对荧光原位杂交技术的认识
摘要:荧光原位杂交技术（FISH）作为分子水平的微生物检测技术，已成为目前首要生物学核酸检测技术，本文主要介绍了FISH的发展及在污水处理中的应用，重点介绍了在硝化细菌方面的应用，并给出了FISH技术存在的缺陷及改进的方法。
Abstract:Fluorescence in situ hybridization (FISH) , as a microbial molecular detection technology, has become the first biology nucleic acid detection technology. This paper introduces the development of FISH and the application in wastewater treatment, and mainly introduces the application in nitrifying bacteria.Further more,it also describes the disvantages in FISH and the improved methods.
关键词：荧光原位杂交技术（FISH），16S rDNA(16S rRNA),污水生物处理荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization）是在同位素原位杂交技术基础上发展起来的非放射性原位杂交方法，起始于20世纪70年代后期。它以16S rDNA(16S rRNA)探针用特殊的核苷酸分子标记然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维素切片上的定性，相对定量分析。有不同细菌的16S rDNA都有其独特序列，利用这些独特的序列制成的探针可以鉴别和跟踪自然样品中的目标细菌。最初FISH技术应用于医疗事业，目前FISH技术的应用范围也来越广，特别是FISH流程的简化完善和检测灵敏度的提高，使FISH成为一种首要的生物学核酸检测技术。
1.FISH的发展历史
1969 年, Pardue【1】等和John【2】两个研究小组开发了原位杂交技术, 用放射性同位素标记的DNA 或28S rRNA 和爪蟾卵细胞制备物进行杂交, 然后进行显微放射自显影检测。这一技术可以在保持细胞形态完整的条件下, 检测出细胞核酸序列, 自此, 原位杂交技术在染色体进化、肿瘤病人和白血病人的染色体分析以及多种细胞遗传学研究方面得到应用。
早期的同位素标记没有专门的标记方法，将随机同位素标记的碱基添加到
生长的细胞中再进行放射自显影。虽然灵敏度高，但是放射性材料因半衰期较短引起探针不稳定，且分辨率有限，检测周期长，价格相对较昂贵，必须按照严格的程序转运、贮存和处理有放射性的材料。【3】
1980年，Bauman【4】首次将荧光原位杂交用于核酸检测，直接接将RNA-3’端用荧光素标记作为特异DNA 序列的探针。氨基-烯丙基标记碱基技术可以与任何半抗原或者荧光素结合，这对于原位杂交是至关重要的，因为氨基-烯丙基标记的碱基技术可以仅通过简单的化学反应就可以获得一系列的低背景信号探针，通过杂交探针的二级检测系统使得杂交信号被放大。早在19 世纪80 年代，缺口平移法检测、生物素标记探针，二级荧光标记抗体检测等方法已经用于DNA【6】和mRNA 【7】检测。
FISH 不仅用于单基因或核酸检测，FISH 技术的进一步发展扩展到多色FISH 多基因位点同时检测，从基因检测发展到基因组、染色体、活细胞中转录产物mRNAs 原位检测以及组织水平的核酸检测，并且在今后的研究中还有可能应用到整个生物体的检测。【3】
Pinkel【8】等（1986）首次将荧光图像定量分析用于基本细胞遗传检测，采用双色激发块装置照相机检测荧光信号，而且定量分析技术很快用于了mRNA 检测。
1988年, Giovannoni【9】等首次将FISH 技术引入细菌学研究中, 使用放射性标记rRNA 寡核苷酸探针检测微生物。随着荧光标记的发展, 非同位素染料逐渐代替。1989 年, Delong【10】首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。
2.FISH的应用
在废水处理工艺中，对微生物鉴定的方法很多，传统的微生物的检测方法基本上有菌种分离培养法，镜检计数法。菌种分离培养法对一些培养条件苛刻或没被培养过的细菌用途不大，重要的是它不能精确的反应菌群的组成及多样性。镜检计数法，不但费时费力，还可能因为微生物形态、特性类似把它们当作同种微生物记错数，同时，没有活性的微生物有可能也会被计入总数。随着分子生物学技术的发展,分子生物学方法已经成为现代环境微生物学的重要手段。
与放射性探针相比, 荧光探针更安全, 具有较好的分辨力, 不需要额外的
检测步骤。此外, 可用不同激发和散射波长的荧光染料标记探针, 在一步反应中同时检测几个靶序列。该技术特异性和敏感度都很高，使得那些环境中数量少，培养难度高的微生物的研究方便快捷了很多。
不仅可以应用到环境样品微生物多样性和污水处理中生物多样性的研究还
可以应用到微生物群落组成及空间分布，原位生理学和功能性研究和特殊菌种的研究。
在聚磷菌方面的应用
荧光原位杂交(FISH)技术在聚磷菌的研究中可以在一定程度上反映污泥中聚磷菌的组成和空间结构。2008年，张勇【11】等通过正交试验筛检可以确定FISH 技术在检测反应器中聚磷菌最佳的优化条件。在固定前应先经过1 ×PBS清洗两次, 37℃热固定3 h,乙醇脱水3 min; FISH技术检测反应器中聚磷菌的最佳实验条件为:杂交温度46℃,杂交时间2 h,清洗缓冲液中NaCl浓度70 mmol/L。使聚磷菌的定量检测更加快、简便、准确。亢涵,王秀蘅【12】等应用FISH 对以乙酸钠为碳源的强化生物除磷(EBPR) SBR 反应器启动期的微生物进行原位分析,考察了除磷生态系统形成过程中聚磷菌种群结构、空间分布关系动态变化及其聚磷特性。
在厌氧反应细菌的应用
Santegoeds 【13】等人利用ARC915 ,SRB385 ,DSV698 和DSS658 等探针发现,产甲烷菌主要分布在颗粒污泥的内部,而硫酸盐还原菌则分布在外层;Sekiguchi 【14】等人也得到类似结论。2006年，许鑫【15】等应用FISH检测厌氧反应器里的硫酸盐还原细菌，并对其试验条件进行优化。硫酸盐还原菌的较好的杂交条件是杂交温度46℃，杂交时间3h, NaCl浓度为90mmol/L。杂交时间和温度均影响探针的特异性，在一定温度范围内提高杂交温度会提高探针的特异性；杂交时间过短会造成探针结合不完全，过长会增加非特异性着色；杂交洗脱液NaCl浓度过高会降低探针特异性。同年，陈瑛，任南琪【16】等应用FISH技术研究了连续流搅拌槽(CSTR)解析发酵产氢细菌中的 2 种产氢发酵类型的菌群组成和发酵类型转化过程中的菌群种类和数量变化及其对产氢速率、生物量和发酵产物的影响.
