硕士研究生
《昆虫生理生化实验技术》
课程代码：3012100018
开课单位：植物科技学院
责任教师：牛长缨
研究生：
学号：
实验一昆虫血淋巴中蛋白质的分离（聚丙烯酰胺凝胶电泳法）
一、实验目的
掌握凝胶电泳基本方法，并测定各种昆虫，以及同一种昆虫不同发育阶段的血淋巴的蛋白谱。
二、实验原理
昆虫的各种组织，均含有多种蛋白质和各种酶类。在血淋巴中经分离和纯化后已鉴定的蛋白质有：卵黄原蛋白，脂蛋白，贮存蛋白，滞育蛋白，抗菌蛋白，抗冷蛋白等。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离蛋白质和酶类，可以得到满意的蛋白谱和酶谱，通常能分离到20－30条带。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂（过硫酸胺）与加速剂（四甲基乙二胺）的作用下，聚合交联而成，具有三维网状结构，能起分子筛的作用，因此常用它作为电泳支持物。对样品的分离不仅取决于各组分所带电荷的多少，也与分子大小有关。此外，凝胶电泳还有一种独特的浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH和凝胶孔径梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带。从而提高了分离效果。
三、实验材料和仪器
供试昆虫：菜青虫
试剂及配制：
1．Acr:丙烯酰胺Bis:甲叉双丙烯酰胺TEMED:四甲基乙二胺AP:过硫酸胺Tris:三羟甲基氨基甲烷
A：1mol/L HCl 48ml；Tris 36.3g；加水至100ml，pH 8.9；贮存于棕色瓶内，4℃保存。B：Acr 30g；Bis 0.8g；加水至100ml，贮存于棕色瓶内，4℃保存。
C：10%AP 1gAP加9ml水，最好现用现配，贮存于棕色瓶内。
D：1mol/L HCl 48ml；Tris5.98g；加水至100ml，贮存于棕色瓶内，4℃保存.
E：Tris6g；甘氨酸28.8g；加水至1000ml，pH8.3(电极缓冲液)
2．1％溴酚蓝指示剂，苯硫脲
3．染色液：考马斯亮蓝R250 1.25g; 水227ml; 冰乙酸46ml; 甲醇227ml; 共500ml,溶解后过滤。
4．脱色液：水875ml; 甲醇50ml; 冰乙酸75ml.
5．分离胶及浓缩胶的配制：
分离胶高pH 不连续系统配制体积比（ml）
A
1mol/L HCl
Tris
加水至100ml
48ml
36.3g
pH 8.9
2．5
B
Acr
Bis
加水至100ml
30g
0.8g
5
TEMED (直接用原液) 0.01
加水12.39
10％AP (最后加入) 0.1
浓缩胶配制体积比（ml）
D 1mol/L HCl
Tris
48ml
5.98g
1.25
加水至100ml pH 6.7
B
Acr
Bis
加水至100ml
30g
0.8g
1
TEMED 0.005 水7.64 10％AP 0.10
仪器及用具：
高压电泳仪与垂直平板电泳槽、冰箱、组织匀浆器、离心机、吸水纸、移液器、注射器及长针头、大培养皿及大玻璃烧杯
四、实验方法及内容
（一）样品制备
血淋巴的采集：用解剖针轻轻刺破菜青虫尾部或头部表皮，用力挤压虫体收集血淋巴，滴入小试管或离心管中，用力适当防止将虫体内脏一起挤入（血淋巴中可加入微量的苯硫脲以防止血淋巴变黑）。
（二）电泳胶的制备
1.凝胶框的安装：将两块制胶玻璃插入橡胶框内成为凝胶框，插入电泳槽中，拧紧电泳
槽两侧的固定螺丝，使橡胶框垂直安装在电泳槽内不致漏水。
2.分离胶的制备：如上述，混匀后速将此胶加到凝胶框内，上面加正丁醇，晾干，约
30分钟。
3.待分离胶凝固后，倾倒出正丁醇，用蒸馏水多次冲洗胶面，最后用吸水纸吸干胶面水
分。
4.配浓缩胶，倒入分离胶上面，马上插入梳子，梳子下不能有气泡，用微量移液器向凹
陷的梳子孔加入浓缩胶补平。约10分钟后，浓缩胶干燥。
（三）加样
1.待浓缩胶干燥后，取出梳子，留下梳子孔准备点样。
2.样品与40％蔗糖（1：1）混匀，一般各取50μl。
3.点样后，每个样上加溴酚蓝指示剂，然后倒入电极缓冲液，至样品以下，用吸管吸缓
冲液覆盖于样品之上，然后再倒满。
（四）电泳
1.打开电泳仪，在浓缩胶150v, 跑到分离胶后200v, 大约跑3－4小时，至底部为止，
关上电泳仪。
2.倒出电极缓冲液，取出玻璃板，分开，浓缩胶不要，将分离胶倒入培养皿中，倒入染
色剂染色（60℃30分钟）
3.用脱色液脱色，至胶变白色为止。
（五）分析
各蛋白谱带迁移率（Rf）的计算：
迁移率Rf：谱带迁移距离（cm）/溴酚蓝迁移距离（cm）
谱带迁移距离是指从分离胶起点至谱带中心的距离（cm）
五、实验结果及分析
实验二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定牛血红蛋白分子量
一、实验目的
掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，并用以测定未知蛋白子分子量大小，分离不同大小的蛋白质。
二、实验原理
一般凝胶层析是非变性的，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是变性的，二硫键也被还原，所以是亚基（肽链）分子量。非变性胶同蛋白质分子结构，分子电荷有关。而变性胶因为有SDS参与，所以同分子结构电荷等等都无关。氨基酸有电泳性质，不过在普通Page胶里面电荷远少于SDS，忽略不计，所以可以用以分离不同大小的蛋白质。
三、实验材料及仪器
同实验一
四、实验方法及内容
方法同实验一，不同的是制备分离胶、浓缩胶和电极缓冲液的时候都要加入10%的SDS。
制样：样品要与上样缓冲液混匀，注意蛋白Marker和样品都要沸水煮3-5min。
五、实验结果及分析
实验三昆虫基因组DNA的提取及检测
一、实验目的
1.学习并掌握昆虫基因组DNA提取的一般方法；
2.掌握基因组DNA检测的一般方法；
3.比较不同样品对基因组DNA提取质量的影响。
二、实验原理
CTAB法原理：
CTAB是一种非离子去污剂，CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。
琼脂糖凝胶电泳检测原理：
在pH值为8.0－8.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
三、实验材料及仪器
供试昆虫：蜚蠊、家蝇、橘小实蝇
试剂：
2×CTAB溶液：
0.05M CTAB (国产)
0.1 M Tris·Cl (pH 8.3)
0.02 M EDTA
1.4M NaCl
Add ddH2O to 1000 ml
氯仿/异戊醇（24:1），实验前配好，放入通风橱中。
异丙醇，分装在棕色瓶中，-20℃保存。
70%乙醇
TE溶液：1mM EDTA，10mM Tris.HCl pH8.0
进口琼脂糖
电泳缓冲液10×TAE：NaAc4.1g+EDTA1.85g（pH8.0）混合定容于250ml
EB 0.5ug/ml
DNA Marker：DL2000
仪器：
冰盒，研钵，1.5ml的离心管，移液器，枪头（蓝黄白三种），一次性手套，玻棒，烧杯，容量瓶，锥形瓶，灭菌瓶
四、实验方法及内容
1.取试验昆虫于研钵中研碎；
2.取约0.4g左右细粉1.5ml离心管，加入1ml 2×CTAB提取液，加入大约2ul的β-巯
基乙醇混匀；
3.65oC水浴中放置1h，每隔10分钟上下颠倒混合数次(DNase变性，促进内溶物释放)；
4.11000rpm离心15分钟；
5.吸取600ul上清于新的1.5ml离心管，加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），上下
颠倒数次；
6.11000rpm离心15分钟；
7.取上清，重复5-6步1-2次；
