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蛋白质分离纯化及鉴定综合实验

蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验

蛋白质分离纯化及鉴定综合实验

一、实验内容

将昆虫总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二纳/磷酸二氢纳缓冲液中,离心取上清液作为蛋白质粗提液

用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度;

将粗提液通过Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离,分部收集流出物,得到不同的组分,测定不同组分的蛋白质浓度;

将蛋白粗提液和收集到的各组分进行SDS—PAGE分析,比较粗提液和各组分中蛋白质的成分,分析分离效果。

二、实验过程:

1.蛋白质粗提液制备

溶液配制:0.1mol/L pH7.4 磷酸缓冲液

(1)1000ml 0.1mol/L磷酸氢二纳;磷酸氢二纳溶于800mL蒸馏水中,定容至1L;

(2)250mL

2.蛋白质浓度测定

(1)溶液配制

1mg/mL 牛血清白蛋白(BSA)标准溶液:5mg牛血清白蛋白溶于5ml水中;考马斯亮蓝G-250蛋白试剂:称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 90%的乙醇溶液中,加入85%的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1000mL,滤纸过滤,避光保存。

(2)0~100ug/mL标准曲线测定:

取6支试管,按下表配制蛋白质浓度梯度各2mL

蛋白质浓度

0 20 40 60 80 100

μg/ml

1mg/mL BSA溶

0 40 80 120 160 200

液(μl)

蒸馏水(μl)2000 1960 1920 1880 1840 1800

总体积(μl)2000 2000 2000 2000 2000 2000

测定各个浓度的标准溶液595nm吸光值(OD595):500uL蛋白质溶液与2.5mL 考马斯亮蓝G250溶液混匀,用分光光度计测定OD595,每个溶液3次重复测定。以OD595值(3次重复的平均值)为X,蛋白浓度为Y做直线,得出标准曲线Y=aX+b,R=?。

(3)测定粗提液蛋白浓度,将粗提液用蒸馏水稀释100倍(2mL),取稀释液500uL与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀,用分光光度计测定OD595,以500uL 蒸馏水+2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀作为空白对照,3次重复测定,用平均值计算其浓度。

3、Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离

(1)凝胶溶胀:将固体凝胶在一定量的沸水浴中溶胀5h,溶胀后倾去上清液,加入一定量的蒸馏水搅拌,静置使凝胶下沉,倾去上清液,直至无细小颗粒为止。

(2)装柱:蒸馏水冲洗柱子,留少量蒸馏水,打开活塞,将悬浮于水中的凝胶连续灌入柱中,直至凝胶沉淀至柱的4/5体积处。

(3)平衡:用10倍于柱床体积的0.1mol/L pH7.4的磷酸缓冲液洗柱,是柱中的离子环境和样品中的一致。

(4)上样:柱床表面液体正好达到凝胶表面,关闭活塞,将蛋白粗提液(留过20uL供电泳用)缓慢加到凝胶表面,注意不能把凝胶冲起来

(5)收集:打开活塞,使样品流下,样品完全进入凝胶后,缓慢加入0.1mol/L pH7.4的磷酸缓冲液(注意不能把凝胶冲起来)使样品继续流出,分部收集流出物,第一管收集1mL,以后每管收集200uL,共收集6管。

(6)稀释20倍,测定每个组分的蛋白浓度,可只测定一个OD595值,计算各组分的蛋白浓度。

4.SDS—PAGE

溶液配制:

100ml 30%凝胶储液(arc/bis):29.2g丙烯酰胺和0.8g甲叉双丙烯酰胺溶于80ml 蒸馏水中,定容至100ml,避光保存。(该溶液有神经毒性,避免接触皮肤);100mL 1.5M Tris-HCl 三(羟甲基)氨基甲烷,pH8.8:18.15gTris 碱溶于60mL 蒸馏水中,用HCl调pH至8.8,定容至100ml蒸馏水中;

100ml 0.5M Tris-HCl(缓冲液),pH6.8:6gTris 碱溶于60ml蒸馏水中,用HCl 调pH值至6.8,定容至100ml蒸馏水中;

10ml上样缓冲液:0.5ml ddH2O(重蒸水,经过两次蒸馏的水)+ 2.5ml of 0.5M Tris-HCl, pH6.8 + 2ml 甘油+ 4ml 10% SDS(十二烷基硫酸钠)+77.1mg DTT (二硫苏糖醇)+1ml 0.05(W/V)溴酚蓝;

600ml 5×电泳缓冲液(?):9g Tris碱+43.2g甘氨酸+3gSDS,蒸馏水溶解定容至600ml;

1ml 10%过硫酸铵溶液(现用现配):0.1g过硫酸铵溶于1ml蒸馏水中。

1000ml固定液:取908ml 50%的甲醇和92ml冰乙酸混匀;

500ml染色液:0.25g考马斯亮蓝R(G?)250,加500ml固定液溶解,过滤后避光保存;

1000ml脱色液:取75ml冰乙酸和50ml甲醇,加蒸馏水定容至1000ml。

凝胶制备

7.5%分离胶(20ml)

10%SDS 0.2ml

ddH2O 11.87ml

10%的AP(过硫酸铵溶液)0.1ml

TEMED(.四甲基乙二胺)10μl

30% arc/bis 5ml

1.5M pH8.8 Tris-HCl

2.5ml

4%浓缩胶(10ml)

ddH2O 6ml

30% arc/bis 1.3ml

0.5MpH6.8Tris-HCl 2.5ml

10%SDS 0.1ml

10%的AP 0.05ml

TEMED 5μl

灌胶:将电泳板组装好,先灌分离胶至2/3处,水封,分离胶凝固后,吸去水,灌入浓缩胶至满,插入梳子,注意不要产生气泡,待胶凝固后,拔去梳子。

样品准备:

