原代海马神经元细胞培养 溶液的配制： (1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤， 室温保存。 (2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol?l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO4?12H2O，1.7g；KCl， 0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。用0.2μm滤膜过滤，4℃保存。 (3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液 冻存。使用时，用解剖液稀释至0.25%。 (4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。将上述多聚赖氨酸 放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。 (5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP04?7H20，0.18g； KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。 (6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。 (7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。 (8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg?ml-1的母液储存。用0.2μm滤膜过滤，-20℃ 储存。使用时，取6μl母液加入2ml培养液中，终浓度为3μg?ml-1。（根据实验情况调整浓度） 大鼠原代海马神经元细胞的培养 (1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解 剖液的培养皿中。 (2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。在分离出全 部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。 (3) 将培养皿中的海马碎片移入离心管中，去除含胰蛋白酶的液体并用种植液将海马碎 片冲洗2～3遍，终止酶的消化作用。
第２３卷第２期化 学 研 究中国科技核心期刊２０１２年３月ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ｈｘｙｊ＠ｈｅｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 雄黄染毒后大鼠脑组织中氨基酸类神经递质含量的变化 霍韬光，畅 蓓，李维凯，杨卉蕾，张颖花，姜 泓＊ （中国医科大学公共卫生学院，辽宁沈阳１１０００１） 摘 要：研究了雄黄对大鼠脑组织氨基酸类神经递质含量的影响．将３２只Ｗｉｓｔａｒ大鼠随机分为对照组（０．５％ ＣＭＣ－Ｎａ）以及低剂量（０．３ｇ／ｋｇ）、中剂量（０．９ｇ／ｋｇ）、高剂量（２．７ｇ／ｋｇ）雄黄染毒组，通过连续灌胃给予雄黄混 悬液两周．采用高效液相色谱－柱前衍生化法测定了大鼠脑组织中氨基酸类神经递质含量的变化．结果表明，与 对照组比较，低剂量组大鼠脑组织中丝氨酸、甘氨酸和γ－氨基丁酸含量明显增加．中、高剂量组大鼠脑组织中同 型半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和天冬氨酸含量明显比对照组的低．总体而言，雄黄可对大鼠脑组织氨基酸类神 经递质产生影响，氨基酸类神经递质可能是雄黄毒性作用的靶点之一． 关键词：雄黄；大鼠；脑组织；氨基酸类神经递质 中图分类号：Ｏ ６１３．６３文献标志码：Ａ文章编号：１００８－１０１１（２０１２）０２－００８７－０４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅａｌｇａｒ ｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｒａｔｓ ＨＵＯ Ｔａｏ－ｇｕａｎｇ，ＣＨＡＮＧ Ｂｅｉ，ＬＩ Ｗｅｉ－ｋａｉ，ＹＡＮＧ Ｈｕｉ－ｌｅｉ， ＺＨＡＮＧ Ｙｉｎｇ－ｈｕａ，ＪＩＡＮＧ Ｈｏｎｇ＊ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００１，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅａｌｇａｒ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｒａｔｓ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．３２Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｃａｔｅｇｏｒｉｚｅｄ ｉｎｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ，ｌｏｗ ｄｏｓａｇｅ， ｍｏｄｅｒａｔｅ ｄｏｓａｇｅ，ａｎｄ ｈｉｇｈ ｄｏｓａｇｅ ｒｅａｌｇａｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅ ｒｅａｌｇａｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅａｌｇａｒ ｂｙ ｇａｓｔｒｉｃ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ａｔ ａ ｄｏｓａｇｅ ｏｆ ０．