8.加入等体积异丙醇-20oC沉淀半小时；
9.弃去上清。用70％乙醇浸洗沉淀，除去离子及CTAB残余，自然干燥30分钟以上；
10.加入50ul TE（含20ug/ml RNaseA），放于4oC冰箱保存备用；
11.0.8-1%琼脂糖凝胶电泳检测：
（1）将挡板及制胶板洗净，水平放置在工作台上；
（2）称取0.24 g琼脂糖于30 ml 1×TAE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶；
（3）调整好梳子的高度，趁热插入凝胶中；
（4）凝胶凝固后，小心拔去梳子，取下挡板；
（5）将电泳样品（约5ul）依次点入加样孔中，选一个适当的位置点DNA Marker；
（6）将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔在电泳槽的负极一端）；电压80v，30min。
（7）电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 μg/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡10－15 min，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。
五、本实验注意事项
1.研钵预冻，粉末转管前至加CTAB前不要融化
2.24:1的苯酚氯仿抽提时动作应轻柔，氯仿的操作要在通风柜中进行
3.所用试剂必需灭菌，带手套
4.EB为诱变剂，可引起插入突变，并有中度毒性，操作时要注意防护。一般配成1000
×储液（0.5mg/ml），工作浓度为0.5ug/ml。
六、实验结果及分析
实验四昆虫肌动蛋白（Actin）基因片段的PCR检测
一、实验目的：
学习并掌握PCR扩增目的基因片断的一般原理和方法，熟练操作琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的方法。
二、实验原理：
PCR（多聚酶链式反应〕是一种体外扩增特异DNA片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技术之一，是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性（denaturation，）退火（annealing）、延伸（extension）三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。
三、实验试剂及作用
Mg2＋：Mg2＋能影响反应的特异性和扩增片段的产率。一般反应体系中1.5-2.5 mmol/L 反应缓冲液：使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。
dNTP：在PCR反应体系中其浓度一般为20-200mmol/L，浓度过高、过低都不利。
Taq DNA聚合酶：在70－75?C具最高活性。具有5’－3’的聚合酶活性和5’－3’的外切酶活性，无校正功能。是镁依赖性酶。
引物序列
Actin基因片段引物：F: 5′- AGGCTAACCGTGAGAAGA
R：5′-GGTGGTGGTGAAAGAGTAA
由上海生工有限公司合成
模板DNA：前次所提质量较好的基因组DNA
1.4-1.5%琼脂糖
EB
电泳buffer的配制
四、操作步骤
1. 20×反应体系
10 × Ex Taq buffer 2 μl
MgCL2（25mM）2ul
dNTP mixture (10 mM) 1μl
Primer F (20uM) 1μl
Primer R (20uM) 1μl
Taq (5 u / 1 μl) 0.2μl
ddH2O 11.8μl
混匀
DNA 1 μl
Total 20 μl
2. PCR反应循环条件设置：
95℃3’
94℃1'
55℃1' 35 cycles
72℃2'
72℃10'
4℃forever
3. 检测：取10 l反应产物电泳；
4. 在1.4-1.5%的琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。
五、实验结果及分析
实验五昆虫肌动蛋白（Actin）基因片段的PCR产物纯化
一、实验目的
通过PCR产物的纯化，可获得高纯度的DNA片段，并能够保持片段完整性和高生物活性，可直接用于连接、体外转录、扩增、测序、微注射等分子生物学实验。
二、实验原理
本实验采用Axygen公司的AxyPrep-96 DNA 凝胶回收试剂盒。该试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中回收多至8 μg 长度在70 bp-10 kb 的片段，回收率为60-85%。琼脂糖凝胶在温和的缓冲液（DE-A 溶液）中熔化，其中的保护剂能防止线状DNA 在高温下降解，然后在DE-B 溶液的作用下使DNA 选择性地结合到膜上。
三、实验材料及仪器
凝胶回收试剂盒
琼脂糖凝胶电泳系统
紫外观察分析仪
离心机
单面刀片
四、实验准备及注意事项
1. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip 头。
2. 第一次使用试剂盒前，在BufferW2 concentrate 中加入指定体积的无水乙醇。
3. 准备75 °C 水浴。
4. 使用前，检查Buffer DE-B 是否出现沉淀，若出现沉淀，应于75 °C 温浴加热至沉淀完全溶解并冷却至室温后再使用。
1. Buffer DE-A（含有β-巯基乙醇）和Buffer DE-B 含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和防护眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。
2. 在步骤1 中，将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时间（线性DNA 长时间暴露在高温条件下易于水解），从而提高回收率。勿将含DNA 的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA造成的损伤。
3. 在步骤2 中凝胶必须完全熔化，否则将严重影响DNA 回收率。
4. DNA 分子呈酸性，建议在2.5 mM Tris-HCl，pH7.0-8.5 的洗脱液中保存。
五、实验方法及内容
1. 用干净锋利的刀片从琼脂糖凝胶中切下含有目的DNA 条带的凝胶块，用纸巾吸尽
凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积（如100 mg=100 μl 体积），然后依次放入96孔2.2 ml 深孔板（试剂盒内提供）孔中。
* 观察DNA 条带位置时，请尽可能缩短紫外照射时间，以减少紫外诱导突变。电泳时间可适当延长，从而使目的DNA 片段与其他DNA 片段尽可能分开，从而提高回收纯度。
2. 加入3 个凝胶体积的Buffer DE-A，用硅胶片密封各孔（试剂盒内提供），混合均匀
后于75 °C 温浴，间断混合（每3-5 min），直至凝胶块完全熔化（15 min 左右）。3,000×g 简短离心使硅胶片上的溶液到96 深孔板中。
* 温浴及混匀过程中，要确保硅胶片与深孔板贴紧，以免孔间样品污染。
* Buffer DE-A 为红色溶液。在熔化凝胶的过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化。
3. 弃硅胶片。每孔加0.5 个Buffer DE-A 体积的Buffer DE-B，用不干胶片（试剂盒内
提供）密封各孔，混合均匀。3,000×g 简短离心使不干胶片上的溶液到96 深孔板中。
当分离的DNA 片段小于400 bp 时，应在此溶液中再加入1 个凝胶体积的异丙醇。