结果表明,梭菌属和肠杆菌科在决定产氢发酵类型方面有重要作用. 以梭菌为优势种群的乙醇型发酵比以肠杆菌为优势种群的丁酸型发酵具有更佳的产氢能力。
Harmsen【17】等人利用EUB338 ,ARC915 ,MX825 和MG1200 等探针的不同组合以蔗糖为基质和以混合酸为基质的颗粒污泥分层不同。其前者为：三层，由外到内，真细菌，产氢产乙酸细菌和产甲烷丝菌的共生体，较大空洞有少量产甲烷细菌和无机物。后者为两层，外层真细菌，内层产甲烷丝菌为主。
对肠道细菌的应用
1995年，Langendijk等【18】首次采用探针Bif164用FISH对人肠道双歧杆菌进行定量分析。2004年，Takada等【19】用3种不同荧光集团组合，并用7种针对双歧杆菌的探针染上不同的探针，成功的运用了多色荧光原位杂交技术。2004年，王建龙【20】利用FISH检测水体中大肠杆菌，可以在一天内给出定量检测结果。但还没有广泛用于饮用水中的大肠菌群计数，原因是饮用水中的细菌因缺乏营养物处于饥饿状态且受消毒剂的影响。其细胞内的染色体含量较低，是杂交产物的荧光信号很弱。利用PAN（是一种合成的核酸,用肽骨架取代了核酸中的戊糖- 磷酸骨架,是一种新型的DNA 模拟物,具有与DNA 和RNA 结合的高度亲合性和良好的稳定性)代替DNA或利用荧光扩增系统可以提高检测的灵敏度和杂交信号的荧光强度。
在生物脱氮方面的应用
Helmer【21】等以NSO1225探针和Amx208202a2A222探针分别对生物膜内细菌进行了FISH检测, 发现亚硝酸细菌主要分布于生物膜的好氧表层, 而厌氧氨氧化菌( Kuene2nia stuttga rtiensis) 则主要分布于生物膜的缺氧内层。Michael 【22】等用同样探针对CANON(Completely Autotrophic Nitrogen OverNitrite) 反应器中的颗粒污泥进行研究时也发现了类似的结果。Schramm【23】等应用FISH技术并将聚焦显微镜和相差显微镜图像叠加，对硝化流化床反应器中活性污泥内硝化细菌的空间分布进行原位分析，发现氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌紧密结合在一起的形态特征。IngoSchmidt【24】等在研究好氧与厌氧氨氧化菌的生存关系时发现Kuenenia stuttga rtiensis和Brocadia anammoxidans Dokhaven紧密
结合在一起的形态特征。Jang等用Nsm156作为探针研究SBR中的好氧颗粒污泥的群落结构特征时发现:氨氧化菌含量很高,但分布并不均匀,大部分集结成球状, 有些甚至在颗粒污泥的缺氧区。这一研究结果表明颗粒污泥中的氨氧化菌含量可能高于絮状活性污泥, 从而可以实现更高的氨负荷。
Silyn【25】等对废水处理湿地生物进行了研究, 结果也表明亚硝化单胞菌是其生物膜上的主要氨氧化细菌。Kazuaki【26】等用EUB338、NSO190、NIT3和NSR1156等探针研究了同时硝化反硝化好氧膜生物反应器中生物膜上的菌群结构, 结果表明氨氧化菌是生物膜中的优势菌群, 而亚硝酸盐氧化菌则未被检出。Han-Woong Lee【27】等用EUB338作为一级探针, ALF1b, BET42a, GAM42a和CF319a 作为二级探针对两个不同脱氮反应器活性污泥中的分子生物学特征进行了定量研究，变形菌纲-β亚纲是反应器中的优势菌群，变形菌纲-γ亚纲是反应器中的第二大优势菌群。Sachiko【28】等用自己设计的Clw844、PSMg43、Hlm474等探针对含盐废水处理脱氮系统中的生物群落进行了定量研究，结果表明, Hlm474 探针所代表的Halom onas1.sp是反应器能实现脱氮最重要的菌属。张丹【29】等研究了OLAND (Oxygen-Limited Autotrophic Nitrification-Denitrification)反应器中硝化菌群随溶氧浓度降低的变化规律, 在限氧条件下, 硝酸细菌不能与亚硝酸细菌竞争氧, 也不能与厌氧氨氧化菌竞争亚硝酸盐。
FISH与PCR-DGGE和16S rRNA / rDNA序列分析等技术相结合是对污水处理构筑物中生物脱氮群落进一步研究的发展方向。
3.FISH的检测步骤
各种微生物的FISH的检测步骤基本相似，都是预处理，固定，杂交，洗脱，镜检。只是由于微生物的生理性质不同，所以预处理方法不同，探针、杂交温度、杂交时间，脱水时间，洗脱液NaCl浓度各不相同。探针都是采取16srDNA(16srRNA)用特殊的核苷酸分子标记，其他条件需要根据可以根据正交试验测出来。
首先，简单介绍一下几类细菌的预处理。
厌氧颗粒污泥的预处理
从处理装置或试验装置取出颗粒污泥,经沉淀和清水漂洗后,用多聚甲醛磷酸缓冲液进行固定,然后浸入熔化的塑化石蜡(paraplast) 中,冷却后切片,切片
厚度一般为5～10μm ,将切片在50 ℃水中进行延展后转移到玻片上,在42 ℃条件下干燥后在二甲苯中浸泡30 min ,再用二甲苯- TBA - 乙醇混合液进行冲洗,即完成了颗粒污泥样品的预处理。
聚磷菌的预处理过程
(1)取1. 5 ML 污泥于2ML 离心管并于14000转离心5分钟。
(2)去除1. 25 ml上清液,震荡使之重新悬浮,并加入0. 75 ml固定液。
(3)震荡1分钟后于4℃冷藏2小时。
(4) 6000转离心5分钟,去除上清液,加入0. 9ml 1 ×PBS。震荡1分钟。
(5)重复步骤4两次。最后离心去除上清液后加入0. 2 ml 1 ×PBS,震荡1分钟。
(6)加入等体积96%酒精可在- 20℃下冷藏数月备用。
(7)取3 ul预处理过的污泥到载玻片上, 37 ℃的烘箱热固定3小时;依次用50% , 80%, 96% (质量分数)乙醇室温下脱水3分钟。
硝化细菌的预处理
（1）活性污泥用0.1% (质量分数) D EPC 浸泡的聚乙烯管子采样; 4% (质量分数)的多聚甲醛于4 ℃固定4 h; 将固定样本用磷酸缓冲液离心漂洗2次,用w ( PBS ) ∶w (乙醇) = 1 ∶1液稀释备用;10μL 的样品涂于包埋明胶的玻片, 37 ℃的烘箱热固定; 依次用50% , 80% , 96% (质量分数)乙醇室温下脱水.
