角膜内皮细胞计 说明书 SP-3000P
前言 感谢您购买了TOPCON SP-3000P角膜内皮细胞计。 此仪器有如下特点： ●能拍摄角膜内皮和测量角膜厚度。 ●自动校准功能确保快速、轻松的摄影和测量。 ●简化了的、具有参考价值的细胞分析，例如对细胞密度的分析，轻松可得。 此说明书介绍了SP－3000P角膜内皮细胞计的基本构造、基本操作、容易出现的问题、保养和清洁的方法。 在操作此仪器前，请仔细阅读“警告标记”和“安全注意事项”。
使用注意事项 要点 向上、向下移动颚托时要小心，不要卡住病人的手、造成伤害。为了避免触电不要打开仪器罩。有问题请联系TOPCON授权的经销商。触电可引起烧伤或火灾。换保险丝之前先关闭主电源开关，并把电源线拔出。只能换上同样规格的保险丝。 处理 处理此仪器时须按照本地的有关规定。 使用环境 温度：10°C ~ 40°C 湿度：30% ~ 75% (无凝露) 气压：700hPa ~ 1060hPa 安装、储存和使用寿命 1．安装环境（无包装）： 温度：10°C ~ 40°C 湿度：30% ~ 75% (无凝露) 气压：700hPa ~ 1060hPa 2．如果要储存此仪器须确认具备以下条件： a.仪器上没有水。 b.储存地点的气压、温度、湿度、通风、光线、灰尘量、空气酸碱度等不会给仪器 造成不良影响。 c.不要在斜坡、不平坦或振动的地面储存或搬运此仪器。 d.不要把仪器放在有化学品或煤气的地方。 3．使用寿命： 如果有定期维修，交货后8年。 带包装时的运输和储存环境 温度：-20°C ~ 50°C 湿度：10% ~ 95% 保养须知 1．定期检查仪器和部件。 2．长期停机再次使用前须确认此仪器可安全、正常工作。 3．不要让摄影窗沾上手指印或尘土，否则会影响画面质量。 4．如果摄影窗脏了，请根据第74页上的“清洁摄影窗”操作。
角膜病专科出科考 一、选择题 1. 对酸或碱性烧伤急救而言，最重要的是（） A．滴入消炎眼药水 B．彻底冲洗眼部 C．滴入碱性或酸性药物 D．结膜下注射维生素C 2．下列哪种角膜炎最危险（） A．绿脓杆菌性角膜炎 B．真菌性角膜炎 C．匍行性角膜溃疡 D．棘阿米巴性角膜炎 3.哪种检测方法有助于诊断单纯疱疹病毒性结膜炎（） A．结膜分泌物刮片 B．免疫荧光 C．检测血清抗体效价 D．结膜分泌物涂片 4．真菌性角膜炎治疗时，哪一项不正确（） A．并发虹睫炎者可用1％匹罗卡品点眼 B．忌用皮质类固醇 C．保守治疗无效时，可手术 D．局部应用抗真菌药物 5.细菌感染引起的角膜溃疡的特点不正确的有（） A溃疡常位于角膜中央 B溃疡表面粗糙、干燥 C溃疡边缘锐利，有穿掘状外观 D溃疡常为圆形 6. 眼部滴用的糖皮质激素的适应症不包括（） A泡性结膜角膜炎 B角膜基质炎 C真菌性角膜炎 D春季卡他性结膜炎 7. 哪项不是地图-点状-指纹状上皮基底膜营养不良的表现( ) A．可反复出现上皮剥脱 B．角膜中央上皮层及基底膜可出现灰白色小点，地图样线和指纹状细小线条混浊C．可应用角膜上皮黏性润滑剂 D．病变常表现为单眼 8. 下列哪个不是慢性细菌性结膜炎的致病菌( ) A．金黄色葡萄球菌 B．Morax-Axenfeld双杆菌 C．萘瑟淋球菌 D．大肠杆菌 9. 关于ShirmerⅠ、Ⅱ、Ⅲ试验( ) A．前二者<15mm／5min为低分泌 B．前二者<1Omm／5min为低分泌 C．前二者<14mm／5min为低分泌 D．前二者<12mm／5min为低分泌 10．关于棘阿米巴角膜炎，何者不对( ) A．常表现为慢性、进行性角膜溃疡
Ist. Nazionale Neurologico Carlo Besta Laboratory Procedures for Human Cell Culture August 2004 _______________________________________________________________ PRIMARY FIBROBLAST CULTURE FROM HUMAN SKIN BIOPSY This protocol describes the steps for obtaining a primary fibroblast cell line from human skin biopsies. Fibroblasts are derived directly from excised skin as explants; enzyme digestion by collagenase may help obtain cells in a shorter time. This protocol describes the different steps for obtaining a primary cell line from a skin biopsy. Equipment and materials ?Laminar flow hood ?CO2 incubator ?Inverted microscope ?Sterile surgical Instruments for microdissection ?BME fibroblast medium +2 or Mg+2 ?PBS 10x without Ca ?Collagenase type II (4mg/ml) ?Petri dishes 100 mm ?Pasteur pipettes 2 ?Culture flask, 25 cm ?15 ml sterile plastic tube BME Fibroblast medium BME 80 ml Foetal bovine serum 20 ml Penicillin-streptomycin solution 100x 1 ml Filter and store at +4°C, up to 1 month. The skin biopsy sample should be shaped as a diamond and about 5-10 mm in diameter. Collect the tissue sample in sterile BME fibroblast medium. Procedure 1 1.Rapidly wash the skin biopsy in PBS in a Petri dish, cut into small fragments and transfer these to a flask. https://www.doczj.com/doc/ab11316667.html,ing a sterile Pasteur pipette with flame-rounded tip, distribute the small tissue fragments over the bottom surface of the culture flask. 3.Pass the flask rapidly and carefully through the Bunsen flame in order to evaporate the medium so that the minced tissue pieces adhere to the plastic surface, but so as not to heat-damage the minced tissue. Take care not to cook the tissue! 4.Carefully add BME medium for fibroblast growth, firmly close the lid of the flask and place in CO2 incubator. 5.The next day, slightly unscrew the lid of the flask so that the tissue can “breathe.” 6.Replace the culture medium after two days and, from this point on, replace it three times a week.