* 加Buffer DE-B 后混合物颜色变为黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。
4. 将96 孔DNA 制备板（试剂盒内提供）置于新的96 孔2.2 ml 深孔板（试剂盒内提
供）上，然后将样品转移至96 孔DNA 制备板中，用不干胶片密封各孔，3,000×g 离心5 min，弃滤液。
5. 将96 孔DNA 制备板置回深孔板上，每孔加800 m l BufferW2，3,000×g 离心1
min，弃滤液；以同样的方法，再用800 m l BufferW2 洗涤一次，3,000×g 离心1 min。
* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
* 两次用Buffer W2 冲洗能确保盐分被完全清除，消除对后续反应的影响。
6. 将96 孔DNA 制备板置回96 孔2.2ml 深孔板上，3,000×g 离心5 min。
7. 将96 孔DNA 制备板置于洁净的96 孔V 型底板（试剂盒内提供）上，在膜正中央
加50 m l Eluent 或去离子水，用不干胶片密封各孔，室温静置5 min。3,000×g 室温离心5 min 洗脱DNA。
* 将Eluent 或去离子水加热至65℃，可提高洗脱效率。
六、实验结果及分析
《植物生理学实验》课程大纲 一、课程概述 课程名称（中文）：植物生理学实验 （英文）：Plant Physiology Experiments 课程编号：18241054 课程学分：0.8 课程总学时：24 课程性质：专业基础课 前修课程：植物学、生物化学、植物生理学 二、课程内容简介 植物生理学是农林院校各相关专业的重要学科基础课，是学习相关后续课程的必要前提，也是进行农业科学研究和指导农业生产的重要手段和依据。本实验课程紧密结合理论课学习内容，加深学生对理论知识的理解。掌握植物生理学的实验技术、基本原理以及研究过程对了解植物生理学的基本理论是非常重要的。本大纲体现了植物生理学最实用的技术方法。实验内容上和农业生产实践相结合，加强学生服务三农的能力。实验手段和方法上，注重传统、经典技术理论与现代新兴技术的结合，提高学生对新技术、新知识的理解和应用能力。 三、实验目标与要求 植物生理学实验的基本目标旨在培养各专业、各层次学生有关植物生理学方面的基本研究方法和技能，包括基本操作技能的训练、独立工作能力的培养、实事求是的科学工作态度和严谨的工作作风的建立。开设植物生理学实验课程，不仅可以使学生加深对植物生理学基本原理、基础知识的理解，而且对培养学生分析问题、解决问题的能力和严谨的科学态度以及提高科研能力等都具有十分重要的作用。 要求学生实验前必须预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期结果，操作关键步骤及注意事项；实验时要严肃认真专心操作，注意观察实验过程中出现的现象和结果；及时将实验结果如实记录下来；实验结束后，根据实验结果进行科学分析，完成实验报告。 四、学时分配 植物生理学实验课学时分配 实验项目名称学时实验类别备注 植物组织水势的测定3学时验证性 叶绿体色素的提取及定量测定3学时验证性 植物的溶液培养及缺素症状观察3学时验证性 植物呼吸强度的测定3学时设计性 红外CO2分析仪法测定植物呼吸速率3学时设计性选修 植物生长物质生理效应的测定3学时验证性 植物种子生活力的快速测定3学时验证性
生物化学实验报告 动物营养研究所 树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二．实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物 的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅 基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后， 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5 等）等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈 蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单 位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定围，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可 用比色法测定，测定围1-1000μg。 三．实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯 亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐 溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材
生物化学实验习题及参 考答案 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI； 2、层析； 3、透析； 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳； 5、蛋白质变性； 6、复性； 7、Tm 值； 8、同工酶； 9、Km值； 10、DNA变性；11、退火；12、增色效应 二、基础理论单项选择题 1、用下列方法测定蛋白质含量，哪一种方法需要完整的肽键（ ） A、双缩脲反应 B、凯氏定氮 C、紫外吸收 D、羧肽酶法 2、下列哪组反应是错误的（） A、葡萄糖——Molish反应 B、胆固醇——Libermann-Burchard反应 C、色氨酸——坂口（Sakaguchi）反应 D、氨基酸——茚三酮反应 3、Sanger试剂是（） A、苯异硫氰酸 B、2，4-二硝基氟苯 C、丹磺酰氯 D、-巯基乙醇 4、肽键在下列哪个波长具有最大光吸收（） A、215nm B、260nm C、280nm D、340nm 5、下列蛋白质组分中，哪一种在280nm具有最大的光吸收（） A、色氨酸的吲哚基 B、酪氨酸的酚环 C、苯丙氨酸的苯环 D、半胱氨酸的硫原子 6、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质（） A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同 B、分子大小不同 C、分子极性不同 D、溶解度不同 7、蛋白质用硫酸铵沉淀后，可选用透析法除去硫酸铵。硫酸铵是否从透析袋中除净，你选用下列哪一种试剂检查（） A、茚三酮试剂 B、奈氏试剂 C、双缩脲试剂 D、Folin-酚试剂 8、蛋白质变性是由于（） A、一级结构改变 B、亚基解聚 C、空间构象破坏 D、辅基脱落 9、用生牛奶或生蛋清解救重金属盐中毒是依据蛋白质具有（） A、胶体性 B、粘性 C、变性作用 D、沉淀作用 10、有关变性的错误描述为（）
生 理 实 验 设 计 实验课题:筒箭毒对神经—肌肉接头处得兴奋传递得影响 实验成员:星期五下午第四实验室第二组 筒箭毒对神经—肌肉接头处兴奋传递得影响 实验假设 筒箭毒能与乙酰胆碱竞争神经肌接头处得ｎm受体,使肌肉松弛。 实验原理与目得 神经肌肉接头处得兴奋传递过程有三个重要得环节: 一就是钙离子促进神经轴突中得囊泡膜与接头前膜发生融合而破裂; 二就是囊泡中得乙酰胆碱释放到神经肌肉接头间隙; 三就是乙酰胆碱与接头后膜上得受体结合,引发终板电位。 乙酰胆碱(Aｃetylｃholine,ACh)就是一种重要得神经递质,就是连接每个运动神经元与骨骼肌之间得信使。如果AＣh得传递受阻,肌肉就不能收缩。箭毒就是美印第安人在猎箭头部涂抹得一种毒药,它能够占用并阻塞ACh 受体得位置,能竞争性阻断AＣh得去极化作用致使神经递质不能影响肌肉、能与ＡCh 竞争神经肌接头处得nm胆碱能受体,但不激动受体,因而使骨骼肌松弛、抗胆碱酯酶药可拮抗其肌肉松弛作用,新斯得明就是胆碱酯酶抑制剂,可通过抑制胆碱酯酶增减乙酰胆碱在肌接头间隙得浓度。故筒箭毒过量可用适量新斯得明解救。筒箭毒与乙酰胆碱竞争性结合乙酰胆碱受体,注射新斯得明后使突触间隙内得乙酰胆碱浓度升高
