天然蛋白纯化的基本流程
一、引言
天然蛋白纯化是生物化学和生物技术领域中的重要研究内容之一。蛋白质作为生物体内功能性分子的基本组成部分，其纯化和分离对于研究蛋白质的结构、功能和生物学特性具有重要意义。本文将介绍天然蛋白纯化的基本流程。
二、样品制备
天然蛋白纯化的第一步是样品制备。通常，我们需要从生物体中提取蛋白质样品。提取方法的选择取决于样品的来源和特性。常见的提取方法包括机械破碎、超声波破碎、化学法和生物法等。在提取过程中，需要注意保持样品的完整性和稳定性，以确保蛋白质的纯度和活性。
三、初步分离
在样品制备之后，需要进行初步分离。初步分离的目的是将蛋白质与其他生物大分子（如核酸、多糖等）分离开来。常用的初步分离方法包括离心、过滤、电泳和层析等。离心通过调节离心力和离心时间，可以将蛋白质从细胞碎片、细胞核和细胞器中分离出来。过滤则是利用孔隙大小的差异，将蛋白质和其他生物大分子分开。电泳是利用蛋白质在电场中的迁移速度差异进行分离，常见的电泳方法有SDS-PAGE和等电聚焦。层析则是利用不同蛋白质在固定相和
流动相之间的亲和性差异进行分离。初步分离后，可以得到蛋白质的粗提物。
四、纯化策略
在初步分离得到蛋白质的粗提物之后，需要根据具体的研究目的和蛋白质的特性选择合适的纯化策略。常见的纯化策略包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、逆流层析和高效液相色谱等。亲和层析是利用蛋白质与某种配体之间的特异性相互作用进行分离，常见的亲和层析方法有金属螯合层析、免疫亲和层析和亲和吸附层析等。离子交换层析是利用蛋白质与固定相之间的电荷差异进行分离。凝胶过滤层析则是根据蛋白质的分子大小进行分离。逆流层析则是利用溶剂的逆向流动和蛋白质与固定相之间的亲和性差异进行分离。高效液相色谱则是利用溶液在固定相上的流动和蛋白质与固定相之间的亲和性差异进行分离。
五、纯化步骤
根据选择的纯化策略，进行相应的纯化步骤。在进行纯化步骤时，需要注意控制条件，如pH值、离子浓度、温度等。同时，也需要监测纯化过程中的蛋白质含量和纯度，常用的检测方法有紫外吸收光谱、蛋白质浓度测定、SDS-PAGE电泳和Western blot等。通过逐步纯化，最终可以得到目标蛋白质的高纯度样品。
六、纯化评估
纯化结束后，需要对纯化的蛋白质样品进行评估。评估的目的是确定纯化过程的效果和纯化样品的质量。常见的评估方法包括蛋白质纯度分析、活性测定、质谱分析和结构分析等。蛋白质纯度分析可以通过比色法、Western blot和凝胶电泳等方法进行。活性测定可以通过酶活测定、抗原抗体反应和功能性实验等方法进行。质谱分析和结构分析可以用于确定蛋白质的分子量和结构。
七、保存和应用
纯化得到的蛋白质样品需要进行保存和应用。常见的保存方法包括冷冻保存、冷冻干燥和液氮保存等。保存时需要注意保持样品的稳定性和活性。应用方面，纯化得到的蛋白质样品可以用于进一步的功能研究、结构研究、药物筛选和生物制剂研发等。
八、结论
天然蛋白纯化是一项复杂而重要的研究工作。本文对天然蛋白纯化的基本流程进行了详细介绍，包括样品制备、初步分离、纯化策略选择、纯化步骤、纯化评估和样品保存和应用等。通过合理选择纯化策略和控制条件，可以得到高纯度的蛋白质样品，为后续的研究提供可靠的基础。
蛋白纯化步骤 引言： 蛋白质是生物体内重要的生物大分子，其结构和功能对于维持生命活动至关重要。为了研究蛋白质的性质和功能，科学家们需要将蛋白质从复杂的混合物中纯化出来。蛋白纯化是一项复杂而重要的实验步骤，本文将介绍常用的蛋白纯化步骤。 一、细胞裂解和收集 蛋白纯化的第一步是将含有目标蛋白质的细胞裂解，并将目标蛋白质收集起来。常用的细胞裂解方法包括机械破碎、超声波破碎和渗透破碎等。裂解后，通过离心等方法将蛋白质从其他细胞组分中分离出来。 二、沉淀和上清液分离 细胞裂解后蛋白质溶液中可能存在大量杂质，需要通过沉淀与上清液分离的方法去除。常用的方法包括盐析法、有机溶剂沉淀法和凝胶渗析法等。这些方法可以根据蛋白质的特性选择合适的杂质去除方法。 三、蛋白质分子量筛选 蛋白质纯化过程中，通常需要对蛋白质进行分子量筛选。这样可以去除低分子量的杂质和蛋白质降解产物。常用的方法包括凝胶过滤法、凝胶电泳法和离子交换色谱法等。
