实验报告科目：分子生物学实验
姓名：实验组：
学号：
单位：
学院：生命科学学院班级：20120513
2012年9月至11月
实验一从cDNA文库和克隆质粒中扩增靶片段第一部分准备实验
一、介绍实验室的规章制度、注意事项
二、准备实验
1.分组，分发实验服、试验用具
2.讲解注意点：戴手套操作
3.准备枪头：装盒，灭菌
4.各个型号的EP管和PCR管的灭菌
5.双蒸水灭菌
6.洗净培养皿、摇菌小三角瓶、试剂瓶等
第二部分利用PCR技术从特定质粒中扩增靶片段
一、实验目的
通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。
二、实验原理
一）引物的设计：
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：
1.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
3.长度
寡核苷酸引物长度为15～30bp，一般为20～27mer。引物的有效长度：Ln=4（G+C）+2（A+T），Ln值不能大于76，因为>76时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃)，不能保证产物的特异性。
4.G+C含量
G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式
Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
5.碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
6.引物自身
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
7.引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
8.引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，同时引物3′应尽量避免A或T，3′的A/T往往会大大降低扩增的特异性。
9.引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入启动子序列等。
10.密码子的简并
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
当然，这是PCR引物设计的一般原则，随着人们对引物的认识，一些引物的计算机设计程序也应运而生，例如Primer Premier，还可以解决特殊目的的引物设计。
二） PCR原理与体系
PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA 合成。基本原理及过程如下：
PCR循环过程中有三种不同的事件发生：
（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。
1．变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
2．退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。
3．延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经
过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。
三实验步骤
1.引物的处理：
a)购买回来的合成引物是粉末状的，一般我们拿到引物后，首先
8000—10000rpm离心5min，使粘在管壁上的引物粉末沉降.
b)溶解引物.需要计算加入的溶剂(ddH2O)的量.
c)轻轻打开EP管盖，将溶剂打入.
d)4℃溶解1h。
2.PCR体系：（50ul体系）
Template DNA: 1.0—700pg (1ul)
Primer:1：10umol/l (1ul)
Primer 2：10umol/l (1ul)
dNTP ：2.5mmol/l (4ul)
10×buffer: 5ul
Taq enzyme： 2.5U (0.5ul)
ddH2O： - (37.5ul)
PCR程序:
1)95℃ 5min
2)95℃ 30s
3)＿℃ 30s
4)72℃＿min
5)Go to 2)，30 cycles
6)72℃ 10min
7)4℃ for ever
实验二 DNA片段检测及回收
第一部分电泳检测PCR产物
一、实验目的
通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳法分离DNA的原理，并掌握实验技术。
二、实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。
由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应：在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样，迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。例如，一般提取的质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，简称cccDNA)，开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，(open circular DNA，简称ocDNA)，线状质粒DNA，即质粒DNA 在同一处两条链都发生断裂(linear DNA，简称LDNA)。由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA 复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA 的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA．
三实验步骤
a)配制1×电泳缓冲液，导入电泳槽
b)洗刷干净制胶板，插好制胶孔的梳子（大孔）
c)称量: 根据你要得到的靶基因片段的大小确定琼脂糖凝胶的浓度（通常
1%）
d)溶解: 用电泳缓冲液溶解琼脂糖:，放在微波炉里加热，帮助溶解，尽量
注意避免沸腾.