３ｇ／ｋｇ，０．９ｇ／ｋｇ，ａｎｄ ２．７ｇ／ｋｇ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｏｒａｌｌｙ ｇｉｖｅｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ０．５％ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ （ＣＭＣ－Ｎａ）ｆｏｒ ２ｗｅｅｋｓ．Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｒｅｃｏｌｕｍｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ，ｇｌｙｃｉｎｅ ａｎｄγ－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｌｏｗ ｄｏｓｅ ｒｅａｌｇａｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ ａｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｅｌｅｖａｔｅｄ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ；ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａｓｐａｒｔａｔｅ，ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ，ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ｓｅｒｉｎｅ ｉｎ ｍｏｄｅｒａｔｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ ｒｅａｌｇａｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐｓ ａｒｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ．Ｉｎ ｏｎｅ ｗｏｒｄ，ｒｅａｌｇａｒ ｈａｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｒａｔｓ，ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ ｍａｙ ｂｅ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｘｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｒｅａｌｇａｒ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒｅａｌｇａｒ；ｒａｔ；ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ；ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ 雄黄为硫化物类矿物，作为药用在我国已有上千年的历史，主要成分为二硫化二砷（Ａｓ２Ｓ２）［１］．近些年， 收稿日期：２０１１－０７－２３． 基金项目：国家自然科学基金（８１０７３１４４）；辽宁省自然科学基金（２００９２１３３）；辽宁省教育厅高等学校科研资助项目（Ｌ２０１０７０８）． 作者简介：霍韬光（１９８３－），女，讲师，博士，研究方向：含重金属矿物药毒作用机制研究．＊通讯联系人．
原代新生大鼠心肌细胞的分离与培养 1.动物与仪器 1.1实验动物：选择出生第2 d的SD乳鼠,雌雄不拘。 1.2主要仪器与试剂:二氧化碳培养箱，Olympus倒置显微镜，超净工作台，低速自动平衡离心机,恒温磁力搅拌器；DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、D-Hank′s 液、溴脱氧尿核苷、小鼠抗大鼠Sarcomerie actin 单抗；山羊抗小鼠IgG。 2.方法 2.1心肌细胞的分离：取第2 d的SD乳鼠，无菌条件下开胸取心尖部，用预冷的D-Hank′s 液洗涤3遍，将心脏剪成约1mm3大小；用0.0625％的胰酶在37℃恒温磁力搅拌器中消化心肌组织，消化过程中采用分次消化时间(5min×5次,6min×5次,7min×5次,8min×5次)，第一次消化后自然沉淀并弃上清，以后自然沉淀后取上清；每次分离的上清液加等量含10％胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打制成细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，重复3次。 2.2心肌细胞的培养:细胞悬液放CO2培养箱培养90min后，采用差速贴壁分离技术,吸收培养瓶中的细胞悬液，调整细胞浓度为5.0×105细胞/mL，将单细胞悬液接种于培养板中，前3 d滴入Brdu使其终浓度为0.1mmol/L，并继续培养；24h后换液,以后隔日换液。 2.3心肌细胞搏动率的观察:在倒置显微镜下观察第1 d至第7 d心肌细胞的生长状态、形态变化，并摄像记录自发搏动频率。随机计数培养至第4 d的心肌细胞的搏动率。细胞搏动率(％)=搏动细胞数／细胞总数×100％。 2.4心肌细胞存活率的测定:取相同量的0.4％台盼蓝液与细胞悬液混匀后再取适量混合液滴于细胞计数板上，随机取10个高倍（20×）视野计数4个大格中的细胞总数及未染成蓝色的活细胞数，计数10次，取平均值。细胞存活率(％)=活细胞数／细胞总数×100％. 2.5心肌细胞纯度的鉴定:取培养72 h后心肌细胞进行纯度鉴定，用横纹肌肌动蛋白(a actin)单克隆抗体作为一抗，用SABC法进行免疫细胞化学染色，用磷酸盐缓冲液（PBS）作为一抗的阴性对照。随机取10个高倍（20×）视野计数阳性细胞及细胞总数。阳性细胞率=阳性细胞数/细胞总数×100％。