（2）水样水样直接按1 ∶1加入4% (质量分数)的多聚甲醛, 4 ℃固定4 h,用苏丹黑B 染色,硝酸纤维膜过滤后,进行热固定、脱水等处理步骤.
其次，以硝化细菌的具体检测步骤如下：
1）玻片处理
（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。
（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。
（c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。
（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干
净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate) 水溶液浸泡处理(37 ℃、2 h ，室温过夜) ，高压消毒去除DEPC ，然后250 ℃烘干4 h 以上或200 ℃过夜。称量试剂勺也要干烤。塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC 水溶液处理3 h 以上，然后再高压灭菌，烘干。若为进口已处理的无RNase和DNase 的枪头、试管可不必处理直接使用。
（e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1 mL/L DEPC 水配制。
2）样品制备及其所涉及的试剂包括：
（a）缓冲溶液
1×PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na
2HPO
4
2.9g，KCl 0.2g，KH
2
PO
4
0.2g，溶入
1000mL超纯水；
3×PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na
2HPO
4
8.7g，KCl 0.6g，KH
2
PO
4
0.6g，溶入
1000mL超纯水；
通常配制成10×PBS的储备液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。
（b） 4%多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）
称取2g PFA加入30ml约60℃的热水，滴几滴20%NaOH放在磁力搅拌器搅拌至完全溶解。然后向其中加入16.5 ml 3×PBS缓冲液，在冰浴中充分混匀冷却，冷却后，用HCl调整至中性（7.2左右），拿出搅拌子。向PFA溶液中加入超纯水，定容在50ml。用0.45微米的膜过滤后使用。（室温或4℃保存备用）。
注意：1、配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因PFA有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用；2、加热时，温度不宜过高，常为60~65℃，否则，PFA降解失效；3、配制好的PFA虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，应尽早使用。
4% PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保持组织及细胞内的RNA，同时对形态保持也较好。样品固定时间在2~3小时，RNA 含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。
（c）配制50%，80%，98%无水乙醇溶液，每个总量20mL。
（d）DAPI溶液
用1 ml ddH 2O 将DAPI 溶解，制得2.9 mM 的DAPI 溶液 （1 mg DAPI/1 mL H 2O ）。（DAPI 不能直接用PBS 等缓冲液溶解，需要先用水将其溶解）。取适量DAPI 水溶液加到PBS 中，制备成10-50 μM 的DAPI 溶液。
3）取样及保存方法
（a ）反应器沉淀前取样2~5mL 至离心管。
（b ）离心（2000r/min ）5min ，去上清液（加蒸馏水重复两次）。 （c ）样品加入1mL 多聚甲醛，摇匀，4℃下放置3h 。 （d ）样品离心(12000r/min)5min ， 去上清夜。
（e ）加入1×PBS，摇匀，离心(10000r/min)5min ， 去上清夜（重复3次）。 （f ）加0.5mL 1×PBS，0.5mL 无水乙醇，摇匀，-20℃保存（可保存6个月）。 4）样品固定：
稀释样品3~5倍，对样品进行超声处理（3W 超声2~3min ，沉降1min ，去 沉淀物，5W 超声5min ），将活性污泥絮体打散成单个细胞以便于显微镜计数。然后取3μL 样品涂于包埋明胶的玻片上（检查样片本底），37℃的热烘箱固定2h （或者在空气中干燥2h 或者过夜）。依次用50%、80%、98%（质量比）乙醇浸渍3min ，对细胞进行脱水后，立放，并进行干燥。 5）样品杂交
试验所涉及的缓冲液包括杂交缓冲液（Hybridization Buffer, HB ）和淋洗缓冲液（Washing Buffer, WB ），其组分如表3-2和表3-3。
表3-2 杂交缓冲液（Hybridization Buffer ）
表3-3 淋洗缓冲液（Washing Buffer ） 5% 10% 20% 30% 35% 40% 0.05%SDS （μL ） 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 50mMTri-HCl
（μL ）
24 24 24 24 24 24
5mol NaCl （mL ） 4.32 4.32 4.32 4.32 4.32 4.32 甲酰胺（mL ） 1.2 2.4 4.8 7.2 8.4 9.6 蒸馏水（mL ） 18.4548 17.2548 14.8548 12.4548 11.2548 10.0548
探针
Nsm156
Ntcoc206 Ntspn693
N sv443
Ntspa662 NSO1225
Nmv
NIT3
组分 体积 0.05%SDS
0.6μL
（a ）吸取2mL 杂交缓冲液遍布在杂交盒内折好的吸水纸上，将已固定好样品的载玻片放入杂交管中，然后在46℃杂交炉中放置数分钟。
（b ）吸取10μL 探针贮存液和80μL 杂交缓冲液混合后，用箔纸包好放入46℃杂交炉中预热数分钟；探针贮存液浓度为25ng/μL ，用无菌水稀释购买的探针，实验用的探针序列及杂交条件见表3-4所示。
表3-4用于检测样品中AOX 、NOX 的寡核苷酸探针及杂交条件
探针 探针序列(5’~3’)
标记细菌种属 浓度a 参考文献 NSO1225 CGCCA TTGTA TTACGTGTGA Ammonia oxidizing beta-proteobacteria 35 [38] Nsv443 CCGTGACCGTTTCGTTCCG Nitroso-spira, -lobus,
-vibrio 30 [38] Nmv TCCTCAGAGACTACGCGG Nitroso-coccus 35 [39] Ntspa662 GGAATTCCGCGCTCCTCT Nitrospira 35 [40] NIT3 CCTGGCTCCA TGCTCCG Nitrobacter 40 [41] Ntcoc206 CGGTGCGAGCTTGCAAGC Nitrococcus mobilis 10 [42] Ntspn693
TTCCCAATA TCAACGCA TT
Nitrospina gracilis
20
[42]
注：a 表示杂交缓冲液中去离子甲酰胺浓度（%）
（c ）吸取9μL 预热后的探针稀释液涂于载玻片待测样品上，然后将载玻片迅速地移回杂交管中于46℃下进行杂交（黑暗中进行），杂交时间为2~3h ；
（d ）杂交后的洗脱：打开恒温水浴槽，加热到48℃，对杂交缓冲液、淋洗缓冲液进行预热。杂交盒中取出载玻片用杂交缓冲液冲洗样品后， 快速放入淋洗缓冲液，48℃水浴20min 后用4℃冰水，冲洗样品，样品洁净台中挥干。
6）DAPI 染色
每孔滴9uLDAPI ， 4℃暗处5min ，4℃冰水（BPS 缓冲溶液）冲洗，挥干。用带有360 nm 激发波长，460 nm 发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。DAPI （4，6-diamido-2-phenylindole ）染色用于全细胞计数。
7）封片
涂封片剂，盖盖玻片，无气泡后指甲油封装。 8）荧光显微镜进行检测