e)从微波炉里拿出三角瓶，待冷却至约60℃时加入荧光DNA染料（Godview）,
摇匀后把熔胶液倒入制胶板，等待凝固。
f)凝固后，拔掉梳子
g)把凝胶放进电泳槽中
h)加样（根据第一次实验电泳检测的阳性PCR样品）
i)插上电源，电泳（200v，250mA）
四、实验结果及分析
第一次PCR后取5ul电泳检测，结果如图：
4321
图2.1第一次PCR后琼脂凝胶电泳图谱
图谱
如图2.1，○1 Pp(无酶切位点的引物)+cDNA;○2 Pp+DNA（质粒DNA）; ○3Pe(有酶切位点的引物)+cDNA;○4Pe+DNA。只有○2 Pp+DNA（质粒DNA）有比较微弱的条带，说明四组PCR实验都做的不成功。原因分析：主要原因是处在操作上面。由于大家对微量操作不熟悉导致PCR体系中许多试剂添加出现失误。如移液枪的使用不规范，没有把Taq酶添加到溶液中而是粘在管壁上等。
由于第一次不成功，我们进行了第二次PCR实验，重复做了○1 Pp(无酶切位点的引物)+cDNA；○4Pe+DNA。
第二次PCR后取5ul电泳检测，结果如图：
○4○1
图2.2 第二次PCR后琼脂凝胶电泳图谱
如图2.2，○1 Pp(无酶切位点的引物)+cDNA；○4Pe+DNA。图中○4的两个条带都较亮，但亮度不一样；图中○1其中有一个较暗的条带，不十分明显。原因分析：○4可能是不同组员操作差异的原因；○1可能有PCR产物，可能是点样出现问题。
总之，检测证明○4组有PCR产物，○1组可能有PCR产物。接下来对○1、○4都做了产物回收。
第二部分回收PCR产物
一、实验步骤
1.电泳后，在紫外灯下切下目的条带（避免在紫外灯下照射超过30秒）。
2.切下的条带放入1.5ml离心管中，按比例（1g/ml）加入结合（溶胶）缓
冲液，55-65℃溶胶7min，期间轻微振荡2-3次。
3.把回收柱放入回收管中，然后把溶解后的溶液加入回收柱中，静置2min，
8000rpm，离心1min，弃去回收管内溶液。
4.重新加入300μl结合缓冲液，10000rpm离心1min。
5.加入500μl清洗缓冲液，静置2-3min后，10000rpm离心1min。
6.重复步骤5.
7.弃去回收管内的液体后，把回收柱重新放入回收管内，12000rpm再次离
心1min以除去多余液体。
8.取出回收柱，放入1.5ml离心管内，静置10min，加入20-50μl洗脱液（视
DNA量而定），1000rpm离心1min，管内即为回收DNA。
9.电泳检测回收结果
二、实验结果及分析
1.剩下45ul全部跑电泳，准备胶回收时的电泳图谱
○1
图2.3 PCR产物回收的琼脂凝胶电泳图谱
如图2.3，图中为○1和○4,○4下面的红色方框内为一条杂带，在切胶是要去除。○1条带不清晰，说明无PCR产物，未进行回收。在紫外下切下有条带的胶放入预先准备好的EP 管中进行胶回收。
2. 胶回收后电泳图
6 4 3组 5组 2
图2.4 胶回收后琼脂凝胶电泳图谱
如图2.4，图中4组两条较亮的条带为○4的，说明回收成功。
实验三制备大肠杆菌感受态
一、实验目的
学习制备感受态细胞的原理，并掌握实验技术。
二、实验原理
1、感受态细胞的概念
重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这种导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积适当比例的无菌甘油在-70℃保存（有效期6个月）。
2、转化的概念及原理
在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2化学试剂法等）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。
除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。
3、感受态细胞制备及转化中的影响因素
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。
⑵、质粒DNA的质量和浓度
用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。
⑶、试剂的质量
所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。
⑷、防止杂菌和杂DNA的污染
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
⑸、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低