神经系统由大量的神经元构成。这些神经元之间在结构上并没有原生质相连，仅互相接触， 其接触的部位称为突触 细胞突起是由细胞体延伸出来的细长部分，又可分为树突和轴突。 树突棘是树突表面的棘状突起，也就是形成突触的部位 一般认为，NMDA受体主要分布在神经细胞的突触后膜。在兴奋性神经元，NMDA受体主要 分布在树突棘头的突触后膜，且主要分布在突触后致密区（postsynaptic density, PSD） 突触可塑性：突触在形态和传递效能上的改变 突触后致密区（PSD）：在电镜下所见的突触后膜胞质面聚集的一层均匀而致密的物质，见 于cns中所有树突棘突触的突触后膜上。主要功能是细胞粘附性的调节，受体集聚的控制和 受体功能的调节。 旷场试验：用来观察小鼠自发性探索运动活性和焦虑行为 反应实验动物在陌生环境中的自主行为与探究行为，以尿便次数反应其紧张度。 开场实验，open field test，这个测的是5min内，动物在一个开阔环境中的行为学变化，我 们用一个强光打在开场中央，开场有方形和圆形两种。圆形是一个大缸，白色的，具体尺寸 我忘记了。需要用的指标是：跨格数、站立数、排便数和梳理数（也就是理毛次数），前两 个指标为主。这个实验可以用中央场次数作为焦虑样行为的观察指标。 运动能力(locomotion， open field test 主要是评价动物的焦虑状态，它主要以动物进入中央区的时间百分率来评价焦虑状态，它也可以度等。 物在一个开放的新的地方会很小心，rodent动物喜暗而避明的特性会让自己躲在暗处，也会 对开阔地方有探索行为（好奇心），同时又有害怕紧张担心和焦虑心理，具有一定的新奇性 同时又具有一定的害怕。如果动物焦虑少，停留在中间等位置时间长久一些，不然反之。比 较这些特性可以比较动物的焦虑程度。具有抗焦虑作用的药物会让动物有更多的对开阔地方 有探索行为，焦虑紧张的动物更喜欢停留在开场的边缘和暗处。 LTP定义：给突触前纤维一个短暂的高频刺激后，突触传递效率和强度增加几倍且能持续数 小时至几天保持这种增强的现象。按LTP的时程分①PTP，强直后增强，一般5分钟后衰减； ②STP，短时程增强，持续半小时左右；③，LTP长时程增强，持续一小时以上 CaMKII这个蛋白是个很特殊的蛋白，在脑内含量非常高，大约占总蛋白量的1-2%。在突触 部位的含量很高，并且是PSD（postsynaptic density）主要蛋白。但这个蛋白最特殊之处是 其具有自身调节能力，仿佛自己本身就是一个具有学习记忆的功能。 因为把随着神经等器官、组织的兴奋所产生的动作电位作为其活动指标是最容易记录的现 象，所以常常用记录动作电位来深入研究神经系统等的机能。 高频刺激可引发突触后细胞的持久增强反应——最初被称为“持久增强作用”（
氟西汀对海马神经元生长的影响 各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢 【关键词】氟西汀;细胞培养;海马神经元;大鼠 氟西汀是5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治疗其他中枢神经系统疾病。有研究表明，氟西汀对海马的神经保护作用是其发挥抗抑郁效应的机制之一［1］。关于氟西汀对体外培养的海马神经元生长的影响未见报道，本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元生长的影响。 1材料与方法 新生大鼠海马神经元的分离和培养 技术方法在参考文献［2］基础上加以改进。取出生24h内的新生SD大鼠（东南大学医学院动物实验中心提供），无菌分离出双侧海马，用显微剪剪碎，
D-Hank#39;s液清洗2或3次，将剪碎的海马组织转移至离心管中，加入等量%的胰酶（美国Sigma公司），37℃消化30min，中间振摇1或2次，加入10%的DMEM/F12（美国Gibco公司）5ml，轻轻吹打15次，然后1000r·min-1离心5min，制成单细胞悬液，置于CO2培养箱（德国Heraeus公司产品）中，差速贴壁30min，去除成纤维细胞，吸取未贴壁的细胞，并用200目的不锈钢滤网过滤，收集过滤后的单细胞悬液于培养皿中，然后至离心管中，取一滴单细胞悬液进行计数，并用DMEM/F12将细胞密度调到1×106ml-1，然后接种于200μg·ml-1多聚赖氨酸（美国Sigma公司）包被的6孔培养板中，转移至培养箱内培养，4h后换为无血清培养基，即含2%B27的Neurobasl培养基（美国Gibco公司），以后每3天半量换液1次。使用培养6d的神经元进行染色鉴定。 大鼠海马神经元的鉴定 烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染
神经元细胞培养 1. 孕16 d SD 大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks’平衡盐液中。 2. 在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。 3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM＋10%FBS)的离心管内终止消化液作用5 min。 4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10%FBS 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3 次。 5. 将所收集的上清经200 目筛网过滤。 6. 