·基础研究· 以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞* 杨俊林 刘雄昊喻姣玲冯劢谭杨李卓吴 奔 高 庭 潘 盛 邬玲仟梁德生夏家辉 （中南大学医学遗传学国家重点实验室湖南长沙410078） 摘要目的：比较人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblasts,HDFs ）与小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs)的增殖能力及研究人皮肤成纤维细胞作为饲养层支持人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs ）未分化生长的能力。方法：利用组织贴壁法从人皮肤中分离出HDFs ，通过细胞形态的观察和生长曲线的绘制比较HDFs 与MEFs 的体外增殖能力。将HDFs 作为饲养层细胞与hESCs 共培养，传代12代后，检测hESCs 碱性磷酸酶(AKP)、表面特异性标志及胚胎干细胞特异性转录因子。结果：HDFs 可连续传代培养15代以上，10代以下的HDFs 增殖迅速，而MEFs 自第4代起，增殖能力就明显下降；hESCs 在HDFs 饲养层上可传代培养12代以上，克隆边界清晰，细胞排列紧密，碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性，表达了hESCs 特异性转录因子。结论： HDFs 比MEFs 具有更强的增殖能力；HDFs 可作为培养hESCs 的饲养层细胞。关键词：人胚胎干细胞；人皮肤成纤维细胞；饲养层细胞中图分类号： R329.2文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2009） 16-3001-05Culture of human embryonic cells by using human dermal fibroblasts as feeder cells* YANG Jun-lin,LIU Xiong-hao,YU Jiao-ling,FENG Mai,TAN Yang,LI Zhuo,WU Ben,GAO Ting, PAN Sheng,WU Ling-qian,LIANG De-sheng,XIA Jia-hui （State Key Laboratory of Medical Genetics,Central South University,Changsha,410078，China ） ABSTRACT Objective:To compare the proliferative potential of human dermal fibroblasts(HDFs)and mouse embryonic fibroblasts (MEFs),and to explore the feasibility for HDFs as feeder cells to support the growth of human embryonic cells (hESCs).Methods:HDFs were obtained from human skin by using the method of tissue-adherence.The proliferative capacities of HDFs and MEFs were compared by cell morphology and growth curve.HDFs were used as feeder cells to culture hESCs.After growing on HDFs for 12passages,the hESCs were tested for the expressions of alkaline phosphatase (AKP),the cell surface markers and cell-specific transcription factor of hESCs.Results:HDFs could be subcultured for more than 15passages,and retained strong proliferative potential before 10passages,while it decreased obviously in MEFs after subcultured for 4passages.The hESCs can passaged on HDFs feeder cells for 12passages with tightly packed cells and clear boundaries of clone,showing the positive results of alkaline phosphatase (AKP)and the cell surface markers and the expression of hESCs-specific transcription factor.Conclusion:HDFs showed a stronger proliferation