高效液相色谱柱的保护
1、最好用预柱。（但要注意，若有时出峰异常，要先看看是不是它有问题了）
2、每次做完分析，都要进行冲洗，
分析用流动相中若无酸、碱、盐类物质，建议用90％甲醇冲洗30～60min；
若分析用流动相中含以上物质，要先用10％甲醇（或用与分析用流动相同比例，把含酸、碱、盐溶液换成水）冲洗1小时左右，再梯度走到90％甲醇冲洗30～60min（若用多元泵）。有必要时再循环几次，可以适当缩短时间。
若长时间不用该色谱柱，要冲洗好后，用纯甲醇或乙腈封存。
3、若流动相中用到离子对试剂，更应该好好冲洗，且该色谱柱最好作为专用，不能再做其它物质分析用。因色谱柱填料性质已与原来所不同，在该柱上所摸索的色谱条件，可能在其它同类柱子上得不到重现。
4、尽量避免反冲，除非该色谱柱厂家明确说明允许。
5、普通C18柱尽量避免在40℃以上的温度下分析。
6、定期测柱效，有下降，可以用10％异丙醇甲醇冲洗色谱柱。若柱效还没有改善，可以再生，甲醇－二氯甲烷－甲醇。
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1．样品要采用0.22或0.45μm滤膜过滤，流动相采用0.45μm滤膜过滤并脱气。
2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围
3．避免流动相组成及极性的剧烈变化。
4. 避免纯水冲洗反相色谱柱。
5．每次测试完毕，要用20倍柱体积的流动相冲洗色谱柱（分析色谱柱250×4.6mm柱体积3.2ml）。如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕后将柱子用纯水冲洗干净，并保存于乙腈中。
6．压力升高是需要更换预柱的信号。
避免流动相组成及极性的剧烈变化。是不是流动相组成改变时要有个梯度,缓慢升或缓慢降?那要多慢呢,比如说我用水和乙腈做流动相,想从20:80升至100:0,设定多长时间比较合适呢另外,纯水冲反相柱的缺点是什么呀?
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说说防止色谱柱堵塞的问题吧：
1：溶剂中的不溶物—应使用色谱纯溶剂，膜过滤（孔径不超过0.45μm）
2：样品中的不溶物—应对样品进行膜过滤（孔径不超过0.45μm）
3：泵，进样器等中的不溶物—在泵和进样器之间安装内置过滤器，在进样器和柱之间安装预过滤器
4：柱内不溶物的形成：由于溶剂的不互溶而产生的沉淀—用能溶解沉淀物的溶剂冲洗色谱柱；在不互溶溶剂中由于进样而产生的沉淀—检查样品液和流动相是否互溶；由于温度的改变或固定相的干涸而产生的沉淀—将色谱柱密封紧，并保持室温恒定！
还有就是平衡色谱柱、色谱柱的再生：
1 平衡色谱柱：反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果您所使用的流动相中
含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"。
硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡
如何平衡色谱柱？
平衡过程中，将流速缓慢地提高；用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂浓度如果较低，则需要较长的时间来平衡）
2 色谱柱的再生：进行色谱柱再生时，应使用一个谦价的泵，最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱！
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1.对于一些特殊型号的柱子，例如不同型号的手性柱应严格按照柱子的相应说明书所要求的进行维护，并按照其规定的范围选择试剂的种类，比例，PH ，等等；
2.尽量避免柱子进气泡的现象出现，如在实验过程中留心流动相的体积，同时对所需体积进行大概的估计，以免吸空，气泡进柱，尽管有多种排气泡的方法，但毕竟影响柱子的性能，尤其是比较“娇贵”的柱子；
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每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！------ 一定得做！
新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。
卡套柱的安装（加预柱）
更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同时可以修补色谱柱）
注意：在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗，而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈，以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。
色谱柱的再生进行色谱柱再生时，应使用一个谦价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。
表1建议用来冲洗的溶剂体积
色谱柱尺寸柱体积所用溶剂的体积
125-4 1.6ml 30ml
250-4 3.2ml 60ml
250-10 -20ml 400ml
请根据下表选择您的再生方法：
极性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色谱填料）的再生：
正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**
非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生：
水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水
0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱
注意：
在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。
**如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。
1.首先，溶剂、样品要前处理，溶剂要用色谱级别的并用0.45um的滤膜过滤并脱气，样品要用0.22um的滤膜过滤。
2.做样前，柱子要平衡一段时间，先用甲醇平衡30-60分钟，再用纯化水平衡30-60分钟，然后用流动相平衡，直到基线走平时，再进样。
3.做样结束后，柱子要用甲醇和水冲洗，冲洗顺序与2步相反，最后柱子用甲醇（95%）保存。
4.如果柱子里东西太多，可以用甲醇，乙腈，水反复冲洗。
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谈谈关于启用新柱子(C18)的注意事项:
1、首先应检查一下，看是否为原装产品和外观完好情况。
2、保存好供应商随柱提供的“关于柱性能测试报告”，其中包含了新柱子的最佳性能指标，如在某预定色谱条件下的柱压、柱效等。
3、重现流动相条件，主要观察柱压的变化（100%甲醇、100%乙腈、50%甲醇-50%水等），并将数据记录在“性能报告上”，以便今后对照。
4、启用新柱子时的流动相流速应慢一点，如0.3-0.5ml/min，经过10-15min后可以加快。
5、对于25cm柱子，流速一般不超过1.0ml/min，能用慢速流量时尽量使用慢一点，当然要考虑分离效果和分析时间。
用离子对色谱法时柱子使用的一个问题.我们知道,一般我们分析样品时,常采用有机相(甲醇,乙腈)-水体系作为流动相,对于大部分的分析工作,这个体系就能胜任了,但是,当我们遇到弱酸碱时,比如生物碱,容易拖尾，这时候我们可以采用离子对色谱法进行分离,常用的离子对试剂有庚烷磺酸肭和十二烷基磺酸钠,这时候,我们常采用pH3-5的缓冲盐体系,我们在采用离子对色谱进行分离时,该怎么保护色谱柱呢?一个很重要的问题是,当我们冲柱子的时候,应该先采用有机相-水体系冲,再用水冲,然后用有机相冲，比如我们的流动想是甲醇-0.5%的庚烷磺酸钠(pH3.3)(50:50),我们在冲柱子的时候,应该先用50%的甲醇水冲柱子,然后用水冲,然后用甲醇冲,这是为什么呢?我们知道,通常的洗衣粉的主要有效成分是十二烷基硫酸钠(表面活性剂),它可以把一些脂肪油洗下来(烷烃及其衍生物),庚烷磺酸纳也是表面活性剂,如果先用水冲洗,会产生用洗衣粉洗衣服时的效果(ODS的固定相是长链烷烃),会造成固定相的损失,如果我们采用有机相-水体系先冲柱子,由于表面活性剂在有机相中有一定的溶解度,并且流动相的量比较大(相对于固定相,因为流动相是在不停的流动嘛)会使表面活性剂逐渐溶解在流动相中而被冲出,当表面活性剂被冲干净之侯,我们就可以采用水冲,然后采用有机相保存柱子了.