分子量Marker、100μg粗提液、100μg分离组分与样品缓冲液混合(哪种,混合比例),煮沸3min,作为电泳样品上样。

电泳装置安装:安好后在正负极分别加入稀释好的电极缓冲液。

上样:将处理好的样品分别加入样品孔中,记好加样顺序。

电泳:接好电泳仪,通电,先恒压80V电泳,溴酚蓝前沿到达分离胶界面时,加大电压至120V继续电泳,直到溴酚蓝前沿到达凝胶底部,结束电泳。

剥胶:拆开电泳装置,取出玻璃板,看清点样方向,从玻璃板的一角撬起,凝胶留在长板上,在右下角切角作标记,用固定液冲下凝胶。

固定:将凝胶放在大培养皿中,用固定液固定1h;

染色:倒去固定液,加入染色液,染色1h,

脱色:倒去染色液,加入脱色液进行脱色,直至看清条带。

凝胶拍照。

三、实验结果

1、各组分蛋白浓度

2、电泳结果

四、分析讨论

分离效果如何?实验设计如何改进?

总黄酮

生物总黄酮是指黄酮类化合物,是一大类天然产物,广泛存在于植物界,是许多中草药的有效成分。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇,其它包括双氢黄(醇)、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等。

简介

近年来,由于自由基生命科学的进展,使具有很强的抗氧化和消除自由基作用的类黄酮受到空前的重视。类黄酮参与了磷酸与花生四烯酸的代谢、蛋白质的磷酸化、钙离子的转移、自由基的清除、抗氧化活力的增强、氧化还原作用、螯合作用和基因的表达。它们对健康的好处有:( 1 )抗炎症( 2 )抗过敏( 3 )抑制细菌( 4 )抑制寄生虫( 5 )抑制病毒( 6 )防治肝病(7 )防治血管疾病(8 )防治血管栓塞(9 )防治心与脑血管疾病(10 )抗肿瘤(11 )抗化学毒物等。天然来源的生物黄酮分子量小,能被人体迅速吸收,能通过血脑屏障,能时入脂肪组织,进而体现出如下功能:消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能、抗脂肪氧化、抗衰老。近年来国内外对茶多酚、银杏类黄酮等的药理和营养性的广泛深入的研究和临床试验,证实类黄酮既是药理因子,又是重要的营养因子为一种新发现的营养素,对人体具有重要的生理保健功效。目前,很多著名的抗氧化剂和自由基清除剂都是类黄酮。例如,茶叶提取物和银杏提取物。葛根总黄酮在国内外研究和应用也已有多年,其防治动脉硬化、治偏瘫、防止大脑萎缩、降血脂、降血压、防治糖尿病、突发性耳聋乃至醒酒等不乏数例较多的临床报告。从法国松树皮和葡萄籽中提取的总黄酮" 碧萝藏"-- (英文称PYCNOGENOL )在欧洲以不同的商品名实际行销应用25 年之久,并被美国FDA 认可为食用黄酮类营养保健品,所报告的保健作用相当广泛,内用称之为" 类维生素" 或抗自由基营养素,外用称之为" 皮肤维生素" 。进一步的研究发现碧萝藏的抗氧化作用比VE 强50 倍,比VC 强20 倍,而且能通过血脑屏障到达脑部,防治中枢神经系统的疾病,尤其对皮肤的保健、年轻化及血管的健康抗炎作用特别显著。在欧洲碧萝藏已作为保健药物,在美国作为膳食补充品(相当于我国的保健食品),风行一时。随着对生物总黄酮与人类营养关系研究的深入,不远的将来可能证明黄酮类化合物是人类必需的微营养素或者是必需的食物因子。性状:片剂。

功能主治与用法用量

功能主治:本品具有增加脑血流量及冠脉血流量的作用,可用于缓解高血压症状(颈项强痛)、治疗心绞痛及突发性耳聋,有一定疗效。用法及用量:口服:每片含总黄酮60mg,每次5片,1日3次。

不良反应与注意

不良反应和注意:目前,暂没有发现任何不良反应.

洛伐他丁

【中文名称】:洛伐他丁

【英文名称】:Lovastatin

【化学名称】:(S)-2-甲基丁酸-(1S,3S,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氢-3,7-二甲基

-8-[2-(2R,4R)-4-羟基-6氧代-2-四氢吡喃基]-乙基]-1-萘酯

【化学结构式】:

洛伐他丁结构式

【作用与用途】洛伐他丁胃肠吸收后,很快水解成开环羟酸,为催化胆固醇合成的早期限速酶(HMG -coA还原酶)的竞争性抑制剂。可降低血浆总胆固醇、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白的胆固醇含量。亦可中度增加高密度脂蛋白胆固醇和降低血浆甘油三酯。可有效降低无并发症及良好控制的糖尿病人的高胆固醇血症,包括了胰岛素依赖性及非胰岛素依赖性糖尿病。

【用法用量】口服:一般始服剂量为每日20mg,晚餐时1次顿服,轻度至中度高胆固醇血症的病人,可以从10mg开始服用。最大量可至每日80mg。

【注意事项】①病人既往有肝脏病史者应慎用本药,活动性肝脏病者禁用。②副反应多为短暂性的:胃肠胀气、腹泻、便秘、恶心、消化不良、头痛、肌肉疼痛、皮疹、失眠等。③洛伐他丁与香豆素抗凝剂同时使用时,部分病人凝血酶原时间延长。使用抗凝剂的病人,洛伐他丁治疗前后均应检查凝血酶原时间,并按使用香豆素抗凝剂时推荐的间期监测。