而使竞争性增强,故乙酰胆碱与受体接触增多,从而使肌无力症状减弱。 本实验得目得就是探索筒箭毒对神经-－肌接头处兴奋传递得影响极其相关机制;观察筒箭 毒得肌松作用,分析其作用点;了解新斯得明对抗筒箭毒得作用。 实验对象 大白鼠,体重2５0g以上 实验器材与药品 Powerlaｂ一套(主机,刺激器,张力换能器),手术器械一套,小动物人工呼吸机,气管插管,棉线,大头针,铁架台,注射器0.０0１g％筒箭毒碱,０。005g％新斯得明,２5％乌拉坦,１。5％普鲁卡因,生理盐水 实验方法 1、大鼠称重,麻醉;25%乌拉坦腹腔注射０。５mｌ／100g麻醉。然后仰卧固定于鼠手术床上,分离气管及颈外静脉,分别插入气管插管与静脉插管,准备好人工呼吸机。数分钟后翻正反射消失,即可进行实验; 2、分离坐骨神经;在髋关节后,坐骨结节内凹陷处切开皮肤,钝性分离肌肉,暴露一段坐骨神经,用浸有1、5%普鲁卡因得棉线围绕坐骨神经打一个结,在坐骨神经干上做传导阻滞麻醉,排除下行干扰; 3、分离腓神经;在外侧剪开皮肤,钝性分离肌肉组织,分离腓神经,神经穿线备用; 4、分离胫前肌;将大鼠两前肢固定在手术台(仰卧),从后置踝关节正前方向剪开小腿皮肤,剪断踝关节前部韧带,分离胫前肌肌腱,沿胫骨分离胫前肌(注意不要损伤血管),在踝部得胫前肌肌腱处扎线,与结扎线远端切断肌腱; 5、安装并设定powｅrlab记录肌张力得cｈarｔ设定文件;调定刺肉毒碱对神经肌肉接头处处兴奋传递得影响 6、连接仪器;手术操作完成后,将胫前肌与pｏwerlab得张力换能器向连接,腓神经处安放刺激电极。最适负荷设定为１０ｇ左右。稳定一段时间后,于给药前记录一段正常得肌肉收缩曲线; 7. 缓慢静脉注射0。001%筒箭毒碱0.1ml／10０g,从仪器上观察肌肉收缩曲线得变化情况; 8。待肌肉收缩曲线再次稳定或完全消失后,停止刺激,同时缓慢静脉注射0。005%新斯得明0、１5mｌ／1０0g,观察肌肉收缩曲线得变化情况、 预期结果 注射筒箭毒后肌肉收缩曲线幅度变小甚至消失,即肌肉处于肌无力状态,注射新斯得明后肌肉收缩曲线又基本恢复正常,即肌肉恢复正常收缩状态; 结果分析 从神经传来得兴奋,通过神经－肌肉接头传递给肌纤维膜,就是以化学递质乙酰胆碱为中介进行得,其全过程可分为:(1)接头前过程、(2)神经递质在间隙得扩散。(3)接头后过程、 如果就是筒箭毒作用于突触前膜,即不能释放乙酰胆碱,那么无论就是否有新斯得明,后膜中均无乙酰胆碱,所以在注射新斯得明后仍然就是肌无力状态,即不会出现预期结果; 如果就是筒箭毒作用于突触间隙,即与突触前膜释放得乙酰胆碱结合,抑制其发挥作用,那么无论就是否有新斯得明,后膜中均无可发挥肉毒碱对神经肌肉接头处处兴奋传递得影响作用得乙酰胆碱,所以在注射新斯得明后仍然就是肌无力状态,即不会出现预期结果; 而如果就是筒箭毒作用于突触后膜,即与乙酰胆碱竞争性结合乙酰胆碱受体,注射新斯得明后使突触间隙内得乙酰胆碱浓度升高而使其竞争性增强,使乙酰胆碱与受体接触增多,从而使肌无力症状减弱,使肌肉收缩曲线幅度增强,即会出现预期结果; 综上所述,假设成立。 注意事项
《植物生理生化实验》复习习题 一、名词解释： 标准曲线:用标准溶液制成的曲线。 先配制一系列不同浓度的标准溶液， 在溶液最大吸收波长下，逐一测定吸光度， 然后用坐标纸以溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，必然得到一条通过原点的直线，即标准曲线。 斐林（Folin）－酚试剂法:又称lowry法，它结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，是双缩脲方法的进一步发展，可利用其在650nm波长下的特定吸收进行比色测定。 茚三酮显色法: 游离氨基酸与茚三酮共热时，能定量生成紫色的二酮茚-二酮茚胺。其吸收峰在570nm，而且在一不定期范围内吸光度与游离氨基酸浓度成正比，因此可用分光光度法测定其含量。 茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。 氨、茚三酮与还原性茚三酮发生反应，生成紫色化合物。 该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，通过测定570nm 处的光密度，可测定氨基酸的含量。 氮素代谢:氮素及含氮的活体物质的同化、异化、排泄，总称为氮素代谢。 淀粉酶：水解淀粉和糖原的酶类总称 真空渗入: 指将叶片打孔放入注射器中，加水浸没，排出空气后用手指堵住前端小孔，同时把活塞向外抽拉，即可造成减压而排出组织中的空气，轻放活塞，水液即进入组织的方法。 离心技术: 根据物质颗粒在一个实用的离心场中的行为而发展起来的 是1.分离细胞器和生物大分子物质的必备的手段之一， 也是2.测定某些纯品物质的部分性质的一种方法。 差速离心法基于待测物质颗粒大小、密度、沉降速度的不同而得到分离。 电泳:各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的颗粒, 这种带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。 同工酶: 指催化同一种化学反应，但其酶本身分子结构和带电性质却有所不同的一组酶。 迁移率: 指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。 溶液中带电粒子在电场中向着与它电性相反的电极移动，它的移动速度是电场和粒子的有效迁移率(m)的乘积，即：V=mE。
《生物化学实验》内容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事求是的科学态度。 二、实验内容
三、成绩 包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据；（3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。
3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体内可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电 加热板或电炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻 璃棒1根；100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）； 不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若
动物生理学实验设计 班级：09级生物技术本一班 小组成员：李水琴姚燕兵罗泉清龙伟雄 实验设计内容 一、课题名称：静脉注射和口服等量生理盐水对小白鼠尿量的影响 二、实验目的：通过对小白鼠注射和口服等量生理盐水，了解尿液生 成过程，进一步熟悉掌握肾小管的功能。 三、基本原理： 生理盐水对尿液的影响：加大了血液中水的含量,冲淡了血 液,增加人体的排尿量.肾脏为了维持体内水的平衡,通过生 成尿液来实现.尿的生成来源于血浆,通过肾小球的滤过,肾 小管的吸收,肾小管的徘汇和分泌这三个过程来完成.在这 三个过程中,除了生成尿液外,肾脏同时根据体内水分的多 少对尿量进行调节,而保持水的平衡,维持人的正常生活.