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我也说说色谱柱的保护
首先要看清楚说明书，是属于何种色谱柱，楼上各位所说都是集中在反相柱上，而正相色谱柱的保护和处理则有很大不同
其次，色谱柱优良好坏的指标有柱效、柱压等如果在实验的某一天突然发现柱压升高，或者峰形脱尾等现象，则有必要对色谱柱进行处理。处理方法，反相柱楼上的已经说了很多
第三，色谱柱在进样时一定要过滤，最好加上预柱
colcare.pdf (100.25k)
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我们的液相，既没有在线流动相过滤器，也没有预柱，（可能是经济原因不给配），所以，做样都要万分小心，但是，柱压还是会莫名其妙的升高。从最初的100%甲醇600psi慢慢到最后1800psi，这个时候可能就是柱子堵了，但是出峰时间和柱效（踏板数）几乎没有什么变化。
一般情况我们的处理办法是，将柱子用甲醇饱和后，将柱子竖直放置，进口端的方向竖直向上，用两个扳手慢慢将柱子的入口端螺丝拧下，这时，会看到白白的硅胶，有时候会看见一个薄薄的筛板，将拧下的螺丝和筛板进行超声清洗，螺丝只需用100%甲醇或者100%乙醇和水超声即可，筛板需要先用水，再用20%硝酸（15分钟以上），再用异丙醇超声，其他的超声10分钟左右就行。
如果筛板和螺丝是一体的，那么就不能用那么高浓度的硝酸了5%既可了。
开口的硅胶在空气中放置1个小时以内是没有任何关系的，当超声完毕后，按照原来的样子重新安装上就可以了。然后再用甲醇饱和。
我的长柱子25cm和短柱子15cm的我都拆开清洗过筛板，效果非常明显，压力从2200psi （25cm）下降至900psi，1800psi（15cm）下降至700psi。
经过全部检查确定压力增大是由柱子引起的可以一试。
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只谈反相硅胶柱的一些清洗方法:
清洗硅胶键合柱子
再生被污染HPLC柱子的关键是知道污染物的性质并且能找到适当的溶剂来去除。如果污染是因为重复进样时强保留物质的累积引起的，利用简单的步骤来除去这些污染物往往能恢复其色谱行为。有时候，经过多次操作以后的色谱柱用90～100％的溶剂B（双溶剂反相系统中较强的溶剂）冲洗20个体积可以清除污染物。（表2列举了不同规格的HPLC柱子的空体积，因此读者能方便地确定相应柱子冲洗的体积。）例如，柱子中残留的脂质就能用非水溶剂如甲醇、乙晴、四氢呋喃。如果你使用的是缓冲液系统，不要直接切换到强溶剂，突然转换到高浓度有机溶剂可能会使HPLC流动体系中的缓冲液沉淀，这样会导致更大的问题如柱头堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞损伤或进样阀转轴失灵。应该先用无缓冲流动相（即把缓冲液换成水）。冲洗5～10个体积以后才更换强溶剂。
有时候，强溶剂也没法把残留在色谱柱上的污染物洗掉。那么更强的溶剂或者是一系列溶剂就有必要用来清洗柱子乐，如果污染物是非生物物质，使用者可以跳过一个或多个另外的有机溶剂去除污染物。溶剂与溶剂之间的组合有很多。到柱子厂家的网页上能找到推荐的溶剂
系统。
一般来说，所有的清洗方法都有类似的形式。所用的溶剂都是随溶剂强度增加，经常最后一个溶剂是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烃），可以用来溶解非极性物质如脂质和油类。我们必须保证一系列溶剂中每个溶剂都能与下一个溶剂互混。清洗过程要结束时，必须借助一个中等强度能互混的溶剂而回到原始溶剂系统。例如，异丙醇是一个非常好的作为中间步骤的溶剂，因为它能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。但是异丙醇粘度非常大，必须确保较低的流速以免使泵压过高。当然，如果使用紫外检测器的话，避免溶剂在紫外区域有吸收，要不然需使用大量的溶剂冲洗才能使基线平稳。
对于典型的硅胶键合柱来说如果没有缓冲溶液的话推荐使用以下溶剂系列：
100％甲醇
100％乙晴
75％乙晴－25％异丙醇
100％异丙醇
100％二氯甲烷
100％正己烷
用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶剂相容性柱子必须用异丙醇冲洗后才能用原来的水相溶剂。每种溶剂至少冲洗10个柱体积。如250mm×4.6mmHPLC分析柱，分析者可以用1～2ml/min的流速来冲洗，要回复原来的溶剂体系，不需要每一步都冲洗，可以跳过中间步骤。中间步骤推荐使用异丙醇，然后用没有缓冲的流动相，最后回复起始流动相配置。四氢呋喃是另外一种比较受欢迎的去除污染的溶剂。如果使用者怀疑柱子被严重污染，可以二甲基亚砜（DMSO）或者二甲基甲酰铵和水按50：50的比例混合用低于0.5ml/min的流速流过色谱柱。成功再生反相柱子是一个非常耗时间的过程，溶剂冲洗可以利用梯度系统过夜操作。还有一个问题是清洗过程中是否可以把HPLC柱子反过来。因为大多数强保留的污染物都会累积在柱头，把柱子反过来可以缩短污染物被冲出柱子的移动距离。考虑到装填柱子的稳定性，现在大多数HPLC柱子都是比普通操作压力大很多的高压装填的，因此他们的柱床应该不会受到反方向流速的影响。但是，如果头上的烧结比尾部的烧结孔径大的话。例如尾部烧结的孔径是2μm，他通常能够留住平均5μm孔径里的填料。有时侯厂家会让头部孔径较大以避免样品或流动相颗粒堵塞。如果这种孔径大于装填颗粒尺寸分布曲线的最小粒径时，有些填料能穿过这些缝隙而流出色谱柱，这样会导致空白出现。如果柱子有箭头标志建议的流动方向，我建议通过操作手册和说明书，厂家主页或者技术支持部门等确认是否可以把柱子反过来冲。无论你是否把柱子反方向，最好不要让溶剂通过检测器避免污染物和穿透缝隙的颗粒进入检测池，否则有可能引起污染。
清洗柱子频率主要看有多少强保留物质被打入色谱柱。因为反相柱有时候在分辨率消失或者鬼峰出现前能承受很大的污染，使用者经常会等到出现了异常情况才开始注意。然而，污染物过多的累积会导致清洗柱子的难度加大。所以，如果你知道经常用杂质较多的样品上样时，我建议你们有规律地清洗柱子，你越是频繁清洗柱子，就清洗起来就越不费劲。
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我觉得应该将所有注意事项条例化，这样比较简明，下面是我的个人观点：
1. 采用预柱或保护柱
2. 要注意样品的前处理，如果是脏样品，例如中药提取液，体液等，就需要采取萃取等操作除去对柱子损坏较大的杂质，例如色素、多糖、蛋白质等
3. 用0.45um的膜过滤流动相和样品
4. 确保流动相pH在2~8之间
5. 在用含缓冲液或者酸性较强的流动相时，分析完后要用水冲洗，再用纯有机溶剂（最好
是乙腈）冲洗
6. 防止柱子干瘪，避免色谱柱受到强烈震荡
7. 定期对色谱柱进行清洗，吸取残留的杂质，并对柱效进行测定
8. 对每种样品最好采用专用色谱柱
9. 避免突然改变流速，也就是流速的改变要平缓
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流动相每天的需要很大的,都用0.45um的膜不是很慢而且不经济啊
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我的流动相是甲醇和水按2比3的比例混合的,开始几天每天做完后都是先用双蒸水先冲30min,然后用甲醇冲30min,接着就保存在甲醇里到第二天再做.柱子是新的ODS碳18柱子,今天老师告诉我不要冲太久,否则会把固定相上面的固定液冲走损害柱子,因为没有加其他盐类,所以可以不冲太就都可以了,那我怎么清洗柱子呢
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我的流动相是甲醇和水按2比3的比例混合的,开始几天每天做完后都是先用双蒸水先冲30min,然后用甲醇冲30min,接着就保存在甲醇里到第二天再做.柱子是新的ODS碳18柱子,今天老师告诉我不要冲太久,否则会把固定相上面的固定液冲走损害柱子,因为没有加其他盐类,所以可以不冲太就都可以了,那我怎么清洗柱子呢
直接用甲醇冲洗。
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流动相每天的需要很大的,都用0.45um的膜不是很慢而且不经济啊
那并不是不经济，因为膜还是很便宜的，而一根柱子的价格可是2000~3000元，如果是一些特殊的柱子，就更贵了，例如灌注色谱、高效排阻色谱柱、手性分离柱等，所以还是不要怕麻烦，这样会给以后的实验带来很大的好处。
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1、注意正确地使用和存放色谱柱，不锈钢柱色谱柱可选用以下的溶剂保存：正相柱用烃类溶剂，反相柱用甲醇，离子交换柱用水或甲醇/水。某些专用分析色谱柱要注意制造商规定的保存条件。另外，要注意溶液的PH值，一般控制在PH2－8范围内，其硅胶柱PH＞8时会发生硅胶溶脱的情况，键合型柱PH＜2时会发生键合相断裂。
2、色谱柱污染后可采用合适的溶剂冲洗，使柱效再生。
⑴硅胶柱可以使用正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和水按顺序冲洗色谱柱，经过净化的色谱柱必须进行水活化，即按上述相反的顺序冲洗。柱再生时所需要的有机溶剂要严格进行脱水处理。
⑵反相柱可以用甲醇、氯仿、正庚烷冲洗，键合C18柱一般用甲醇冲洗，必要时可用0.5 M EDTA钠盐溶液冲洗，然后用水冲洗，以达到去除柱内盐类。
⑶键合型的离子交换柱可以用缓冲溶液、水、甲醇冲洗。
3、对污染严重的色谱柱在冲洗无效时，需将柱内填料取出进行处理或更换新的填料，还可以用更换柱头填料的方法即将柱头入口处的被污染的填料取出，重新补装和柱内同类型的填料，然后在改变柱流向进行再生。这种逆流再生柱的方法，可以救活大部分柱子。
4、注入色谱柱的溶剂、标液、样品溶液都必须严格过滤，以去除杂质，防止堵塞色谱柱。当用反冲洗方法无效时，可将柱口过滤装置取下，用弱酸溶液处理，去除污物或定期更换。
5、建议：为了保护色谱柱，避免给分析带来不必要的麻烦，请使用保护柱！
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1.流动相中含缓冲盐的最好新鲜配制。
2.流动相的水也最好用新鲜的，而且要放在棕色瓶中。
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要注意流动相中的磷酸盐与甲醇混合时要注意其比例，否则可能异致磷酸析出，堵塞柱子。--------------------------------------------------------------------------------
我觉得关于柱子的保护除了加预柱,流动相和样品要过滤之外,很重要的一点是实验后柱子冲洗.冲洗液应该按柱子的说明进行.我在工作中发现:盲目的使用冲洗液,即使冲洗的时间很长,柱子的寿命还是很短.而根据柱子说明书中不同流动相使用不同的冲洗液进行冲洗,能使柱子的寿命延长.在进行柱子的再生时也是如此.