他汀类药物

他汀类药物(statins)是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA)还原酶,阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径,使细胞内胆固醇合成减少,从而反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)受体数量和活性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低。他汀类药物还可抑制肝脏合成载脂蛋白B-100,从而减少富含甘油三酯AV、脂蛋白的合成和分泌。他汀类药物分为天然化合物(如洛伐他丁、辛伐他汀、普伐他汀、美伐他汀)和完全人工合成化合物(如氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗伐他汀、pitavastatin)是最为经典和有效的降脂药物,广泛应用于高脂血症的治疗。他汀类药物除具有调节血脂作用外,在急性冠状动脉综合征患者中早期应用能够抑制血管内皮的炎症反应,稳定粥样斑块,改善血管内皮功能。延缓动脉粥样硬化(AS)程度、抗炎、保护神经和抗血栓等作用。

结构比较

辛伐他汀(Simvastatin)是洛伐他汀(Lovastatin)的甲基化衍化物。美伐他汀(Mevastatin,又称康百汀,Compactin)药效弱而不良反应多,未用于临床。目前主要用于制备它的羟基化衍化物普伐他汀(Pravastatin)。

体内过程

洛伐他汀和辛伐他汀口服后要在肝脏内将结构中的其内酯环打开才能转化成活性物质。相对于洛伐他汀和辛伐他汀,普伐他汀本身为开环羟酸结构,在人体内无需转化即可直接发挥药理作用,且该结构具有亲水性,不易弥散至其他组织细胞,极少影响其他外周细胞内的胆固醇合成。除氟伐他汀外,本类药物吸收不完全。除普伐他汀外,大多与血浆蛋白结合率较高。

用药注意

大多数患者可能需要终身服用他汀类药物,关于长期使用该类药物的安全性及有效性的临床研究已经超过10年。他汀类药物的副作用并不多,主要是肝酶增高,其中部分为一过性,并不引起持续肝损伤和肌瘤。定期检查肝功能是必要的,尤其是在使用的前3个月,如果病人的肝脏酶血检查值高出正常上线的3倍以上,应该综合分析病人的情况,排除其他可能引起肝功能变化的可能,如果确实是他汀引起的,有必要考虑是否停药;如果出现肌痛,除了体格检查外,应该做血浆肌酸肌酸酶的检测,但是横纹肌溶解的副作用罕见。另外,它还可能引起消化道的不适,绝大多数病人可以忍受而能够继续用药。

红曲米

天然降压降脂食品——红曲米

红曲红曲米又称红曲、红米,主要以籼稻、粳稻、糯米等稻米为原料,用红曲霉菌发酵而成,为棕红色或紫红色米粒。

红曲米是中国独特的传统食品,其味甘性温,入肝、脾、大肠经。早在明代,药学家李时珍所著《本草纲目》中就记载了红曲的功效:营养丰富、无毒无害,具有健脾消食、活血化淤的功效。上世纪七十年代,日本远藤章教授从红曲霉菌的次生级代谢产物中发现了能够降低人体血清胆固醇的物质莫纳可林K(Monacolin-k )或称洛伐他汀,(Lovastatin),引起医学界对红曲米的关注。1985 年,美国科学家Goldstein 和Brown 进一步找出了Monacolin-k 抑制胆固醇合成的作用机理,并因此获得诺贝尔奖,红曲也由此名声大噪。

红曲米的医疗保健功效如下:

1.降压降脂:研究表明,红曲米中所含的Monacolin-K 能有效地抑制肝脏羟甲基戊二酰辅酶还原酶的作用,降低人体胆固醇合成,减少细胞内胆固醇贮存;加强低密度脂蛋白胆固醇的摄取与代谢,降低血中低密度脂蛋白胆固醇的浓度,从而有效地预防动脉粥样硬化;抑制肝脏内脂肪酸及甘油三酯的合成,促进脂质的排泄,从而降低血中甘油三酯的水平;升高对人体有益的高密度脂蛋白胆固醇的水平,从而达到预防动脉粥样硬化,甚至能逆转动脉粥样硬化的作用。

2.降血糖:远藤章教授等人曾直接以红曲菌的培养物做饲料进行动物试验,除确定含有红曲物的饲料可以有效地使兔子的血清胆固醇降低18%~25%以上外,又发现所有试验兔子在食入饲料之后的0.5 小时内血糖降低23%~33%,而在 1 小时之后的血糖量比对照组下降了19%~29%。说明红曲降糖功能显著。

3.防癌功效:红曲橙色素具有活泼的羟基,很容易与氨基起作用,因此不但可以治疗胺血症且是优良的防癌物质。

4.保护肝脏的作用:红曲中的天然抗氧化剂黄酮酚等具有保护肝脏的作用。

压乐胶囊

压乐胶囊成分

压乐胶囊”唯一成分“红曲酵素”大纪事

1970:红曲米提取6种他汀,制成降脂药世界第一红曲,是寄生在红曲米上,发酵提取

压乐胶囊

的活性生物菌。70年代日本科学家远藤根据《本草纲目》上记载红曲的“活血”功效的启示,从红曲营养液中分离出优良的6种含胆固醇抑制剂和甘油三酯分解剂的红曲菌,被命名为“莫纳可林”即“他汀类”,此后30多年来,红曲米提取的“他汀”被世界医学界公认为最好的降脂药,在临床上大量使用。

2002:降压史上历史性突破----6种他丁+2种红曲降压素=“红曲酵素”2002年,震惊世界的生物领域重大发明,红曲中的降糖、降压、抗癌成分(GABA-GLUCOSAMINE)通过发酵提取,在原来6种他丁的基础上合成“红曲酵素(Monacolin-R),经大量的临床试验,这种复合酵素不仅保留了生物他丁的降脂功效,而且它的降血压效果堪比任何药物,《药日新闻》撰文品论,红曲酵素的出现,将开辟降压药新时代。

2008:6年临床证实“红曲酵素”降血压、治心脑、防猝死、能停药随后的6年,5万名高血压患者临床运用证实:“红曲酵素”对调理器官微血循环、帮助血液进行重新分配,迅速降压,修复受损心脑肝肾作用显著。而且“红曲酵素”降压同时、养心、护脑、清肝、活肾的功效,达到了降压药的顶峰!“红曲酵素”也被世界医学界誉为“可以媲美青霉素的旷世发现!”“红曲酵素”摘取美国医学界最高荣誉“拉斯克奖”“红曲酵素”的发现者日本Biopharm研究所所长远藤章(74岁),因此项发明被授予美国医学界最高荣誉“拉斯克奖”,纽约市长布隆博格将颁奖理由归结于“数千万

人因此得以延长生命!”