每个样品及每个探针都采集20个不同区域。每个区域中的细胞个数要超过1000个，然后进行平均以获得每个探针对于每个样品的杂交结果。细菌丰度或
50m MTri-HCl 12μL 5mol NaCl 2.16mL 蒸馏水
42.8274mL
细菌数目（cells/g或cells/L）为AS
1/(S
2
V)，其中A为视野中细菌平均数；S
1
为样品涂抹面积；S
2
为视野涂抹面积；V为样品体积。
FISH技术存在的不足及改进
FISH检测有时会出现假阳性和假阴性结果。造成假阳性的原因有两种：自身荧光和缺乏特异性。
微生物的培养基、固定方法和封闭剂对荧光的信号强度均有很大的影响。使用狭窄波段的滤镜和信号放大系统能降低自身背景荧光。在进行数字处理时减少像数可以消除自身荧光，使用共聚焦激光扫描显微镜可以通过分析自身荧光减少FISH检测影响。FISH 检测的精确性和可靠性主要依赖于寡核苷酸探针的特异性，探针的特异性和灵敏性也取决于杂交条件, 杂交和洗脱温度、变性剂的浓度等。
造成假阴性原因有：探针穿透力不足；rRNA 形成的三维结构, 导致寡核苷酸探针的差别感受性而无法接近靶序列, 阻碍了杂交；低rRNA含量和光脱色。
细胞壁结构影响探针穿透力，因此要对革兰氏阴性菌进行特殊的固定和预处理，采用PAN探针可以克服寡核苷酸探针的差别感受性，提高杂交效果。使用高亮度的荧光染料Cy3 或Cy5 和多重探针标记, 以及应用信号放大系统或多聚核苷酸探针均可增强杂交信号。使用细菌探针是控制因方法学问题而导致假阴性结果的最好手段
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【25 】Silyn R G, Lewis G1Water Research, 2001, 35 (11) : 2731～27391
【26 】Kazuaki H, Akihiko T, Satoshi T, et al1Journal of Biotechnology, 2003, 100 (1) : 23～321
【27 】HanWoong L, Soo2Y L1FEMSMicrobiology Ecology, 2002, 41 (2) : 85～941
【28 】Sachiko Y, Naohiro N, Satoshi T, et al1FEMSMicrobiology Letters, 2004, 235 (1) : 183～1891
【29 】张丹, 刘耀平, 徐慧, 等1应用与环境生物学报, 2003, 9 (5) : 530～5331
附录
表1部分亚硝酸氧化菌和氨氧化菌的特异寡核苷酸探针
表2 厌氧颗粒污泥研究常用探针
荧光原位杂交技术FISH 1 目的 通过FISH实验检测两条Brd2基因cRNA探针的效价。 2材料与仪器 2.1材料 件为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s；50℃退火45 s；72℃延伸45 s；循环30次； 72℃再延伸8 min。 2) 将所有PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用凝胶回收试剂盒回收并纯化PCR产 物，并用微量分光光度计测定其浓度。 3) 进行体外转录反应合成Brd2 cRNA探针，20 μL体外转录反应体系如下：RNase
inhibitor 1μL，10×NTP dig labeling mixture 2μL，10×transcription buffer 2μL，Template DNA 13μL，RNA polymerase 2μL。 4) 37℃水浴孵育2 h，取0.5μL于1%琼脂糖凝胶电泳检测。 5) 加入2μL无RNase污染的Dnase I 37℃水浴孵育15 min来消化模板DNA。 6) 加入EDTA 0.8μL，加入5.6μL NH4Oac终止反应，再加入56μL无水乙醇并混匀，于 -80℃放置20 min。 7) 15000 r/min,4℃离心15 min，弃上清，加入700μL 80%的无水乙醇混匀，15000 r/min,4℃ 离心10 min沉淀RNA。 8) 干燥后用DEPC处理的水50μL溶解RNA。合成的两条探针经1%琼脂糖凝胶电泳鉴 定并用微量分光光度计测定探针浓度，于-80℃保存备用。 3.2荧光原位杂交实验检测探针的效果 1) 正常C57BL/6小鼠用1%戊巴比妥钠深麻后，依次以30 mL 0.01 mol/L DEPC-PBS和 100 mL含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液（PB）行左心室灌注，小心剥离脑组织，于4℃环境下用上述相同固定液进行后固定过夜，后将组织转移浸没于含30%蔗糖的PB溶液中脱水至沉底。 2) 最后取出组织用OTC包埋，冰冻切片机连续切片至需要的层面，切片厚度30 μm。 3) 选取上述脑组织切片于室温条件下经含有2%H2O2的0.1 mol/L DEPC-PB处理10 min 以阻断内源性过氧化物酶，再用0.1mol/L DEPC-PB室温漂洗10 min，接着用含 0.3%Triton X-100的0.1 mol/L DEPC-PB处理20 min，在用乙酰化液处理10 min，后 于0.1mol/L DEPC-PB中清洗2次，每次10 min，后加入预杂交液，60℃预杂交1 h 以封闭非特异结合位点。 4) 分别于两组切片中加入探针并使探针终浓度为1 μg/mL。于60℃杂交炉中恒温孵育 16-20 h，同时设立省略探针的空白对照，以上操作严格在无RNA酶环境下进行。 5) 杂交后组织切片置于wash buffer中60℃浸洗2次，每次20 min，接着切片在RNase buffer中室温孵育5 min，后加入终浓度为20 μg/mL的RNase，37℃作用30 min以消化未结合的cRNA探针。 6) 接下来恒温37℃条件下依次用2×SSC，0. 2×SSC溶液各浸洗切片2次，每次20 min， 再在TS7.5溶液中室温孵育5 min，后置于TBS溶液中室温封闭1 h，加入地高辛抗体（POD-anti-DIG,1:100）室温孵育过夜。
荧光原位杂交（FISH）综述 摘要 本文简单介绍了荧光原位杂交（FISH）技术的一些基础理论知识以及常用操作方法和步骤。 关键词：荧光原位杂交; 1.发展 荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位，或在分子生态学中用来标记不同分类细菌或古菌中的核糖体RNA[1]。1969年，Pardue等和John两个研究小组发明了原位杂交技术，放射性标记的DNA 或28s RNA 被杂交到细胞制备物上，通过放射自显影技术(m icroautoradiography, MAR)检测杂交位点，这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下，使核酸序列在细胞内被检测[2]。 2.原理 通过特定分子的荧光标记探针在细胞内与染色体上特意的互补核酸序列原位杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号。由于荧光燃料收到一定波长的（即激发波长）的光激发后会发射荧光（即发射波长），所以就滤光镜选择合适的激发波长的光，即可显示某一特定的荧光染料，于是就可以直接显示特定细胞核中或染色体上的DNA序列间相互位置关系[2]。 原位杂交的处理：染色体上杂交的位点提供了DNA探针序列的定位信息。所以应用该方法时，需打开维持染色体DNA双螺旋结构的碱基配对以使其形成单链分子（这称为DNA变性）。只有这样染色体DNA才能与探针杂交。变性染色体DNA而不破坏其形态的标准方法是将染色体干燥在玻璃载玻片上，再用甲酰胺处理[1]。