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说说新手容易出错的地方！
1、用完柱子后不冲柱子。
2、用完柱子后两端没封口。
3、堵柱子后不管三七二十一就反冲。
4、只要柱效不够就要买新柱子，不看是否有挽救措施。
5、流动相含有机相用水系膜过滤。
6、片剂溶解离心后不过滤。
7、PH不测定就开始冲柱子。
8、拧柱子时用劲太猛，导致接口塞在柱口。
上面的情况大家可否遇到过！
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"要注意流动相中的磷酸盐与甲醇混合时要注意其比例，否则可能异致磷酸析出，堵塞柱子。"
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"要注意流动相中的磷酸盐与甲醇混合时要注意其比例，否则可能异致磷酸析出，堵塞柱子。"--------------------------------------------------------------------------------
其实最好的是参照色谱柱生产厂家的推荐方案，别的意见只能作为平时的参考，作到心里有数！
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针对普通的反相柱的冲洗，就我经验来谈几点吧：
一般要做好一下几点：
1.保证样品内尽可能的澄清，具体方法：
1.1过0.45um微孔滤膜；
1.2有些样品很难滤过：我遇到过这种情况，我采用的方法是将样品放冰箱静置1天，然后在过0.45um微孔滤膜，结果并不影响试验；
2.就是具体进样的时候：中药的话一般最好采用预柱；化药不用也行的；
3.柱子的冲洗了：
3.1如果流动相有盐或者离子对的话先用纯水冲洗30～60分钟的样子，然后从低浓度冲到高浓度，最后用甲醇饱和就ok了，时间一般在60～90分钟就行了
3.2如果流动相没有盐或者离子对的话就直接从低浓度冲到高浓度，最后用甲醇饱和就ok 了，时间一般在60～90分钟就行了。
4.就好多人说：不要用纯水冲洗，我认为并不一定的，可以用水，但是不要采用高流速这是真的，我的试验一直是采用纯水的，结果没有什么问题。
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我现在在做一个新的化合物，用一般的C18柱分不开，但能略微的看到是有两个峰，调流动相和流速都分不开，我想换柱子，但不知道用什么柱子好呢？
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shaoshen :离子对试剂是很难被“逐渐融解在流动相中重干净”的吧？！它和C18之间的作用不能简单的理解为表面活性剂与C18的作用吧？！（唉～距离你的发言两年了～）
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我觉得目前国内在分离度改善方面更多的是改变流动相,而国外更专注于选择柱子.我想可能是经费方面的问题吧.
目前,Waters和安捷伦,HP有一系列针对不同物质和结构的柱子,建议选择其中一种多研究分析.我曾成功地用普通C18柱在20分钟时分离手性物质(流动相是甲醇-水体系),所以遇到分离不佳可以考虑根据结构选柱子,而非改流动相.
具体的各公司网页和产品说明说中有.
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若柱子使用的时间较长，柱压较高时，可采用柱子再生法处理，即按水-甲醇-四氢呋喃-二氯甲烷-四氢呋喃-甲醇-水的顺序来冲洗柱子，以达到提高柱子的柱效和寿命
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色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为1～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm 以上。一般在分离前备有一个预柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样。
柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外，还要有合理的柱结构（尽可能减少填充床以外的死体积）及装填技术。即使最好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍粒径的厚度。在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。
2.1 液相色谱柱的结构
色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，压力不高于70 kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效，减小管壁效应，不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度，其效果与抛光相同。还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径取决于填料粒度，目的是防止填料漏出。
柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端是3／16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7／16英寸外螺纹与1／4英寸柱管(Φ6.35mm)连接，中间放置压环用于密封。3／16英寸的内螺纹与1／16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用Φ1.57mm 连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2．5mm长或其他固定尺
寸)。
在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。
2.2 色谱柱分类
色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规格也不同：
①常规分析柱（常量柱），内径2～5mm（常用4.6mm，国内有4mm和5mm），柱长10 ～30cm；
②窄径柱（narrow bore，又称细管径柱、半微柱semi-microcolumn），内径1 ～2mm，柱长
10 ～20cm；
③毛细管柱（又称微柱microcolumn），内径0.2 ～0.5mm；
④半制备柱，内径＞5mm；
⑤实验室制备柱，内径20 ～40mm，柱长10 ～30cm；
⑥生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。
2.4 柱的填充和性能评价
色谱柱的性能除了与固定相性能有关外，还与填充技术有关。在正常条件下，填料粒度＞20μm时，干法填充制备柱较为合适；颗粒＜20μm时，湿法填充较为理想。填充方法一般有4种：①高压匀浆法，多用于分析柱和小规模制备柱的填充；②径向加压法，Waters专利；
③轴向加压法，主要用于装填大直径柱；④干法。柱填充的技术性很强，大多数实验室使用已填充好的商品柱。
必须指出，高效液相色谱柱的获得，装填技术是重要环节，但根本问题还在于填料本身性能的优劣，以及配套的色谱仪系统的的结构是否合理。
无论是自己装填的还是购买的色谱柱，使用前都要对其性能进行考察，使用期间或放置一段时间后也要重新检查。柱性能指标包括在一定实验条件下（样品、流动相、流速、温度）下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性，或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在±5%或±10%以内。进行柱效比较时，还要注意柱外效应是否有变化。
一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数，如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不对称度和柱压降等。
2.5 柱的使用和维护注意事项
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。
在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。
1避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。
2应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然，流动相使用前必须经脱气和过滤处理
3一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
4选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解，压力升高是需要更换预柱的信号。
5避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。
6经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50～75ml。
7.避免使用高粘度的溶剂作为流动相；如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净
8进样样品要提纯；
9严格控制进样量；不要超载
10 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4~5天开机冲洗15分钟。
11大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围
12 按说明书保存色谱柱，绝对禁止讲缓冲液留在柱内过夜，注意反相柱不能用纯水长时间冲
13 不建议拆开柱子，自己更换填料
一般来说，所有的清洗方法都有类似的形式。所用的溶剂都是随溶剂强度增加，经常最后一个溶剂是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烃），可以用来溶解非极性物质如脂质和油类。我们必须保证一系列溶剂中每个溶剂都能与下一个溶剂互混。清洗过程要结束时，必须借助一个中等强度能互混的溶剂而回到原始溶剂系统。例如，异丙醇是一个非常好的作为中间步骤的溶剂，因为它能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。但是异丙醇粘度非常大，必须确保较低的流速以免使泵压过高。当然，如果使用紫外检测器的话，避免溶剂在紫外区域有吸收，要不然需使用大量的溶剂冲洗才能使基线平稳。
当拿到一根新色谱柱时，请搞先仔细阅读其说明书和质检报告,并按报告说明进行验证，
以下参数必须清楚：
填料类型（C18,3μm,全多孔型，含炭量，100A，）
色谱柱规格（250×4.6）
柱子出厂保存在何种溶液，是否平衡过，否则需要在使用前以低流速平衡过夜
当色谱柱使用一段时间，柱效下降的很厉害时
请根据下表选择您的再生方法：极性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色谱填料）的再生：正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水** 非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生：水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱
在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水
洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。**如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。
色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死
（请按说明书的规定，采用相应的溶剂。）
还有一个问题是清洗过程中是否可以把HPLC柱子反过来。因为大多数强保留的污染物都会累积在柱头，把柱子反过来可以缩短污染物被冲出柱子的移动距离。考虑到装填柱子的稳定性，现在大多数HPLC柱子都是比普通操作压力大很多的高压装填的，因此他们的柱床应该不会受到反方向流速的影响。但是，如果头上的烧结比尾部的烧结孔径大的话。例如尾部烧结的孔径是2μm，他通常能够留住平均5μm孔径里的填料。有时侯厂家会让头部孔径较大以避免样品或流动相颗粒堵塞。如果这种孔径大于装填颗粒尺寸分布曲线的最小粒径时，有些填料能穿过这些缝隙而流出色谱柱，这样会导致空白出现。如果柱子有箭头标志建议的流动方向，我建议通过操作手册和说明书，厂家主页或者技术支持部门等确认是否可以把柱子反过来冲。无论你是否把柱子反方向，最好不要让溶剂通过检测器避免污染物和穿透缝隙的颗粒进入检测池，否则有可能引起污染。
对于反相柱子，不建议用表面活性剂如十二烷基磺酸钠（SDS）和三硝基甲苯，因为这些化合物必然会牢固吸附在硅胶键合相柱子上很难除去。用表面活性剂会影响装填表面而改变其性质。
如果样品含有离子化合物，变化pH可以使他们转为非离子状态，这样他们就可以被水－有机溶剂混合物洗脱下来。例如，强碱性物质能在pH低于3时被除去，在这个条件下质子铵变得水溶性更好。酸性物质能在pH调整到大于其pKa时被洗下来--大约时pH8或9，这个状态酸性物质处于离子状态。然而，要注意硅胶柱子在长时间处于高pH条件下容易被破坏。