通知

各地消费者:

为了打击假冒伪劣产品,保护消费者利益,公司从2011年4月起,正式委托国家GMP认证企业吉林市隆泰参茸制品有限责任公司生产我公司产品《压乐牌鑫康延平胶囊》(以下简称压乐)。

按照国家规定,《压乐》产品盒子和说明书做以下相应调整:

1.委托生产企业由原来的“山西天特鑫保健食品有限公司”,

改为“吉林市隆泰参茸制品有限责任公司”。

2.生产地址由原来的“山西省大同县马连庄”,改为“吉林

省桦甸市经济开发区”。

3.产品企业标准由“Q140200TTX009-2010”改为“Q/HDLTS.

09-2011”.

4.卫生许可证由“晋卫食证字(2007)140000-110039号”,

改为吉卫食证字(2008)第220282-SC4348号。

5.增加了食品流通许可证号SP1101051010090481(1-1)。

6.盒子上增加了“数码钞票花纹防伪”技术,包装上的花纹

清晰,仔细观看,花纹中间有“压乐”字样。

北京鑫康胜生物技术开发有限公司

2011年4月6日

本店郑重声明:不卖假货!

每天解释防伪码的问题真的很累!请顾客买之前先看完。厂家因为不让在网上出售,所以我们的防伪码都要刮掉,那个防伪码对于顾客来讲是查询真伪用的,但是对于代理来讲是厂家用来查串货用的,所以我们网上出售一定要撕掉,希望您理解!如果您不能接受的话,请不要拍,免得没有必要的麻烦!以后凡是因为防伪码被撕申请退货的顾客,本店一律不支持!请您考虑好了再拍!~

我们盒子上的防伪挖掉了一部分,是查不了的,因为厂家严查网上低价串货,厂家可以从防伪数字查出货源,不能接受的请不要拍!绝对正品,收到可以试用几天满意在确认,不满意可以全额退款!

谁能详细给我介绍一下药品串货。谢谢!浏览次数:697次悬赏分:0 | 解决时间:2010-9-12 16:15 | 提问者:yanyecc

最佳答案药品串货是一种违规操作。一般来说药品的经营,在地方都是有代理商,代理商是负责独家供货,而药品的生产厂家也会给予市场保护,每个地区不能出现同样品种的经营代理商。串货是指通过厂家发货到其他的地方,再把药品流通到有生产厂家代理商的地方市场去销售,形成了市场冲撞!分享给你的朋友吧:

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回答时间:2010-9-2 22:29

药品串货对药厂有什么害处浏览次数:607次悬赏分:0 | 解决时间:2010-10-22 11:52 | 提问者:匿名最佳答案首先明确什么是串货。

串货的种类有以下3种:

1.良性串货:厂商在市场开发的初期,有意或者无意地选中了市场中流通性强的经销商,使其产品迅速流向市场空白区域和非重要区域。

2.恶性串货:经销商为了获得非正常利润,蓄意向自己辖区外的市场倾销商品。

恶意串货形成的5个大的原因:

1.市场饱和;

2.厂商给予的优惠政策不同;

3.通路发展的不平衡;

4.品牌拉力过大而通路建设没跟上;

5.运输成本不同导致经销商投机取巧。

对厂家来说:——害处

可追溯性差,出了事搞不清状况。

价格体系混乱长远看影响品牌发展。

消费者得不到应有保证,经销商受到打击,不利于渠道建设。

当然也有好处。所以窜货屡禁不止

这里学问不小,可以慢慢交流。

新浪微博

回答时间:2010-10-22 10:20 | 我来评论

压乐胶囊”唯一成分“红曲酵素”大纪事

1970:红曲米提取6种他汀,制成降脂药世界第一

红曲,是寄生在红曲米上,发酵提取的活性生物菌。70年代日本科学家远藤根据《本草纲目》上记载红曲的“活血”功效的启示,从红曲营养液中分离出优良的6种含胆固醇抑制剂和甘油三酯分解剂的红曲菌,被命名为“莫纳可林”即“他汀类”,此后30多年来,红曲米提取的“他汀”被世界医学界公认为最好的降脂药,在临床上大量使用。

2002:降压史上历史性突破----6种他丁+2种红曲降压素=“红曲酵素”

2002年,震惊世界的生物领域重大发明,红曲中的降糖、降压、抗癌成分(GABA-GLUCOSAMINE)通过发酵提取,在原来6种他丁的基础上合成“红曲酵素(Monacolin-R),经大量的临床试验,这种复合酵素不仅保留了生物他丁的降脂功效,而且它的降血压效果堪比任何药物,《药日新闻》撰文品论,红曲酵素的出现,将开辟降压药新时代。

2008:6年临床证实“红曲酵素”降血压、治心脑、防猝死、能停药

随后的6年,5万名高血压患者临床运用证实:“红曲酵素”对调理器官微血循环、帮助血液进行重新分配,迅速降压,修复受损心脑肝肾作用显著。而且“红曲酵素”降压同时、养心、护脑、清肝、活肾的功效,达到了降压药的顶峰!“红曲酵素”也被世界医学界誉为“可以媲美青霉素的旷世发现!”