四、材料与用品：小白鼠数只、生理盐水200ml、25%氨基甲酸乙酯 溶液、纱布、棉线、注射器、试管、试管夹等五、注意事项： 1．实验前给小白鼠多喂些食物，或用导尿管向小白鼠胃中灌入40—50ml 清水，以增加其基础尿流量； 2．实验中需多次进行耳缘静脉注射，注射时应从耳缘静脉远端开始，逐步移近耳根。手术的创口不宜过大，防止动物的体温下 降，影响实验； 3．输尿管手术的难度较大，应注意防止导管被血凝块堵塞，或被扭曲而阻断尿液的流通。 六、方法与步骤： 1、小白鼠抓取、称重、麻醉：抓取3只体型相近、健康指数大致 一致的小白鼠称重，然后用25%氨基甲酸乙酯溶液（按1g/kg 或4ml/kg用量），从耳缘静脉注入，小白鼠麻醉成功后，使其仰卧并用绳固定在兔台上备用，并标号、记录数据； 2、分别对上述上三只小白鼠进行注射、口服30ml等量生理盐水 和空白对照处理；
3、在胱底部找到并分离两侧输尿管，在输尿管靠近膀胱处用细线 结扎，另穿一细线打松结备用，略等片刻，待输尿管充盈后，提起结扎细线，在管壁上用眼科剪剪一小斜口，从斜口向肾脏方向插入口径适当的预先充满生理盐水的输尿管插管，结扎固定，用试管收集尿液。 4、三小时后，每隔半小时，观察小白鼠尿量变化（滴/分），做 好记录，并绘制成曲线图观察。
不同pH值对牛蛙离体心脏收缩活动的影响 2008231144 赖泽红生科一班 摘要：本实验主要是采用斯氏蛙心插管法，在保持灌流液高度恒定的情况下，分别以不同pH值的溶液对牛蛙离体心脏进行灌流，经张力换能器、RM6240D型生物信号采集处理系统与处理系统记录心肌的活动过程，探讨不同pH对离体心脏活动的影响，以揭示酸碱度与心脏收缩活动的关系。 关键词：pH值；离体心脏；收缩活动 生理状态下，血液pH值保持在7.35—7.45，这是保证细胞惊醒正常代谢和机能活动的基本条件。在生命活动的过程中，体内不断生成酸性或碱性产物，机体通过多方面的调解活动，使血液pH值保持在正常范围内。然而，一旦机体酸碱调节失衡，会导致体内酸中毒或碱中毒，对机体造成影响。心脏直接与血液接触，心肌细胞的收缩活动容易受血液pH值的影响。本实验通过用不同PH值的灌流液灌流牛蛙离体心脏，观察其对心脏某些功能的影响，以揭示酸碱度与心脏收缩活动的关系，用离体牛蛙心脏，排除了在体时的神经体液干扰，故实验结果更为可靠。 一、实验材料： 1、实验仪器：RM6240D型生物信号采集处理系统、张力换能器、pH酸度计。 2、常用器械：蛙板或蜡盘，蛙心夹、蛙心套管，滴管，培养皿或小烧杯，玻璃板、容量瓶，移液管、量筒、污物缸，纱布，棉线，
常用手术器械。 3、药品：任氏液， HCL溶液，NaOH溶液。 4、实验动物：牛蛙2-4只（雌雄不限）。 二、实验步骤与方法 1、药品配制 （1）任氏液配制 母液及容量成分 NaCl、 KCl 、CaCl2 、NaH2PO4 、NaHCO3 、葡萄糖、蒸馏水，注: 表内各成分除葡萄糖以 g 为单位外，均以 ml 为单位. 任氏液的配制方法：一般先将各成分分别配制成一定浓度的母液，而后按所要的容量混合。需要注意的是：CaCl2 应在其他母液混合并加入蒸馏水后，再边搅拌边加入，以防钙盐生成。另外，葡萄糖应在用前临时加入，否则不宜久置。两栖类的为PH6.5-7.0 （2）不同PH浓度的任氏液配制。 不同PH值灌流液的配制。首先，校整酸度计。先将酸度计“PH-mv”开关拨到位置。打开电源开关，指示灯亮，预热30分钟。取下放蒸馏水的小烧杯，并用滤纸轻轻地吸去玻璃电极上多余水珠，在小烧杯内放入选择好的已知的PH值准确的缓冲溶液。将电极浸入。根据标准缓冲液的PH，将量程开关拧到 0～7 或 7～14 处。调节控温钮指示的温度与室温相同，调节零点，使指针在PH为7.0处。轻轻按下或稍许转动读数开关使开关卡住。调节定位旋钮，使指针恰好指在标准缓冲溶液的PH值处。放开读数开关，重复操作，直到数
福建农林大学考试试卷（A卷） 2006 —2007 学年第二学期 课程名称：植物生理生化实验考试时间90分钟 专业年级班学号姓名___ 一、名词解释（每小题2分，共20分） 1、标准曲线： 2、离心技术： 3、同工酶： 4、酶活力： 5、诱导酶： 6、呼吸速率： 7、种子生活力： 8、抗逆性： 9、超氧化物歧化酶（SOD）： 10、光合速率： 二、填空题（每格1分，共32分） 1、测定植物组织中可溶性蛋白质含量的方法有_______________________、________________和___________________等。 2、在测定植物可溶性蛋白质含量时，绘制标准曲线是以为横坐标，以_ 为纵坐标。 3、用茚三酮显色法测定植物组织氨基酸含量时，茚三酮溶液与氨基酸共热生成_________，
_________与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成________________。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成_________，可通过测定__________nm处的光密度，求出氨基酸的含量。 4、在测定淀粉酶的活性时：α－淀粉酶不耐，β－淀粉酶不耐。 5、测定淀粉酶活性时，3，5－二硝基水杨酸试剂（DNS）的作用是_______________________和__________________。 6、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶实验中，电泳存在三大效应，分别是______________、________ ____ 和。 7、测定硝酸还原酶活性的方法有___________________和_________________________。 8、类胡萝卜素吸收光谱最强吸收区在_____ ，它不仅可以吸收传递光能，还具有_______ 的作用。 9、叶绿素溶液在透射光下呈色，在反射光下呈色。 10、在研究植物矿质元素中,常用的植物溶液培养法有__ 、 __ 和 __________。 11、水培时要选用黑色容器装营养液，这是为了防止______ 。 12、常用________ 法确定植物生长的必需元素。 13、用活体法测定硝酸还原酶的材料，取样前叶子需进行一段时间的光合作用，以积累_______________，产生更多________________，加速硝酸盐的还原。 14、植物光合速率测定方法有__________________和_________________等。 三、选择题(每题1分，共10分) ） A、底物浓度必须极大于酶浓度 B、酶浓度必须极大于底物浓度， D、酶能提高反应的平衡点C、与底物浓度无关 2、蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在（）波长处。 