四、亲和纯化 亲和纯化是一种常用的蛋白纯化方法，该方法利用蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用进行纯化。亲和基质可以是抗体、金属离子、亲和标签等。通过将亲和基质与目标蛋白质结合，再通过洗脱等步骤将目标蛋白质从杂质中分离出来。 五、离子交换层析 离子交换层析是一种基于蛋白质与离子交换基质之间的静电作用力进行纯化的方法。根据蛋白质的电荷性质，可以选择合适的离子交换基质和缓冲液条件，使目标蛋白质与基质发生相互作用。通过调整离子浓度和pH值，可以实现目标蛋白质与基质的分离。 六、凝胶过滤层析 凝胶过滤层析是一种根据蛋白质的分子量进行纯化的方法。通过选择合适的凝胶基质和孔径，可以使目标蛋白质从较大分子量的杂质中分离出来。这种方法适用于蛋白质的富集和浓缩。 七、逆流层析 逆流层析是一种根据蛋白质的亲和性进行纯化的方法。该方法利用逆流层析柱中填充的亲和基质与目标蛋白质之间的特异性相互作用进行纯化。通过调整流动相的条件，可以实现蛋白质的吸附和洗脱，从而分离目标蛋白质。
四种蛋白纯化方法 1. 溶液沉淀法 溶液沉淀法是一种常用的蛋白纯化方法，适用于从复杂的混合物中分离目标蛋白。该方法基于蛋白质在不同条件下的溶解度差异，通过添加盐类或有机溶剂来诱导蛋白质的沉淀。 步骤： 1.样品制备：将待纯化的样品经过初步处理，如细胞破碎、组织切割等，得到 含有目标蛋白的混合物。 2.溶解度测试：在不同条件下（如pH、温度、盐浓度等）测试目标蛋白质的 溶解度，并确定最适合其沉淀的条件。 3.沉淀：根据前一步骤确定的最佳条件，向样品中添加盐类或有机溶剂，使目 标蛋白质发生沉淀。可以通过离心将沉淀物与上清液分离。 4.溶解：将沉淀物重新溶解在适当的缓冲液中，得到纯化后的目标蛋白。 优点： •简单易行，不需要复杂的设备和操作。 •适用于从复杂混合物中纯化目标蛋白。 缺点： •可能会导致非特异性沉淀，使得纯化后的蛋白含有杂质。 •沉淀方法对蛋白质的溶解度要求较高，不适用于所有蛋白。 2. 凝胶过滤法 凝胶过滤法是一种基于分子大小的蛋白纯化方法，适用于分离不同分子量范围的蛋白。该方法利用孔径可调的凝胶柱或膜来分离目标蛋白和其他小分子。 步骤： 1.样品制备：将待纯化的样品经过初步处理，如细胞破碎、组织切割等，得到 含有目标蛋白的混合物。 2.凝胶柱选择：根据目标蛋白的分子量范围选择合适孔径的凝胶柱或膜。 3.样品加载：将样品加载到凝胶柱上，并使用缓冲液进行洗涤，以去除小分子。
4.蛋白洗脱：通过改变缓冲液的组成或pH值，使目标蛋白从凝胶柱上洗脱下 来。 5.收集纯化蛋白：将洗脱得到的蛋白收集起来，即可得到纯化后的目标蛋白。 优点： •可以根据分子量范围选择合适的凝胶柱，实现高效分离。 •纯化后的蛋白质纯度较高。 缺点： •操作相对复杂，需要一定的专业知识和技术。 •只适用于分子量差异较大的目标蛋白。 3. 亲和层析法 亲和层析法是一种基于生物分子间特异性相互作用的蛋白纯化方法，适用于富含目标蛋白的混合物。该方法利用目标蛋白与特定配体之间的亲和力进行分离和纯化。 步骤： 1.配体固定：将具有亲和力的配体固定在石英珠、琼脂糖等载体上，并填充在 层析柱中。 2.样品加载：将待纯化的样品加载到层析柱中，目标蛋白与配体发生特异性结 合。 3.洗脱：通过改变缓冲液的组成或pH值，使目标蛋白与配体解离，从而洗脱 下来。 4.收集纯化蛋白：将洗脱得到的蛋白收集起来，即可得到纯化后的目标蛋白。 优点： •可以实现高选择性的分离和纯化。 •纯化后的蛋白质纯度较高。 缺点： •需要特定的配体和载体进行固定，成本较高。 •需要对目标蛋白和配体之间的亲和力进行研究和优化。 4. 离子交换层析法 离子交换层析法是一种基于生物分子电荷差异的蛋白纯化方法，适用于具有不同电荷特性的目标蛋白。该方法利用离子交换树脂对样品中带电物质进行吸附和洗脱。