?“红曲酵素”摘取美国医学界最高荣誉“拉斯克奖”

“红曲酵素”的发现者日本Biopharm研究所所长远藤章(74岁),因此项发明被授予美国医学界最高荣誉“拉斯克奖”,纽约市长布隆博格将颁奖理由归结于“数千万人因此得以延长生命!”

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肌缺血等症状明显好转,可减少服用量。

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蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤: (一)材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有: 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二)蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。(三)蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法: 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质。此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度。 (四)样品的进一步分离纯化

蛋白质的分离纯化和表征

蛋白质的分离纯化和表征 第一节蛋白质的酸碱性质 各个解离基团的pK 值与游离氨基酸的不完全相同。等电点要用等电聚焦等方法测定。 第二节蛋白质分子的大小与形状

一、根据化学组成测定最低相对分子质量 假定某种微量成分只有一个,测出其百分含量后,可用比例式算出最低相对分子质量。 若测出两种微量成分的百分含量,分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时,可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。 例题:一种纯酶含亮氨酸(Mr 131)1.65%,含异亮氨酸(Mr131)2.48%,求最低相对分子质量。 解:按照Leu 的百分含量计算,最低Mr X1: X1=(100′ 131)/1.65=7939.4。 按照Ile 的百分含量计算最低Mr X2: X2=(100′ 131)/2.48=5282.3。 由于X1 和X2 数字差异较大,提示这种酶含Leu 和Ile 不止1 个,为了估算Leu 和Ile 的个数,首先计算: X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5。 这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数,说明该酶至少含有2 个Leu,3 个Ile,其最低相对分子质量为: 7939.4 ′2 =15878.8或5282.3×3=15846.9。 二、渗透压法测定相对分子质量 三、沉降分析法测定相对分子质量

基本原理: (一)离心力(centrifugal force,Fc) 当一个粒子(生物大分子或细胞器)在高速旋转下受到离心力作用时,此离心力“Fc”由下式定义: F=m·a=m·ω2 r a—粒子旋转的加速度,m—沉降粒子的有效质量,ω—粒子旋转的角速度,r—粒子的旋转半径(cm)。 (二)相对离心力(relative centrifugal force,RCF) 由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同,离心力而受变化,因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力,只要RCF 值不变,一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。 RCF 就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。

蛋白质纯化的方法选择

蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展,越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术,并研制成套试剂盒,使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的,分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物,以研究其生物学作用,或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说,分子克隆的下游工作显得更难,蛋白纯化工作非常复杂,除了要保证纯度外,蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白,重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败,因为后者要求规模化,且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性,以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异,利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染,而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异,利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开,由于此时样本体积大、成分杂,要求所用的树脂高容量、高流速,颗粒大、粒径分布宽.并可以迅速将蛋白与污染物分开,防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率,此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来,要用更小的树脂颗粒以提高分辨率,常用离子交换柱和疏水柱,应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性,柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力,洗脱峰越窄,柱效越好。仅有好的选择性,洗脱峰太宽,蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2.1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸,在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低,蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐,因为它在冷的缓冲液中溶解性好,冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步,它可以初步粗提蛋白质,去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定,可以短期在这种状态下保存中间产物,当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题,硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题,但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来,PEG是一种惰性物质,同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果,在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度,蛋白沉淀可通过离心或过滤获得,蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法,因为它只能达到几倍的纯化效果,而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2.2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度,但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来,毫无疑问蛋白是处在高盐环境中,需要想办法脱盐,可用的方法有利用半透膜透析,通过勤换透析液体去除盐分,此法尚可,但需几个小时,通常要过夜,也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间,板的一侧加缓冲液,另一侧加需脱盐的蛋白溶液,并在蛋白溶液一侧通过泵加压,可以使两侧溶液在数小时内达到平衡,若增加对蛋白溶液的压力,还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱,柱内的填料是小孔径的颗粒,蛋白分子不能进入孔内,先于高浓度盐离子从柱中流出,从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失,缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上,剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2.3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用,通过选择不同的缓冲液,同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂(能结合带负电荷的分子)结合,也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种:二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂;羧甲基用于弱的阳离子交换树脂;季铵用于强阴离子交换树脂;甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成,氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH(pH6~8)下带负电荷,需用阴离子交换柱纯化,极端的pH下蛋白会变性失活.应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同,与树脂的结合力也不同,随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化,蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值,因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱,利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升,当离子强度能够中和蛋白的电荷时,蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制,所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比,离子交换特异性更好,有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果,树脂也比较便宜。值得一提的是,即便是用最精确控制的条件,仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白,还需要其他的纯化步骤。

蛋白质的分离纯化方法(参考资料)

蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最

蛋白质提取、纯化、鉴定的方法(二)