过滤后的细胞悬液于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液(DMEM＋20%FBS)并吹打成单细胞悬液。 7. 细胞计数，调整细胞密度按（700000个）1.5×105/cm2 种入6 孔板内，放入CO2 孵箱中培养。 (1)把细胞悬液用(DMEM＋20%FBS)悬浮，种到培养皿上6－12 h 后，全量换成2% B27 的neurobasal 培养基，继续培养，3 d 半量换液。（+0.5mmol/L谷氨酰胺） 鉴定 1.形态学的观察，在DIC下可以很清楚的看到神经元特有的形态，轴突树突以及胞体非常 明显。 2.免疫学鉴定：正如楼上几位所说，NF（神经丝）或者tubulin 或者MAP2等都是目前 鉴定神经元的Marker,不论你好似免疫荧光还还是免疫组化，阳性表达即可！ 3.在进一步你可一做mRNA水平的实验，也就是RT-PCR了。这就更能支持2的阳性表达 了。 4.电生理学的鉴定：测定神经元特有的电生理学也是证据之一啊！ 从以上几个方面去做，应该能证明是神经元了！ 错误之处还请赐教！ TUJ1
［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究 工作. 昆明医学院学报2011，（5）：17～19Journal of Kunming Medical University CN 53-1049/R 胎鼠海马神经元培养及其鉴定 李玉1），王波1），但齐琴2 ） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所，云南昆 明650031 ）［摘要］目的建立胎鼠海马神经元体外培养方法，观察细胞生长情况，免疫组织化学染色鉴定神经元特 异性．方法取胎鼠海马，分裂获得细胞悬液，接种于24孔板，经2h 差速帖壁去除成纤维细胞，将细胞液转移并继续培养，以获娶纯度较高的海马神经元．培养第5、11、15天观察细胞和突起生长情况，用NeuN 抗体以免疫组化SP 二步法染色鉴立神经细胞．结果培养头3d ．细胞生长缓慢，5d 时细胞开始生长，可见突起， 11d 时突起连成网状．经Neun 染色培养细胞呈阳性反应，证明是神经元．结论 本方法获取生长良好，纯度 较高的海马神经元． ［关键词］胎鼠；海马神经元；Neun ；培养 ［中图分类号］Q831.1+1［文献标识码］A ［文章编号］1003－4706（2011）05－0017－03 I dent ificat ion and Cult ur e of Hippocampus Neur ons in Fet al Rat s LI Yu 1），WANG Bo 1），DAN Qi －qin 2 ） （1）Deat.of Neurosurgery ；2）Institute of Neuroscience ，Kunming Medical University ， Kunming Yunnan 650031，China ） ［Abstract ］Objective To establish the protocol for culturing hippocampus neurons in vitro and explore the neuronal growth character istics ．Methods Tissues from hippocampus of fatal rats were harvested ，then digested into cell suspension by using 0.125%trypsin ．After planted into wells for 2hours ，cell suspension was transferred into next well for continuing incubation ．The cell growth was observed at day 5，11and 15．Neurons specific Enolase （NSE ）antibody ，recognized specifically NSE antigen in cultured cells ，was used to identify neurons by SP-two-step staining method ．Results After incubated for 2hours ，transferred suspensions in wells showed some pure neurons ，which is identified by NSE staining ．However ，they grew slowly during 1～3days ，then grew well from 5th day ，with gradual increasing the neuritis outgrowth ．Conclusion Purified neurons with neurite outgrowth states can be acquired by this method. ［Key words ］Fetal rats ；Hippocampus neurons ；NSE staining ；Culture 海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源干扰因素作用（细胞因子）的有效细胞模型，其在神经生物学，发育生物学体外实验研究中已被广泛应用[1-3]．然而，要获得纯度较高， 生长状态较好的海马神经元也不是一件易事．本实验长期从事海马神经细胞生物特性及其应用研究，故需建立该细胞模型．鉴于胚胎来源的细胞 生长状态较成年动物来源者好[4，5] ．本实验建立大