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤: (一)材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破 碎组织细胞的方法有: 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便,但 要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子 强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提,
抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。 (三)蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法: 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质。此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度。 (四)样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质,须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有:凝胶过滤层析、离子交
蛋白纯化方法大全 蛋白纯化的技术很复杂，以下就会大家熟知蛋白纯化步骤。那为什么蛋白质要纯化呢，去掉蛋白质含有的一些杂质与其他蛋白质一起沉淀。那么又要去除蛋白质的杂质又要保证蛋白质的营养不被流失，于是就要制作不同的方案来应对，称为蛋白纯化技术。根据蛋白的相似度和差异去除蛋白中的杂质! 1、粗分级分离 当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。有些蛋白提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。 2样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括
区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。 3结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的，但是只有某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。由于结晶过程中从未发现过变性蛋白，因此蛋白的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。 41.机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2.渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3.反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种
天然蛋白纯化的基本流程 一、引言 天然蛋白纯化是生物化学和生物技术领域中的重要研究内容之一。蛋白质作为生物体内功能性分子的基本组成部分，其纯化和分离对于研究蛋白质的结构、功能和生物学特性具有重要意义。本文将介绍天然蛋白纯化的基本流程。 二、样品制备 天然蛋白纯化的第一步是样品制备。通常，我们需要从生物体中提取蛋白质样品。提取方法的选择取决于样品的来源和特性。常见的提取方法包括机械破碎、超声波破碎、化学法和生物法等。在提取过程中，需要注意保持样品的完整性和稳定性，以确保蛋白质的纯度和活性。 三、初步分离 在样品制备之后，需要进行初步分离。初步分离的目的是将蛋白质与其他生物大分子（如核酸、多糖等）分离开来。常用的初步分离方法包括离心、过滤、电泳和层析等。离心通过调节离心力和离心时间，可以将蛋白质从细胞碎片、细胞核和细胞器中分离出来。过滤则是利用孔隙大小的差异，将蛋白质和其他生物大分子分开。电泳是利用蛋白质在电场中的迁移速度差异进行分离，常见的电泳方法有SDS-PAGE和等电聚焦。层析则是利用不同蛋白质在固定相和