蛋白质提取、纯化、鉴定的方法(二) 一、层析技术 1.离子交换层析的亲和洗脱这种技术结合了离子交换与亲和层析。如在某一pH时,目的蛋白质带正(负)电荷,用阳(阴)离子交换剂吸附,这一过程去除了很大一部分不吸附的杂蛋自。然后用该目的蛋白质的配体来洗脱,该配体特异性地结合目的蛋白质并使之洗脱,但不洗脱其他吸附的蛋白质,达到纯化的目的。注意,该配体需带有一定量的阴(阳)电荷,有效降低目的蛋白质与阳(阴)离子交换剂之间的电荷相互作用。 2.固相金属亲和层析重组蛋白质可在C-或N-端引入组氨酸标签,一般为6个组氨酸残基(His-tag)。这些组氨酸残基与过渡金属(transitionalmetals)Ni2+或Co2+形成配位键。用固相化的Ni2+或Co2+(如商品化的树脂,Ni-NTA)可吸附带有His-tag的重组蛋白质,用含有咪唑(imidazole)的缓冲液可洗脱重组蛋白质。注意,有些含有较多组氨酸的蛋白质也可与吸附剂结台,但较弱,因此可用低浓度的咪唑洗脱;在层析过程中不能引入金属螯合剂如EDTA;避免使用还原剂如DTT或DTE,但可用低浓度的巯基乙醇。 该技术也用于提取磷酸化的蛋白质。将螫合剂交联到树脂,螯合三价铁或三价镓,该亲和吸附剂可吸附混合物中的磷酸化的蛋白质。洗去不吸附的非磷酸化蛋白质后,用磷酸缓冲液即可将磷酸化蛋白质从该亲和吸附剂上洗脱。要注意的是酸性蛋白质也可被不同程度地吸附。 3.凝胶过滤该技术过去也被称为分子筛。构成凝胶的小珠(bead)中有大小不一的孔,分子量大的分子能进入较大的孔而不能进入小的孔,分子量小的则不仅能进入较大的孔也能进入小的孔,因此在层析过程中,小分子经过的路程较长而大分子经过的路程较短,如此就可分离分子量不同的蛋白质。然而,分子量相近的蛋白质非常多,因此,用这种技术得到的蛋白质是分子量相近的混合蛋白质。然而这种技术在某些研究中很有用,如丙酮酸激酶M2(PKM2)由四个相同的亚基组成,PKM2在细胞中以三种形式存在——单体、二聚体、四聚体,这三种形式的功能不同,若要鉴定细胞中PKM2的各种形式的量,先用凝胶过滤技术分离细胞裂解液中的PKM2的三种形式,之后用Western blot对每一种形式的PKM2做相对定量。 4.反相层析该技术是指用疏水固相的一种层析技术。“反相”是相对“正相”而言,正相是指亲水的固相如硅胶表面带有硅羟基(silanol group),硅羟基可与被分离的化台物相互作用,被分离的化合物的亲水性越强,则滞留在正相

蛋白质分离与纯化教学设计课题

蛋白质分离与纯化教学设计 一、教学背景分析 【教材分析】 “蛋白质的分离与纯化”实验是《高中生物》选修1生物技术实践 5.3血红蛋白的提取与分离中的容。本节课的主要容包括蛋白质的提取、分离纯化等基本知识,主要要求学生掌握凝胶电泳的实验原理以及操作方法。“血红蛋白分离与纯化”实验不仅是学习血红蛋白的提取、分离纯化方法,而且也是进一步掌握蛋白质的组成、结构和功能的基础。 【学情分析】 到目前为止,学生已经学习了蛋白质的相关知识,对蛋白质有了一定的了解,“蛋白质的分离与纯化”实验目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取和纯化生物大分子的基本原理、过程和方法,虽然操作难度较大,但原理清晰,动手机会较多,学习兴趣很高。学生有必修“生命活动的主要承担者——蛋白质”的基础,在一定程度上掌握了蛋白质的组成、结构和功能等基础知识,学生在进行实验前还是能大概了解影响蛋白质分离纯化的因素的,再者经过老师的指导,实验能取得良好的结果的。 二、教学目标 【知识目标】 1.了解从血液中提取蛋白质的原理与方法。 2.说出凝胶电泳的基本原理与方法。 【能力目标】 运用凝胶电泳对蛋白质进行分离纯化。 【情感态度与价值观目标】 1.培养学生科学实验的观点。 2.初步形成科学的思维方式,发展科学素养和人文精神。 三、教学重难点

【教学重点】 从血液中提取蛋白质;凝胶电泳分离纯化蛋白质。 【教学难点】 样品预处理,色谱柱的装柱,纯化分离操作。 四、实验实施准备 【教师准备】 1.分组。学生按学科能力的强中弱平均分组,各组尽量平衡,各组自行分工,并由实验员统一安排实验过程。 2.实验材料:血液 仪器:试管、胶头滴管、烧杯、玻璃棒、离心机、研磨器、透析袋、电泳仪等。 试剂:20mmol/L磷酸缓冲液(pH为8.6)、蒸馏水、聚丙烯酸铵、生理盐水、5%醋酸水溶液等。 【学生准备】 1.预习实验“蛋白质分离纯化”,了解蛋白质的相关信息。 2.进行分组。 五、教学方法 【教法】分析评价法、任务驱动法、直观演示法 【学法】自主学习法、合作交流法 六、教学媒体 黑板、多媒体 七、课时安排 两个课时(80min) 一个课时用来讲述理论部分知识:样品处理与色谱柱分离纯化蛋白质的原理与方法; 另一课时用来进行实验。

分离纯化蛋白质的方法及原理

(二)利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有:1、溶液的pH;2、离子强度;3、介电常数;4、温度。但在同一的特定外部条件下,不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀:原理:蛋白质处于等电点时,其净电荷为零,由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时,他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时,蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥,阻止了单个分子聚集成沉淀,因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点,利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理,可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时,这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来,那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象,能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶:原理:低浓度时,中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后,带电层使蛋白质分子彼此排斥,而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强,因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出,这就是因为透析除去了盐类离子,使蛋白质分子之间的相互吸引增加,引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时,蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时,例如饱和或半饱和程度,很多蛋白质可以从水中沉淀出来,这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低,原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子,因此被移去以溶剂化盐离子,留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露,由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象,能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳,在水中的溶解度很高,而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法:与水互溶的有机溶剂(甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性,如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下,然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂,以防局部浓度过高,那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此控制有机溶剂浓度也可以分