三、实验步骤
(1)准备实验
配制制备大肠杆菌感受态的试剂和培养板
配制LB培养基：
1. 称量下列试剂，置于1L烧杯中
Tryptone 10g ，Yeast Extract 5g ，NaCl 10g。
2. 加水补至1L。
3. 高温高压灭菌后，4℃保存。
固体LB培养基：500ml，分装为2瓶
按照上面比例称量好药品，然后按照15g/L的比例加入琼脂粉，高温高压灭菌后，冷却至50℃左右加入所需抗生素或不加抗生素直接倒平板。
配制0.1M CaCl2溶液500ml，灭菌后放入4℃冰箱待用。
配制80%甘油（v/v）
（2）制备感受态
（本实验选择两个菌种分别为为不同目的载体质粒使用，选用大肠杆菌TOP10为T-载体重组质粒的宿主，选用BL21菌株作为pET表达质粒的宿主）
1、分别挑取大肠杆菌TOP10和BL21单克隆，在LB 固体培养基上划线培养，37°C O/N；
2、挑取单克隆，接种于10ml LB （50ml无菌三角烧瓶中）液体培养基中，37°C，220r/min，O/N；
3、按1: 50 将菌液转接到100 ml LB 液体培养基中，37°C，220r/min，2.5-3h，此时，OD590 值约为0.4；
4、将菌液分装至10ml 预冷无菌的离心管，各加8 ml 菌液，置于冰上25min；
5、4°C，4000 r/min 离心6min，弃上清。用2ml 冰预冷0.1MCaCl2 溶液重悬菌体沉淀（冰浴中操作）；
6、重复步骤5；
7、冰上放置30 min，4000 r/min 离心6min，去上清；
8、用0.4ml 冰预冷的0.1MCaCl2 溶液重悬菌体沉淀，然后按每管0.1ml 分装于
1.5 ml 的Eppendorf 管中，可随即使用，也可于4°C 保存（7d）或每管加入70μl 80%甘油，液氮速冻，然后置于-70°C 冰箱保存（120-150d）。
（3）双酶切DNA片段用于连接表达载体
使用BamHI，Hind III两个内切酶
酶切体系：50μl
23μl H2O，5μl Buffer，20μl DNA回收产物，1μl BamHI，1μl Hind III。
37°C酶切过夜
（4）酶切片段回收
酶切结束后，在反应体系中加入两倍体积的预冷的无水乙醇，冰浴沉淀2h，离心12000rpm 15min，弃去上清，再加入400μl预冷的70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm 15min，弃去上清，离心管倒扣放置15min，加入15μl无菌水。
四、实验结果及分析
对○4酶切后片段回收
4组
图3.1
如图3.1，条带较暗，说明产物不多。分析，与离心后去上清洗壁不彻底有关。
实验四连接及转化大肠杆菌感受态细胞
一、实验目的
通过本实验，掌握大肠杆菌感受态的基本知识、转化的方法和技术以及重组子的鉴定方法。
二实验原理
重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
我们实验中使用的感受态是大肠杆菌感受态是TOP10（transgene）。
在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的
通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复
制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
重组DNA转化受体细胞后，须在不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组
子与非重组子以及鉴定所需的特异性重组子。在转化过程中，并非每个受体细胞都被转化；
即使获得转化细胞，也并非都含有目的基因，所以需采用有效方法进行筛选。筛选的方法包
括根据遗传表型筛选、限制性内切酶分析筛选、核酸探针筛选、PCR筛选等。本实验采用遗
传表型筛选中的抗生素平板筛选和α互补筛选的方法。
α互补筛选的方法适用于含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的载体，如 pUC系列等，其原
理是：载体含有LacZ的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了
一个多克隆位点。当这种载体进入可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞后（质粒
和宿主细胞编码的片段各自都没有酶活性），它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白