ability than MEFs;HDFs can support the growth of hESCs. Key words:Human embryonic stem cells;Human dermal fibroblasts;Feeder cells Chinese Library Classification:R329.2Document code:A Article ID:1673-6273（2009） 16-3001-05*基金项目：国家重点基础研究发展计划（2004CB518800），国家高技术研究发展计划（2007AA021002和2007AA021206）和国家自然科学基金（30700458和30971298） 作者简介：杨俊林（1977-），男，博士研究生，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：yangjunlin@https://www.doczj.com/doc/ab11316667.html, 刘雄昊（1975-），男，博士，助理研究员，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：liuxionghao@https://www.doczj.com/doc/ab11316667.html, 杨俊林、刘雄昊为并列第一作者 △通讯作者：梁德生，E-mail ：liangdesheng@https://www.doczj.com/doc/ab11316667.html, （收稿日期：2009-07-06接受日期：2009-07-30） 前言 自1998年Thomson [1]等人建立第一株人胚胎干细胞（hu-man embryonic stem cells,hESCs ）细胞系以来，hESCs 迅速成为人干细胞领域的研究热点。 hESCs 是具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，可以定向分化成不同的细胞、组织，这使得hESCs 在细胞治疗以及再生医学方面具有巨大的潜力。目前大 多数的人胚胎干细胞系是以小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse em-bryonic fibroblasts,MEFs)作为饲养层细胞维持其生长和未分化状态的， MEF 细胞通过与hESC 直接接触及分泌多种因子维持人胚胎干细胞未分化状态。而鼠源性的饲养层细胞很可能给hESCs 带来动物源性的病原体或生物活性分子的污染，严重阻碍hESCs 的临床应用。早期就在鼠的细胞发现Hantaan 病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV ）、呼肠病毒-3[2]，这些病
角膜内皮细胞功能及其临床意义 李旭 09临床乙班【关键词】角膜内皮细胞；功能 角膜内皮细胞对角膜透明性有着至关重要的作用，角膜的高度透明是实现视觉器官正常生理功能的重要条件之一，而解剖形态完整和生理功能正常的角膜内皮层则是保持角膜透明的关键。故临床眼科医生在任何内眼手术中，均要十分注意对内皮细胞的保护。同时术前ti王要极为注意对其活性的检测研究近年来由于各种新技术在眼科领域的应用和生物技术的发展，对角膜内皮细胞活性的检测研究d三逐渐深入。 一角膜内皮细胞的功能 作为角膜最内层的内皮层是由单层内皮细胞所组成，它前附着于后弹力层，后与前房水接触，内皮从角膜中央到周边可被分为四个区：I区：占角膜中央8．6～91II111的大片区域；1I区：宽度仅150 ～500urn；m 区：宽度50～150urn；1V区包括最周边部分，与角膜的小梁网毗邻，宽50～lOOum?。角膜内皮细胞是通过其主动的代谢性液泵作用，把房水与角膜基质隔开的生理屏障，其泵一漏系统可防止过多的水分和溶质通过，使角膜基质保持相对脱水的状态，维持其透明性。这一作用的实施，是通过角膜内皮细胞的的Na 一K 一ATP酶的活性，维持角膜内和房水内的Na 梯度。内皮细胞之间的复合连接结构，又起到防止水分渗入角膜内的屏障作用，从而保持角膜实质层的相对脱水状态。任何导致角膜内皮细胞损害的因素，均能使这一屏障功能受损，而导致角膜水肿，失去其透明性。 二检测方法的发展史 最初在发现了裂隙灯显微镜后，人们发现通过镜面反射照明法可以观察角膜内皮细胞的密度及形态，1968年David Maurice利用镜面反射的原理制造出内皮显微镜，1970年Brown制造出临床非接触内皮显微镜，但只能放大10倍，1975年Laring对仪器进行改造使其放大100倍或更大，产生高分辨率，后Brown和Bigan等又进一步改进，发展到目前的非接触及接触式两种而应用于临床。电子显微镜及共焦显微镜的问世也为角膜内皮的研究增添了新的途径。尤其是共焦显微镜，它可以从细胞水平来判定各种角膜疾病。 三临床意义 1.正常角膜内皮细胞形态及密度为一单层扁平细胞，呈六角形、紧密镶嵌、大小均等、排列整齐，对维持角膜透明和相对脱，K状态有极为重要作用。正常人的角膜内皮细胞密度(每平方毫米内皮细胞的数量)随年龄增长而降低，体内HCECs随年龄增长会发生衰老改变，各年龄段HCECs中均有衰老相关基因的表达，pl6INK4a的相对表达量随年龄增加而增高，其介导的衰老通路可能在正常HCECs衰老的过程中发挥着重要作用。