色谱工作者经常会讨论到离子对色谱中离子对试剂对固定相的影响。显然离子对试剂如辛烷－磺酸（用于阳离子）和四烷基铵溴（用于阴离子）在一定浓度的有机修饰剂下能很强地吸附在硅胶键合柱子上。柱子因此被污染很难回复到起始状态，因此人们都认为任何用于离子对的柱子都会被破坏而且用于不能再用于普通的反相色谱。
Bidlingmeyer不同意这种观点，他认为用于离子对色谱苛刻的pH值会通过水解键合相和在酸性条件下（pH1-3）硬化硅胶或在高pH条件下（pH7-8）溶解硅胶使一些柱子的性质改变。要清除离子对试剂中的磺酸，他建议首先用相同的没有离子对的缓冲液（至少20体积）冲洗然后用没有缓冲液的流动相(在清洗过程中甲醇可能比乙晴更有效；如果是长链的离子对试剂，用四氢呋喃)。很明显，磺酸离子对试剂和铵离子对试剂有着不同的表现。Bidlingmeyer 和他的合作者证明了在C18柱子上用流动相浓度大于70％的甲醇，长链离子对试剂，SDS 不会吸附在固定相上。这个发现跟分离组的结果一致。硅胶键合整体柱如Chromolith 柱子（默克公司，德国）可认为跟别的硅胶柱一样。
色谱柱中的流动相会排干吗？不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了？色谱柱还能使用吗？
事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。
即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输送液体，
而不能输送空气。相比之下，另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱
两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同样，整个色谱柱干涸的情况
不太容易发生，多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉所
有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了，也不一定
就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂（如
经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润
填料表面；已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱
大约需要（以1mL/min的流速）冲一个小时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。
既然谈柱子，那也谈谈填料
固定相
基质（担体）
HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。无机物基质主要是硅胶和氧化铝。无机物基质刚性大，在溶剂中不容易膨胀。有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有机聚合物基质刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最终使柱效降低。
硅胶
硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2～8。
硅胶的主要性能参数有：
①平均粒度及其分布。
②平均孔径及其分布。与比表面积成反比。
③比表面积。在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大。
④含碳量及表面覆盖度（率）。在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。
⑤含水量及表面活性。在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾。在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形。
⑦几何形状。硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，
缺点是涡流扩散项及柱渗透性差；后者无此缺点。
⑧硅胶纯度。对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾
硅胶的表面结构
表面积
硅胶的比表面积（每克硅胶的表面积）与孔径大小成反比。
表面活性
表面活性取决于硅胶表面含有的硅羟基。
游离硅羟基：活性最高
氢化硅羟基：活性有所降低
硅氧环：活性很弱
活性的调节：在硅胶中加入一定量水，利用物理吸附水降低活性。
1.1.2 氧化铝
具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。
1.1.3 聚合物
以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯为基质的填料是用于普通压力下的HPLC，它们的压力限度比无机填料低。苯乙烯-二乙烯苯基质疏水性强。使用任何流动相，在整个pH范围内稳定，可以用NaOH或强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质本质上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强，但它可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。这种基质不如苯乙烯-二乙烯苯那样耐酸碱，但也可以承受在pH13下反复冲洗。
所有聚合物基质在流动相发生变化时都会出现膨胀或收缩。用于HPLC的高交联度聚合物填料，其膨胀和收缩要有限制。溶剂或小分子容易渗入聚合物基质中，因为小分子在聚合物基质中的传质比在陶瓷性基质中慢，所以造成小分子在这种基质中柱效低。对于大分子像蛋白质或合成的高聚物，聚合物基质的效能比得上陶瓷性基质。因此，聚合物基质广泛用于分离大分子物质。
1. 1．4 基质的选择
硅胶基质的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，
聚合物填料用于大分子量的被分析物质，主要用来制成分子排阻和离子交换柱。
硅胶氧化铝苯乙烯-二乙烯苯甲基丙烯酸酯
耐有机溶剂+++ +++ ++ ++
适用pH范围+ ++ +++ ++
抗膨胀/收缩+++ +++ + +
耐压+++ +++ ++ +
表面化学性质+++ + ++ +++
效能+++ ++ + +
化学键合固定相
将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。这类固定相的突出特点是耐溶剂冲洗，并且可以通过改变键合相有机官能团的类型来改变分离的选择性。
目前，化学键合相广泛采用微粒多孔硅胶为基体，用烷烃二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷与硅胶表面的游离硅醇基反应，形成Si-O-Si-C键形的单分子膜而制得。硅胶表面的硅醇基密度约为5个/nm2，由于空间位阻效应（不可能将较大的有机官能团键合到全部硅醇基上）和其它因素的影响，使得大约有40～50%的硅醇基未反应。
残余的硅醇基对键合相的性能有很大影响，特别是对非极性键合相，它可以
减小键合相表面的疏水性，对极性溶质（特别是碱性化合物）产生次级化学吸附，从而使保留机制复杂化（使溶质在两相间的平衡速度减慢，降低了键合相填料的稳定性。结果使碱性组分的峰形拖尾）。为尽量减少残余硅醇基，一般在键合反应后，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等进行钝化处理，称封端（或称封尾、封顶，end-capping），以提高键合相的稳定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其与水系流动相有更好的“湿润”性能。
由于不同生产厂家所用的硅胶、硅烷化试剂和反应条件不同，因此具有相同
键合基团的键合相，其表面有机官能团的键合量往往差别很大，使其产品性能有很大的不同。键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示，也可以用覆盖度来表示。所谓覆盖度是指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。
pH值对以硅胶为基质的键合相的稳定性有很大的影响，一般来说，硅胶键合相应在pH=2~8的介质中使用。
键合相的种类
化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种。
常用的极性键合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)键合相。
极性键合相常用作正相色谱，混合物在极性键合相上的分离主要是基于极性键合基团与溶质分子间的氢键作用，极性强的组分保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱的固定相。常用的非极性键合相主要有各种烷基(C1～C18)和苯基、苯甲基等，以C18应用最广。非极性键合相的烷基链长对样品容量、溶质的保留值和分离选择性都有影响，一般来说，样品容量随烷基链长增加而增大，且长链烷基可使溶质的保留值增大，并常常可改善分离的选择性；但短链烷基键合相具有较高的覆盖度，分离极性化合物时可得到对称性较好的色谱峰。苯基键合相与短链烷基键合相的性质相似。
另外C18柱稳定性较高，这是由于长的烷基链保护了硅胶基质的缘故，但C18基团空间体积较大，使有效孔径变小，分离大分子化合物时柱效较低。
固定相的选择
分离中等极性和极性较强的化合物可选择极性键合相。氰基键合相对双键异构体或含双键数不等的环状化合物的分离有较好的选择性。氨基键合相具有较强的氢键结合能力，对某些多官能团化合物如甾体、强心甙等有较好的分离能力；氨基键合相上的氨基能与糖类分子中的羟基产生选择性相互作用，故被广泛用于糖类的分析，但它不能用于分离羰基化合物，如甾酮、还原糖等，因为它们之间会发生反应生成Schiff 碱。二醇基键合相适用于分离有机酸、甾体和蛋白质。
分离非极性和极性较弱的化合物可选择非极性键合相。利用特殊的反相色谱技术，例如反相离子抑制技术和反相离子对色谱法等，非极性键合相也可用于分离离子型或可离子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是应用最为广泛的非极性键合相，它对各种类型的化合物都有很强的适应能力。短链烷基键合相能用于极性化合物的分离，而苯基键合相适用于分离芳香化合物。
另外，美国药典对色谱法规定较严，它规定了柱的长度，填料的种类和粒度，
填料分类也较详细，这样使色谱图易于重现；而中国药典仅规定填料种类，未规定柱的长度
和粒度，这使检验人员难于重现实验，在某些情况下还浪费时间和试剂。
固定相的结构
50μm
large porous particles
大孔填料
30μm
2μm active surface
pellicular beads
表面多孔型薄壳玻璃珠
3-10μm
Microparticulates
全多孔型硅胶微粒填料
50μm填料的缺点：机械强度低，传质阻力大，柱效低
30μm填料的缺点：比表面积小，吸附不充分，分离度不好
3－10μm填料最常使用
如果表面硅羟基键合不完全，会有二次保留效应，使得峰形发生扩展，所以
对裸露的硅羟基要实行封端（封尾）技术。
常见的封尾技术：
1.空间位阻：甲基换成异丁基
2.双封端法：用C18和甲基同时封端
3其他技术
在甲醇中，毛（C18 )处于树立状态，而在纯水中，毛处于蜷缩，倒立状态，长期用纯水冲柱子，键合相容易损伤,所以建议用5－10％甲醇的水溶液替代纯水洗柱子（缓冲盐）
当小孔径、端基封口良好的反相填料色谱柱使用接近100%的水为流动相时，有时会发生分离突然丧失及被分析物质保留明显降低或完全不保留的现象，这就是疏水坍塌。此现象是由流动相不浸润固定相表面而致。挽救的办法实现用含大量有机组分的流动相浸润固定相，再用高水含量的流动相进行平衡。由是色谱柱长期储存也会发生此现象。使用内嵌极性基团的反相色谱柱（如Waters SymmetryShield RP色谱柱）或非端基封口的色谱柱（如Waters Resolve 色谱柱）也可避免发生坍塌。
最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化学键合相硅胶，这种固定相要占所有柱填料的80％。它是通过化学反应把某种适当的化学官能团（例如各种有机硅烷），键合到硅胶表面上，取代了羟基（－OH）而成。它是近代高效液相色谱技术中最重要的柱填料类型。
使用微粒硅胶要特别注意它的使用pH范围是2～7.5，若过碱（＞pH8），硅胶会粉碎或溶解；若过酸（＜pH1），键合相的化学键会断裂。有些特殊的健合相可以用于pH 9～11。
正相色谱原理
极性固定相
有机流动相
传统
硅胶
氧化铝
目前
氰基
氨基
二醇基
适用于
同分异构体的分离
在有机/水流动相中不溶化合物的分离
适用于中等极性化合物的分离
机理
H键
偶极矩
П键
溶质顶替等量的溶剂
被分析物极性过大时，样品会在吸附柱中会被永久的吸附保留，毁坏柱子
硅胶柱和氧化铝柱的缺点：
容易脱尾
样品被催化分解
不易剃度洗脱
含水量要控制
太多，贴不完，上面是自己三年前做的PPT，专门介绍液相，有1000多页，参考了很多课件，还有安捷伦网站，及液相方面书籍，但是也有很多自己写的体会，错误难免，有些东西也存在争论，液相技术发展很快，上面是三年前的，数据不准，大家见凉!