质，这种现象叫α互补。由α互补而产生的 Lac细菌在呈色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-
半乳糖苷（X-gal）和诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）存在下形成蓝色菌落。当
外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致产生无α互补能力的氨基端片段。因此，带有
重组质粒的细菌形成白色菌落。通过呈色反应即可初步识别可能带有重组质粒的菌落。通过
小量制备质粒DNA进行限制酶切分析，即可确定这些质粒的结构。
三、材料准备
1.LB 培养基(20g/l) 250ml
2.平板培养基 500mlAgar 15g/l， LB 20g/l， Amp 50ug/ml
3.培养皿: 12个
4.冰
5.42℃水浴
四实验步骤
一．连接载体
T载体连接:
PCR产物 1.5ul (根据PCR产物的量可适当增减，最多不超过4UL)， pGEM-T Easy
Vector 0.5ul，2×Buffer 2.5 ul，T4 DNA Ligase 0.5ul。
轻轻混合，室温（22℃-37℃）反应1hr或者4℃过夜。
pET表达载体连接:双酶切PCR片段 1-6μl，双酶切表达质粒 1μl，T4 ligase 1μl， 5xbuffer 2μl，无菌纯水至总体积10ul。
轻轻混合，室温（22℃-37℃）反应30min—2hr或4℃ O/N。
二．倒平板
将熔化的灭菌后的LB固体培养基冷却到～50℃，加入抗菌素，随即导入无菌培养皿，冷却待用（若长期存放，则平板倒扣置于4℃）。
三．转化
转化过程：
1)取感受态细胞（PCR-T-载体连接产物接种DH5а或TOP10; 表达质粒连接
产物接种BL21菌株），放在冰上融化2-5min。
2)融化后轻弹管1-2次重悬细胞。
3)加入连接好的质粒载体，摇动混合。
4)冰融30min。
5)42℃水浴90sec，不可摇动。
6)冰上放2min。
7)加入500ul LB培养基(不加任何抗生素，冰上加)，37℃，250rpm，1-2hours。
8)取适当体积（100-200μl）涂板，过夜培养。
四．配制下次试验所需试剂：以下试剂每种配制100ml
1.solutionI（1L）：50mM Glucose 9g，25mM Tris.Cl pH8.0 取1M Tris.Cl 25ml，
10mM EDTA pH8.0 取0.5M EDTA 20 ml，灭菌15min，4°C 保存。
2.solution II（1ml）： 10M NaOH 20μl， 10% SDS 100μl， ddH2O 定容至1ml，
37°C 溶解至清后使用。
3.solutionIII（100ml）： 5MKAc 60ml，冰乙酸 11.5ml，ddH2O 28.5ml，
4.10%SDS（500ml）：SDS 50g，加ddH2O 400ml，68°C 溶解后定容500ml。
5.5MKAc（100ml）：KAc 49.07g，68°C 溶解后定容至100ml。
6.0.5M EDTA pH8.0（100ml）：EDTA.Na2 18.61g，加80mlddH2O溶解， NaOH 调pH8.0，
定容至100ml，高压灭菌。
7.1M Tris.Cl（100ml）：Tris 12.1g，ddH2O 80ml溶解。 HCl 调pH，用量约为：
pH8.0: 4.2ml。定容至100ml，高压灭菌。
五实验结果及分析
过夜培养后，观察AMP培养基上长有大量的菌落，AMP选择培养基失效，原因为在培养基中加入AMP时温度过高，导致AMP结构发生变化，失去选择效果，则无法判断连接转化是否成功。另观察Kna培养基上长有稀少的菌落，可知仅有少数的质粒连接转化成功，并通过比较，450ul的板上菌落数高于50ul的菌落数。
实验五碱裂解法少量提取质粒DNA
一实验目的
通过本实验，掌握碱裂解法提取质粒的原理方法和相关基本技术。
二实验原理
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：
当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒是分子生物学研究的常规技术，碱法质粒抽提用到三种溶液：
溶液I： 50 mM葡萄糖、 25 mM Tris-Cl 、 10 mM EDTA，pH 8.0；
溶液II： 0.2 N NaOH、1% SDS；（临用前混合）
溶液III ：3 M 醋酸钾、 2 M 醋酸。
1.溶液I的作用对于任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此选用适