婴幼儿期细胞通过有丝分裂增殖，总数约为90～l00万个，成人后则无增殖能力，损伤区域由邻近细胞扩展、移行来覆盖。正常人HCECs在3O岁以前平均细胞密度3 000～4 000个／ram ，31～40岁为3 000个／mm 左右，41～50岁为2 800个／ram 左右。51～60岁为2 600个／mm2左右．61～80岁为2400～2 500个mIn 左右，80岁以上为2 160～2 400个／ram 。一般认为维持正常角膜内皮屏障功能所需最低临界密度为700个／mln 、 1.1角膜内皮细胞图象定性分析 1.1.1 内皮细胞形态正常的内皮细胞呈六边形，大小相等、均匀规则、边界清晰，细胞边界的交叉角为120。，随著年龄增长尤其在60岁以后或某些眼病时，可见细胞形态发生变化，大小不等、形态不规则，细胞平均面积增大。 1.1.2 内皮细胞边界正常角膜内皮细胞的边界呈清晰的暗的直线，有时也可见几个细胞出现双边，就是细胞边界线内又出现一条平行于边界的暗线，这可能是光学上的阴影现象，并无病理学意义。在正常状态下，由于细胞呈六边形镶嵌排列，细胞之间的连接呈均一状态，以三个相等的120。对顶角相连接，如果内皮细胞受损或发生移行，这个角度即发生改变。
人皮肤成纤维细胞的获取 一、材料：手术过程中获取的老年人皮肤组织 二、所需试剂：DMEM高糖培养基，胎牛血清，胰蛋白酶，PBS缓冲液，青霉素，链霉素 三、方法： 1.提前准备好含有添加过青霉素和链霉素的PBS缓冲液的15ml离心管低温放置。 2.将得到的皮肤组织置于含有PBS（添加300U/ml青霉素和300μg/ml链霉素）的15ml 离心管中，并以冰盒存放拿至实验室立马进行实验。 3.在生物安全柜中将得到的皮肤组织于培养皿内用（含300U/ml青霉素和300μg/ml链霉 素）的PBS缓冲液反复漂洗3-5次。 4.用无菌手术刀片和镊子轻轻剪除、刮去皮下肌肉和脂肪组织。或在PBS清洗前，用70% 酒精浸泡半分钟。 5.清理干净的皮肤组织转移至新培养皿内，用含抗生素的PBS反复清洗后，取出皮肤组织 转移到新的皿中。 6.用剪刀将皮肤剪成体积约1mm3大小的组织块。 7.将小组织块贴附于一新的培养皿底部，每平方厘米均匀接种10-15块组织。 8.5-10分钟后（以团块贴紧培养皿为准），加入少量含10%FBS的DMEM培养液，使组织 块刚刚接触培养液即可（不能浸没组织，防止组织块飘起来），置于CO2培养箱。 9.2-3h后沿培养皿边缘缓慢加入含10%FBS的DMEM培养液浸没组织块，随后将培养皿 轻轻放置于培养箱内，在移动过程中严禁剧烈晃动培养皿影响组织块的贴壁。 10.间隔2-3天观察组织块贴壁情况，并进行换液。 11.观察细胞爬出情况，当组织块周边细胞生长汇合率达90%以上时进行胰蛋白酶的消化传 代。剩余的组织块加入10%FBS的DMEM培养液继续培养，细胞达到融合后，再消化传代，然后剩余组织块加入10%FBS的DMEM培养液继续培养，反复上面的步骤。
角膜内皮检查技术操作规范 【适应证】 1.通过角膜内皮层检查，估计其功能状态。 2.诊断某些眼病，如多形性角膜营养不良、Fuchs角膜内皮营养不良。 3.评价某些疾病对角膜内皮的损害。 4.指导角膜接触镜的材质选用和佩戴方式。 5.评价内眼手术可能造成角膜内皮功能失代偿的风险。 6.指导前房内给药。 7.为穿透性角膜移植术优选高质量供体材料。 【禁忌证】 1.角膜大面积擦伤。 2.角膜基质层水肿。 3.角膜浑浊。 4.结膜、角膜感染。 5.角膜穿孔。 【操作方法及程序】 1.角膜内皮层检查以角膜内皮显微镜检查法(specular microscopy)常用，它可分为非接触型和接触型检查法两种。也可以通过共聚焦显微镜(confocal microscopy)进行检查。 2.非接触型接触法更适用于儿童、心理紧张或角膜有术
后新鲜伤口的患者。 (1)受检者头部放置托架上。 (2)机器自动取像，根据所拍摄的照片分析角膜内皮的形态、大小。 (3)点击细胞数目分析角膜内皮的细胞密度。也可应用计算机直接分析角膜内皮的细胞密度及大小。 (4)可对角膜上、中、下、鼻侧、颞侧几个点的内皮进行检查。 (5)分析后打印结果。 3.接触型检查法适用于配合检查的成年受检者。 (1)首先进行角膜厚度测量。 (2)用0.5%丁卡因滴眼液滴眼，进行角膜表面麻醉。 患者头部固定于托架上，物镜须接触患者角膜。 (3)． (4)调节焦点使图像清晰。 (5)进行摄像或录像。 (6)分析检查结果。 【注意事项】 1.进行角膜内皮层检查之前，需常规行裂隙灯显微镜检查。 2.结果定性分析的内容包括:细胞大小一致性、细胞形态一致性、细胞内或细胞间有无异常结构。 3.定量分析的内容包括:细胞密度、平均细胞面积、细
