细胞培养系列方法
【实验前准备】
（1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul枪头、PBS溶液。
（2）清洁超净工作台面，照紫外30分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、胰酶PBS液、双抗置于室温下复温。
细胞的冻存与复苏
【实验用品】
（1）材料：培养的贴壁细胞（70%-80%融合）、于液氮中冻存的细胞
（2）试剂： PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM培养基、胎牛血清、二甲亚砜（DMSO）、双抗
（3）设备：培养瓶、巴氏吸管、15ml离心管、1.5ml冻存管、盛酒精的喷壶、
培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作酒精灯、水浴锅、CO
2
台。
试剂配制：（1）完全培养基含90%DMEM培养液加10%的胎牛血清加1%的双抗。
（2）冻存液含80%的DMEM培养基加10%的胎牛血清加10%的DMSO，用吸管混匀，置于4℃冰箱中备用。
细胞的冻存
(1)依照传代的方法用0.25%胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消
化。
(2)收集消化细胞于离心管中，800-1000r/min离心5min。
(3)弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为
5*106-1*107个/ml。
(4)每个冻存管分装细胞悬液1.5ml，旋紧冻存管的盖，并用封口膜密封。
(5)在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。
(6)将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4℃,0.5h→-20℃，1h→-80℃，过
夜→转入液氮灌中。
细胞的复苏
（1）准备水浴锅，调温度至37℃。打开离心机。
（2）用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管1只，迅速将其置入38℃水浴锅中，不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。
（3）用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。
（4）将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加10倍体积的DMEM培养基，吹打混匀。
（5） 1000r/min离心5min，弃上清液。
（6）加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。
（7）按5*105个/ml的细胞浓度，将细胞接种在培养瓶中，置于培养箱中培养。（8） 24h后取出培养瓶，观察细胞生长状况。
【注意事项】
（1）对数期的细胞增值能力强，冻存后生存率较高，因此，在进行细胞冻存时，应尽量选择处于此期的细胞加以冻存。
（2）为了保证复苏后细胞的存活率，复苏接种时，细胞的浓度不能太低，最好控制在5*106-1*107个/ml，这样才能保证复苏成功。
（3）冻存管的瓶盖应封盖严密，以免复苏时细胞外溢。
（4）复苏时，从液氮取出冻存管到水浴中融化的过程要快，否则会导致冰晶的形成，伤害细胞。同时，一次复苏的冻存管数量不要太多，否则会引起水
浴锅中传热不佳，延缓冻存的细胞悬液融化的时间。
（5）为防止液氮冻伤，注意戴上防护手套。
【实验结果及分析】
经复苏刚接种的细胞是悬浮于培养基中的。复苏成功的细胞24h左右可贴壁，48h后即可开始生长、增殖。复苏不成功的细胞，将继续悬浮于培养液中，不能贴壁。
细胞的传代培养
【实验用品】
（1）材料：原代培养的肝细胞、原代培养的外周血淋巴细胞
（2）试剂：PBS液、DMEM培养基（含10%小牛血清）、0.25%胰蛋白酶消化液（3）设备：25ml培养瓶、吸管、离心管、酒精棉球、酒精灯、离心机、倒置显微镜、超净工作台、C02培养箱
【实验方案】
1.贴壁细胞的传代培养
（1）用吸管吸出原代培养的肝细胞培养瓶中培养液。
（2）向瓶内加入适量的PBS液，轻轻摇动后倒掉。
（3）每25ml的培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶消化液1ml，消化液的量以覆盖整个细胞培养面为宜，置于37℃的培养箱环境中。轻轻摇动培养瓶，
在倒置显微镜下对培养细胞进行观察，当细胞胞质回缩、细胞间隙增
大时，迅速将消化液吸出。
（4）加入PBS液于培养瓶中，轻轻转动培养瓶，然后用吸管将溶液吸出，加入含血清的培养液终止消化。
（5）用吸管吸取培养液，反复轻轻吹打瓶壁，制备细胞悬液。吹打的部位应均匀，可按从上到下、从左到右的顺序进行，保证瓶底各个部位的
细胞均能被吹到。此外，吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以
免损伤细胞。
（6）将吹打后的细胞置于倒置显微镜下观察，当发现原贴壁的细胞均已悬浮于培养液中，成片的细胞已分散成小的细胞团或单细胞，即可终止
吹打。
（7）收集细胞悬液于离心管中，1000r/min，离心5-8min，去除上清。
（8）细胞计数，按照1*105-1*106个细胞的密度接种细胞于新培养瓶中。2.悬浮细胞的传代
（1）将原代培养的外周血淋巴细胞连同培养液一并转移到离心管中。
（2）800-1000r/min离心5min，去除上清液。
（3）加新的培养液到离心管中，吸管吹打、制悬。根据细胞的数量多少，将细胞悬液按1:2或1:3的比例分别接种于新的培养瓶中。
【注意事项】
（1）消化过程中需根据培养细胞形态的变化来严格控制消化时间。当胞质回缩、细胞间的连接变松散等情况出现时，应终止消化。因上皮样细胞彼此间连接较为紧密，其消化时的时间通常比成纤维细胞长。此外，首次传代的细胞与已建系的细胞相比，也需要更多的消化时间。
（2）首次传代的细胞因需适应新的环境，可适当增加其接种量，以促进生存与增殖。
（3）在对细胞进行吹打时，不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。（4）传代培养的过程通常较长，细胞被污染的可能增加，因此，必须严格进行无菌操作。
【实验结果及分析】
用倒置显微镜观察可见接种24h后，大多数肝细胞已贴附于培养瓶底部，有少数细胞悬浮于培养基中。48h以后，细胞开始增殖、细胞的数量增多，在接种的肝细胞或肝细胞团周围可见新生细胞长出，这些细胞内含物少而较为透明，胞体轮廓通常较浅。96h以后，培养细胞数量明显增多，并逐渐汇合，细胞轮廓清晰、可见。
细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。
背景知识： 细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜(DMSO)作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 细胞冻存 操作步骤： 1. 配制含6-10%DMSO的10%小牛血清的冻存培养液，冰上预冷； 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管； 3. 离心500rpm，5min； 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，由慢至快，滴入配制好的冻存培养液，用吸管轻柔吹打使细胞均匀（在冰上进行）；一般一个小方瓶冻一支或者一个10cm培养皿冻2支。 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1ml（若冻存多于1支，则每支要均匀分装）； 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 7. 冻存：放入装有异丙醇的程序降温盒中，-70℃冰箱中放3天左右，取出冻存管，移入液氮容器内。 