当浓度和适当pH值的Tris-Cl溶液。加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制 DNase的活性和微生物生长。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。
2.溶液II的作用 NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物
细胞，碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。SDS也呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做铺垫。这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
3.溶液III的作用 SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两
个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀。2 M的醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。基因组DNA一旦发生断裂，小于100 kb的片断，就不容易与 PDS共沉淀。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA 污染。这一步操作混合均匀后在冰上放置，可以使PDS沉淀更充分。
4.酚/氯仿/异戊醇的作用 PDS的沉淀并不能将所有的蛋白质沉淀，酚可以使蛋
白质变性，作用大于氯仿，但水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收。加入氯仿后可以增加其比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收。还有，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。而用酚/氯仿混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。异戊醇的添加，主要可以使离心后上下层的界面更加清晰，方便水相的回收。
三. 试剂准备
1 Solution I(100ml)： 50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl(PH8.0)，10mM EDTA，
10mg/100ml RNaseA。
2 Solution II(100ml)：0.2N NaOH， 1% SDS。
3 Solution III (100ml) (PH5.5)：3M KAc ， 2M HAc。
4酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）
5 70%乙醇 100ml
6 LB/amp 培养基 200ml(前一次实验已准备)
四.实验步骤
1 接种(实验前一晚进行)
挑取单克隆，接种到LB（Ampr或Kan）液体培养基中，37°C，220r/min，O/N；
2 质粒提取
1)吸取1ml 菌液于Eppendorf 管中，8000 r/min 离心3min，弃尽上清。加
入150μl冰预冷的solutionI，涡旋振荡30s 后置于冰上3min；
2)加入300μl solution II，快速上下颠倒试管4-5 次，置于冰上3-5 min；
3)再加入225μl 冰预冷的solutionIII，上下小心颠倒5-6 次，置于冰上
3-5 min；
4)12000 r/min 离心5 min。取上清（约600μl），加入等体积的酚-氯仿-
异戊醇（25:24:1），混匀；
5)12000 r/min 离心5 min。取上清（约500μl），加入2 倍体积冰预冷的
无水乙醇，-20°C 静置2h 或O/N；
6)12000 r/min 离心5min，去上清，沉淀用400μl 冰预冷70%乙醇洗2-3 次，
吹干沉淀；
7)加入15μl 含0.5U RNAase 的ddH2O 溶解沉淀，37°C 静置30min，
-20°C 保存。
3 电泳检测质粒提取结果
琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。
五.实验结果及分析
电泳检测质粒提取结果
图5.1 对提取质粒电泳检测琼脂凝胶电泳图谱
如图5.1，电泳图中显示，提取质粒失败。原因可能为：1.加solutionI时，未充分使得