●麦粒肿的病因治疗原则及注意事项： 眼睑腺体的细菌感染，常见葡萄球菌。治疗原则：早期热敷，选择敏感抗生素局部及全身应用控制感染。感染没有控制时，有脓肿形成时，及时切开排脓，必要时放置引流。注意事项：切忌挤压，以免扩散；脓肿未形成时，不可切开排脓；外麦粒肿切口与睑缘平行，内麦粒肿切开与睑缘垂直。 ●霰粒肿的病因治疗原则和注意事项： 睑板腺管口堵塞，腺体的分泌物滁留在睑板内，对周围组织产生慢性无菌性肉芽肿炎症。小而无症状无需治疗，待其自行吸收；大而有症状的热敷或者囊内注射糖皮质激素促进吸收；保守治疗无效时手术治疗。注意事项：切口与睑缘垂直，应尽可能完整的摘除囊壁；反复发作的应做病理检查，排除睑板腺癌的可能。 ●新生儿泪囊炎的病因及治疗原则： 主要是由于鼻泪管下段发育不完全，没有完成管道化，或留有一黏膜皱襞部分或者全部遮盖鼻泪管开口从而使泪液在泪囊内滁留，导致泪囊细菌感染，常见致病菌为流行性感冒嗜血杆菌。治疗原则：一般常规冲洗泪道或者局部使用抗生素滴眼液，待泪囊无脓后，可考虑泪囊内加压冲洗术，绝大多数患儿疗效较好。若保守治疗无效，可考虑泪道探通术。 ●急性泪囊炎的治疗原则： 早期可局部热敷，全身和局部使用敏感抗生素控制炎症。炎症初期切忌泪道冲洗或泪道探通，以免感染扩散。如炎症没有控制脓肿形成，则切开排脓，放置引流条，待伤口愈合后，炎症完全消退后，按慢性泪囊炎处理。 ●结膜充血和睫状充血的鉴别： 结膜充血睫状充血部位越靠近穹窿部越明显越靠近角巩膜缘越明显 颜色鲜红色暗红色或者棕红色 血管来源结膜血管角膜缘深层血管网 血管形态屈曲毛刷状 移动性随结膜而移动不随结膜而移动 0.1%肾上腺素消失不消失
论著 【收稿日期】2004-10-12;【修回日期】2004-12-03 【作者简介】李卫华(1971-),男,籍贯河北,硕士,主治医师,主要研究方向为瘢痕的形成机理。 增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞生长差异比较 李卫华1,李德水2,刘洪琪2 (武警医学院:11整形美容中心;21烧伤整形科;天津300162) 摘 要: 【目的】探讨增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞基因表现型的差异以及EGF 、PD GF 和 bF GF 对其的影响。【方法】测定细胞生长曲线;应用液闪计数测定成纤维细胞胶原蛋白的合成。【结果】增生性 瘢痕成纤维细胞增殖速度比正常皮肤成纤维细胞慢;胶原蛋白的合成高于正常皮肤成纤维细胞。EGF 、PD GF 和 bF GF 均对两种成纤维细胞的增殖具有强烈的刺激作用。EGF 和bF GF 可减少增生性瘢痕成纤维细胞的胶原蛋白 合成,PD GF 可以使两种成纤维细胞的胶原蛋白合成增加。【结论】增生性瘢痕成纤维细胞是一种特殊基因表现型的成纤维细胞,它具有自己特殊的生物学特性。EGF 、PD GF 和bF GF 在增生性瘢痕的形成过程中可能具有重要作用。 关键词:增生性瘢痕;成纤维细胞;胶原蛋白;表皮细胞生长因子;血小板衍生生长因子;碱性成纤维细胞生长因子 【文章编号】 100825041(2005)022******* 【中图分类号】 R32912 【文献标识码】 A The study of the phenotypic differences of hypertrophic scar f ibroblasts versus normal dermal f ibroblasts by cytokine stimulation L I Wei 2hu a ,L I De 2shui ,L IU H ong 2qi (Department of Plastic and Esthetic Surgery ,The A ff iliated H ospital of Medical College of Chinese People ′s Armed Police Force ,Tianjin 300162,China) Abstract :【Objective 】To study the phenotypic differences between the hypertrophic scar fibroblasts and normal dermal fibroblasts by determining their responsiveness to EGF 、PD GF and bF GF 【Methods 】Hypertrophic scar fibroblasts and normal dermal fibroblasts were propagated in culture.Their proliferative behaviors were studied.The collagen synthetic rates were determinedwith liquid scintillation technology.【R esults 】Hypertrophic scar fibroblasts grew at a lower rate than that of normal dermal fibrob1asts.The collagen synthetic rate of the hypertrophic scar fibroblasts was higher than that of the normal dermal fibroblasts.EGF 、PD GF and bF GF stimulated the proliferation of both cells violently.The col1agen synthesis of hypertrophic scar fibroblasts was inhibited by EGF and bF GF whereas PD GF increased both cells ′collagen synthesis.