注意事项： 1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞培养操作 1）复苏细胞：将含有1mL 细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL 培养基混合均匀。在1000RPM 条件下离心4 分钟，弃去上清液，加1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm 皿中，加入约8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。 2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。 1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS 润洗细胞1-2 次。 2. 加1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。 3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM 条件下离心4 min，弃去上清液，补加1-2mL 培养液后吹匀。 4. 将细胞悬液按1：2 比例分到新的含8ml 培养基的新皿中或者瓶中。 3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25 瓶为类； 1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入1ml 胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml 细胞悬液，注意冻存管做好标识。 3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，2h以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
细胞冻存方法 一、概述 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。 二、主要冷冻设备和材料 常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。使用时要注意以下几点：（1）一般两周需充液氮一次，至少一个月充氮一次。液氮温度达-196℃，使用时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免引起冻伤。 （2）液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶口有双层焊接处，应防止焊接部裂开。（3）在装入液氮时，要注意缓慢小心，并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导，使液氮直达瓶底，如有专用液氮灌注装置则更好。若为初次使用，加液氮时更要缓慢，以免温度骤降而使容器损坏。 细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培养液，DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121°C蒸气高压消毒)，2mL安瓿（或专用细胞冻存管）、吸管、离心管、喷灯、纱布袋（或冻存管架）等。 三、细胞冻存方法 主要操作步骤为： （1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。 （2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。（3）将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。 （4）将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时（此步可省略），再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。 细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。
细胞培养基础知识详解 细胞的复苏、传代和冻存实验操作指导 整理：江耀伦李美娣 1 细胞复苏 细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 1.1实验前准备 （1）将水浴锅预热至37℃ （2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的生物安全柜内部台面。 （3）在生物安全柜中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 1.2 细胞复苏培养 （1）根据细胞冻存记录取出需要复苏的细胞。 （2）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。 （3）约1-2 min后冻存管内液体完全溶解，取出放入离心机中以1000 rpm/min速度离心3~5 min。 （4）用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入生物安全柜内。吸弃上清液，向离心管内加入1 mL培养液，吹打制成细胞悬液。 （5）将细胞悬液分装入培养瓶或者培养皿内，将培养瓶/培养皿放入37℃，5％ CO2的培养箱内过夜后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。 1.3 初学者易犯错误 （1）水浴锅未预热或者未预热到37℃。 （2）水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。 （3）离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。 （4）一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。 1.4 细胞传代 1.4.1 传代前准备 （1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶
子放入37℃水浴锅内预热。 （2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的生物安全柜内台面和双手。 （3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 1.4.2 细胞传代 （1）取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入生物安全柜内。 （2）从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 （3）将培养瓶放入生物安全柜后打开瓶口，同时用酒精棉擦拭瓶口消毒。 （4）加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。 （5）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 （6）弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液终止反应。小心吹打成细胞悬液。 （7）将细胞悬液吸入10 mL离心管中。平衡后将离心管放入离心机中，以1000 rpm/min离心5 min。 （8）弃去上清液，加入适当体积的培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 （9）将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 （10）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/mL。最后要做好标记。 （11）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养，传代细胞2-4 h后开始贴附在瓶壁上。 1.4.3 注意事项 （1）严格的无菌操作 （2）适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，