A、260nm B、650nm C、540nm D、280nm 3、斐林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质浓度时，应选用的波长是（）。 A、260nm B、650nm C、540nm D、280nm 4、叶绿素提取时，叶片匀浆时加入少许CaCO3，其目的是（） A、使研磨更充分 B、加速叶绿素溶解 C、使叶绿素a、b分离 D、保护叶绿素 5、一般而言，正常植物叶片的叶绿素与类胡萝卜素的比值为（） A、2:1 B、3:1 C、1 :2 D、1:3
《生物化学实验Ⅰ》总复习思考题 部分是自己做的，部分是百度的，各位看官如果要借鉴请酌情考虑，后果自负。 ——江湖游子 1. 请掌握下列生物化学实验常用仪器的正确操作使用方法，并能回答以下问题： （1）离心机使用时为什么要平衡？普通离心机与高速离心机在平衡时有什么不同要求？ 平衡是为了让转动物体重心正好在转轴上，如果不在，会对转轴产生很大作用力，有时整台机器会跟着晃动。这对机器损耗很大。转速越高的离心机不光重量很重，使用时还要特别放平衡，就连离心管里面的试液都要放置等量，离心管还要对称放入转子试管孔内，以确保转子平衡运行，而且在调节转速时，还要使用分段升速法。 (2)为什么用高速组织捣碎机进行动、植物组织捣碎时，需采用间歇式方式进行操作？ 为了防止产热过高，破坏组织内的蛋白质。防止蛋白变性。 (3)用真空泵进行减压抽滤时，为什么要连接缓冲瓶？ 防止负压产生，引起水泵里的水或油泵里的油倒吸，进入滤瓶中，污染滤液。 2.为什么肝糖元只能从刚宰杀的动物肝脏中获取？在提取肝糖元过程中，三氯乙酸、95%乙醇各起什么作用？糖元水解产物中如果存在提取中残留蛋白质时，在用班氏试剂检测水解产物，有什么影响！ 动物死亡后，体内的细胞还能存活一段时间，由于进行细胞呼吸作用，肝细胞会消耗肝糖元，所以必须用新鲜的肝脏细胞。三氯乙酸是固定作用（蛋白质能被三氯乙酸沉淀）；乙醇：糖元不溶于乙醇，可以提取糖元。班氏试剂使用时需要加热，而加热会时残留的蛋白质变性水解，对最终测得的水解产物颜色可能有影响。（水解的产生的氨气结合铜离子，是铜离子的氧化性失去，导致生产绛蓝色沉淀，实验将失败） 3.请阐述分光光度仪的主要部件及其功能；阐述紫外与可见光的光波长范围；在紫外与可见光范围内测定物质吸光度时，对光源与吸收池有何要求？光电管的功能是什么？为什么说光电管是分光光度仪最脆弱和最易损的部件？ 光源（钨灯）：发光。 单色器：把混合光波分解为单一波长光的装置。 吸收池：盛放待测流体（液体、气体）试样的容器。该容器应具有两面互相平行、透光且有精确厚度的平面。它藉助机械操作能把待测试样间断或连续地送到光路中，以便吸收测量的辐射（光）通量。 检测器：将单色器分出的光信号进行光电转换，电信号在工作站显示成出峰。 测量装置：通过测得的电流表·记录器·数字示值读书单元的数据来绘制吸收曲线。 紫外光：200至350nm 可见光波长:350至760nm 紫外测定：其应用波长范围为200～400nm的紫外光做光源，在低于350nm的紫外光区工作时，必须采用石英池或熔凝石英池。 可见光测定：用波长为400～850nm的可见光作光源，可以用玻璃池·石英池·熔凝池。 光电管的功能：光电转换，将光信号转化成电信号。 光电管容易产生光电管疲劳：所以不测定时必须将试样室盖盖好，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。
实验设计影响骨骼肌收缩的因素 [实验原理] 蛙类的一些生理活动规律与温血动物相似，而维持其离体组织正常活动所需的理化条件较简单，易于建立和控制。坐骨神经和腓肠肌是可兴奋组织，将其置于人工配置的任氏液中，兴奋性在几小时内可保持不变。因此在实验中常用蛙类的坐骨神经-腓肠肌标本来观察和研究兴奋、兴奋性、刺激与肌肉收缩等基本的生理现象和过程。 神经受到一次阈刺激或阈上刺激，先产生一次动作电位，通过神经-肌肉接头处兴奋的传递，引起受支配的骨骼肌产生动作电位，然后通过兴奋-收缩耦联机制引起骨骼肌收缩。在一定范围内，随着刺激强度的增加，骨骼肌的收缩强度也随着增加。 整块骨骼肌或单个肌细胞受到一次短暂而有效的刺激时，可产生一次机械收缩，称为单收缩。若给肌肉相继两个有效刺激，且使两个刺激的间隔时间小于该肌肉单收缩的总时程。则引起肌肉的收缩可以总和起来，出现一连续的收缩，称为复合收缩。当骨骼肌受一串有效刺激时，若刺激频率较低，则肌肉的反应表现为一连串单收缩，若刺激频率逐渐增加，肌肉收缩反应可表现为不完全强直收缩和完全强直收缩 [实验对象] 蟾蜍或蛙。 [实验药品与器材] 青蛙或蟾蜍、常用手术器械（包括粗剪刀、手术剪、手术镊、眼科剪、眼科镊、金属探针、玻璃分针）、固定针、锌铜弓、蜡盘、培养皿、污物缸、棉线、纱布、滴管、任氏液 RM6240计算机采集系统、JZ100型张力换能器(50 g)、支架、一维位移微调器、肌槽、双针型露丝电极 [实验方法与步骤] 1. 制备蛙的坐骨神经—腓肠肌标本 1) 毁脑和脊髓 取青蛙一只，用纱布包裹青蛙的四肢和躯干，露出头部。用左手握住青蛙，并用食指压其头部前端使其尽量前俯，拇指按压背部，使头部前俯；右手持金属探针由头前端沿中线向尾方划触，触及凹陷处即枕骨大孔处转向头方，向前探入颅腔内，然后向各个方向搅动探针，以捣毁脑组织。如探针确实在颅腔内，可感觉出针在四面皆壁的腔内。脑组织捣毁后，将探针退出，再由枕骨大孔刺入,并转向尾方,与脊髓平行刺入椎管,以确坏脊髓，要确定脑和脊髓是否完全破坏，可检查动物四肢肌肉的紧张性是否完全消失。 2) 剥制后肢标本 自青蛙的两侧腋部以下完全剥离皮肤（注意：可事先剪去尾椎末端及汇殖腔附近的皮肤，使剥离更容易）。而后倒提蛙腿，使其头部向下，用手术剪横向剪开腹部肌肉，看清脊神经后,用粗剪刀剪断脊柱(注意铁损伤坐骨神经)。把标本浸泡于盛有任氏液的培养皿中，将手及用过的剪刀、镊子等全部手术器械洗净，再继续下面的步骤。
实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作