蛋白表达、分离和纯化

蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定 来源:易生物实验浏览次数:2704网友评论0 条第一部分蛋白质的表达、分离、纯化克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理,同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作 结构与功能的研究。 第二部分蛋白质的鉴定电泳可用于分离复杂的蛋白质混合物,研究蛋白质的亚基组成等。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中,凝胶的孔径,蛋白质的电荷,大小,性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。 关键词:蛋白质蛋白质表达克隆基因聚丙烯酰胺凝胶电泳氯霉素酰基转移酶十二烷基硫酸钠SDS聚丙烯酰 胺凝胶 第一部分蛋白质的表达、分离、纯化 目的要求 (1)了解克隆基因表达的方法和意义。 (2)了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理,同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统,其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中,携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中,在37℃,IPTG诱导下,超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白,该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸(NTA)使镍离子(Ni2+)固相化的层析介质加以提纯,实为金属熬合亲和层析(MC AC)。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 试剂和器材

一、试剂 [1] LB液体培养基:Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. [2] 氨苄青霉素:100mg/mL [3] 上样 缓冲液:100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0 [4] Washing Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 [5] Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH 8.0 [6] IPTG 易生物仪器库:.ebioe./yp/product-list-42.html 易生物试剂库:.ebioe./yp/product-list-43.html 二、器材 摇床,离心机,层析柱(1′10 cm) 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中(含100ug/mL 氨苄青霉素),37℃震荡培养过夜。 2. 转接1mL过夜培养物于100mL(含100ug/mL 氨苄青霉素)LB液体培养基中,37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h.

实验十蛋白质的表达、分离纯化和鉴定

实验十蛋白质的表达、分离纯化和鉴定 第一部分蛋白质的表达、分离纯化 目的要求 (1)了解重组蛋白表达的方法和意义。 (2)了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 目的基因在宿主细胞中的高效表达及表达的重组蛋白的分离纯化对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理,同时目的基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统,其表达外源基因产物的水平远高于其它表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中,携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中,在37℃,IPTG诱导下,超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白,该蛋白N端带有6个连续的组氨酸残基,可通过固相化的镍离子(Ni2+)亲和层析介质加以分离纯化,称为金属熬合亲和层析(MCAC)。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 试剂和器材 一、试剂 [1] LB液体培养基:Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL。 [2] 氨苄青霉素:100mg/mL。 [3] 上样缓冲液(GLB):100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 1 mM β-巯基乙醇, pH8.0。 [4] 清洗缓冲液(UWB):100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3。 [5] 洗脱液缓冲液:100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 500 mM 咪唑, pH8.0。 [6] IPTG 二、器材 摇床,离心机,层析柱(1 10 cm),蠕动泵 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株于5mL

蛋白质的分离纯化方法

蛋白质的分离纯化方法 根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有 用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最

蛋白质纯化原理

蛋白质的纯化原理 一)根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有:(1)温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外,一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低,更容易盐析。(2)pH值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。(3)蛋白质浓度:蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升;0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻璃纸),用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短。 2、等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小,因而溶解度也最小,各种蛋白质的等电点有差别,可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀,但此法很少单独使用,可与盐析法结合用。 3、低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂,甲醇,乙醇或丙酮,可使多数蛋白质溶解度降低并析出,此法分辨力比盐析高,但蛋白质较易变性,应在低温下进行。 (二)根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 1、透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。 超滤法是利用高压力或离心力,强使水和其他小的溶质分子通过半透膜,而蛋白质留在膜上,可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。 2、凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析,这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶(Sephadex ged)和琼脂糖凝胶(agarose gel)。 (三)根据蛋白质带电性质进行分离 蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同,可将其分开。 1、电泳法 各种蛋白质在同一pH条件下,因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳,这是利用一种两性电解质作为载体,电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度,当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时,到达各自等电点的pH位置就停止,此法可用于分析和制备各种蛋白质。

蛋白质提取与纯化技术总结

蛋白质提取与纯化技术 选择材料及预处理 以蛋白质和结构与功能为基础,从分子水平上认识生命现象,已经成为现代生物学发展的主要方向,研究蛋白质,首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识,但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别,把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中,如盐析,有机溶剂提取,层析和结晶等;二是将混合物置于单一物相中,通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的,如电泳,超速离心,超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性,防止酸、硷、高温,剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段:选择材料和预处理,细胞的破碎及细胞器的分离,提取和纯化,浓细、干燥和保存。 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料,所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物,应注意它的生长期,在微生物的对数生长期,酶和核酸的含量较高,可以获得高产量,以微生物为材料时有两种情况:(1)得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等;(2)利用菌体含有的生化物质,如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳,脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同,其中所含生物大分子的量变化很大,另外与季节性关系密切。对动物组织,必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料,先进行绞碎、脱脂等处理。另外,对预处理好的材料,若不立即进行实验,应冷冻保存,对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。 蛋白质的分离纯化 一,蛋白质(包括酶)的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液,少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中,因些,可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 (一)水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋

蛋白质分离与纯化技术

化工学院生物工程一班胡冠南 3010207234 蛋白质分离与纯化技术 蛋白质(protein)是生命的物质基础,没有蛋白质就没有生命。因此,它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。所以研究蛋白质的结构与功能是研究生物科学的基础。蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。由于深入研究蛋白质的结构与功能需要用到高纯度的蛋白质,因此蛋白质分离与纯化技术是生物产业中的核心技术。然而该技术难度、成本均高;例如一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。所以对该项技术的改良与创新在实际应用中具有重要意义。 一.蛋白质分离的准备 从正常生物基质中提取各种蛋白质均需要有特定的条件。如果不能满足这一条件,蛋白将很快失去生物学活性,其生物半衰期也将迅速降低。因此,在蛋白质的特性研究中,确定提取条件是一个关键问题。在不同的实验中所通到的困难各不相同,有的困难是如何抵抗外源性蛋白酶的作用而维持蛋白质的稳定,在有些实验中的困难是如何维持酶的活性。在不同的实验中要针对不同的情况来解决不同的问题。然而对蛋白质研究而言却有着一些共同的参数。缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中pH值的改变,选择合适的缓冲液对于维持—定pH 值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性十分重要。pH和pKa是描述缓冲液的两个重要概念。pH值是指溶液中氢离子浓度的负对数,pH=-log(H+)。 pKa值是溶液中酸解离常数的负对数值。溶液的pH值与pKa值越接近表明溶液的缓冲能力越强,离pKa值越远则缓冲能力越弱。 表1 常用缓冲液的pKa值