3.关于探针的发展 早期原位杂交技术中探针是放射性标记的，但这个方法并不令人满意，因为放射性标记很验证同时满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的必要条件。灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（例如用32P标记），当标记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低。如果使用低辐射能的放射性标记物，如 3H可以得到较高的分辨率，但由于灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致背景过高，难以分辨出真正的信号。20世纪80年代后期，非放射性DNA荧光标记技术的发展解决了上述问题，这些标记将高灵敏度与高分辨率结合起来，适用于原位杂交。 现已设计出具有不同发光特性的荧光标记物，因此有可能将一组不同的探针与单个染色体杂交，并分辨出每种杂交信号，从而测定出各探针序列的相对位置。为了得到最高的灵敏度，探针的标记需要尽可能大一些。在过去这就意味着探针必须是相当长的DNA分子，通常是至少40kb的克隆片段。现在已发展出将较短的DNA分子进行标记的技术，对长度的要求已不那么重要。 构建物理学图谱时，克隆的DNA片段可被简单地看作另一种类型的标记物，但在实际应用，由于克隆的DNA片段确定了DNA序列，将其作为标记应用则具有另一层含义。因此，克隆间位置关系的确定提供了基因组图谱与其DNA序列间的直接联系。如果探针是长的DNA片段，至少对于高等真核生物，就可能产生这样一个问题：探针中可能含有一些重复的DNA序列，因此探针可能与染色体上多个位点杂交，探针在使用前要与来自被研究组织的未标记DNA混合。这种DNA可以是总的核DNA（即代表了全基因组），但如果使用富集重复序列的片段更好。加入未标记DNA的目的在于与探针中的重复序列结合并将其封闭，使随后的原位杂交完全由单一序列驱动（Lichter et al.，1990）。这样非特异性杂交即可被减少或完全消除[1]。 4.荧光染料 常用的荧光染料的DAPI(在UV 光激发下发出蓝色荧光)、FITC和荧光素(蓝光 下发出绿色荧光)以及罗丹明和德克萨斯红(绿光激发下产生红色荧光)。由于FISH 的信号空间分辨率高。不同的DNA 探针可以用不同的半抗原标。再用不
荧光原位杂交技术及其应用 摘要：荧光原位杂交技术是一种非常有用的分子细胞遗传学工具，特别是对一些染色体数目异常和复杂染色体异常的诊断，架起了染色体显带技术和分子遗传学之间的桥梁。本文主要就荧光原位杂交技术的发展历程、探针制备和临床应用做一简单的综述。 关键词：FISH；荧光原位杂交；临床应用；产前诊断；肿瘤 Fluorescence in situ hybridization and applications SUN Jingjing,YAN Shouqing (College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，China) Abstract:FISH is a powerful molecular cytogenetic technique which allows rapid detection of numerical and complex chromosome aberrations on interphase cells and metaphase spreads, bridging the gap between conventional chromosome banding analysis and molecular genetic DNA studies. This review gives a brief overview of the historical developments of FISH techniques and applications in clinic genetic diagnostics. Key words:FISH; Fluorescence in situ hybridization; Clinical applications; Prenatal diagnosis; Tumor DNA荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示DNA序列位置的方法[1]。该技术具有快速、安全、灵敏度高以及探针可长期保存等特点，目前已广泛应用于细胞遗传学、肿瘤生物学、基因定位、基因作图、基因扩增,产前诊断及哺乳动物染色体进化研究等领域。 1 FISH技术的产生 1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获得成功之后，Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模板，利用体外合成的含3H 的RNA为探针成功地与中期染色体标本进行了原位杂交，从而开创了RNA-DNA的同位素原位杂交技术[2]，但是没有得到广泛应用。1974年Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来，提高了基因定位的准确性。1981年，Langer等首次采用生物素标记的核苷酸探针(bio-dUTP)成功地进行了染色体原位杂交，建立了非放射性原位杂交技术(Nonisotopic in situ hybridization)，至此，以荧光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。1985年这项技术被引进到植物。1986年，Cremer与Licher等分别证实了荧光原位杂交技
1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。1981年Harper 成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH 技术得到了迅速的发展和广泛应用。 1．原理 FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。2．实验流程 FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。 3．特点 原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。 缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。 4．应用 该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。 荧光原位杂交FISH操作规程 一、主要试剂 1变性液20SSC 4mlddH2O 8ml甲酰胺28ml 2PBD液1000ml 20SSC中加入1.25gTween20 二、操作流程 1 硅化玻片切片烤片60过夜 2 脱蜡入水斜置切片空干 3 2SSC洗涤三次每次5min下简写为35 4 0.2M HCl处理室温10接步骤3 5 0.25mg/ml 蛋白酶K处理室温1530接步骤3 6 切片入20梯度酒精脱水各2空干 7 切片入85变性液8 8 迅速入20梯度酒精脱水各2空干 9 杂交液85变性50冰浴10滴加至切片加盖玻片37过夜 10 反应体系中加入等体积的甲酰胺4510
仪器设备 1、医用微波炉； 2、水浴锅； 3、OLYMPUS BX51荧光显微镜； 4、OLYMPUS DP11数字显微照相机。 FISH试剂 （1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃； （2）20×SSC（）； （3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成； （4）25mg/ml蛋白酶K消化液。 （5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。 （6）杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH 前升至室温。 实验步骤 1、脱蜡： 1）二甲苯脱蜡3次，每次5min； 2）100％酒精两次，每次2min； 3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。 2、蛋白酶处理: 1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。 2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。 3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。 4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。 3、变性： 1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液； 2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸； 3）78℃孵育8min； 4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min； 5）空气干燥。 4、杂交： 1）准备探针； 2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片； 3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片； 4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。 杂交后的水洗： 5）镊子小心去除盖玻片； 6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min； 7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min； 8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。 检测：