Waters高效液相色谱柱简单介绍与选择 2016-04-25 Bruce Lee 生产高效液相色谱柱的厂家有很多，如Waters，Agilent，Phenomenex，Shimadzu，Thermo等，每家供应商又生产多个系列，导致市场上的液相色谱柱的可选择性极强。 目前实验室以及公司，企业使用最多的是Waters以及Agilent所生产的RP液相色谱柱。Waters主要有Symmetry，Sunfire，XTerra，XBridge，XSelect，CORTECS以及Atlantis系列等，其详细分类以及键合相如下。 Figure 1 Waters Symmetry column family Figure 2 Waters Sunfire column family Symmetry与Sunfire系列色谱柱使用高纯度硅胶（B型）作为固定相基质，摒除金属离子杂质对固定相Si-O键的促进水解作用，此外由于金属离子含量特别低，在对其表面键合选择性烃基或内嵌极性官能团烃基时，可通过配体添加量控制硅胶表面键合相的多少，因此其最大特点在于批次之间的重现性。两个系列均采用封端技术，Sunfire C8与C18表面载碳量分别为12%和16%；SymmetryC8与C18载碳量均为12%，因此两个系列的C8色谱柱对于分析物的保留能力上没有本质的区别，而Sunfire C18色谱柱则相比Symmetry C18色谱柱，对于非极性比较大的分析物具有更强一些的保留能力，当然对于有机相的最低比例也相对比较高一些。Symmetry C8 Prep与C18 Prep色谱柱的填料粒径为7 um，其设计用途为制备；Symmetry300 C18（孔径300埃，载碳量8.5%）与Symmetry300 C4（孔径300埃，载碳量2.8%）则是为生物大分子多肽以及蛋白质的分离，分析而设计。Symmetry Shield RP 18内嵌极性官能团色谱柱，由于在靠近硅胶表面的极性官能团的存在，增加了硅胶表面的水分子浓度，改善了与水之间的浸润状况;因此可以允许使用极高水相作为分离，分析条件，而不会
1 目的 建立本实验室高效液相色谱仪的保养维护操作，确保仪器能正常使用。 2 适用范围 适用于本实验室高效液相色谱仪的保养维护操作。 3 责任者 本实验室所有操作高效液相色谱仪人员。 4 操作规程 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1 对仪器的一般要求和色谱条件 所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关规定。 4.1.1 色谱柱 反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷相等）也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子交换填充剂； 分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含炭量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。分析分子量小于2000的化合物应选择孔径在15nm （1nm=10A）以下的填料，分析分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm 以上的填料。除另有规定外，普通分析柱的填充剂粒径一般在3~10um之间。粒径更小（约2um）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm）。 使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40℃，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60℃。
液相色谱柱的选择、使用、维护和常见故障及排除液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合 -CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用： 一、反相色谱柱的选择 1．柱子的PH值使用范围 反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。 2．填料的端基封尾（或称封口） 把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。 3．戴安公司Acclaim柱子介绍—极性封尾C16固定相柱 戴安公司有28种类型的柱子，Acclaim反相柱填料高纯，金属含量极低，完全封尾。PH 2-9范围内兼容，低流失，高柱效。尤其是2003年推出的Acclaim极性封尾C16柱，是最先商品化的磺酰氨-O链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活性，能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。对酸
Agilent 1290 超高效液相色谱仪标准操作规程Ⅰ目的：制定Agilent 1290超高效液相色谱仪使用操作规程，确保操作人员能正确规范地操作液相色谱仪。Ⅱ范围：适用于Agilent1290超高效液相色谱仪的使用。Ⅲ规程： 1 开机 1.1 打开计算机，进入 Windows画面。 1.2 打开 1290INFINITY HPLC 各模块电源。 1.3 待各模块自检完成后，双击“Instrument 1 Online”图标，化学工作站自动与12001290INFINITY HPLC 通讯。 1.4 从“View”菜单中选择“方法和运行控制”画面，点击”视图”菜单中的“样品视图“系统视图”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。 1.5 点击泵下面的瓶图标，选择‘瓶填充‘如下图所示，输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。点击“Ok”。 1.6 从菜单“视图”中，选中“在线信号”，选中“信号窗口1”，然后点击“改变…” 钮，将所要绘图的信号移到右边的框中，点击“确定”。(如同时检测二个信号，则重复选中“信号窗口2”) 2 排气 2.1 首先在方法编辑中，泵的参数设置部分，选好需要排空的通道（保证是开的） 2.2 点击仪器状态视图中泵的图标，选择控制，出现如下图 2.3 勾上吹扫，并且输入流速，
时间，比例就可以 purge 泵头。排空的时候阀会自动切换，无需人为介入。 2.4 当我们发现泵头里面有气泡出不来的时候，选择预备---开。然后点击确定。此时泵会用很强烈的方式朝外泵液体，并持续20 次自动停止。 3 编辑数据采集方法 3.1 开始编辑完整方法： 从“方法”菜单中选择“编辑完整方法…” 项，如下图所示选中除“数据分析”外的三项，点击“确定” ，进入下一画面。 3.2 方法信息：在“方法注释”中加入方法的信息（如：This is for test!）。点击“确定” ，进入下一画面。 3.3 进样方式选择根据自动进样器的类型，选择合适的进样方式。 3.4 泵参数设定：在“流速”处输入流量，如 1.5ml/min，停止时间：10 min。在“溶剂B”处输入70.0，(A=100-B) ，也可“插入”一行“时间表” ，编辑梯度。在“压力限”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。 3.5 自动进样器参数设定: 选择合适的进样方式，如图所示，进样体积1.0ul ，标准进样”----只能输入进样体积，此方式无洗针功能。“洗针进样”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在针座旁边中洗针。 3.6 柱温箱参数设定: 在“温度”下面的空白方框内输入所需温度，如：40度。并选中它，点击“更
高效液相色谱柱 怎样选择色谱柱 现代高效液相色谱中，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。但是色谱填料的选择范围很宽，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。 1、正相色谱 正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica），以及其他具有极性官能团，如胺基团(NH2,APS)和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他团的极性较强，因此，分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小，即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene Chloride）等。 2、反相色谱 反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。 二、聚合物填料 聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要优点是在PH值为1～14均可使用。相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。 三、其他无机填料 其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性，该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强，石墨化碳可用于分离某些几何导构体，又由于HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC，氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用，新型氧化锆填料也可用于HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用PH范围1～14，温度可达100℃。由于氧化锆填料几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行中。 怎样选择填料粒度 目前，商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3um、5um