基金项目:新疆石河子大学科学技术研究发展计划项目(ZRK X2006 Q04) 新生大鼠心肌细胞培养技术 新疆石河子大学医学院(832002) 李润琴 慕晓玲 摘 要 目的 探讨新生大鼠心肌细胞的分离、培养方法。方法 取1~3d 龄新生大鼠的心室肌细胞,用胶原酶!分离心肌细胞,离心收集心肌细胞,差速贴壁法纯化后培养于DM EM 培养基。显微镜下鉴定心肌细胞的纯度和形态结构,锥虫蓝染色检查心肌细胞成活率。结果 心肌细胞纯度为96%,平均成活率95 43%,并出现同簇细胞的同步跳动。结论 该方法简单有效,为研究心肌细胞的人员提供了一种实验手段。 关键词 细胞培养技术; 心肌; 大鼠 Culture method of the myocardial cell in Neonate Rats LI Run qin,M U X iao lin.M edical College of Shi hez i Uni versity ,X inj iang 832002,China Abstract Objective T o find an easy way to separ ate and cultur e myocardial cells of neonate rats.Methods T o obtain ventr icular myocardium of neonate rats about 1~3years o ld.We separate myo cardial cell w ith collag enase I,and collect myocar dial cell w ith centrifug alization.M yocar dial cell was cultur ed in DM EM and was separated by the t ime of adherence.W e observed the structure of myocar dial cell from lig ht microscope and stained living my ocardial cell with trypan blue.Results W e find 96percent cells ar e myocardial cells and 95.43percent ar e alive.A ll the myocardial cells were jumping synchronously.C onclusion T his is an effective w ay to study myocardial cells. Key words Cell culture techniques; M yocardial; Rats 原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型, 被广泛地应用于心血管疾病的研究中。我们经过长期摸索总结出一套简便、有效的大鼠心肌细胞的培养技术,为研究心肌细胞的人员提供一种实验手段[1]。1 材料和方法 1 1 主要试剂和仪器 1 1 1 试剂:小牛血清:购自Sigma 公司。DM EM (Dulbcc co ?s M odified Eagle M edium)合成培养基:购自Sigma 公司,含10%的小牛血清,100万U 青霉素,100万U 链霉素。胶原酶!0 8g/L:购自Sig ma 公司(现用现配)。磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline,PBS ):购自Sigma 公司。锥虫蓝:购自G ibco 公司,加无菌三蒸水配成浓度0 04%备用。 1 1 2 仪器:超净工作台,CO 2培养箱,倒置相差显微镜,离心机等。所有手术器械高压灭菌。玻璃品均强酸浸泡过夜,流水冲洗20遍,蒸馏水冲洗3遍,烤干后高压灭菌备用。 1 2 实验动物 Wistar 大鼠,1~3d 龄,新生大鼠心肌细胞在出生后3d 内具有部分增殖能力,大鼠出生时间越短,其心肌细胞分离后成活率越高,越容易贴壁生长。1 3 心肌细胞的制备和培养 取一窝1~3d 龄新生大鼠,不用麻醉和处死,用手固定住四肢,75%的酒精消毒皮肤,无菌眼科剪在剑突上一肋处入剪(注意避免剪破消化道预防污染)。开口0 5cm,心脏自然跳出,将心尖部组织剪下迅速置于预冷的不含Ca 2+、M g 2+的PBS 中,反复冲洗3遍,洗去残留的血细胞,将其剪成0 5~1mm 3大小的组织块,放入锥形瓶中[2],加入8mL 0 8g/L 的胶原酶!,在37#水浴,磁力搅拌器转速为100r/min,消化10min 。将黏附在搅拌子上的心肌组织吹散,当组织液由红转白呈半透明状态时,应停止消化。用吸管吸取第一次消化后的上清液弃去,再次以同上的方法消化3次,收集以后每次的消化后的上清液,加适量含10%的小牛血清的DM EM 培养基,终止胶原酶!对心肌细胞的继续作用。将收集到的上清液在500r/min 的离心机上离心10min,弃去上清液,用PBS 吹散沉淀细胞,同条件下再次离心,弃上清,然后加含10%的小牛血清,100万U 青霉素,100万U 链霉素,p H =7 2的DM EM 培养基制成细胞悬液接种于培养瓶中,放入37#,5%CO 2培养箱中静置培养90min 后,轻轻振摇后倾出尚未贴壁的心肌细胞,重新接种。将纯化的心肌细胞以1 5?106/mL 接种于预先用50mg /L 多聚赖氨酸涂布的25mL 培养瓶中,每瓶3mL ,放入37#,5%CO 2培养箱中培养,每48h 更换1次培养基,取培养72h 的单层细胞进行实验。1 4 心肌细胞质量评价 1 4 1 心肌细胞纯度鉴定[3]:显微镜下观察、计数纯化后的细胞,心肌细胞成圆型,成纤维细胞成梭形,计算心肌细胞纯度=心肌细胞数/(心肌细胞数+成纤维细胞数)?100%。