荧光原位杂交（FISH） 1.样品处理与固定(约4h，可提前准备) （1）用纯水清洗样品数次，加1×PBS，涡旋悬浮样品，离心（2000r/min）5min 弃去上清液； （2）在样品中加入4%多聚甲醛（终浓度4%），置于4℃固定3小时左右；（3）离心（12000r/min）5min，弃去上清液； （4）加1×PBS摇匀清洗3次，离心（10000r/min）5min弃去上清液； （5）加0.5mL1×PBS和0.5mL乙醇，重悬样品，-20℃可保存6个月。 2.载玻片涂层处理（约2.5h，可提前准备） （1）将载玻片用盐酸乙醇溶液中（1份盐酸2份乙醇）浸洗10min，然后用自来水水充分清洗，再用纯水清洗2-3遍，100%乙醇中贮存备用； （2）拿出玻片晾干后，滴一滴poly-L-lysine（0.1mg/mL）溶液于载玻片上，覆盖样品孔，室温放置10-30min分钟； （3）吸去多余的溶液，用无菌水冲洗表面数次； （4）接种前至少室温干燥1小时或过夜晾干。 3.透化与脱水（约1h） 现配proteinase k buffer：50mL 1M Tris/HCl0.5mL0.5M EDTA1mL 5M NaCl1mL10%SDS 2.5mL dd H2O to50mL pro.k(20mg/mL)25μL （1）取适量固定后样品于载玻片上（可提前超声破碎），放入46℃孵育箱中烘干10分钟； （2）将样品浸入蛋白酶k缓冲液中，37℃，20min，然后浸入灭菌水中清洗3次，每次1min。 （3）再依次浸入50%、80%、100%乙醇中脱水，每次3min，最后在空气中晾干。 4.杂交（约2h） （1）加9μL杂交缓冲液到载玻片的样品上，尽量让样品全被覆盖； （2）（此步之后，保证样品充分避光）在杂交缓冲液上加1μL探针（终浓度
细胞遗传学课程论文 题目：荧光原位杂交技术的发展 及在植物中的应用 姓名：秦冉 学号：11316040 荧光原位杂交技术的发展及在植物中的应用 摘要: 荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）是20世纪80年代末发展起来的一种非放射性原位杂交技术。该技术因其具有灵敏度高、特异性强、定位准确、快速有效、安全直观等特点而被应用于很多领域。本文简要介绍了荧光原位杂交在染色体制片技术、探针类型及探针标记方法方面的发展，概述了荧光原位杂交技术在基因定位，远缘杂种的鉴定及外源染色质的检测等方面的应用。 关键词：荧光原位杂交技术；染色体制片技术；探针标记方法；基因定位 The development of fluorescence in situ hybridization and its application in plant Abstract: Fluorescence in situ hybridization(FISH) is a non radioactive in situ hybridization technique developed in the late 1980s. Because of its characteristics:high sensitivity, strong specificity, accurate positioning, fast, safe and effective, it can be used in many fields.This paper briefly introduces the development of FISH in plant including the chromosomal technique, probe type and labeling method, then summarizes the application of FISH in gene mapping, identification of the distant hybrid and detection of the alien chromatin, etc. Keywords: fluorescence in situ hybridization; chromosomal technique; probe method; gene mapping 前言 荧光原位杂交技术是20世纪80年代末发展起来的一种非放射性原位杂交技术[1]。其基本原理为：根据核普酸碱基互补配对原则, 使荧光标记的探针序列与靶DNA序列进行杂交, 然后用合适的检测方法将荧光信号检出, 达到基因定位的目的。因其具有灵敏度高、特异性强、定位准确、快速有效、安全直观等特点而被应用于很多领域。自从Rayburn等[2]于1985年首次将原位杂交技术应用于植物染色体研究后，该技术便在植物学研究中得到了广泛的应用。主要是由于以下几方面的原因：①FISH 的灵敏度接近同位素标记探针杂交[3-4]，在安全性，空间分辨率，速度和探针的稳定性等比放射性同位素标记探针杂交更具优越性；②运用不同荧光色素标记的探针可同时检测一个细胞核中2种或更多的核甘酸序列；③DNA 序列能被定位在目标范围从载玻片上分散的中期细胞染色体到悬浮固定保存细胞三维结构的间期核中[5]；④探针标记和荧光试剂从商业上可得，而且使FISH过程直接可靠；⑤荧光显微镜和数字成像系统在过去20 多年中不断改进；⑥特殊种属的全基因组，完整染色体，染色体亚区域或单拷贝序列能在多种探针混合运用情况下出现特异信号；⑦未标记的基因组DNA 通过探针预杂交抑制重复序列，对定位象柯斯质粒这样一类含大插入探针的特定序列是至关重要的。来。FISH技术的程序较复杂，主要流程包括染色体标本的制备，探针的制备、纯化与检测，染色体与探针的变性，原位杂交，杂交后洗脱，杂交信号的检测和放大，荧光显微镜观察、照相。 随着FISH 技术的不断发展，衍生了染色体原位抑制（CISS）技术、间期核FISH、引物原位标记或DNA 合成（PRINS）技术等，并且发展出M-FISH、3D-FISH、Rx-FISH 技术、CGH 以
FISH-荧光原位杂交实验（原位杂交） 1.实验目的 通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。 2. 实验原理 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。 杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。 3. 实验用具及材料
荧光原位杂交实验（FISH） 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。 1实验方法原理： 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。 杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III 类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-