超高效液相色谱(UPLC?)简介 UPLC原理基础 随着科学技术的进步，液相色谱用户对液相色谱技术的 要求也不断提高，他们需要“更快地得到更好的结果”。因 此超高效液相色谱（UltraPerformance LC?）概念的提出也 就十分自然；简单的说：UPLC是用HPLC的极限作为自己的起 点，把分离科学推向一个新领域。 沃特世公司引入UPLC的概念是由研究著名的van Deemter 方程式及其曲线开始。 由van Deemter曲线可以得到以下几点启示: 首先,颗粒度越小柱效越高；其次,不同的颗粒度有各自 最佳柱效的流速；最后，更小的颗粒度使最高柱效点向更高 流速（线速度）方向移动，而且有更宽的线速度范围。所以 降低颗粒度不但能提高柱效，同时还能提高分析速度。 使用更高的流速会受到色谱柱填料耐压及仪器耐压的 限制。反之；如果不用到最佳流速，小颗粒度填料的高柱效 就无法体现。 此外；更高的柱效需要更小的系统体积（死体积）、更快的检测速度等一系列条件的支持，否则小颗粒度填料的高柱效同样无法充分体现。 因此；要真正创建一个全新的分离科学领域－ UPLC，必须解决以下几个问题： 1. 大幅度提高色谱柱的性能:第一要解决小颗粒填料的耐压问题，第二要解决小颗粒填 料的装填问题，包括颗粒度的分布以及色谱柱的结构。 2. 高压溶剂输送单元（超过15,000psi） 3. 完善的系统整体性设计，降低整个系统的体积，特别是死体积,并解决超高压下的耐 压及渗漏问题。 4. 快速自动进样器，降低进样的交叉污染 5. 高速检测器；优化流动池以解决高速检测及扩散问题 6. 系统控制及数据管理，解决高速数据的采集、仪器的控制问题 新型的色谱填料及装填技术 UPLC分离只有在新型的、耐压而且颗粒度分布范围很窄的1.7μm颗粒填料合成出来之后才有可能实现。 色谱柱技术应该涵盖几个方面的内容：首先是填料的合成，以得到高质量的填料颗粒，包括：耐高压、耐酸碱等等。其次是颗粒的筛选，选出颗粒度分布尽可能窄的填料。最后是装填技术，以保证既能堵住颗粒不使其外流，又不至于引起反压的大幅升高。 沃特世公司的ACQUITY UPLC?BEH色谱柱使用了更严格的筛分技术,使1.7μm填料的分布很窄，并且使用了全新筛板（专利申请中）及其它色谱柱硬件（柱管及其连接件），在超过20,000psi的压力下装填。沃特世公司为此安装了一条新的色谱柱装填生产线及新的测试设备。因此；ACQUITY UPLC色谱柱的性能及质量比目前的HPLC柱有了质的飞跃。 基于1.7 μm小颗粒技术的UPLC，与人们熟知的HPLC技术具有相同的分离原理。不同的是：UPLC不仅比传统HPLC具有更高的分离能力，而且结束了人们多年来不得不在速度和分离度之间忍痛割舍的历史。使用UPLC可以在很宽的线速度、流速和高反压下进行高效的分离工作，并获得优异的结果。(见下图)
高效液相色谱流动相选择 流动相 流动相的性质要求：一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。 流动相选择 1：由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。2：三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。 3：粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。 选择流动相时应考虑以下几个方面： ①流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。②纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。③必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。④粘度要低(应<2cp)。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相。⑤对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。⑥样品易于回收。应选用挥发性溶剂。 流动相的pH值 采用反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)或弱碱(7≤pKa≤8)样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在;对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液;分析弱碱样品
安捷伦1290超高效液相色谱仪操作规程 一．开机 1)打开计算机，进入Windows 7 画面。 2)打开Agilent 1290 Infinity HPLC 各模块电源。 3)待各模块自检完成后，双击“LC1290(联机)”图标，化学工作站自动 与Agilent 1290 Infinity HPLC 通讯。 4)从“视图”菜单中选择“方法和运行控制”、“系统视图”，使其命令前 有“√”标志来调用所需的界面。 5)右键点击泵下面的瓶图标，选择“瓶填充”，输入溶剂的实际体积和 瓶体积。也可输入停泵的体积。点击“确定”。 6)从菜单“视图”中，选中“在线信号”，选中“信号窗口1” 二．排气 1)首先在泵模块单击右键，在方法编辑中，泵的参数设置部分，选好需 要排空的通道（保证是开的）。 2)右键点击仪器状态视图中泵的图标，选择控制。 3)勾上清洗，并且输入流量、时间、比例，开启“泵”、“清洗”功能， 点击“确定”，就可以排空管道。排空的时候阀会自动切换，无需人为介入。 4)当我们发现泵头里面有气泡出不来的时候，选择开启“注入”，然后 点击确定。此时泵会用很强烈的方式朝外泵液体，并持续20 次自动停止。 三、编辑数据采集方法 1)从“方法”菜单中选择“编辑完整方法”，在方法编辑选项仅选择“仪 器/采集”，点击“确定”，进图下一画面。 2)在“方法注释”中加入方法的信息，点击“确定”，进入下一画面。 3)选择进样方式，默认为“HipAls”。 4)设定泵参数：在“流量”处输入流量，输入溶剂比例，也可“添加” 一行“时间表”，编辑梯度。 5)设定自动进样器参数、柱温箱参数、DAD检测器参数（可以开启光学 单元温度控制、可以设定8通道信号等）。 6)保存方法 四、样品测定 1)从“运行控制”菜单中，选择“样品信息”选项，输入操作者名称、 在“数据文件”中选择“手动”或“前缀/计数器”、在“样品参数” 中填入“样品位置”、“样品名称”。 2)点击“确定”，在“仪器”菜单选择“系统开启”。 3)等仪器准备好，基线平稳，从“运行控制”菜单中选择“运行方法”， 进样。 五、数据处理 1)从“视图”菜单中单击“数据分析”进入数据分析画面。
高效液相色谱的色谱柱的类型和流动相的选择方法The Choicing W ays of Chromatographic Colum n and Mobil Phase about HPLC 徐 红 侯 健 (新疆昌吉州产品质量检验所,新疆昌吉831100) 摘 要:高效液相色谱仪的核心是色谱柱。另外,流动相对改善分离效果也有重要的辅助效应。色谱柱的关键内容是制备出高效的填料。现代高效液相色谱填料多使用键合固定相。色谱柱的填充技术直接影响柱效的发挥。在研究制定一个高效液相色谱方法时,选择适宜的流动相也很重要。 关键词:高效液相色谱;色谱柱;填料;流动相;溶剂 色谱柱的关键内容是制备出高效的填料。这些填料装成的色谱柱既要有好的选择性,又要有高的柱效。要提高柱效是现代高效液相色谱的又一重要问题。所以填料和装柱技术是关键问题。 现代高效液相色谱填料多使用键合固定相,其固定相膜很薄,因而大大提高了柱效。高效液相色谱填料的基质有以下几种:(1)全多孔硅胶。现代高效液相色谱填料绝大多数用键合的方法把活性基团接枝到基质上,全多孔硅胶是使用最为普遍的基质。全多孔硅胶的孔径有三种类型:①微孔全多孔硅胶,孔径<2nm;(2)中孔全多孔硅胶,孔径<50nm,>2nm;(3)大孔全多孔硅胶,孔径>50nm。高效液相色谱填料使用中孔和大孔全多孔硅胶,在分离低分子量的混合物时,选择(6～15)nm孔径的全多孔硅胶,其比表面相当于(500～200)m2/g。在分离合成聚合物或生物大分子时,要使用(15～100)nm的全多孔硅胶。如果使用<2nm的全多孔硅胶,色谱峰就会拖尾。(2)其他金属氧化物基质。由于硅胶有一些缺点:在碱性介质中(pH>8)不稳定;在孔隙中大分子扩散困难,降低柱效;硅胶表面上的剩余硅羟基有离子交换作用。为此近年来用氧化铝、氧化锆、氧化钍和氧化钛作为高效液相色谱填料的基质有很大的H PLC应用前景。高效液相色谱固定相有以下几种:(1)硅胶表面键合或涂渍各种聚合物。(2)其他氧化物表面上涂渍聚合物。(3)无孔单分散填料。(4)有机高聚填料。(5)灌注色谱填料。(6)手性固定相填料。 色谱柱的填充技术直接影响柱效的发挥。如果色谱柱填充不好,如填料颗粒之间不均匀、不密实,就会使涡流扩散项增加,导致柱效下降。高效液相色谱柱的性能主要决定于固定相填料,但是色谱柱的填充好坏也有很大的影响。填充色谱柱的方法有干法和湿法两种,一般大颗粒的(如外径>20nm)可以用干法填充;一般小粒径的填料宜用湿法填充。湿法填充也称作匀浆法,即用密度和填料相近的液体或混合液作分散介质,用超声波处理此浆液,然后用高压泵快速压入色谱柱管中,这样就可以制备出高效的色谱柱。 在研究制定一个高效液相色谱方法时,选择适宜的流动相也很重要。在选择流动相溶剂时,首先要考虑的是溶剂的物理性质,其次要考虑溶剂对所要分离样品的容量因子,最后是所使用的溶剂要有分离能力。用作高效液相色谱流动相溶剂,首先要满足以下几点要求:(1)容易得到;(2)适合于所用的检测器;(3)纯净、有一定的惰性;(4)无毒、使用安全;(5)对所分离的样品有一定的溶解性能。 下面介绍选择流动相的要点: (1)首先要考虑溶剂对检测器的适应性。 高效液相色谱在多数情况下要使用紫外检测器,所以必须考虑所用溶剂在紫外波段的吸收。如使用示差折光检测器,要考虑溶剂的折光率。 (2)溶剂的活性 有许多溶剂可能与样品发生反应,或在某些固定相的存在下产生聚合,他们就不能作为流动相使用。 (3)溶剂的沸点和粘度 溶剂的沸点和粘度密切相关,低沸点的溶剂通常其粘度也低。通常选用沸点高于柱温(20～50)℃、粘度不大于5×10-4Pa.S的流动相。 (4)高效液相色谱流动相溶剂的极性 在分配色谱和吸附色谱中,溶剂的极性是用混合溶剂的比例来调节的,一个极性强的溶剂和一个极性弱的溶剂经过适当的混合可以得到一定极性的混合溶剂。 (5)溶剂的选择性和溶剂的分类 选择流动相的极性能使被分离样品的分配容量在1～5之间,这时如果有两个或几个色谱峰重叠,可以通过调节溶剂的选择性来解决。 选择合适的色谱柱和流动相是高效液相色谱的关键。 参考文献 [1]富玉,陈能武.高温液相色谱的原理及研究进展.中国测试技术, 2006(3)36. 作者简介:徐红,女,副高级工程师,所长。工作单位:新疆昌吉州产品质量检验所。通讯地址:831100新疆昌吉市健康西路17号。 侯健,新疆昌吉州产品质量检验所(昌吉831100)。 收稿时间:2009-10-16 10 《计量与测试技术》2010年第37卷第2期