流动相之间的亲和性差异进行分离。初步分离后，可以得到蛋白质的粗提物。 四、纯化策略 在初步分离得到蛋白质的粗提物之后，需要根据具体的研究目的和蛋白质的特性选择合适的纯化策略。常见的纯化策略包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、逆流层析和高效液相色谱等。亲和层析是利用蛋白质与某种配体之间的特异性相互作用进行分离，常见的亲和层析方法有金属螯合层析、免疫亲和层析和亲和吸附层析等。离子交换层析是利用蛋白质与固定相之间的电荷差异进行分离。凝胶过滤层析则是根据蛋白质的分子大小进行分离。逆流层析则是利用溶剂的逆向流动和蛋白质与固定相之间的亲和性差异进行分离。高效液相色谱则是利用溶液在固定相上的流动和蛋白质与固定相之间的亲和性差异进行分离。 五、纯化步骤 根据选择的纯化策略，进行相应的纯化步骤。在进行纯化步骤时，需要注意控制条件，如pH值、离子浓度、温度等。同时，也需要监测纯化过程中的蛋白质含量和纯度，常用的检测方法有紫外吸收光谱、蛋白质浓度测定、SDS-PAGE电泳和Western blot等。通过逐步纯化，最终可以得到目标蛋白质的高纯度样品。 六、纯化评估
蛋白质分离纯化步骤
一、蛋白质分离纯化的一般原则 大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。 蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。
力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。(二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 (三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度
一、蛋白质分离纯化的一般原则 大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。 蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。 二、分离纯化蛋白质的一般程序 分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提
纤溶（溶栓）酶的分离及其性质研究 血栓是一种严重危害人类尤其是中老年人身体健康和生命的疾病，近年来发病率逐年增加，已成为常见病和多发病，是造成死亡和病残的首要原因。纤溶酶对纤维蛋白（原）具有专一水解活性，纤溶酶作为溶栓药物可以降解血栓骨架结构——纤维蛋白多聚体，从而达到溶解血栓栓子的目的，因此，药物溶栓是目前临床上治疗血栓性疾病的首选策略。 对“理想”溶栓药物的要求是：快速溶栓，对纤维蛋白特异，只作用于血栓而全身反应低，效力持久；出血危险性低；无全身性副反应，无抗原性，避免全身性纤溶、价廉等。目前对溶栓药物研究工作主要从两方面开展，一是应用基因工程和单克隆抗体技术对现有药物进行改造使之更理想；另一方面是开发新型天然来源的溶栓药物。 近几年，寻找天然来源的纤溶酶也成了一个研究热点。在动物、植物、海洋生物、微生物中都发现了天然的溶栓物质。在动物来源的纤溶酶中，人们研究较多的是从蚯蚓、蛇毒和蝙蝠的唾液及吸血动物中提取的纤溶酶；植物来源的纤溶酶主要是从丹参和蒲黄中提取；微生物更是纤溶酶的一种重要来源，如目前临床应用的溶栓药物链激酶、葡激酶、纳豆激酶等；在细菌、真菌、藻类中还发现了多种新型纤溶酶。 从作用机理上纤溶酶分成两类：一类是纤溶酶原激活剂，能将纤溶酶原激活为纤溶酶而降解纤维蛋白（原）；另一类是纤溶酶类活性物质，直接可以降解纤维蛋白（原）；都具有溶解血栓的作用（见下图）。 发现和筛选新型来源的纤溶酶是研发溶栓药物的基础，利用基因工程技术或蛋白质工程技术改造天然纤溶酶制成变异体、嵌合体或导向药物，是提高纤溶酶的选择性溶栓效果，延长半衰期，减少用药剂量和变态反应，降低成本的重要手段。制药工程研究室已从土壤中筛选出70多株纤溶酶产生菌，上学期的毕业生对其中9株菌进行了鉴定，并提取了外泌蛋白，检测后其中6（30—60） ，6（60—90） ，15（20—90） ，31（30—60） ，31（60—90） ，45（20—90） ，50（20—90） ，55（20—90） ，70（30—60） ，70（60—90） ，72（20—90）（菌号（硫酸铵沉淀浓度））具有纤溶活性。