蛋白质、 RNA、DNA片段、 大分子药物及细胞融 合 单层巨大脂质体(GUV) 冻融法5~30 适合包被蛋白质、 RNA、DNA片段， 除菌处理较难
本实验采用超声波法、冻融法、冰冻干燥 法三种不同类型的方法，超声波法的原理是：在超声波作用下，磷脂类双亲媒性分子被打碎为分子或分子团，并自动重新排布成类似生物膜的双分子层囊泡。冻融法是在超声波法形成的小脂质体基础上，通过冷冻和融解过程使其破裂，重组为大体积脂质体，在通过透析时膜内外渗透压的变化而膨胀为更大体积的脂质体。冰冻干燥法语原理与冻融法基本一致，只在处理条件上有所不同。
三实验用品 1.器材 超声波清洗机、光学显微镜、荧光显微镜、荧光 分光光度计、漩涡混合器、核酸蛋白检测仪、柱层析装置、冰冻干燥机。 2.试剂 １）磷脂液：100mg经丙酮-乙醚法纯化的卵磷 脂，57.2mg胆固醇，溶于1ml氯仿。 ２）荧光液：钙黄绿素（calcein）47mg溶于 100ml Tris缓冲液。 ３）Tris 缓冲液：称取Tris 0.12g，EDTA 0.288mg，溶于80ml去离子水中，用0.1 mol/L 盐酸调Ph7.2，再加水至100ml。
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 日期：2012-06-25 来源：互联网作者：青岚点击：4751次 摘要： 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀 法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 找产品，上生物帮 >> >> 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n， n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR 混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 二、脂质体转染操作步骤
脂质体的制备方法及其研究进展 作者：穆筱梅，梁世强 【摘要】介绍了目前常用脂质体的两大类制备方法：被动载药法和主动载药法，并对其优缺点进行比较。被动载药法适于脂溶性强的药物，包封率高且不易泄露；而主动载药法适于两亲性药物。 【关键词】脂质体；被动载药；主动载药 脂质体作为药物载体具有提高药物疗效、减轻药物不良反应及靶向作用的特点。三十多年来，人们就其制备方法进行了大量的研究。脂质体是由磷脂分子在水相中通过疏水作用形成的，因此制备脂质体所强调的不是膜组装，而是如何形成适当大小、包封率高和稳定性高的囊泡。制备的方法不同，脂质体的粒径可从几十纳米到几微米，并且结构也不尽相同。目前，制备脂质体的方法较多，常用的有薄膜法、反相蒸发法、溶剂注入法和复乳法等，这些方法一般称为被动载药法，而pH梯度法，硫酸铵梯度法一般被称为主动载药法。 1 被动载药法 脂质体常用制备方法主要有薄膜分散法、反相蒸发法、注入法、超声波分散等。在制备含药脂质体时，首先将药物溶于水相或有机相中，然后按适宜的方法制备含药脂质体，该法适于脂溶性强的药物，所得脂质体具有较高包封率。 1.1 薄膜分散法 此法最初由Bangham 等报道，是最原始但又是迄今为止最基本和应用最广泛的脂质体的制备方法。将磷脂和胆固醇等类脂及脂溶性药物溶于有机溶剂，然后将此溶液置于一大的圆底烧瓶中，再旋转减压蒸干，磷脂在烧瓶内壁上会形成一层很薄的膜，然后加入一定量的缓冲溶液，充分振荡烧瓶使脂质膜水化脱落，即可得到脂质体。这种方法对水溶性药物可获得较高的包封率，但是脂质体粒径在0.2～5 μm 之间，可通过超声波仪处理或者通过挤压使脂质体通过固定粒径的聚碳酸酯膜，在一定程度上降低脂质体的粒径。 1.2 超声分散法 将磷脂、胆固醇和待包封药物一起溶解于有机溶剂中，混合均匀后旋转蒸发去除有机溶剂，将剩下的溶液再经超声波处理，分离即得脂质体。