荧光原位杂交技术（FISH）常见问答 对于FISH操作来说，那些因素比较重要？ 在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度；各种试剂pH是否符合要求直接关系到FISH的稳定性。 在夏季成功检测的同一探针和样本为什么在冬季就得不到理想的效果？ 发生上述现象最大的可能是FISH操作的环境温度发生了变化导致的。在我国，冬季普遍比夏季寒冷，低的环境温度使FISH得不到良好的杂交效率。此外，探针的保存不当也容易引起荧光素的萃灭而导致效果不佳。因此保证FISH操作中的温度非常重要。 该如何保证FISH操作中的温度？ 最佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作。如果是手工操作，首先要对FISH操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查，诸如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进行更换（疾病诊断中的探针要求温控精度在1度以内）。其次，要尽可能地保持操作环境温度在20度以上，对于在冬季进行的FISH 操作尤为重要。此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。同时检测的样本最好不能超过4块。操作中的行动一定要迅速。操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。特别是在冬季，盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多（10ul），因此事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标DNA的杂交效率。因此对上述小部件的预热也能有效地提高FISH的杂交效果。 使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号。但随后信号急剧衰减。几分钟后信号就消失了。这是探针本身的质量问题吗？ 在正常情况下，目前的商业化探针即使是杂交后，如果保存适当，荧光信号能保持半年以上。出现上述情况主要的原因是操作观察的过程中或是探针的保存过程中没有采取严格的避光措施。阳光或是强的灯光都会使荧光染料发生急剧的淬灭，从而造成了观察结果的不稳定。因此在操作和观察时，尽可能在暗室中操作。也可以在封片观察时加入一定的antifade（抗淬灭剂）以延缓荧光素的淬灭。 如何配制各种试剂呢？ 强烈建议使用去离子水配制各种所需的试剂。此外，配制后使用pH计检测是否符合要求。配制的各种试剂都要采用超纯级的要求。每次FISH使用新的试剂，旧的试剂最好弃置不用。洗脱液和变性液当天用当天配。 直标型探针和间标型探针有何不同？为什么我们要选择直标型探针？ 所谓的直标型探针是指DNA探针共价连接着荧光素基团；间标型探针则是指DNA探针先与某个半抗原连接，诸如生物素或地高辛，然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针－半抗原－荧光素基团，类似“三明治”的复合物。与间标型探针相比，直标型探针具有低背景、高特异性的特点。随着荧光染料和荧光检测技术的不断发展，直标型探针的灵敏度也不断提高。因而在FISH检测领域，尤其是在疾病分型领域，探针大多采用直标型设计。 我能对同一样本进行多次的FISH操作吗？ 在多数情况下，如果FISH操作没有得到正常的结果，我们可以将探针洗去，然后使用同样的探针进行再次的杂交。如果我们使用的是直标型探针，还可以使用不同探针对同一样本进行反复杂交。针对不同的样本，处理方法略有不同。
荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤 FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量。试验方法如下： 1）玻片处理 （a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。 （b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。 （c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。 （d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37℃、2h，室温 过夜)，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃过夜。称 量试剂勺也要干烤。塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进 行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC 水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。若为进口已处理的无RNase 和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。 （e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1mL/L DEPC水配制。 2）样品制备及其所涉及的试剂包括： （a）缓冲溶液 1×PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g， 溶入1000mL超纯水； 3×PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，
荧光原位杂交技术原理及操作步骤 1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。 1.原理 FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素.地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性.定量或相对定位分析。 2.实验流程 FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。 3.特点原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺
点是探针不稳定.自显影时间长.放射线的散射使得空间分辨率不高.及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点: 1.荧光试剂和探针经济.安全； 2.探针稳定，一次标记后可在两年内使用； 3.实验周期短.能迅速得到结果.特异性好.定位准确； 4.FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当； 5.多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列； 6.既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。 缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。 4.应用该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性.定量.整合.表达等方面的研究中颇具优势。 荧光原位杂交FISH操作规程 一.主要试剂1变性液20SSC4mlddH2O8ml甲酰胺28ml2PBD液1000ml20SSC中加入 1.25gTween20
硕士学位论文 荧光原位杂交技术及其在环境领域内的应用 Fluorescence in situ hybridization technology and its application in the field of environment 作者姓名： ** 学科、专业：环境科学与工程 学号： ******** 指导教师： *** 完成日期： 2014/3/26 大连理工大学 Dalian University of Technology
大连理工大学硕士学位论文 摘要 荧光原位杂交（FISH）是现代分子生物学及基因工程中广泛应用的新技术，本文概述了FISH实验原理、实验流程以及技术问题等。总结了一些实验关键步骤的操作要点和注意事项，并对荧光原位杂交技术在环境微生物监测方面的应用做了综述。利用FISH 技术在环境样品上直接原位杂交，不仅可以测定不可培养微生物的形态特征及丰度，而且可原位分析它们的空间及数量分布。并且展望了FISH技术的未来。 关键词：荧光原位杂交技术；探针；环境微生物；监测 - I -