第12章高效液相色谱法习题 （一）选择题 单选题 1. 在高效液相色谱中影响柱效的主要因素是( ) A 涡流扩散 B 分子扩散 C 传质阻力 D 输液压力 2. 在高效液相色谱中，提高柱效能的有效途径是( ) A 提高流动相流速 B 采用小颗粒固定相 C 提高柱温 D 采用更灵敏的检测器 3. 高效液相色谱法的分离效果比经典液相色谱法高，主要原因是( ) A 流动相种类多 B 操作仪器化 C 采用高效固定相 D 采用高灵敏检测器 4. 在高效液相色谱中，通用型检测器是( ) A 紫外检测器 B 荧光检测器 C 示差折光检测器 D 电导检测器 5. HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为( ) A 柱前压力高 B 流速比GC的快 C 流动相黏度较小 D 柱温低 6．液相色谱定量分析时，要求混合物中每一个组分都出峰的是( ) A 外标标准曲线法 B 内标法 C 面积归一化法 D 外标法 7．下述四种方法中最适宜分离异构体的是是( ) A 吸附色谱 B 反离子对色谱 C 亲和色谱 D 空间排阻色谱 8．在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离( ) A 异构体 B 沸点相近，官能团相同的化合物 C 沸点相差大的试样 D 极性变化范围宽的试样 9．在HPLC中，范氏方程中对柱效影响可以忽略不计的因素是( ) A 涡流扩散 B 纵向扩散 C 固定相传质阻力 D 流动相传质阻力 10．当用硅胶为基质的填料作固定相时，流动相的pH范围应为( ) A 在中性区域 B 5一8 C 1一14 D 2一8
11．高效液相色谱法中，常用的流动相有水、乙腈、甲醇、正己烷，其极性大小顺序为( ) A 乙腈>水>甲醇>正己烷 B 乙腈>甲醇 >水>正己烷 C 水> 乙腈>甲醇>正己烷 D 水>甲醇> 乙腈>正己烷 12．高效液相色谱法中,使用高压泵主要是由于( ) A 可加快流速，缩短分析时间 B 高压可使分离效率显著提高 C 采用了细粒度固定相所致 D 采用了填充毛细管柱 13．液相色谱的H-u曲线（）。 A 与气相色谱的一样，存在着H min B H随流动相的流速增加而下降 C H随流动相的流速增加而上升 D H受u影响很小 14. 与气相色谱相比，在液相色谱中（）。 A 分子扩散项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成 B 涡流扩散项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成 C 传质阻力项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成 D 速率方程式同样由三项构成，两者相同 15．液相色谱中不影响色谱峰扩展的因素是（）。 A 涡流扩散项 B 分子扩散项 C 传质扩散项 D 柱压效应 16．在液相色谱中，常用作固定相又可用作键合相基体的物质是（）。 A 分子筛 B 硅胶 C 氧化铝 D 活性炭 17．样品中各组分的出柱顺序与流动相的性质无关的色谱是（）。 A 离子交换色谱 B 环糊精色谱 C 亲和色谱 D 凝胶色谱18．高效液相色谱法中，对于极性成分，当增大流动相的极性，可使其保留值（）。 A 不变 B 增大 C 减小 D 不一定 19．在反相色谱法中，若以甲醇-水为流动相，增加甲醇的比例时，组分的容量因子k与保留时间t R的变化为（）。 A k与t R增大 B k与t R减小 C k与t R不变 D k增大，t R减小 多选题 20．下列检测器中，不属于高效液相色谱中的检测器是（） A 紫外检测器 B 氢火焰离子化检测器 C 荧光检测器 D 氮磷检测器 E 示差折光检测器 21．化学键合固定相具备下列何种特点（） A 固定液不易流失 B 选择性好 C 不适用于梯度洗脱 D 柱效高 E 易和组分形成氢键吸附
高效液相色谱仪维护保养规程 1. 高压恒流泵为整个色谱系统提供稳定均衡的流动相流速，保证系统的稳定运行和系统的重现性。高压输液泵由步进电机和柱塞等组成，高压力长时间的运行回逐渐磨损泵的内部结构。在升高流速的时候应梯度势升高，最好每次升高0.2ml/min当压力稳定时再升高，如此反复直到升高到所需流速。 2. 保持贮液瓶清洁，对专用贮液瓶应定期清洁；定期（如半个月）在稀硝酸溶液中超声、清洁过滤器，清洁后用纯水清晰到中性，保持过滤器畅通无阻。 3. 所使用的流动相均应为HPLC级或相当于该级别的，在配置过程中所有非HPLC级的试剂或溶液均经0.45um薄膜过滤。而且流动相使用前都经过超声仪超声脱气后才使用。 4. 所使用的水必须是经过蒸馏纯化后再经过0.45um水膜过滤后使用，超纯水和哇哈哈纯净水或同等级水可直接使用，所有试液均新用新配，配置后液体需经过0.45um水膜过滤后使用，并且在进样的样品都必须经过0.45um薄膜针筒过滤后进样。 5.流动相保存时间：纯有机相，比如甲醇，乙腈等为1个月；水相（含超纯水，磷酸水，乙酸水，缓冲盐水，离子对试剂等）最好现配现用，存放不超过3天为宜；水相与有机相混合的为7天。有效期内，每一到两天要进行脱气。水相每两天进行过滤、脱气，有效期内如发现有长毛和浑浊，视为变质要进行重新配制。
6. 采用保护柱，延长柱寿命。如污染物堆积于保护柱柱头，造成柱压升高，柱效下降，峰型变差时，卸下用强溶剂反冲后再用或更换新保护柱。 7. 在仪器检测完了后，均使用水：甲醇=95：5清洗了管路和色谱柱1 小时以上，使用水：甲醇=5：95保存管路和色谱柱40分钟以上。 8. 定期清洗在线过滤器：把在线过滤器卸下，先用甲醇超声30分钟，最后用超纯水超声30分钟。 9. 仪器使用结束，饱和完色谱柱后，在不接通色谱柱的情况下，将所有非纯有机试剂通道插入已过滤并超声处理的纯化水中，开启泵。冲洗30分钟后，将纯化水换成色谱甲醇冲洗30分钟后，关闭电源。 10. 实验结束后用洁净干布擦拭仪器及电脑表面，切忌用湿布擦拭及水冲洗，最后罩上仪器罩。
常用高效液相色谱柱SOP 1 目的： 色谱柱的使用和保养：液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。 建立高效液相色谱柱日常维护与保养规程，保证能正常使用。 2 适用范围： 本规程适用高效液相色谱柱的维护与保养。 3 责任人： 液相色谱柱使用者。 4 液相色谱柱的安装： 4.1 液相色谱柱的结构： 4.1.1 液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。 柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70 kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用于柱填料的装填。空柱各组件均为不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。 压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。 密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。 4.1.2柱填料： 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。 正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3-10 μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合-CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。
反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。 常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3-10 μm之间。 4.2色谱柱的安装： 4.2.1拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。 4.2.2拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。 4.2.3 按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57 mm、内径为0.1-0.3 mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止。 5 液相色谱柱的使用： 色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。 5.1样品的前处理： 5.1.1最好使用流动相溶解样品。 5.1.2使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。 5.1.3使用0.45 μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。 5.2 流动相的配制： 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点： 5.2.1流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
优胜美特制药有限公司&浙江巨泰药业有限公司 --------药物研究所-------- 变更内容及定期审核 制定Agilent 1260型高效液相色谱仪操作维护规程，使操作维护规范化，保证检测结果准确可靠。
二、适用范围 本规程适用于Agilent 1260型高效液相色谱仪的操作维护。 三、职责 QC对本规程的实施负责，项目主管、研发总监对本规程实施进行监督。 四、程序内容 4.1仪器配置 本仪器由梯度泵，自动进样器，柱温箱，VWD检测器或DAD检测器和操作软件工作站组成。 4.2操作前的准备 色谱纯的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水为新鲜制备的重蒸馏水。对规定pH值的流动相，应使用精密pH计进行调节，配制好的流动相应通过0.45μm以下的滤膜滤过，用前脱气，应配制足量的流动相。 4.2.2 供试溶液的配制供试品用规定溶剂配成供试溶液。定量测定时，对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。供试溶液在注入色谱仪前，一般应经0.45μm以下的滤膜滤过，必要时，在配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染。 4.2.3 检查上次使用记录和仪器状态，检查色谱柱是否适用于本次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的pH值与该色谱柱是否相适应，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。 4.3仪器的操作 4.3.1 接通电源，打开计算机及工作站其他各部件开关，约30秒后，各部件进入待机状态，指示灯为橘黄色，启动完成。 →梯度泵→柱温箱→检测器的状态，橘黄色为未就绪状态，绿色为空闲状态，粉色为进样状态，蓝色为运行状态，红色为出错状态。 显示所有数据：即打开运行样品时所有记录运行状态的数据图谱。 平铺数据：即将所有运行状态图谱平铺。 重叠数据：即将所有运行状态图谱重叠。 4.4色谱条件的设定及数据采集操作过程 一模块图标中的控制来开或关。把泵上的Purge阀逆时针松开，调流速为3.0ml/min,启动泵，系统开始排气泡，直到管线内（由容器瓶到泵出口）无气泡为止，切换通道继续Purge，直到所用流动相通道中无气泡为止，调流速为1.0ml/min，再把Purge 阀顺时针旋紧。 “与泵和进样器一致”使柱温箱温度一致，单击确定进入下一画面。 “最大压力限度”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子，单击确定进入下一画面。VWD检测器参数的设定