菌悬浮，底部残留菌，使得抽提得率降低。2.在第四步操作时混入DNA酶，使得质粒被降解。
3.在加入solutionII后，震荡稍剧烈或者使得基因组裂解或者是蛋白未去除干净出现拖尾。
实验六重组载体(质粒)的验证
一实验目的
对提取的（重组载体）质粒进行快速PCR验证及酶切验证，以确定外源片段的正确插入。
二实验原理
当把PCR扩增产物连接进入克隆载体并转化大肠杆菌后，尽管有抗性选择（如Amp筛选）压力及蓝白斑筛选，仍需要对阳性菌株中所带有的质粒进一步验证，排除假阳性等实验误差以确保外源片断的正确插入。准确性最高的验证方法是对重组载体进行序列测定，但测序所需时间周期较长，因此在测序反应之前一般可以进行快速PCR验证及酶切验证。
PCR验证即指以菌落或从菌落中提取的质粒为模板，用与插入片断特异结合的引物进行PCR扩增，如果PCR扩增能够得到的片断并且大小与预期相符则该菌株或质粒就很有可能为阳性结果。由于PCR反应受多种条件的影响，特别是有可能会出现假阳性，因此，在PCR验证的基础之上还需要进行酶切验证（一般双酶切或多酶切）。在酶切验证中选择合适的内切酶是关键，选择内切酶时除了要参考质粒载体所带有的内切酶位点之外，还要考虑到插入片断中是否带有该酶的酶切位点。内切酶可以选择质粒多克隆位点区域的，也可以选择插入片段上的酶切位点，也可以选择质粒与插入片段位点相组和。
三实验步骤
1. 酶切验证：
在灭菌的1.5ml离心管依次加入下列溶液：
10×Reaction buffer2μl，重组质粒6μl，XhoI和NdeI 各1μl（1-5单位），加无菌水至总体积20μl，混匀，37℃水浴过夜。
电泳检测反应结果。
2. PCR验证：
取1μl稀释100倍的质粒作为模板进行PCR反应；电泳检测反应结果。
3. 准别下次试验所需LB液体培养基、1M浓度IPTG（抽滤灭菌）、无菌牙签、无菌试管及三角瓶、10%SDS、β-巯基乙醇
四实验结果及分析
1.质粒酶切鉴定的电泳条带
图6.1 质粒酶切鉴定琼脂凝胶电泳图谱
如图6.1，图中条带较暗，说明产物较少。分析，由于操作问题导致酶加入量不足，酶切不充分。
2.PCR验证
4组
图6.2 PCR后电泳检测琼脂凝胶电泳图谱
如图6.2，条带清晰，无杂带。说明重组质粒成功。
总结，图6.1的酶切验证和图6.2的PCR验证显示了不同的结果，说明质粒重组是成功的，问题出在酶切的验证过程。
实验七外源基因在原核中的表达
一实验目的
用IPTG（异丙基硫代-β-D半乳糖苷）诱导外源基因在重组大肠杆菌菌株中表达。
二实验原理及意义
将外源基因片段插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。大肠杆菌表达系统具有操作简单、成本低廉等特点，能够大量的获得目的蛋白，因此是一种广泛使用的基因工程体系。
原核表达系统中，合适的表达载体尤其重要，典型的应该包括有可供选择标志的编码序列、可控转录的启动子、转录终止子，多克隆位点和可在宿主体内自主复制的序列等元件。本实验中所使用的重组菌株被转化有pET30a重组质粒，即利用pET30a表达质粒将外源基因在大肠杆菌中进行表达。pET30a表达质粒带有Lac启动子，受IPTG诱导。外源基因插入在Lac 启动子的下游。当培养基中加入IPTG后，它们能够同阻遏物结合，使之从操纵单元部位移去，于是乳糖操纵子的抑制状态被消除，外源基因得到表达。（参见《基因工程原理》第八章）。表达水平的高低受IPTG浓度和生长温度、时间等多种因素影响。
三试剂
LB液体培养基、1M浓度IPTG（抽滤灭菌）、无菌牙签、无菌试管及三角瓶、10%SDS、β-巯基乙醇
四实验步骤
1. 实验前一晚上各组分别挑取2个单菌落至2mlLB/AMP液体培养基（10毫升无菌试管）中37℃+200rpm培养过夜；
2. 每组选一管生长较好的菌液以1:100的比例将过夜培养物加至新的10ml LB/AMP液体培养基（50毫升无菌三角烧瓶）中；
3. 37℃200rpm培养至OD600 为0.4–1（约3h）；
4. 每组分装2ml菌液到4个10毫升无菌试管中，分别加入IPTG至终浓度为0、0.01mM、0.1mM和1mM，继续培养1-4h；
5. 各取1ml菌液，6000rpm离心2min，去上清液，用100ul裂解液悬浮细胞，-20℃保存。
实验八 SDS-PAGE的检测
一实验目的
用SDS-PAGE的方法检测外源基因的诱导表达情况。
二实验原理及意义