大连理工大学硕士学位论文格式规范 Abstract Fluorescence in situ hybridization （FISH）is a new technology which is widely used in modern molecular biology and genetic engineering. This article summarizes the experimental principle, process and technical issues of FISH .Also we summarize some operation points and matters needed attention of key steps, and review application of FISH in environmental microbe monitoring. Using FISH technology directly in the environmental samples, can not only measure the morphology and abundance of uncultured microorganisms, but also analyse their spatial distribution and quantity in situ. And look forward to the future of FISH. Key Words：Fluorescence in situ hybridization technology; Probe; Environmental microbes; monitoring - II -
荧光原位杂交的染色体分析（一）标本的制备 1．室温下，依次用70％、90％和100％的乙醇脱水5min。 2．空气干燥载玻片。 3．若短期使用，载玻片可在室温贮存数天。若载玻片要长期保存，应在室温下过夜使组织“老化”（aged），然后放入容器中，该容器密封于含干燥剂的塑料袋内，－70℃保存。根据作者的经验，在6个月内使用的载玻片可贮存在－20℃。在杂交实验之前解冻这些载玻片，不提倡反复冻融载玻片。 （二）缺口平移法标记探针 通过缺口平移法生物素（酰）化DNA探针 1．结合：2μg探针DNA，10μl 10×反应缓冲液，10μl β－巯基乙醇，10μl 核苷酸母液（含0.5mmol/L dATP, 0.5mmol/L dCTP, 0.5mmol/L dGTP, 0.5mmol/L生物素-16-dUTP和0.12mmol/L dTTP），20单位DNA聚合酶I和 1：1000稀释的DNase I，加双蒸水至100μl（最后加酶）。 2．在15℃温育2h。 3．置反应混合物于冰浴直至反应产物的大小被确定。 4．凝胶电泳检测探针分子的长度：取10μl反应混合物，加入凝胶上样缓冲液，水浴箱中煮沸2～3分钟使其变性，冰浴3min，上样到1～2％的琼脂糖微型凝胶中，并以适当大小的标准品做对照，以50V/cm电泳3min。用浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭染胶，在紫外透照仪上显示DNA并拍照。 5．对于最佳的杂交条件，探针（可见一脱尾）应为100 ～500nt。根据电泳结果进行下述步骤： a.如果探针大小在期望的范围内，进行步骤6。 b.如果探针太大，可加入更多的DNase I，在15℃温育。 c.如果探针未完全消化，纯化探针并重复缺口平移法。 d.如果探针太短，用较少的DNase重复反应。 6．为使DNase失活，加入2μl 0.5mol/L EDTA和1μl SDS，在68℃加热10min。
实验四荧光原位杂交实验 一、实验目的 1.掌握核酸杂交的基本原理、过程和操作； 2.熟练掌握荧光显微镜的使用方法； 3.掌握Image J软件进行图像融合的方法； 4.理解荧光原位杂交技术的应用。 二、实验原理 核酸杂交是以碱基互补为基础、以双链核酸分子在特定条件下的变性和复性为手段，对核酸分子进行定性和定量检测。两条互补的核苷酸单链在特定条件下退火形成异质双链；应用荧光标记的探针与待检测材料中的单链核酸进行特异性结合，形成可悲检测的杂交双链核酸。在显微镜下观察并记录结果。 本实验所用探针是位点特异性标记探针GSP myc，是由SpectrumOrange （552/576）直接标记的荧光DNA探针，长度为200bp，能识别8号染色体的着丝粒部位的α卫星序列。 三、实验器材和试剂 防脱载玻片（premiere公司），医用砂轮，20×20mm盖玻片，橡皮胶，平板加热器，杂交盒，恒温水浴锅，玻璃染色缸，香柏油，荧光显微镜拍照系统，MYC基因扩增检测试剂盒。 四、实验步骤 1.样品处理 1）取细胞培养悬液5ml（107 cell）,2000rpm离心5min，去上清； 2）加入10ml的0.075M KCl，吹打混匀，静置3min； 3）37℃水浴箱低渗30min； 4）加固定液2ml，吹打混匀，室温预固定10min； 5）2000rpm离心5min，去上清； 6）沉淀加固定液5~10ml，吹打混匀，-20℃冰箱静置30min； 7）2000rpm离心5min，去上清。 2.制片 1）取一张干净的载玻片，用砂轮在背面划“一”标记，尽量在中间或靠下
端标记； 2）加50ul固定液重悬细胞，取4ul悬液滴加到载玻片上的标记位置，室温晾干； 3）平板加热器上烤片，60℃30min，显微镜下观察细胞密度； 4）PBS洗涤3min； 5）1%多聚甲醛室温固定10min； 6）PBS洗涤3min； 7）70%、90%、100%梯度乙醇脱水2min； 8）取出玻片，室温晾干。 3.样品和探针同时变性，杂交 1）取出杂交液，混匀，瞬离； 2）加10ul杂交液到杂交区域，迅速盖上盖玻片，轻压使杂交液均匀分布，赶走气泡； 3）用橡皮胶沿盖玻片边缘封片； 4）平板加热器上78℃变性3min，放入湿盒； 5）37℃温箱中杂交10~18h。 4.杂交后洗涤 1）将载玻片取出，轻轻撕去橡皮胶； 2）载玻片放入2×SSC中，1min左右微微晃动，以移去盖玻片，37℃水浴10min，不时上下晃动载玻片； 3）取出载玻片，37℃，0.1%NP-40/2×SSC中6min； 4）取出玻片，70%，90%，100%乙醇各2min脱水； 5）取出玻片，暗处自然晾干。 5.DAPI复染细胞核 室温滴加10ul DAPI复染剂到盖玻片，载玻片目标区域朝下，请放于盖玻片上，轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察。 6.荧光显微镜观察拍照 出现2G2O的细胞计为FISH阴性细胞，出现≥3O的细胞计为FISH阳性细胞。 7.Image J进行图片融合处理
荧光原位杂交（FISH ） 实验原理 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH ）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA 分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。 杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III 类的探针，其杂交靶位常大于1Mb ，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记DNA 探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp 的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。 实验用具及材料 相关溶液的配制 1）20×SSC ：175.3g NaCl ，88.2g 柠檬酸钠，加水至1000mL （用10mol/L NaOH 调pH 至7.0）。 2）去离子甲酰胺（DF ）：将10g 混合床离子交换树脂加入100mL 甲酰胺中。电磁搅拌30min ，用Whatman l 号滤纸滤。 3）体积分数70％甲酰胺/2×SSC ：35mL 甲酰胺，5mL 20×SSC ，10mL 水。 4）体积分数50％甲酰胺/2×SSC ：100mL 甲酰胺，20mL 20×SSC ，80mL 水。 5）体积分数50％硫酸葡聚糖（DS ）：65o C 水浴中融化，4o C 或-20o C 保存。 6）杂交液：8μL 体积分数25％DS ，20μL 20×SSC 混合。（或40μL 体积分数50％DS ，20μL 20×SSC ，40μL 材料及试剂 人的MyoD1（MYF3）基因探针 人外周血中期染色体细胞标本 指甲油 甲酰胺 氯化钠 柠檬酸钠 氢氧化钠 吐温20 用具 恒温水浴锅 培养箱 染色缸 载玻片 Nikon E-400荧光显微镜 盖玻片 封口膜 200μL 移液器 暗盒