生物化学实验 一、名词解释： 分配层析法电泳同工酶酶活性分光光度法层析技术比活力 二、填空题： 1. 测定蛋白质含量的方法有，，和。 2. CAT能把H2O2分解为H2O和O2，其活性大小以来表示，当CAT与H2O2反应结束，再用测定未分解的H2O2。 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以作为载体的一种区带电泳，这种凝胶是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成。化学聚合法一般用来制备_____________胶，其自由基的引发剂是，催化剂是______________；光聚合法适于制备大孔径的_________________胶，催化剂是______________。 4.层析技术按分离过程所主要依据的物理化学性质进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________，_______________和________________。 5. 使用离心机离心样品前，必须使离心管__________且对称放入离心机。 6. 米氏常数可近似表示酶和底物亲合力，Km愈小，表示E对S的亲合力愈，Km愈大，表示E对S 的亲合力愈。 7. 分光光度计在使用之前必须预热，注意预热及样品槽空时必须_________（打开、合上）样品池翻盖。 8. CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的密切相关。 9. 纸层析实验中，____________形成固定相，____________流动相。 10. 聚丙烯酰胺凝胶是是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成的，在具有自由基团体系时，两者就聚合。引发产生自由基的方法有两种：和。11. 层析技术按按固定相的使用形式进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________和________________。 三、问答题： 1、简述4种测定蛋白质含量的方法及其原理。 2、简述不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个不连续及三种物理效应。 3、试分析影响电泳的主要因素有哪些？ 参考答案： 生物化学实验 一、名词解释： 1、电泳：指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 2、同工酶：指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。 3、分配层析法：用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。
植物生理学实验指导 Prepared on 24 November 2020
植物生理学实验指导
目录
植物材料的采集、处理与保存 植物生理实验使用的材料非常广泛，根据来源可划分为天然的植物材料（如植物幼苗、根、茎、叶、花等器官或组织等）和人工培养、选育的植物材料（如杂交种、诱导突变种、植物组织培养突变型细胞、愈伤组织、酵母等）两大类；按其水分状况、生理状态可划分为新鲜植物材料（如苹果、梨、桃果肉，蔬菜叶片，绿豆、豌豆芽下胚轴，麦芽、谷芽，鳞茎、花椰菜等）和干材料（小麦面粉，玉米粉，大豆粉，根、茎、叶干粉，干酵母等）两大类，因实验目的和条件不同，而加以选择。 植物材料的采集和处理，是植物生理研究测定中的重要环节。在实际工作中，往往容易把注意力集中在具体的仪器测定上，而对于如何正确地采集和处理样品却不够注意，结果导致了较大的实验误差，甚至造成整个测定结果的失败。因此，必须对样品的采集、处理与保存给予足够的重视。 一、原始样品及平均样品的采取、处理 植物生理研究测定结果的可靠性（或准确性），首先取决于试材对总体的代表性，如果采样缺乏代表性，那么测定所得数据再精确也没有意义。所以，样品的采集除必须遵循田间试验抽样技术的一般原则外，还要根据不同测定项目的具体要求，正确采集所需试材。目前，随着研究技术的不断发展，应该不断提高采样技术的水平。 在作物苗期的许多生理测定项目中都需要采集整株的试材样品，在作物中后期的一些生理测定项目中，如作物群体物质生产的研究，也需要采集整株的试材样品，有时虽然是测定植株的部分器官，但为了维持器官的正常生理状态，也需要进行整株采样。 除研究作物群体物质生产外，对于作物生理过程的研究来说，许多生理指标测定中的整株采样，也只是对地上部分的采样，没有必要连根采样，当然对根系的研究测定例外。采样时间因研究目的而不同，如按生育时期或某一特殊需要的时间进行。除逆境生理研究等特殊需要外，所取植株应是能代表试验小区正常生育无损伤的健康植株。
生化大实验 实验报告 姓名： 学号： 专业： 班级： 实验班级： 单位： 指导老师：
实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取 一、实验原理： 多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。 植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。 蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。 二、实验目的： 通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。 三、材料与试剂： 1.材料：马铃薯（两小组共称200g） 2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2） 3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机； 四、操作步骤： 1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min； 2.用两层纱布将所得的浆液过滤； 3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min； 4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min； 5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min； 6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。 五、结果和分析： 实验所得的初酶液颜色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。 六、讨论与结论： 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化； 2．实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净； 3.加入硫酸铵固体时一定要小心缓慢，同时伴有玻璃般的搅拌，在溶解蛋白的过程中避免溶液局部盐离子浓度过大，使蛋白变性，并注意用量的计算，第二步加入的时候起点浓度是40%而不是0，否则会加入过量，影响实验的结果； 4.透析时，提前检查透析袋是否完整，避免透析时出现孔洞导致样品丢失。