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS)，大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4g的SDS－复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与蛋白质所带的电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳使用含有一种去污剂——十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸3～5分钟），经过处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。由于SDS 是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，大的蛋白质按比率可以结合更多的SDS。所有结合SDS的蛋白质-SDS复合物的形状近似于长椭圆棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成比例。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。
在蛋白质样品加到凝胶上后，接通电源，所有SDS-蛋白质复合物都向着阳极迁移。由于它们通过凝胶的速率与它们分子量的对数成反比，大的蛋白质会遇到更多的阻力，因此它们迁移的速度比小的蛋白质慢，这是一种分子筛效应，反应在电泳后的凝胶上。凝胶通过染色（常用的考马斯亮蓝染料）出现不同的蛋白带。未知蛋白质的分子量（严格讲应是多肽链的分子量）可以通过与同一块凝胶上参考蛋白的迁移率相比较计算出来。在SDS-PAGE中，在一定的凝胶浓度下，蛋白质（实际上是多肽链）的分子量对数与多肽链的迁移率成线性关系，所以通过依据标准蛋白迁移率画出的标准蛋白分子量对数对它们迁移率的标准曲线，根据未知蛋白迁移率就可从标准曲线上求出未知蛋白的分子量。应用这一技术，只需将诱导表达后的细菌总蛋白与对照进行对比即可快速、高效地检测外源基因在原核表达系统中的表达情况。
本实验中，我们基本采用Lammli的不连续垂直平板电泳，此系统分辨率高，便于电泳样品间的相互比较，是目前科研工作中广泛采用的一个系统。不连续电泳在电泳时，使用两种浓度的凝胶。上面的称作上胶或成层胶、浓缩胶；下面的称作下胶或分离胶，同时根据电化学的弱电介质调节函数理论采用不连续缓冲体系。在浓缩胶中，由于蛋白质分子的迁移率
比Cl-1低，并Gly高，泳动过程中蛋白质分子夹在引导离子Cl-1和随后离子Gly之间，并逐渐浓缩为一薄层，进入分离胶后，pH值升高，Gly有效迁移率增加而越过蛋白质分子，蛋白质分子便在随后均一的缓冲系统下分离。
三试剂
A液（100ml）：29.2%丙烯酰胺，0.8%甲叉双丙烯酰胺（丙烯酰胺具有神经毒性，在配制使用A液时应避免皮肤接触）
B液（100ml）：1.5M Tris-HCl （pH8.8），0.4%SDS
C液（100ml）：0.5M Tris-HCl （pH6.8），0.4%SDS
D液（10ml）：10%过硫酸铵
E液（1000ml）（5×电极缓冲液）：900ml水中加入94g甘氨酸，15.1gTris，然后加入50ml 的10%SDS ，去离子水补至1000ml
TEMED （四甲基二乙胺）
染色液：（100ml）0.25%考马斯亮蓝，50%甲醇，10%冰醋酸
脱色液：（500ml）10%冰醋酸，30%甲醇
样品裂解液（20ml）0.5M Tris-HCl （pH6.8）5ml
10%SDS 8ml
巯基乙醇2ml
甘油4ml
0.25%溴酚蓝1ml
四实验步骤
本实验使用凝胶：分离胶浓度12%，浓缩胶浓度4%；
1. 清洗制胶玻璃板，干燥后将两块玻璃板在电泳槽上装好，插入电泳梳子，在距离梳子下端约1cm处做一标记，取出梳子；
2. 烧杯中配制12ml的12%分离胶：4.8ml A液，
3.0 ml B液，
4.12ml水，67.5μl D液，12μl TEMED；
3. 混匀后灌入胶板至标记处，取适量水封口；
4. 待分离胶凝固后，去除胶上面的水分，用滤纸吸干，注意不要碰到胶面；
5. 配制6ml浓缩胶：0.81ml A液，1.5 ml C液，3.65 ml水，31μl D液，9μl TEMED；
6. 灌入浓缩胶，插入梳子；
7. 待浓缩胶凝固后，安装胶板，倒入电泳缓冲液；