蛋白质的提取与纯化

蛋白质的提取与纯化 一,蛋白质的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液,少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中,因些,可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 (一)水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,温度高利于溶解,缩短提取时间。但另一方面,温度升高会使蛋白质变性失活,因此,基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温(5度以下)操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制剂(如二异丙基氟磷酸,碘乙酸等)。 下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。 1、pH值 蛋白质,酶是具有等电点的两性电解质,提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时,应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化,从而导致蛋白质构象的不可逆变化,一般来说,碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 2、盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶,称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点,因此在提取液中加入少量NaCl等

中性盐,一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 (二)有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶,不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂,它们具的一定的亲水性,还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越,一是因为丁醇亲脂性强,特别是溶解磷脂的能力强;二是丁醇兼具亲水性,在溶解度范围内(度为10%,40度为6.6%)不会引起酶的变性失活。另外,丁醇提取法的pH及温度选择范围较广,也适用于动植物及微生物材料。 二、蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化方法很多,主要有: (一)根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

分离纯化蛋白质的方法及原理

分离纯化蛋白质的方法及原理 (一)利用分子大小 1、透析:原理:利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质,使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。 方法:将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行 涉及的问题: 如何加快透析过程 (1)加大浓度差,及时更换透析液 (2)利用磁力搅拌器 常用的半透膜:玻璃纸、火棉和其他材料合成 2、超过滤:原理:利用压力和离心力,强行使其他小分子和水通过半透膜,而蛋白质留在膜上 3、凝胶过滤层析:原理:当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时,比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构,排阻在凝胶珠以外,在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内,这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。 结果:大分子先被洗脱下来,小分子后被洗脱下来 (二)利用溶解度差别 4、等电点沉淀:原理:不同蛋白质具有不同的等电点,当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时,这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。 5、盐析与盐溶:原理:低浓度时,中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加,足够高时,例如饱和或半饱和程度,很多蛋白质可以从水中沉淀出来,这种现象称为盐析

(三)根据电荷不同 6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理:通过加热和SDS可以使蛋白质变性,多亚基的蛋白质也解离为单亚基,处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的,分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。 7、离子交换层析:原理:氨基酸分离常用阳离子交换树脂,树脂被处理成钠型,将混合氨基酸上柱,氨基酸主要以阳离子形式存在,在树脂上与钠离子发生交换,而被挂在树脂上。 氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力,决定亲和力的因素有:(1)主要是静电吸引力(2)氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用氨基酸与阳离子交换树脂间的静电引力大小次序依次是: 碱性氨基酸R2+>中性氨基酸R+>酸性氨基酸R0。 因此洗脱顺序应该是: 酸性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸 为使氨基酸从树脂上洗脱下来采用逐步提高pH和盐浓度的方法

蛋白质纯化与结晶的原理

蛋白质纯化与结晶的原理 获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈,就是制备大量纯化的蛋白质(>10 mg),其浓度通常在10 mg/ml 以上,并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术,将特定基因以选殖(clone)的方式嵌入表现载体(expression vector)内,此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中,如大肠杆菌(Escherichia coli),在菌体快速生长的同时,也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体,因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。 在取得高纯度的蛋白质溶液后,接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似,是在饱和溶液中慢慢产生的,每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异,影响晶体形成的变量很多,包含化学上的变量,如酸碱度、沈淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等;物理上的变数,如溶液达成过饱和状态的速率、温度等;及生化上的变数,如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等,皆是养晶时的测试条件。截至目前为止,并无一套理论可以预测结晶的条件,所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后,才可能得到一颗完美的单一晶体(图一) 。 蛋白质晶体的培养,通常是利用气相扩散法(Vapor Diffusion Method) 的原理来达成;也就是将含有高浓度的蛋白质(10-50 mg/ml)溶液加入适当的溶剂,慢慢降低蛋白质的溶解度,使其接近自发性的沈淀状态时,蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说,我们将蛋白质溶于低浓度(~1.0 M) 的硫酸铵溶液中,将它放置于一密闭含有高浓度(~2.0 M)硫酸铵溶液的容器中,由气相平衡,可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度,进而达成结晶的目的(图二)。 蛋白质晶体在外观上与其他晶体并无明显不同之处,但在晶体的内部,却有很大的差异。一般而言,蛋白质晶体除了蛋白质分子外,其他的空间则充满约40 %至60 %之间的水溶液,其液态的成分不仅使晶体易碎,也容易使蛋白质分子在晶格排列上有不规则的情形出现,造成晶体处理时的困难及绕射数据上的搜集不易等缺点。但也由于高含水量的特性,让蛋白质分子在晶体内与水溶液中的状态,极为相似。所以由晶体所解出的蛋白质结构,基本上可视为自然状态下的结构。 ?蛋白质结构解析的方法简介 到目前为止,蛋白质结构解析的方法主要是两种,x射线衍射和NMR。近年来还出现了一种新的方法,叫做Electron Microscopy。其中X射线的方法产生的更早,也更加的成熟,解析的数量也更多,我们知道,第一个解析的蛋白的结构,就是用x晶体衍射的方法解析的。而NMR方法则是在90年代才成熟并发展起来的。这两种方法各有优点和缺点。 首先来说一下,这两种方法的一般的步骤和各自的优点和缺点。电子显微镜(electron microscop y)作为一种新型的技术,目前的应用还是非常少,并且比较狭窄,我可能等到最后在给它作些

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