【Conclusion 】The hypertrophic scar fibroblast is a different phenotype from the normal dermal fibrob 2last.EGF 、PD GF and bF GF may play important roles in the formation of hypertrophic scars.K ey Words :Hypertrophic scar ;Fibroblasts ;Collagen ;EGF ;PD GF ;bF GF 增生性瘢痕一直是限制患者正常愈合的一个主要问题,其病因尚未完全明了。Worrall 1的研究结果显示将正常皮肤成纤维细胞长期暴露于可溶性单核细胞提取物的环境中可使成纤维细胞发生红斑 狼疮样基因表现型改变。G arner 2的研究结果揭示增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞可能具有不同的基因表现型。为了进一步明确增生性瘢痕成纤维细胞基因表现型,我们应用体外细胞培养技术研究了增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞的形态、生长曲线以及胶原蛋白的合成,并就表皮细胞生长因子(EGF )、血小板衍生生长因于(PD GF )和碱性成纤维细胞生长因子(bF GF )对增生性瘢
SP-2000P角膜内皮细胞计操作规程 使用环境： 温度： 10°C - 40°C 湿度： 30% - 85% 防尘防震，避免日光直接照射。 使用前： 检查电源线及各连接线是否连接好；是否完好无损。若有损坏及时更换。连接线未连接好时，开机后计算机会提示机器硬件故障。 基本操作： 1.接通电源，依次打开电脑主机、显示屏和打印机。 2.调整病人的头位、眼位； 3.选择菜单“患者信息”里的“登记患者”项，输入患者信息；选择菜单“采 集”里的“选择病人”项，找到病人名字后点击确定键； 4.打开采集窗口； 5.使用操作杆进行对准和聚焦，使之达到最佳状态后将自动拍摄；先拍右眼， 后拍左眼； 6.拍摄完毕按DATA键，将拍摄图片输出到影像处理系统并保存； 7.打开图象进行分析，分析完毕后点击DONE键结束，并并打印结果。 8.报告分析：CD(cell density):表示細胞密度（以細胞數/mm2為單位） 一般CD正常值為2899±410.16個/mm2。隨著年齡的增大，CD逐漸減少，其关系可見表4－1。 表4－1 年龄与CD的关系 年龄31-40 41-50 51-60 61-80 80以上 CD 值3000 2800 2600 2400-2500 2100-2400 SD(standard deviation):表示細胞面积标准差，理想值140以下。 CV(co-effient of variation):表示細胞面积变化系数，理想值30以下。 6A(percentage of hexagonal cells of the cells marked)：表示六边形細胞的百分数，理想值50%以上。μAVE:表示平均細胞面积（以m2為單位）μMAX:表示最大細胞面积（以 m2為單位）μMIN:表示最小細胞面积（以m2为单位）NUM:表示检查的細胞數目 注意事项： 1.摄像时注意調整下頜架高度，使患者瞳孔出現在螢幕中央；當眼瞼遮擋瞳孔時，不能進行攝像。讓患者在固視燈閃爍時睜大眼睛；如病人上瞼下垂，檢查者可用手指將其撐開。 2.內皮細胞分析時注意，進內皮細胞分析的前提是必須保證輸入的是細胞的中央，這一點很重要；在輸入過程中，請注意不要略去中間的細胞；至少要數50個細胞，最多輸入200個細胞。
正视：当眼调节静止时，外界的平行光线经眼的屈光系统后恰好在视网膜黄斑中心凹聚焦，这种屈光状态即为正视。 散光：由于眼球在不同子午线上屈光不同，平行光线经过屈光系统后不能形成焦点的屈光状态。 高眼压症（ocular hypertension.眼压高与统计学正常上限，但长期随访并不出现的视神经和视野损害。 正常眼压青光眼（NTG.部分患者眼压在正常范围，却发生了典型青光眼视神经萎缩和视野缺损。 交感性眼炎（sympathetic opthalmia.是指发生于一眼穿通伤或内眼手术后的双侧肉芽肿性葡萄膜炎。 角膜缘（limbus.透明的角膜移行到不透明巩膜内，是角膜和巩膜的移行区，是前房角及房水引流系统所在部位，角膜缘解剖结构上是前房角和房水引流系统所在部位，临床上又是许多内眼手术切口的标志部位，组织学上还是角膜缘干细胞所在之处。 角膜房水屏障角膜内皮细胞间的紧密连接，阻止房水进入角膜，能泵出水分，维持角膜相对脱水状态，使角膜维持透明。黄斑视网膜后极部有一中央无血管的凹陷区，解剖上成为中心凹，临床称黄斑，是由于该区域含有丰富的叶黄素 视盘距黄斑鼻侧3mm处有一约1.5mm*1.75mm大小，境界清楚的橙红色圆形盘状结构，又称为视乳头。 视路（visual pathway.是视觉信息从视网膜光感受器开始到大脑枕叶视中枢的传导通路。 视力即视敏度，视锐度，是眼对二维空间物质形状和位置的分辨能力，即对某一细小空间细节的分辨能力，主要反映黄斑的视功能。 视野（visual field.