电针对脑功能障碍大鼠海马物质影响的 研究进展 （作者： _________单位：____________ 邮编：___________ ） 【摘要】目前，电针对脑缺血模型大鼠海马细胞影响的研究报道很多，对海马与学习记忆关系的研究已成为国内研究的重 点。本文就电针对脑功能障碍大鼠海马物质影响的研究作简要综述。 【关键词】电针海马物质 海马的生理功能目前仍在探讨之中.大量的动物模型研究表明，海马与学习记忆有关。当脑缺血等致海马受损时，可引起学习记忆功能的严重障碍。电针刺特定穴位可影响脑功能障碍大鼠海马物质的表达。现就目前电针对脑功能障碍大鼠海马物质影响的研究作一综述。 1电针对海马细胞凋亡相关蛋白表达的影响 1.1 Bel ]2是功能最为明确的细胞凋亡拮抗基因Bcl[2蛋白基本生物学功能为延长细胞的生命期限、增加细胞对多种凋亡刺激因素的抗性。Bax与Bcl]2作用相反，能够促进凋亡，Bcl〕2表达水平较高时，形成Bcl[2/Bcl[2同源二聚体，抑制细胞凋亡；Bax表达水平较高时，形成
Bax/Bax同源二聚体，加速细胞凋亡；BcL2和Bax水平相当 时，则形成Bcl[2/Bax异源二聚体，终止细胞凋亡。近年的研究提示 Bcl[2与Bax调节细胞凋亡，不仅取决于自身表达的高低，还与 Bax/Bcl_2比率有关，当比率增大时，细胞趋于凋亡[1 ]o caspase ]3 激活是触发凋亡的关键（有“分子开关”之称是凋亡的最终执行蛋白。Bcl]2家族基因在调节线粒体通透性上发挥重要作用，Bcl]2或其他 抗凋亡Bcl_2家族成员下调，或促凋亡Bcl_2家族成员如Bax在线粒体膜上过度表达和移位，均导致线粒体通透性增加，使细胞色素C 从线粒体释放入胞浆，与Apaf”、dADP形成复合体，再与胞浆中的caspase ]9前体形成凋亡小体，导致caspase[9被裂解激活，随后再裂解caspase家族其他成员包括caspase[3,引发凋亡。赵建新等[2] 报告电针刺激脑缺血小鼠“肾俞”膈腧”百会；各观察时点均可上调小鼠海马细胞Bcl[2表达，下调Bax表达，降低凋亡率。故电针可起到抑制凋亡、保护神经元的作用电针可显著上调内源性海马Bcl[2表达，降低Bax表达，有可能进一步抑制caspase [3的激活，或影响神经生长因子、过氧化物歧化酶、CHAT等促神经细胞存活相关基因的表达而发挥抗凋亡作用，有待今后动物实验验证。Noxa为BH3only 亚家族成员]3]，脑缺血研究发现，Noxa在脑缺血引起的细胞凋亡中起重要作用[4 ]。朱燕珍等]5]报告，电针刺激血管性痴呆模型大鼠“大椎百会：海马CA1区的Noxa阳性细胞数增加，Caspase ]3 阳性细胞数增加，提示Noxa调节的线粒体凋亡途径促进血管性痴呆的发展；电针治疗抑制
海马神经元细胞免疫荧光检验 神经元鉴定： 一、烯醇化酶鉴定： 培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS 漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min 以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，80%，90%，100%I，100%II 梯度酒精透水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明2次，每次30min---中性树胶灯片---镜下观察。 二、β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）荧光显示： 培养细胞用预冷PBS液轻柔漂洗3次，4%多聚甲醛固定，1h，4℃---吸去多余甲醛---PBS漂洗5min×3次---0.25%triton，室温，15min---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------弃血清，加入β-tubulinⅢ抗体（1:100稀释），4℃，过夜---PBS漂洗5min×3次---滴加FITC 标记的山羊抗小鼠lgG（体积比1:200稀释），37℃，1h---DAPI复染10min---抗荧光猝灭封片液封片---荧光显微镜观察---选择10个视野，统计学处理。
神经元原代培养 一、准备 1. 试剂 1）胎牛血清灭活：血清室温自然融解，摇匀。选用与血清瓶同规格的对照瓶一个，并加入与血清等体积的水。对照瓶内插入1～2支温度计(保证测试温度的准确性)。将血清瓶与对照瓶同时放入恒温水浴箱，待温度计所示温度上升至56℃时，定时30分钟。灭活后分装，10ml/瓶，一瓶放在培养箱做无菌实验，其余-20～-70℃保存。 2）D-Hank’s液(g/L)：NaCl: 8, KCl: 0.4, KH2PO4: 0.06, Na2HPO42H2O: 0.06, NaHCO3: 0.35; 酚红：0.02，超纯水溶解，调节PH至7.2，高压灭菌（购自南方医院临床试验中心）。 3）多聚赖氨酸：避光，用超纯水配制好后过滤，200μl或400μl/tube分装, -20度储存。母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml（购自Sigma，P2636，100mg）。配置方法：20ml超纯水溶解，分装为1ml/管。用时加入49ml超纯水稀释为0.1mg/ml的工作液。 4）50mM谷氨酸：超纯水溶解，滤过除菌，分装50μl/tube，-20℃保存。使用时需将终浓度调整为25μM（购自Sigma，G8415，100g，分子量：147.13）。配制方法：电子天平称量谷氨酸1.4713g，即0.01mol=10mmol，溶于200ml超纯水中，配制为50mM的谷氨酸母液。 例：500ml的Neurobasal Medium中加入Glutamate母液（50mM）250μl，此时终浓度约为25μM。 5）胰蛋白酶：0.25%（购自Hyclone，SH30042.01，100ml）。 6）阿糖胞苷（AraC）母液：10mM，(阿糖胞苷，1：1000稀释用)（购自Sigma，C1768，100mg，分子量：243.22）；配制方法：100mg/243.22≈0.41mM，加入41ml超纯水溶解，配制成10mM的AraC母液。 AraC工作液：10μM（半量换液，终浓度5μM）； 7）DNAse I（）（购自ROCHE，，100mg，1mg=2000U，用dH2O配成10mg/ml 母液，过滤分装100μl/tube，每次使用50-100μl） 8）培养基 FBS DMEM/F12：购自Hyclone，SH30023.01B，500ml