细胞冻存的方法与步骤文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）
细胞冻存、解冻方法与细胞计数 江苏大学附属医院风湿科李晶??????〖〗 一、细胞冷冻保存 1.材料： 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(SigmaD-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII) 2、冷冻保存方法： （1）传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。 -20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 （2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、步骤： （1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。 （2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。 （3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。
实验步骤一、材料准备 1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。 2. 玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸。 3. 塑料器皿：吸头、枪头、胶塞、移液管（10ml）、15ml离心管、冻存管（1～2ml）。 4. 其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。 5. 试剂：D-Hanks液、小牛血清、培养液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油。 二、细胞冻存 1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液。 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。 3. 离心1 000 rpm，5 min。 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml。 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml。 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。 三、细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。 3. 离心，1 000 rpm，5 min。
一、细胞培养（复苏、换液、传代、冻存）（已正） 进行细胞培养前，将所用物品放入超净台中，打开紫外开关，照射20-30分钟。紫外结束后，打开鼓风，使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。 1.细胞培养液的配制： 配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)（如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加） 2.细胞复苏： 将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解，大约1min。将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中，用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中，这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml，混匀，1000rpm, 3分钟。然后弃掉上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。（将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解。1000rpm, 离心3分钟。弃掉上清，然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。此时将其转移到T25瓶内，再加入4ml配好的培养基，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。） 3.细胞换液： 复苏的细胞在37℃ 5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液，去除未贴壁的死细胞（贴壁生长的细胞）。贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基，喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。悬浮生长的细胞具体过程如下:将培养瓶内的培养液混匀，用1ml无菌的大枪头将培养液小心的转移至15ml 无菌的离心管中，1000rpm,3分钟去上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。 4.细胞传代： 当细胞生长到80%-90%时，其的生长状态和细胞形态都比较好时，即只要判断细胞处于生长对数期，这时就可以进行细胞传代了。贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入1ml 0.25%胰酶消化，放入孵箱，1-2分钟后取出，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，如果观察到细胞开始由长梭形变成圆球形时，喷上75%的乙醇，拿到超净台里，加入2ml培养基终止消化，用1ml无菌的大枪头或无菌的塑料吸管反复吹打，尽
细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP) 背景知识： 细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特*都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。 原理： 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透*，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 主体内容（操作步骤）： 一、材料 （一）仪器 1. 净化工作台 2. 离心机 3. 恒温水浴箱 4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃） 5. 倒置相差显微镜 6. 培养箱 7. 液氮冰箱 （二）玻璃器皿 1. 吸管（弯头、直头） 2. 培养瓶 3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 4. 废液缸 （三）塑料器皿 1. 吸头 2. 枪头 3. 胶塞 4. 移液管（10ml） 5. 15ml离心管 6. 冻存管（1～2ml） （四）其他物品 1. 微量加样枪 2. 红血球计数板 3. 记号笔 4. 医用橡皮膏 5. 移液枪 （五）试剂 1. D-Hanks液