本学期主要工作有： 1. 纤溶酶活性测定：琼脂糖—纤维蛋白平板法 2. 蛋白含量测定：考马斯亮蓝法 →比活力测定 3. 分离和纯化：离子交换层析DEAE Sepharose 或CM-Sepharose 4. SDS-PAGE 电泳：硝酸银染色和考马斯亮蓝G-250染色, 检测分子量大小和分离效果。 5. 活性电泳：检测活性带位置， 6. 等电聚焦电泳：分离纤溶蛋白、测定等电点 7. 转膜、测序 纤溶酶原激活剂 纤溶酶原 纤溶酶 纤维蛋白原或纤维蛋白 （血栓栓子） 纤维蛋白原降解物(FgDP)或纤维蛋白降解物(FDP) （血栓溶解） 血栓的溶解过程
蛋白质是生物体内一类非常重要的大分子有机化合物，承担着多种生物学功能。为了进行蛋白质的研究、分析或应用，科学家们需要从复杂的生物体系中提取和纯化目标蛋白质。蛋白质提取纯化的基本流程通常包括样品制备、裂解、离心、层析、电泳等步骤。下面是关于蛋白质提取纯化的基本流程的详细解释： ### **1. 样品制备：** 蛋白质提取纯化的第一步是样品的制备。这涉及到从生物体（细胞、组织等）中获得样品。样品的制备过程中要注意避免蛋白质的降解和损失。常见的样品包括细胞总蛋白、细胞膜蛋白、细胞器蛋白等。制备好的样品需要储存在低温下以防止蛋白质的降解。 ### **2. 裂解（细胞破碎）：** 样品制备完成后，下一步是裂解，也就是将生物体内的细胞或组织破碎，释放蛋白质。裂解可以通过机械破碎、超声波破碎、高压破碎等方法实现。同时，可以添加裂解缓冲液，其中可能包含蛋白酶抑制剂、还原剂等，以维持蛋白质的稳定性。 ### **3. 离心：** 裂解后的混合物通过离心可以分离成上清液和沉淀。离心是利用离心机产生的离心力，使样品中的颗粒沉降，从而实现液体和颗粒的分离。上清液中包含了可溶性的蛋白质，而沉淀中则包含了细胞核、细胞壁等。 ### **4. 层析（柱层析或凝胶层析）：** 层析是蛋白质提取纯化中的关键步骤之一。这一步旨在根据蛋白质的性质，通过将混合物在柱上或凝胶中进行分离。常见的层析方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。层析可以根据蛋白质的大小、电荷、亲和性等特性有选择性地分离目标蛋白质。 ### **5. 电泳：** 电泳是蛋白质分离和分析的重要手段。在电场作用下，蛋白质根据其电荷和大小在凝胶中迁移。蛋白质电泳分离可以用于检测样品的纯度、确定分子量等。常见的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。 ### **6. 检测和分析：** 在蛋白质提取纯化的过程中，需要对提取得到的蛋白质样品进行检测和分析。常用的方法包括蛋白质定量、Western blotting等。这些方法可以用于确定提取得到的蛋白质是否符合预期，以及蛋白质的纯度和浓度等。 ### **7. 保存和存储：** 最后一步是保存和存储提取纯化得到的蛋白质样品。蛋白质样品应该以适当的方式存储，通常是在低温下。此外，还要考虑使用适当的缓冲液来保护蛋白质免受冻融等因素的影响。 ### **总结：** 蛋白质提取纯化是蛋白质学研究中至关重要的步骤之一。通过以上基本流程，科学家们可以从复杂的生物样品中高效、精确地提取和纯化目标蛋白质，为蛋白质研究提供了坚实的基础。在实际操作中，可以根据样品的来源、所需蛋白质的性质以及实验目的的不同，选择合适的方法和技术进行蛋白质提取纯化。
蛋白纯化相关原理及方法 蛋白纯化是生物科学研究中常用的一项技术，它可以分离纯化出目标蛋白质，从而方便后续的研究和应用。本文将介绍蛋白纯化的原理和方法。 一、蛋白纯化的原理 蛋白纯化的原理是基于不同蛋白质的特性差异，通过采用不同的分离技术，将目标蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且使其达到纯度较高的状态。 蛋白质的特性差异主要包括以下几个方面： 1. 分子质量：蛋白质的分子质量不同，可以通过分子大小的差异进行分离。常用的方法包括凝胶过滤层析和超速离心。 2. 电荷性质：蛋白质具有不同的电荷性质，可以通过离子交换层析、电泳等方法进行分离。离子交换层析是利用蛋白质与固定在固相上的离子交换基团之间的相互作用进行分离。 3. 亲和性：蛋白质与其他分子之间可能存在特异的结合，可以通过亲和层析进行分离。亲和层析是利用蛋白质与特定配体之间的结合进行分离。 4. 疏水性：蛋白质的疏水性不同，可以通过逆向相层析等方法进行