眼向前方固视时所见的空间范围，相对于视力的中心视锐度而言，它反映了周边视力。 暗适应（dark adaption.当眼从强光下进入暗处时，起初一无所见，随后逐渐能看清暗处的物体，这种对光敏感度逐渐增加，并达到最佳状态的过程。 立体视觉（stereoscopic vision.又称深度觉，是感知物体立体形状及不同物质相互远近关系的能力。 角膜沉着物（kp.炎症细胞或色素沉着于角膜后表面，其形成要角膜的损伤和炎症细胞或色素的同时存在。根据KP的形状将其分为三种类型：尘状，中等大小和羊脂状。见于前葡萄膜炎。 直接光反射在暗室内用手电筒照射受检眼，该眼瞳孔迅速缩小的反应。此反应需该眼瞳孔的传入和传出神经通路的共同参与。 间接对光反射在暗室内用手电筒照射另一侧眼，受检眼瞳孔迅速缩小的反应。此反应只需受检眼瞳孔的传出途径参与。相对性传入性瞳孔障碍（RAPD.譬如左眼传入性瞳孔障碍，用手电筒照射右（健.眼，双眼瞳孔缩小，患眼瞳孔由于间接对光反射存在而缩小，随后移动手电筒到左（患.眼上，双眼瞳孔不缩小，因左眼传入性瞳孔障碍，以1秒间隔交替照射双眼，键眼瞳孔缩小，患眼瞳孔放大，这种体征特别有助于诊断单眼的黄斑病变或视神经炎等眼病。 黄斑囊样水肿（CME.黄斑区视网膜水肿时，由于henle纤维的放射状排列，液体聚集成特殊的花瓣状外观 弱视是视觉发育期内由于异常视觉经验（单眼斜视，屈光参差，高度屈光不正以及形觉剥夺.引起的单眼或双眼最佳矫正视力下降，眼部检查无器质性病变 棉绒斑（COTTON WOOL SPOT.以往曾称“软性渗出”，是视网膜内形态不一，边界不清的灰白色棉花绒毛状斑块，它实质上不是渗出，而是毛细血管前小动脉阻塞后，神经纤维层得微小梗塞，轴浆运输阻断而形成. 视网膜脱离RD任何原因引起的视网膜的色素上皮与神经上皮的脱离，可分为孔原性，牵拉性及渗出性。 樱桃红瓣（cherry red spot.视网膜中央动脉阻塞时，视网膜浑浊，水肿，尤其是后极部，但在中心凹处科透见其深面的脉络膜有红色反光，在周围灰白色水肿衬托下，成樱桃红色，故称樱桃红瓣。 睑腺炎（hordeolum.又称麦粒肿，是眼睑腺体的急性化脓性炎症。 睑板腺囊肿（chalazion.由于睑板腺出口阻塞，腺纤体分泌物潴留在睑板腺内，对周围组织产生慢性特发性无菌性肉芽肿性炎症。以往称为散粒肿。 睑内翻（entropion.睑缘向眼球方向卷曲的位置异常，当睑内翻达一定程度时，睫毛也倒向眼球。 上睑下垂（ptosis.上睑的提上睑肌和miiller平滑肌的功能不全或丧失，导致上睑部分或全部下垂，正常眼球向前注视时，上睑缘遮盖角膜上部1~2mm 调节（accommodation.为了看近距离目标，需增加晶状体的曲率，从而增强眼的屈光能力，是近距离物体在视网膜形成清晰的像，这种为看清近物而改变眼的屈光能力的功能称为调节。 近视（myopia.在调节放松状态下，平行光线经眼球屈光系统后聚焦在视网膜之前。近视眼的远点在眼前某一点 老视(presbyopia)随着年龄的增长，晶状体逐渐硬化，弹性减弱，睫状肌的功能减低，从而引起演的调节功能下降，大约在40-45岁开始，出现阅读等近距离工作困难，这种由年龄增长所致的生理性调节减弱成为老视。 远视（hypermetropia .当调节方松时，平行光线经眼的屈光系统聚焦在视网膜之后。 角膜变性(cornerl degeneration)由于某些光期的疾病引起角膜组织退变并使功能减退。引起角膜变性的原发病通常为眼部炎症性疾病，少部分原因不明，但与遗传无关。 暴露性角膜炎(exposure keratitis)角膜失去眼睑的保护而暴露在空气中，引起干燥，上皮脱落进而继发感染的角膜炎症。常见原因有眼睑缺损，眼球突出，睑外翻，手术源性上睑滞留或闭合不全。
成纤维细胞 成纤维细胞（fibroblast）成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动；纤维细胞（fibrocy te）功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核小着色深，核仁不明显，细胞质少。此二型细胞可互相转化。 成纤维细胞：数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，细，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清。 成纤维细胞摄取所需的氨基酸，如脯氨酸和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成前α多肽链（proalpha polypeptide chain），多肽链输送到高尔基复合体后，组成前胶原分子（procollagen）。前胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞外。在前胶原肽酶催化下，将每一前α多肽链的尾段除去，成为原胶原分子（tropocollagen）。许多原胶原分子成行平行排列，结合成具有周期性横纹的胶原原纤维。由胶原原纤维互相结合形成胶原纤维。 是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位〔2，3〕。