细胞生物学实验报告
实验一细胞的传代与冻存
1引言
1.1 实验目的
1. 掌握无菌操作技术。
2. 掌握传代细胞培养和细胞冻存技术。
1.2 实验原理
1.细胞传代：体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，进行下一步的实验并维持细胞种的延续。当细胞生长达到一定密度后，都需要做传代处理，传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。贴壁细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本饱和，为使细胞能够继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代培养。当细胞汇合至80%~90%时即可进行分离培养，否则细胞会因增值过度导致营养枯竭和酸中毒，传代要在严格的无菌环境下进行。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法，同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。培养细胞一代生长过程可分为：潜伏期，指数增生期，停滞期（平台期）和衰退期。
2.细胞冻存：细胞冻存是细胞保藏的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃的液氮中长期低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态并将细胞特性保存起来，在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适时适量的保存细胞可以防止因正在培养的细胞被污染或者其他意外的事件而使得细胞种丢失，达到细胞保种的目的。
2实验仪器、试剂及操作步骤
2.1 实验仪器
酒精灯、酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒（头）、吸管筒（头）、废液缸、移液器、枪头、显微镜等
2.2 实验试剂
DMEM培养基（其中血清含量10%）、血清、胰蛋白酶、抗生素、DMSO冻存液等
2.3 实验步骤
1. 实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。
2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。
3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。
4.从培养箱取出细胞并在显微镜下观察，先低倍后高倍，放入超净工作台用酒精棉球擦瓶口。过酒精
灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。
5.正确摆放超净台内的实验用品，点燃酒精灯，准备无菌试管，一次性滴管和移液管，安上橡皮头，
插在无菌试管内。
6.配制完全培养基：45ml培养液中加入5ml血清，500ul抗生素，轻轻摇匀，标上时间、姓名、完全培
养基。
7.配置冻存液：在冻存小管中配置2ml冻存液，1.4ml培养基、0.2mlDMSO和0.4ml血清，轻轻摇匀，做
上标记。
8.打开细胞瓶瓶盖，并在酒精灯上烧口消毒，倒掉培养基。用一次性滴管吸取一滴管胰酶，弃胰酶，
再加入一滴管胰酶（以盖住细胞量为准），转动培养瓶，使其润湿整个细胞层，盖好瓶盖。
9.显微镜下观察细胞的消化状态，待细胞大部分收缩、突起、一半变圆，细胞边界清晰时，即可立起
或翻转培养瓶停止消化，在超净工作台内靠近火焰处弃胰酶。
10.将配制好的冻存液加入细胞培养瓶中，吹打细胞瓶壁，吹打均匀，细胞浓度宜大。
11.将细胞悬液吸至冻存管中，拧好盖，封好胶布，并标记好细胞种类、冻存时间，以及冻存者姓名。
12.在培养瓶中加入5ml完全培养基，盖好瓶盖（拧紧后并旋回半圈），做好标记，倒置相差显微镜下
观察细胞形态，放入CO2培养箱中培养。
13.冻存管放入冻存盒中或者包上棉花，直接放入-80度，再转移进液氮内。
14.整理实验用品，使超净工作台整洁干净。
3 结果与分析
图 1 细胞在初始培养时在显微镜下的状态（放大倍数：4）
图 2 细胞在培养2天后在显微镜下的状态（放大倍数：10）
图 3 细胞在培养2天后在显微镜下的状态（放大倍数：10）
结果：如图1所示，刚刚进行传代培养的细胞，细胞状态较好，但是数量较少；如图2和图3所示，整体细胞数量较少，贴壁细胞少，有成团的死细胞，分析原因可能是:1)传代培养的初始细胞数量少;2)胰酶消化时间过长；3）成团细胞在做传代和冻存时就已经发现，很可能是初始细胞质量不好。