分离。逆向相层析是利用溶剂的极性进行分离，疏水性较高的蛋白质会更早洗脱。 二、蛋白纯化的方法 1. 直接纯化法：直接从生物样品中纯化目标蛋白质，可以通过分离离心、沉淀和过滤等简单的操作步骤进行。这种方法适用于目标蛋白质含量较高的样品。 2. 柱层析法：柱层析是一种常用的蛋白纯化方法，可以根据目标蛋白质的特性选择不同的层析柱进行分离。常用的柱层析方法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。 3. 电泳法：电泳是利用蛋白质的电荷性质进行分离的方法，常用的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和等电聚焦电泳（IEF）等。 4. 超滤法：超滤是利用膜的孔径大小对蛋白质进行分离的方法，常用的超滤方法包括凝胶过滤和离心浓缩等。 5. 亲和纯化法：亲和纯化是利用蛋白质与特定配体之间的结合进行分离的方法，常用的亲和纯化方法包括亲和层析、亲和吸附、亲和沉淀等。 6. 水相两相法：水相两相法是利用两相体系的差异进行蛋白质的分
蛋白质纯化工艺 蛋白质纯化是生物工程学重要的研究和应用基础。蛋白质纯化包括质量和生物活性的筛选，在各种体系中短暂的保存与防止变性与失活，滤纯，再分离，活性评价，最后进行其化学组成分析和蛋白质结构分析等。蛋白质纯化技术是分子生物学研究和药物开发的重要步骤，也是生物活性物质的制备技术，其正确的应用将决定检测或研究的成败。 蛋白质纯化工艺主要包括以下步骤：粗纯化、活性筛选、精纯化、储存保护、测定纯度、稳定性研究、活性评价、结构分析及分子变异研究等。 1、粗纯化 粗纯化是蛋白质纯化的第一步，是从复杂的细胞、组织和体液等中分离出质量较高的蛋白质的步骤。精确的粗纯化是实际纯化步骤的关键，可以减少后面精纯的步骤数量，从而减少纯化的时间和成本，提高纯化效率。粗纯化的能否实现良好极大程度上取决于蛋白质的组成，它的特性密切相关于技术的选择，一般采用分离技术和催化材料结合在一起，以便相容性的反应释放蛋白质。 2、活性筛选 活性筛选是一种重要的技术，它可提供有关活性的相关信息，重要的是评估蛋白质的生物活性，这 requires a complex set of assays to identify and understand the activity of a protein. 常用的活性筛选技术有：ELISA(酶联免疫吸附测定)、流式细胞术
(FACS)、定量PCR(qPCR)、酶联免疫检测(ELISPOT)、荧光免疫检测(FITC)、定量蛋白印迹(WB)、定量琼脂糖凝胶电泳(SDS-PAGE)、RNA 组学(RNA-Seq)和细胞形态学等。 3、精纯化 精纯化是蛋白质纯化工艺中最重要的一步，它是将有效的活性蛋白质从其它杂质物质中分离出来的过程，其基本步骤有：蛋白质浓缩、抽提、沉淀、结合、柱层析、交换性结合、膜分离、离心等。精纯化的方法实际上也是一种分离技术，它是利用物理性质的差异分离和抽提蛋白质，包含了层析法和属性法两种分离方式。层析法利用蛋白质的分子量、电荷和结构的特点作为分离依据，而属性法利用蛋白质的特定特性作为分离的依据，如可以利用蛋白质的疏水性、可交换性、聚性等。 4、储存保护 储存保护是指将纯化的蛋白质保存在现有环境下，以维持其正常功能及活性的步骤，不同的蛋白质的储存条件也不同。