成纤维细胞形态多样，常见的有梭形、大多角形和扁平星形等，其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。成纤维细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松着色浅，核仁明显。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，表明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成与成骨细胞合成分泌的胶原原纤维一样具有64nm(640?)周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘合形成胶原纤维。经检测，这两种细胞合成分泌的胶原纤维均是Ⅰ型胶原纤维，在形态和生化结构上完全相同〔4,5〕。处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损
眼视光特检技术四 2007-06-15 08:42 A.M. 第四章角膜内皮细胞镜 学习提要：角膜内皮细胞正常值、角膜内皮镜的临床应用和操作。 第一节概述 角膜内皮细胞镜也称角膜内皮显微镜或角膜内皮镜，它是利用镜面反射的原理，观察角膜内皮细胞形态和密度的改变并进行分析处理的一种仪器。由于角膜内皮细胞和房水屈光指数不同，两者之间形成了界面；当一窄光束聚焦在这一界面上时引起反射，内皮细胞各部分反射程度的差异显示出细胞的边界。利用显微镜放大观察并照相，便可取得内皮细胞大小形态和密度等客观资料。 角膜内皮镜的用途是：通过观察角膜内皮细胞大小形态、密度（细胞数量）及计算分析，以确定病因及发病机制、了解病情、判断手术和治疗对角膜内皮细胞的影响。 目前，临床上角膜内皮镜有两种类型，非接触型和接触型。 1.非接触型角膜内皮镜（如日本KONAN公司生产的NONCON ROBO）包括照明装置和显 微放大光路，在分光显微物镜中照像与观察光路以一定的角度固定。它不接触受检者角膜，能自动对焦并照像，能安全、舒适、方便地进行测量，临床上对难以配合的儿童、老人及角膜术后不久的患者均较便利。因放大倍率较低，图象分辨率稍差，但能满足临床需要，见图4-1。 2、接触型角膜内皮镜：其照明和显微放大装置与非接触型角膜内皮镜相同。不同之处是在物镜前面装上一个锥型的玻璃压平角膜镜，此镜与压平眼压计的压平镜类似。需要在角膜表面麻醉下进行角膜检查。因检查时眼球相对固定，可排除眼球轻微震颤的干扰，焦点不易移动，图象清楚，分辨率好，为临床和科研提供了更为精确的资料，但检查操作相对较难。 第二节操作技术 一、非接触型角膜内皮镜(以KONAN非接触角膜内皮镜为例) 1.接通电源，打开机器后，屏幕上显示主菜单。 2.鼠标（或控制板控制）左击ID框输入患者姓名（字母）或编号（数码），完成后左击 END。 3.时间设置，左击TIME框设置正确的时间,完成后左击END。 4.点击R或L框选择左右眼。 5.鼠标左击RECORD框（或控制板按REC钮）执行自动摄像。若进行区域摄像，用鼠标左 击屏幕上所示的区域，然后该圆框将显亮。 6．调整受检者位置并使之配合检查： （1）如对左眼摄像，让受检者下颌放在右下颌架上。反之，对右眼摄像时让病人下颌放在左下颌架上。如果下颌没有放好位置，屏幕上的R/L键将闪烁。
成纤维细胞的培养 1前言 成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞。 成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位[1,2]。 成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍[3]。 2材料和方法 2.1材料 玻璃器材：细胞培养瓶、500ml盐水瓶、青霉瓶、刻度吸管 塑料器材：细胞培养板 橡胶器材：细胞培养瓶胶塞、青霉素瓶塞、翻口胶塞和胶管 滤器；玻璃漏斗、微孔滤膜 2.2试剂的配制 水、0.4%酚红液、Hank’s液、MEM、无钙PBS液、双抗的配制、NaHCO3配制、新生犊牛血清（FCS)、原代和传代细胞分散液、3％谷氨酰胺、细胞生长液和细胞维持液、其他液体；洗液、无钙PBS胰酶液、Hank's液、 2.3方法 2.3.1试剂配制 （1）细胞分散液：无钙胰蛋白酶加4倍无菌蒸馏水 （2) 组织冲洗液：无血清MEM （3）细胞生长液：含10％FCS MEM 2.3.2实验分配：每人1枚鸡胚，每人制备1瓶100mL培养瓶细胞。 2.3.3细胞制备过程 碘酊消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，用无血清MEM 冲洗3次，将鸡胚置于无菌平皿内，去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个平皿内，用无血清MEM冲洗3次，剪碎胚体，静止片刻，吸净上清，加入5－10倍无钙胰蛋白酶，并吸入于无菌青霉素小瓶内，用橡皮膏封严瓶口，37 ℃消化至细胞呈毛球样，吸净消化液，加入细胞生长液，将细胞置于细胞培养瓶中，并用大口吸管吹打细胞使之充分分散，分装2个细胞培养瓶内。 4、换液或接毒 细胞于37℃培养过夜，次日换细胞维持液，或单层接种病毒，每日观察CPE。