生物化学实验方法手册 Markus R Wenk National University of Singapore, Singapore Aaron Zefrin Fernandis National University of Singapore, Singapore A Manual For Biochemistry Protocols 2007,127pp. Paperback ISBN 978-981-270-066-7 Markus R Wenk等编 该书是生物医学研究手册丛书的第三卷，其前两卷分别是《初级哺乳动物细胞培养手册》和《生物医学研究中的显微镜技术》，后续还将推出《生物材料及骨架编织技术手册》和《知识产权管理手册》，这五卷均由世界科学出版社出版。 本手册共分为6章，各章内容分别是：1.蛋白纯化；2.蛋白分析；3.脂肪分析；4.哺乳动物细胞培养；5.显微镜学； 6.分析与鉴定。作者希望这本手册不仅仅是将各种生物化学实验方法的简单罗列，更希望读者能够通过这本手册掌握生
物化学实验技巧进而理解这些方法背后的原理。这本手册将给广大读者带来一个全景式的生物化学，尤其对于那些初次踏入生物化学领域的读者，选择这本手册会是一个不错的开始。 这本手册的编者都是科研一线人员，所编著的方法实用且前沿，并且详尽地介绍了生物化学中可能会使用的实验方法。 本手册适合从事生物化学、分子生物学的相关人员，在实验中它是一本不错的参考工具。 程恩隽，博士生 (国家纳米科学中心） Chengenjun, DoctoralCandidate (National Center for Nanoscience and Nanotechnology ,China)
实验三：影响神经冲动传导的因素观察 实验目的： 1．继续学习蟾蜍坐骨神经-腓神经标本制备方法，掌握坐骨神经标本的制备方法。 2．引导蟾蜍坐骨神经动作电位，并观察其基本波形（包括双相和单相动作电位）。 3．学习和掌握神经干动作电位传导速度测定的原理和方法。 4．设计改变细胞外液的某些因素会对动作电位在神经干上传导的速度产生何种影响？ 实验原理： 蛙类的一些基本生命活动和生理功能与恒温动物相似，若将蛙的神经-肌肉标本放在任氏液中，其兴奋性在几个小时内可保持不变。若给神经或肌肉一次适宜刺激，可在神经和肌肉上产生一个动作电位，肉眼可看到肌肉收缩和舒张一次，表明神经和肌肉产生了一次兴奋。在生理学实验中常利用 如果将两个引导电极置于正常完整的神经干表面，当神经干的一端兴奋之后，兴奋波会先后通过两个引导电极(r1r1’,图5坐骨神经干包括多种类型的神经纤维成分，因此记录到的动作电位是它们电位变化的总和，因此神经干动作电位是一种复合动作电位。由于各类神经纤维的兴奋阈值各不相同，所以记录到的动作电位幅值在一定范围内可随刺激强度的变化而改变，这一点不同于单根神经纤维的动作电位。
动作电位在神经纤维上的传导有一定的速度。不同类型的神经纤维动作电位传导速度各不相同。蛙类坐骨神经干中以Aα类纤维为主，传导速度(V)大约为35～40 m/s。测-腓肠肌标本的制备，但无需保留股骨和腓肠肌。坐骨神经干要求尽可能长些。在脊椎附近将神经主干结扎，剪断。提起线头剪去神经干的所有分支和结缔组织，到达腘窝后，可继续分离出腓神经或胫神经，在靠近趾部剪断神经。将制备好的神经标本浸泡在任氏液中数分钟，待其兴奋性稳定后开始实验。 3．仪器及标本的连结 （1）用浸有任氏液的棉球擦拭神经标本屏蔽盒上的电极，标本盒内放置一块湿润的滤纸片，以防标本干燥。用滤纸片吸去标本上过多的任氏液，将其平搭在屏蔽盒的刺激电极、接地电极和引导电极上，并且使其近中端置于刺激电极上，远中，频率8～16 Hz，波宽0.1～0.2 ms，强度根据标本兴奋性而定，由小增大(一般可选2V)。示波器灵敏度0.1～0.5 V/cm，扫描速度1～2 ms/cm。外触发输入接刺激器的触发输出端。触发选择置于外触发同步。开启电子刺激器时，调节触发电平旋钮，使示波器扫描与刺激输出同步。将扫描线调至荧光屏中间。 （3）若使用计算机生物信号采集处理系统进行实验则参照图5.5-2连接仪器。两对记录电极分别连接到CH1、CH2通道，刺激电极连接到刺激输出。打开计算机，启动生物信号采集处理系统，进入“神经干动作电位”模拟实验菜单。 4．观测和测定双相值时的阈刺激。 （2）增大刺激强度的过程中，伪迹和动作电位均随之加大，但当强度加大到某一程度后(此刺激强度称为最大刺激)，动作电位就不再增大，而伪迹仍随之加大。这是区别刺激伪迹与动作电位的可靠方法之一。
《生物化学实验》容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事的科学态度。 二、实验容
包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据； （3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。 3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性
糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电加热板或电 炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻璃棒1根； 100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）；不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若干。每个洗 手池常规配置烧杯刷、毛巾、洗手液。 四、实验操作 取新鲜植物叶片，洗净表面污物，用滤纸吸去表面水分。称取0.5g，剪碎，加入5～10ml蒸馏水，在研钵中磨成均浆，转入锥形瓶中，用蒸馏水少量多次冲洗研钵，洗出液也转入锥形瓶中，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min，提取液冷却后过滤到100ml容量瓶中，同法残渣再提取2~3次，将提取液合并至容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。贴好标签，保存至冰箱中，用于实验二。 五、实验结果与讨论 1、观察产品颜色是否与理论相符，若不符合，分析原因。 2、结合实验二结果计算含量 六、实验注意事项 （1）若有干扰，可滴加饱和中性醋酸铅以除去溶液中的蛋白质，乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质，若色素较多可脱脂。 （2）加热时应小心，避免灼伤皮肤。 七、思考题 1、可溶性糖在植物物质代中的作用。