2.1天然条件下纯化His标签蛋白 缓冲液的准备： 建议所有加入到柱中的液体都是用0.45 um滤膜过滤。 LE buffer: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 8.0 Wash Buffer: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 咪唑, pH 8.0 Elution buffer: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM咪唑, pH 8.0 样品准备： 1. 将50-100 ml培养液在4℃，5000 rpm离心5 min，弃上清液。 2. 每50 ml培养液用8 ml预冷的LE buffer重悬沉淀，加入合适的蛋白酶抑制剂如PMSF （蛋白酶抑制剂需要对树脂无影响） 3. 冰上超声破碎，180 V，超一秒停三秒，直到样品不再粘稠。 4. 4℃，12000 g离心15 min除去细胞碎片，将上清液用0.45 um滤膜过滤后即可上样。取10 ul上清样品和10 ul沉淀样品，留作SDS-PAGE分析检测His融合蛋白的量和表达形式（溶解性）。 柱子准备： 1. 将装有resin的小瓶轻柔颠倒数次以彻底重悬树脂。 2. 转移合适的树脂量到柱中，待树脂沉降后将储存缓冲液放掉。通常取2 ml 50% slurry （沉降后有1 ml树脂）可以结合20 mg His标签蛋白。 3. 使用4倍床体积的LE buffer平衡树脂。 柱子纯化步骤： 1. 上样：将含有His融合蛋白的上清液以0.5-1 ml/min的流速上样。 2. 洗杂：所有样品上样结束后，加入8倍床体积的Wash Buffer洗涤，流速：1 ml/min 3. 洗脱：用5-10倍床体积的Elution buffer洗脱His融合蛋白，流速：0.5-1 ml/min 4. 收集10-20 ul 上样后流出液、洗杂液、洗脱液，用SDS-PAGE分析确认目标蛋白的量。 5. 根据目的蛋白的后续应用，决定是否需要4℃透析（透析液：20 mM Tris‐HCl, pH 8.0 或1 × PBS, pH 7.4） 2.2变性条件下的纯化方式 目的蛋白主要以包涵体形式表达。 缓冲液的准备：
走眉.看着，身边的故事凤否能“联”別你生活里裕经急间的恿触； 删学眉，那墜零碎的知识星苦“联”刘你科研里正左探索的实範； _—…绘点们的科研一点联嚴,._点活默知识公冋虽设计着一位主角，那棵树，笔直的干、侧伸的斜枝是思维的框架，“联着” 地下，仲向天空。科研的思维总在不断地规划、设计，梳理知识，以备清晰行动。在设计的流程中不断的呎收新的知识，枝繁叶茂，丰富主干，正如条条大路逋罗马，思维也会随之活跃，路也会更加灵活。 而今天，我们所要梳理的主干，是罢白纯化的知识流程，即罢白纯化的基本第路，愿这些简单的知识点归类能够联到你的科研思维。 蛋白鈍化畸三步曲‘ 前奏：释放蛋白，目标：浓缩捕获蛋白： 间奏：粗分离蛋白，主要利用离心、沉淀、萃取等方法将蛋白和细胞中的苴他成分（DNA、RNA等）物质进行分离。 主旋律：精细纯化蛋白，去除蛋白质分子量比较接近的蛋白以及痕量杂质。 蚤白化三拠k程印仪 1
我们需要根据目标蛋白质的各种性质选择合适的蛋白纯化方法。 亲和层析因其高分辨率的特点，常用于精制纯化蛋白，根据目标蛋白与配体之间特异性 结合的能 力、重组标签蛋白螯合金属离子的能力、带有糖基化修饰蛋白可于外源凝集素结合 的能力，亲和层析具有高的目的蛋白分辨率，但是在进行精纯化蛋白之前，需要对蛋白质进 行粗纯化，常用的有硫酸钱盐析法。 例如分享来自一位网友的纯化蛋白的经验帖子，英目标在于纯化大肠杆菌表达的可溶性 sigma32 蛋白，该蛋白可以与细胞内的Core RNApolymeras 结合形成复合体，最终确定采用 免疫亲和柱来纯化蛋白复合体，但为了提髙纯化的效率，首先对复合体进行粗纯化，利用带 正电的PEI （聚乙烯亚胺）沉淀酸性蛋白和核酸，接着高盐洗脱蛋白，为了去除洗脱液中的 PEI 溶剂，采用硫酸钱沉淀蛋白，将蛋白和PEI 分开，粗分离纯化后，再采用免疫亲和柱的 方法进行精细纯化目标蛋白。 凝胶过滤层析可以应用蛋白分子间的分级分离，也可以去除蛋白混合物中分子量差别较 大的杂质。例如从Hcla 细胞中纯化一种叫AP-1的转录因子，就采用凝胶过滤的方法去除混 合物中的核酸酶，因为核酸酶能够降解DNA 亲和柱，并能够和其他非特异性蛋白结合，影 响目标蛋白的纯化。 蛋白质纯化 粗分离蛋白 处理样品 精纯化蛋白 人 A 人