2. 小牛血清 3. 培养液 4. 双抗（青霉素、链霉素） 5. 胰蛋白酶（0.08%） 6. 1NHCl 7. 7.4%NaHCO3 8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油 四、操作步骤 （一）细胞冻存 1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液； 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、； 3. 离心1000rpm，5min； 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml； 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml； 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。（二）细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀； 3. 离心，1000rpm，5min； 4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养； 5. 次日更换一次培养液，继续培养。 五、注意事项 1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤； 3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。
细胞冻存、解冻方法与细胞计数 江苏大学附属医院风湿科李晶〖返回主页〗 一、细胞冷冻保存 1、材料： 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sｉｇma D-2６５0）、无菌塑料冷冻保存管(Naｌgene 5０0０—00２0)、0、４％（w／ｖ)tryｐan blue(GibcoBＲL1５250-061）、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KＲYＯ10Sｅri ｅsIＩ) 2、冷冻保存方法： （１)传统方法：冷存管置于4℃１0分钟－--＞-20℃3０分钟--－>-80℃１6~18小时（或隔夜)——->液氮槽ｖaｐorphａsｅ长期储存. -20℃不可超过１小时,以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入—80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。 (２）程序降温:利用已设定程序得等速降温机以—１～-3℃／分钟之速度由室温降至（－8０℃以下）-12０℃，再放在液氮槽vａｐｏrphａｓｅ长期储存。适用于悬浮型细胞与hybｒidoｍａ之保存。 ３、步骤： （1）冷冻前2４－4８小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。 （2)配制冷冻保存溶液（使用前配制）：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMＳO）至20％浓度,即制成双倍得冻存液，置于室温下待用。 (3）离心收集培养之细胞，用加血清得培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约０、1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）取与细胞悬液等量得冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管,制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×１0６cｅlls/ｍl，混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中，1~2mｌ/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测.严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。 4、注意事项: （１）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（lｏgphase）且存活率高之状态，约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞就是否仍保有其特有性质,例如hｙbrｉdoｍa应在冷冻保存前一至二日测试就是否有抗体之产生。
细胞培养程序 材料 A、仪器 1. 净化工作台， 2. 离心机， 3. 恒温水浴箱， 4. 冰箱（4℃） 5. 倒置相差显微镜， 6. CO2培养箱， 7. 振荡混合仪 8. 酶联免疫检测仪，9. 移液枪，10. 电磁力搅拌机，11. 微孔滤器 B、玻璃器皿 1. 吸管， 2. 小烧杯（100ml）， 3. 废液缸， C、塑料器皿 1. 吸头， 2. 枪头， 3. 96孔培养板， 4. 15ml离心管， 5. 50ml离心管， 6. 胶塞， D、其他物品 1. 微量加样枪， 2. 红血球计数板， F、试剂 1. D-Hanks液， 2. 小牛血清， 3. RPMI1640， 4. 双抗（青霉素、链霉素）， 5. 0.25%胰酶， 6.0.025% EDTA 7. 二甲基亚砜（DMSO）， 8. MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。 一、原代细胞培养或细胞株（系）复苏培养： （一）细胞原代培养 1.贴壁细胞培养法： 1）、组织块培养法 将所取得的组织用含青霉素、链霉素400U/ml和400ug/ml的生理盐水漂洗2此，5分钟/次。取出组织尽可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加两滴小牛血清，用剪刀尽可能将其剪碎，用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁，倒置于37°、5%CO2条件下30分钟后将培养瓶正置，从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液（小
牛血清15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml），使组织块有培养液与其接触为准，轻轻放置于37°培养。待24小时候补液。 或小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。 其他方法：消化分离法、器官培养略 2.悬浮细胞培养法 对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。 （二）细胞株(系)细胞复苏培养 细胞复苏的主要操作步骤 (1)佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。 (3) 然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。 (4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。 注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生