超声波法可分为两种“水浴超声波法和探针超声波法”，本法是制备小脂质体的常用方法，但是超声波易引起药物的降解问题。 1.3 冷冻干燥法 脂质体混悬液在贮存期间易发生聚集、融合及药物渗漏，且磷脂易氧化、水解，难以满足药物制剂稳定性的要求。1978 年Vanleberghe 等首次报道采用冷冻干燥法提高脂质体的贮存稳定性。目前，该法已成为较有前途的改善脂质体制剂长期稳定性的方法之一。 脂质体冷冻干燥包括预冻、初步干燥及二次干燥 3 个过程。冻干脂质体可直接作为固体剂型，如喷雾剂使用，也可用水或其它溶剂化重建成脂质体混悬液使用，但预冻、干燥和复水等过程均不利于脂质体结构和功能的稳定。如在冻干前加入适宜的冻干保护剂，采用适当的工艺，则可大大减轻甚至消除冻干过程对脂质体的破坏，复水后脂质体的形态、粒径及包封率等均无显著变化。单糖、二糖、寡聚糖、多糖、多元醇及其他水溶性高分子物质都可以用做脂质体冻干保护剂，其中二糖是研究最多也是最有效的，常用的有海藻糖、麦芽糖、蔗糖及乳糖。本法适于热敏型药物前体脂质体的制备，但成本较高。陈建明等［1］以大豆磷脂为膜材，以甘露醇为冻干保护剂，采用冻干法制备了维生素A前体脂质体，复水化后平均粒径为0.615 1 μm ，包封率98.5%。林中方等［2］采用冻干法制备了鬼臼毒素体脂质体，复水化后平均粒径为 1.451 μm ，包封率72.3%，但是这种方法仍然存在着不足之处，例如脂质体复水化后粒径分布不够均匀。 1.4 冻融法 此法首先制备包封有药物的脂质体，然后冷冻。在快速冷冻过程中，由于冰晶的形成，使形成的脂质体膜破裂，冰晶的片层与破碎的膜同时存在，此状态不稳定，在缓慢融化过程中，暴露出的脂膜互相融合重新形成脂质体。何文等［3］分别用反相蒸发法、乳化法和冻融法制备了甲氧沙林脂质体。通过研究发现，冻融法制备的脂质体的包封率最高，但是粒径最大。反复冻融可以提高脂质体的包封率，王健松［4］
脂质体的制备及检测 一.目的要求 1.掌握注入法制备脂质体的工艺。 2.掌握脂质体包封率的测定方法。 二.实验原理 1. 60年代初，Begkan等发现磷脂分散在水中可形成多层囊，并证明每层囊均为双分子脂质膜且被水隔开，称这种具有生物膜结构的囊为脂质体。1971年Rymen 等人提出将脂质体作为药物载体，即将酶或药物包裹在脂质体中。 2. 脂质体系一种人工细胞膜，它具有洋葱似的封闭球形结构，可使药物被保护在它的结构中，发挥定向作用，特别适于作为抗癌药物载体，以改善药物的治疗作用，降低毒副作用等。脂质体系由磷脂为骨架膜材及附加剂组成。用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂，如豆磷脂，卵磷脂等，合成磷脂，如二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱等。磷脂在水中能形成脂质体是由其结构决定的。磷脂具有两条较长的疏水烃链和一个亲水基团。当较多的磷脂加至水或水性溶液中，磷脂分子定向排列，其亲水基团面向两侧的水相，疏水的烃链彼此对向缔合形成双分子层，形成椭圆形或球状结构一—脂质体。常用的附加剂为胆固醇，它也是两亲性物质，与磷脂混合使用，可制备稳定的脂质体，其作用是调节双分子层流动性，减低脂质体膜的通透性。其它附加剂有十八胺、磷脂酸等，这两种附加剂可改变脂质体表面电荷的性质。 3. 脂质体载药系统的优势： 1.被动靶向：脂质体进人体内可被巨噬细胞作为外界异物而吞噬，主要被单核巨噬细胞系统的巨噬细胞所吞噬而摄取，形成肝、脾等网状内皮系统的被动靶向性。 2.缓释作用：将药物包封成脂质体，可减少肾排泄和代谢，延长药物在血液中的滞留时间，使药物在体内缓慢释放，从而延长了药物的作用时间。 3.降低药物毒性：药物被脂质体包封后，有效地在肝、脾和骨髓等单核巨噬细胞较丰富的器官中浓集，对心、肾有毒性的药物或对正常细胞有毒性的抗癌药包封脂质体后，可明显降低药物的毒性。 4.提高稳定性：一些不稳定的药物被脂质体包封后，可受到脂质体双层膜的保护。 4. 常用的脂质体制备方法： 注入法、薄膜分散法、超声波分散法、逆向蒸发法。 脂质体作为药物载体的应用： 1、抗肿瘤药物载体：