昆明医学院学报2011，（6）：29～32 CN53-1049/R Journal of Kunming Medical University 成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定 李玉1），但齐琴2），习杨彦彬2） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所， 云南昆明650031） ［摘要］目的观察体外培养成年小鼠海马神经细胞生长情况及其形态学变化．方法获取成年海马组织，制成细胞悬液，接种于培养板，分别于1，3，7，10，13，15d观察细胞生长情况，用神经元特异烯醇化酶抗体经免疫组织化学染色技术鉴定神经元．结果成年海马神经元接种后1～3d，有较多的杂质和部分细胞漂浮，贴壁细胞较少量．每隔3d半量换液后，杂质不断减少，但第1周细胞生长缓慢，第7～10d才见细胞生长良好．培养15d后，大部分细胞出现有明显的颗粒等早期退化征象．免疫组化染色证实培养细胞呈现神经元特异烯醇化酶染色阳性染色，免疫阳性产物主要分布于细胞质；证明是神经元．结论体外培养成年海马神经元早期生长缓慢，7～10d才显示良好的生长状态，2周左右细胞则开始退变．提示10d以前的细胞是供体外研究用的理想细胞． ［关键词］大鼠；神经细胞；海马；细胞培养；免疫组化 ［中图分类号］Q813.1+1［文献标识码］A［文章编号］1003－4706（2011）06－0029－04 Cult ur e and Ident ificat ion of Hippocampus Neur ons in Adult Rat s LI Yu1），DAN Qi－qin1），XIYANG Yan－bin2） （1）Dept.of Neurosurgery，The1st Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650032；2）Institute of Neuroscience，Kunming Medical University，Kunming Yunnan650031，China） ［Abstract］Objective To observe the morphology and characteristics of hippocampus neurons in adult rats in vitro．Method The hippocampus tissues from adult rats were collected，then digested into cell suspension by using0.125%trypsin．Cell suspension was planted into wells and observed at day1，3，7，10，13，and15 after incubation．Neurons specific Enolase（NSE）antibody，recognized specifically NSE antigen in cultured cells，was used to identify neurons by SP-two-step staining method．Results During1-3days，the extensive bodies of floating cells and tissue blocks were seen，but a few cells attached to the bottom of well．The growth of attached cells was also extensively slow，specifically within1week，while it began to grow quickly after7days，and maintained till15days．Amazingly，cells exhibited aging character with more particles in cytoplasm after15 days．NSE staining showed that cultured cells were positive staining by neuronal specific enalose antibody．Conclusion Adult hippocampus neurons grow slowly during the first week，but they are better from7day to15，then begin to degenerate after15days in vitro．This suggests that neurons from hippocampus of adult rats cultured in10days could be better for related neurobiological studies. ［Key words］Adult rats；Hippocampus neurons；NSE staining；Culture ［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究工作.