1 使用前 1.1 保持贮液瓶清洁，对专用贮液瓶应定期清洁；用试剂瓶作贮液瓶时，要经常更换。 1.2 定期（如半个月）在稀硝酸溶液中超声、清洁过滤器，保持过滤器畅通无阻。 1.3 使用HPLC试剂和新蒸二次蒸馏水作流动相，所使用的溶剂其截止波长一定要低于检测波长，对不是HPLC级的试剂要进行过滤（HPLC试剂出厂前已用0.02μm滤膜过滤）。对流动相一定要脱气。 1.4 每天开始使用仪器，注意放空排气，确保泵头、流动池以及其它流路系统中无气泡存在。 1.5 保持仪器使用环境20℃-30℃，湿度30%-70%。 2 使用中 2.1 珍惜保护色谱柱，避免柱头突然产生大的波动，扰动损伤柱床。如避免泵启动过速、升压过快、样品阀搬动过慢所造成的柱压力的波动。 2.2 采用保护（警戒）柱，延长柱寿命。如污染物堆积于保护柱柱头，造成柱压升高，柱效下降，峰型变差时，卸下用强溶剂反冲后再用或更换新保护柱。 2.3 避免超负荷进样，对250*4.6mm的柱子，绝对进样量应不超过100μg。在灵敏度允许的前提下，应尽量将试样浓度降低，减少绝对进样量（进样体积可保持不变），这是保持HPLC 柱性能持久良好的重要举措之一。 2.4 经常用强溶剂冲洗柱子，将柱内强保留组分及时洗脱出。反相柱用异丙醇-二氯甲烷（1:1）冲洗，正相（硅胶柱）用纯甲醇或异丙醇冲洗，时间均不少于1h。 2.5 以硅胶为基质的柱子，如C-18、C-8等，要控制好流动相的pH值，一般不要低于2.5，不高于7.0。 2.6 尽量用流动相溶解样品，一是避免出现拖尾峰、怪峰，二是避免试样在系统中由于溶解度降低而析出。 2.7 对于阻塞或受伤严重的柱子，必要时，可卸下不锈钢滤板，超声洗去滤板阻塞物，对塌陷污染的柱床进行清除、填充、修补工作，此举可使柱效恢复到一定程度（80%），有继续使用的价值。 2.8 色谱仪检测器输出和积分仪（处理机）要匹配，要合理设置参数如斜率、半峰宽、阈值、AUFS值、衰减等。将适宜的进样量和合适的参数结合起来，使主峰峰高达到记录仪满量程的80%左右。 2.9 如仪器突发故障，应立即停机并报告，由专业人员排除故障后经校准方可重新使用。 3 使用后 3.1 做完实验，及时用适当溶剂冲洗柱子和进样阀，尤其是对过夜的柱子和进样阀，一定要
高效液相色谱的日常使用和维护 高新科技与现代产业的迅猛发展，促进了以高效液相色谱（HPLC）为代表的复杂样品的分离分析和分离纯化仪器的飞速发展。HPLC以它定量分析结果准确、分析周期短、分析范围广、分析检测限低等优势，在食品添加剂、药物成分分析等多领域得到了广泛的应用。高效液相色谱仪是一种高端检测仪器，它精密快速，有效准确检测的同时就要求我们一定要严格正确使用仪器，定期科学有效地维护仪器，只有这样仪器才能长久持续有效使用。但是从目前实际使用情况看，与高效液相色谱仪的应用及产品技术升级的发展速度相比，其使用和维护则相对比较滞后，从而造成对仪器的滥用和对耗材不必要的浪费。主要原因是由于对于仪器使用操作者的培训侧重于仪器的初步使用，忽略了仪器的后续培训及维护操作学习；其实很多高效液相色谱都是国外进口仪器，英文版本软件对于大多数理工科毕业的仪器操作者也是一个障碍。笔者根据自己的工作经验，以岛津LC-20AT液相色谱仪为例，阐述液相色谱仪在使用时应注意的几个问题及日常使用后的仪器维护基本事项，并对仪器使用过程中容易遇到的问题进行分析，提出解决方法。 1、高效液相色谱仪的组成 高效液相色谱仪主要是由输液系统、进样器、色谱柱、检测器和色谱软件数据处理系统组成。 1.1输液系统 输液系统主要包括溶液贮器、在线脱气装置、高压输液泵、梯度洗脱装置。 溶液贮器用于存放符合HPLC要求的流动相。在线脱气装置主要功能是流动相在进入柱子前排除气泡。高效液相色谱柱的填料颗粒较小，通过2～5mm的色谱柱受到的流动阻力很大，因此需要通过高压输液泵抽取流动相输送至色谱柱。 高压泵按输液性能可分为恒压泵和恒流泵两种。按机械结构又可分为液压隔膜泵、气动放大泵、螺旋注射泵和往复柱塞泵四种，前两种为恒压泵，后两种为恒流泵。恒压泵可以输出稳定不变的压力。在一般的分析仪器中，由于系统阻力不变，恒压亦可达到恒流的效果。但是当系统阻力发生变化时，输入压力即使不变，流量却可随阻力而变化。恒流泵则无论系统阻力如何变化都可保证其流量基本不变。在色谱实际操作中，系统阻力可能随着运行时间的增加产生微小的改变，因此恒流泵比恒压泵更优越。然而在泵和柱系统所允许的最大压力下操作时，恒压泵较为安全方便。
高效液相色谱柱的选择、使用与维护 辛金菲 天津大沽化工股份有限公司，天津塘沽区300457 摘要：随着社会的进步，色谱分析理论和技术也得到了较大的发展，高效液相色谱现已广泛应用于分析的各个领域，聚集了检测与分离双重性能。其中的色谱柱是样品组分分离的场所，更是高效液相色谱的核心部件，并且属于仪器的耗材，费用比较高。正确的使用方式，才能使其保持良好的性能，而错误的操作方式，可能会导致报废。所以，正确的使用和维护才能保证检测的准确性，而且还能延长使用寿命，降低检测的成本。色谱柱的选择、使用与维护方面的研究在现实中具有非常重要的意义，同时也是色谱工作者和仪器厂商所关注的热点。 关键词：高效液相色谱柱；选择；使用；维护 1前言 高效液相色谱属于色谱法中的一个分支，其流动相为液体，运用的是高压输液系统，将单一或是混合的溶剂和缓冲液流动相泵入装后有固定相的色谱柱，待各成分被分离，再进入检测器，以此实现对试件的分析。由于要分析的样品种类比较多，并且样品的基质都比较复杂，色谱柱很容易被污染，这也是导致分离能力下降和柱压升高的原因之一。通常来说，样品中都会含有一定的不利于分析的物质，其中保留值相对比较弱的物质，一般情况下能快速地从色谱柱中洗脱出
来，才不会对分析产生干扰，对于基质复杂的样品来说，一根色谱柱可能只能使用百余次，并且每一种色谱柱只能适用有限的样品，一次错误进样有时候甚至能导致色谱柱失效。 2高效液相色谱柱的选择 一般情况下，选择保护柱的首先考虑因素是样品的清洁程度，对于大部分相关研究者来说，最合适的保护柱的选择是2cm或3cm，自然所装填的色谱填料随着保护柱的增长而增多，同时它也更能减少污染物进入分析色谱柱。样品的保留时间也会随着保护柱的增长而增长。 保护柱的内径应与分析色谱柱的内径相同或相当，现如今薄膜装填过的保护柱，使用起来也比较简单方便，而且可以干装，但是比较的不经济，一次性使用相对费用较高。另外，薄膜装填法的保护柱所装填的色谱填料是有限的，提供的保护作用有限，但是因为装填了较少的色谱料，保护柱也比较短，所以对分析样品的保留时间的影响小。另外一种保护柱结构的实质是缩短色谱分析柱，设计方式上有整体式、手紧式或直连式；从保护柱的结构可分为是否可以更换保护柱柱芯，以此降低保护柱的成本。 3高效液相色谱柱的正确使用 3.1加装保护柱 加装保护柱的作用比较大，特别是在分析中成药、中药等生物样品和复杂混合物之时，更是保护分析柱的重要措施，保护柱填料与分析柱应该保持一致，保护柱属消耗品，在经过大量的样品分析(50～100次)之后,当峰形变坏或柱压显著升高或基线漂移之时,应考虑
常用高效液相色谱柱S O P Prepared on 24 November 2020
常用高效液相色谱柱SOP 1 目的： 色谱柱的使用和保养：液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。 建立高效液相色谱柱日常维护与保养规程，保证能正常使用。 2 适用范围： 本规程适用高效液相色谱柱的维护与保养。 3 责任人： 液相色谱柱使用者。 4 液相色谱柱的安装： 液相色谱柱的结构： 4.1.1 液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。 柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70 kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用于柱填料的装填。空柱各组件均为不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。 压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。
密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。 4.1.2柱填料： 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。 正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3-10 μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合-CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。 反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。 常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3-10 μm之间。 色谱柱的安装： 4.2.1拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。 4.2.2拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。 4.2.3 按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57 mm、内径为-0.3 mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止。