一、细胞培养(复苏、换液、传代、冻存)(已正) 进行细胞培养前,将所用物品放入超净台中,打开紫外开关,照射20-3０分钟。紫外结束后,打开鼓风,使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。 １、细胞培养液的配制: 配制50mｌ培养液(45mｌ基础培养液＋5ml的胎牛血清+５０0ｕｌ的青霉素/链霉素)(如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加) 2、细胞复苏: 将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴,不停地晃动使其迅速溶解,大约1mｉｎ。将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中,用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15mｌ离心管中,这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml,混匀,１０00rpm, 3分钟。然后弃掉上清,加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在T２５的培养瓶中加入4mｌ配好的培养基,然后用１ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T２5瓶内,使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀,从超净台中将Ｔ２５取出,拿到倒置显微镜下观察细胞就是否铺匀,如铺匀了喷上7５%的乙醇,放入３7℃ 5%CO2的孵箱内。(将细胞冻存管从液氮或者－8０℃取出后迅速置于3７℃水浴箱中水浴,不停地晃动使其迅速溶解。1000rpm, 离心３分钟。弃掉上清,然后加入１mｌ配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。此时将其转移到T25瓶内,再加入４ml配好的培养基,使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀,从超净台中将T ２5取出,拿到倒置显微镜下观察细胞就是否铺匀,如铺匀了喷上75%的乙醇,放入3７℃5%CO2的孵箱内。) 3、细胞换液: 复苏的细胞在３7℃ 5％CO2的孵箱内孵育4-６个小时后就应该给细胞换液,去除未贴壁的死细胞(贴壁生长的细胞)。贴壁生长的细胞具体过程如下:将原培养基弃去,然后用高压无菌的PBＳ冲洗1-2次,每次3－5ml,最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS,小心的用1ml无菌的大枪头加入５mｌ新鲜培养基,喷上75%的乙醇,放入3７℃5%CＯ２的孵箱内。悬浮生长的细胞具体过程如下:将培养瓶内的培养液混匀,用1ｍｌ无菌的大枪头将培养液小心的转移至１5ml无菌的离心管中,1000rpｍ,3分钟去上清,加入1ｍｌ配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在T2５的培养瓶中加入4ｍｌ配好的培养基,然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶 内,使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀,从超净台中将T25取出,拿到倒置显微镜下观察细胞就是否铺匀,如铺匀了喷上75%的乙醇,放入37℃ 5%CO2的孵箱内。 4、细胞传代: 当细胞生长到８0%-90％时,其的生长状态与细胞形态都比较好时,即只要判断细胞处于生长对数期,这时就可以进行细胞传代了。贴壁生长的细胞具体过程如下:将原培养基弃去,然后用高压无菌的PBＳ冲洗１-２次,每次3-５ｍl,最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PＢS,小心的用1ml无菌的大枪头加入1ml 0.25%胰酶消化,放入孵箱,1-2分钟后取出,在倒置显微镜下观察细胞形态变化,如果观察到细胞开始由长梭形变成圆球形时,喷上75％的乙醇,拿到超
培养细胞的冷冻保存与复苏 ?概述?冻存过程 ?冷冻保存与复苏的原理?冻存结果 ?冷冻速率?讨论 ?冷冻保存温度?冻存细胞的复苏 ?复温速率?非玻璃化冻存细胞的复 苏 ?冷冻保护剂?主要材料 ?冷冻保存方法?复苏过程 ?非玻璃化冻存方法?结果 ?主要材料?讨论 ?冻存过程?玻璃化冻存细胞的复苏 ?冻存结果?主要材料 ?讨论?复苏过程 ?玻璃化冻存方法?结果 ?主要材料?讨论
? Polge等人（1949）发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用，他们仍然以精子进行研究发现，加入甘油能够大大提高贮存于-790C下精子的存活率。接下来的重大进展是Luyet（1951）与Lovelock（1953）等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。他们的结论是，电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得到Merryman（1956）、Rey（1957）以及Smith （1961）等学者的继续和发展。 1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”，这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂。Lovelock（1959）等人发现了一种新的化学保护剂，这就是人们熟悉的二甲基亚砜（DMSO）。而且，用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前，无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。 返回页首 ?冷冻保存与复苏原理 在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤 点击次数：3337 发布时间：2011-4-12 细胞的冻存 一、概述 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。 二、细胞冻存操作步骤： (1)选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。 (2)去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。(3)将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。 (4)将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时(此步可省略)，再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。 细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。
冷冻保存方法： （1）传统方法：冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ -80℃16～18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 （2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、步骤： （1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。 （2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5～10％，混合均匀，置于室温下待用。 （3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1ml）计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。 4、注意事项： （1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度。 （2）冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 （3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。 这是我的实验记录，经过实践检验的，成功率很高。 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入1.5ml新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与1ml的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀
. 细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。 '.