体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能 上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下: 一、鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。 1、材料和方法 （1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。 （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。 （3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。 （4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。 （5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。 2、结果 鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。 二、新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养 背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数
海马神经元培养 （1）材料 ①孕鼠：海马：孕18d，皮层或纹状体：孕16d ②Neurobasal medium (Gibco-BRL, cat. no. 21103) L-Glutamine (Gibco-BRL, cat. no. 25030) 谷氨酰胺 Glutamic acid (Sigma, cat. no. G-1626) 谷氨酸 B27 (Gibco-BRL, cat. no. 17504) ③Poly-D-lysine (mol wt 30,000—70,000) (Sigma, cat. no. P-7280)多聚赖氨酸 ④Hank’s balanced salt solution (HBSS) (Gibco-BRL, cat. no. 14025) ⑤HBSS without Ca2+, Mg2+ (Gibco-BRL, cat. no. 14175) ⑥trypsin 胰酶 ⑦NaHCO 3 ⑧Na pyruvate (Gibco-BRL, cat. no. 11840)丙酮酸钠 ⑨Trypan blue, 0.4% 台盘蓝 ⑩巴氏吸管，前端用火抛光 刻度吸管 离心管 闪烁瓶 玻璃培养皿：小：3套 大：2套 冰袋、纱布 手术器械、筛网 培养瓶或培养板
（2）步骤 ①准备 a．配制试剂 i) Poly-D-lysine（需保存在聚苯乙烯容器中，不能保存在玻璃、聚碳酸酯或聚丙烯容器中） 配制硼酸缓冲液（pH8.4） A液（硼砂溶液）：1.907g硼砂溶于100ml纯水（0.05M），0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 B液（硼酸溶液）：1.237g硼砂溶于100ml纯水（0.2M）0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 4.5mlA液+ 5.5mlB液 5mg P-D-L溶于10ml硼酸缓冲液中，配制成0.5mg/ml贮存液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存使用时用硼酸缓冲液稀释10倍。 ii)HBSS without Ca2+, Mg2+（D-Hank’s溶液）配制 不含钙、镁的HBSS粉剂：4.75g溶于400ml纯水 NaHCO3：0.175g加入溶液 1M NaOH 调节pH至7.2-7.4 纯水定容至500ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 iii）1M NaOH溶液配制 NAOH：4g 溶于100ml纯水 iv）0.125%胰酶+0.02%EDTA D-Hank’s溶液10ml EDTA 20mg 溶解后 D-Hank’s溶液80ml 胰酶125mg 溶解后 1M NaOH溶液调节pH至7.2 D-Hank’s溶液定容至100ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 v）D-Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4） 不含钙、镁的HBSS粉剂： 2.375g溶于200ml纯水 NaHCO3：0.088g加入溶液 HEPES：0.596g加入溶液 Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液 1M NaOH 调节pH至7.4 纯水定容至250ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 vi）Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4） 含钙、镁的HBSS粉剂： 2.45g溶于200ml纯水 NaHCO3：0.088g加入溶液 HEPES：0.596g加入溶液 Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液