2 脂质体的制备方法 2.1 薄膜蒸发法该方法是将脂质及芯材（脂溶性药物）溶于有机溶剂，然后将此溶液置于大圆底烧瓶中，再旋转减压蒸干，磷脂在烧瓶内壁上会形成一层很薄的膜，然后加入一定量的缓冲溶液（生理盐水），充分振荡烧瓶使脂质膜水化脱落，即可制得脂质体。尽管薄膜分散法是使用最广泛的方法，由于这种方法比较原始，所以尚存在较多缺点。用该方法制备得到的脂质体的粒径较大且不均匀，为了使其粒径更小、更均匀，可通过超声波仪处理，在一定程度上降低脂质体的粒径，从而提高包封率。如采用此法制备得到的细辛脑脂质体的包封率达54. 1%[5]。 2.2 超声波法 MLVs的混悬液经超声波处理，再通过 Sepharose 2B或4B柱色谱仪可去除较大的脂质体和 MLVs 。常用的方法有探针型和水浴型。小量脂质悬液（高浓度脂质或黏性水溶液）需要高能 量时用探针型。水浴型更适于大量的稀释脂质。郑宁等[6]采用薄膜 -超声分散法制备依托泊苷脂质体，按均匀设计的最优组合制备脂质体的平均包封率为（61.58±0.83）% ，粒径均小于2卩m,体外释药达到了长效缓释的作用，60Co灭菌后脂质体较稳定。李维凤等⑺以薄 膜-超声法和乙醚注入法制备硝苯地平脂质体，结果表明薄膜蒸发法和超声法综合使用，所得脂质体粒径均匀,粒度小,且多为单室。 2.3复乳法（二次乳化法）这种方法是先将脂质溶于有机溶剂,加入待包封芯材的溶液,乳化得到W/O 初乳,其 次将初乳加入到 10 倍体积的水溶液中混合,进一步乳化得到 W/O/W 乳液,然后在一定温度下去除有机溶剂即可得到脂质体,其包封率变化较大,一般为20%-80% 。通过研究发现, 在第二步乳化过程和有机溶剂的去除过程中, 对脂质体的粒径有较大影响的因素是温度, 较 低的温度有利于减小脂质体的粒径。姚瑶等[8]采用二次乳化法制备的酪丝亮肽多囊脂质体, 不仅稳定性好，80%的粒径分布在 20-30卩m，且包封率为 92. 43%。 2.4反相蒸发法（逆相蒸发法）反相蒸发法最初由 Szoka 和 Papahadjopoulos 于 1978 年提出, 这 种方法适用于脂质成分中磷脂占有较大的比例, 且芯材中水溶性成分较多的情况。一般的制备方法是将脂质等膜材料溶于有机溶剂中,加入芯材药物的水溶液经过短时超声振荡形成稳定的W /O 乳液后,减 压蒸发除掉有机溶剂,形成所谓“反相胶团” ,在达到胶态后,滴加缓冲液,旋转蒸发使器壁上的凝胶脱落,然后在减压下继续蒸发,制得水性混悬液, 再除去未包入的芯材,即得到 单层脂质体。因这种方法可包裹较大的水容积, 所以一般适用于包封水溶性药物、大分子生物活性物质等的情况。李淑梅等[9]采用逆向蒸发法制备黄芪多糖脂质体,操作简单可行,包 封率为 44. 32%。 2.5 注入法将脂质和芯材溶于水中或者不相溶的有机溶剂中, 然后用微量注射器把有机相均速注射到水相（含水溶性药物）中,搅拌挥发除去有机溶剂,再超声得到脂质体。此法根据溶剂的不同可分为乙醇注入法和乙醚注入法。用乙醇注入法制备时若放慢注入速度可制得具有较高包封率的脂质体, 并且乙醇注入法避免了使用有机溶剂。乙醚注入法制备的脂质体大多为单层脂质体，粒径绝大多数在 2卩m以下，操作过程中温度比较低（40 — 50C），该方法适用于在乙醚中有较好溶解度和对热不稳定的芯材, 通过调节乙醚中不同磷脂的浓度, 可以得到不同粒径且粒径分布均匀的脂质体混悬液。许洁等[10]采用乙醇注入法制备环孢素 A 脂质体, 包封率高达 87. 09%。 2.6冷冻干燥法 采用低温干燥技术，通过反复包封、冻干和重新融合来实现较高的包封率。冻干法为提高脂质体储存期的稳定性提供了较好的解决方法，它改变了液态脂质体不稳定和易氧化的缺点，具有工艺稳定、适合于工业化生产、质量易于控制和产品稳定性好等特点。冻干法存在的问题是 :制备工艺