细胞冻存的常规程序为: 1、配置含10%-15%(常见为10%)的DMSO或甘油,含10%-20%血清的冻存培养液; 一般来讲血清含量可以在10%-90%之间调整,冻存液中加入血清一方面可以为细胞提供营养,另一方面可以在细胞冻存过程中提供非渗透性保护物质,如蔗糖,白蛋白等从而更好地保护细胞。有人亲测10%血清冻存细胞,结果证明就是可以的,但高血清比例的冻存液更有助于提高细胞活力,此外娇贵的细胞可以适当提高冻存液中血清的比例以保证获得更高的存活率及活力。我们用的冻存液配方含10%的DMSO,40%的血清及50%的完全培养基,复苏细胞后细胞状态良好。
另有各类实验耗材与常规试剂售卖。 2、取增殖期细胞胰酶消化下转移至离心管,离心富集细胞,悬浮细胞则直接转移至离心管离心富集即可; 细胞最好处于对数生长期,而汇合度最少到50%以上
,其她状态的细胞也可冻存,但就是复苏时存活率会大大降低。 3、用配好的冻存液重悬细胞,并调节细胞密度至5×106/ml-1×107,转移至冻存管中; 具体冻存密度因细胞不同而异,高密度或者低密度对细胞成活率都有一定的影响。此阶段细胞最好放于冰上或4℃,尽量减少细胞的常温代谢活动。 4、细胞冻存:常见的方法主要有两大类,一类为传统方法,另一类为程序降温; 4、1、传统方法:冻存管置于4℃10 min →-20℃30 min →-80℃16-18 小时(或过夜)→转移至液氮长期储存。 细胞置于4℃及-20℃的时间不必太长,且从4℃转移至-20℃时,最好颠倒混匀下细胞,防止细胞大量沉降堆积至管底,影响细胞复苏。 4、2、程序降温:将细胞转移至细胞渐冻盒后放于-80℃冰箱过夜或置于渐冻仪中以1-2℃/min的降温速率将至 -100℃后,再将细胞转移至液氮长期保存; 此过程的核心就就是:缓降。因此,有人在冻存管外面包裹一团拳头大小的棉花,将细胞转移至-80℃冰箱过夜后,次日直接转移到液氮,这种简易的做法也就是可行的。还有将-80℃冰箱过夜后,又增加了一步将细胞悬挂于液氮液面上一段时间,再转移至液氮,这种做法也可以一定程度上提高细胞的存活率。 细胞复苏的常规程序为: 1、快速解冻,液氮中取出冻存细胞后,迅速放入37℃水浴中,轻轻摇动细胞,待其全部融化; 为使冻存管快速解冻,此过程中水浴温度可以也调整至40℃,边晃动边观察,待冻存管中残留有小块冰时,停止即可,此时冻存管中细胞仍维持在0℃左右,甚至有经验丰富的大神直接用将近60℃的水浴复苏细胞,复苏后细胞状态也挺好。细胞复苏要迅速,一般要求在1min左右,而且为减少DMSO的细胞毒性,尽量保证在3min以内完成细胞解冻。