医学分子生物学 疾病和基因关系始终是医学领域关注的重大问题。在孟德尔遗传规律被重新认识的初期，就发现许多疾病受到遗传因素的控制，遵守孟德尔遗传因子的传递规律。遗传连锁定律的提出，现代经典遗传学理论体系的完善，极大地促进了对遗传性疾病的认识。上世纪40年代，L Pauling提出了”分子病”的概念，1956年，V Ingram发现血红蛋白β链第六位氨基酸从谷氨酸突变为缬氨酸是导致镰刀状贫血的原因。几乎同时，J.Lejeune发现Down综合症是由于21号染色体三陪体异常所致，系列染色体疾病病因。1976年，H Vanmus 和M Bishop在对肿瘤病毒学的研究中，发现了病毒癌基因，继而又无确定细胞癌基因的存在，此后抑癌基因也相继被发现，建立了肿瘤发生的基因理论，肿瘤被认为是体细胞的遗传病得到了普遍的认可。1983年，将亨廷顿病基因定位于第四号染色体上，1986年，克隆了慢性肉芽肿病的致病基因，同年杜氏肌营养不良和视网膜母细胞瘤的基因，也被定位克隆成功，掀起了单基因遗传病致病基因鉴定和克隆的热潮。世纪之交，人类基因组计划的完成，新的DNA标记的发现，为研究常见病的遗传因素成为了可能，2005年，首次用全基因组关联分析（GWAS），解析了视网膜黄斑变性病的相关基因，揭开了复杂性疾病易感基因确定的序幕，此后，一系列的常见多发疾病基因的GWAS研究，极大地丰富了人们对疾病发病机制的认识，加深了对疾病发生发展机制的认知。今天，疾病和基因关系仍是很长一段时间的重点工作，解析疾病基因,不但可以确定疾病的遗传易感性，有目的的开展预防、诊治，更
重要的是了解疾病新的致病机制，为分子诊断、分子靶向干预提供分子靶点。另一方面，药物作用靶点分子基因在人群的多态性，对药物作用的疗效影响；参与药物吸收、分布、代谢、排泄和毒性（admet）的基因多态性，也会影响药物的疗效，即药物基因组方面的研究，必将成为后基因组时代的重要研究内容。以疾病基因组学和药物基因组学为代表的组学研究进展，将为个体化医疗、精准医学提供理论和实践基础。
分子生物学试题及答案
分子生物学试题及答案一、名词解释 1．cDNA与cccDNA：cDNA是由mRNA通过反转录酶合成的双链DNA；cccDNA是游离于染色体之外的质粒双链闭合环形DNA。 2．标准折叠单位：蛋白质二级结构单元α－螺旋与β－折叠通过各种连接多肽可以组成特殊几何排列的结构块，此种确定的折叠类型通常称为超二级结构。几乎所有的三级结构都可以用这些折叠类型，乃至他们的组合型来予以描述，因此又将其称为标准折叠单位。3．CAP：环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein ），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMP activated protein ） 4．回文序列：DNA片段上的一段所具有的反向互补序列，常是限制性酶切位点。 5．micRNA：互补干扰RNA或称反义RNA，与mRNA序列互补，可抑制mRNA的翻译。 6．核酶：具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。 7．模体：蛋白质分子空间结构中存在着某些立体形状和拓扑结构颇为类似的局部区域 8．信号肽：在蛋白质合成过程中N端有15~36个氨基酸残基的肽段，引导蛋白质的跨膜。
除了5’ 3’外切酶活性 19．锚定PCR：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。 20．融合蛋白：真核蛋白的基因与外源基因连接，同时表达翻译出的原基因蛋白与外源蛋白结合在一起所组成的蛋白质。 二、填空 1． DNA的物理图谱是DNA分子的（限制性内切酶酶解）片段的排列顺序。 2． RNA酶的剪切分为（自体催化）、（异体催化）两种类型。3．原核生物中有三种起始因子分别是（IF-1）、（ IF-2 ）和（IF-3 ）。4．蛋白质的跨膜需要（信号肽）的引导，蛋白伴侣的作用是（辅助肽链折叠成天然构象的蛋白质）。 5．启动子中的元件通常可以分为两种：（核心启动子元件）和（上游启动子元件）。 6．分子生物学的研究内容主要包含（结构分子生物学）、（基因表达与调控）、（ DNA重组技术）三部分。 7．证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是（肺炎球菌感染小鼠）、（ T2噬菌体感染大肠杆菌）这两个实验中主要的论点证据是：（生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能）。 8．hnRNA与mRNA之间的差别主要有两点：（ hnRNA在转变为mRNA 的过程中经过剪接，）、
分子生物学实验思考题答案 实验一、基因组DNA的提取 1、为什么构建DNA文库时，一定要用大分子DNA 答、的大小(即数目)取决于基因组的大小和片段的大小，片段大则文库数目小一些也可以包含99%甚至以上的基因组。而文库数目小则方便研究人员操作和文库的保存。所以构建文库要用携带能力大的载体尽量大的DNA片段. 2、如何检测和保证DNA的质量？ 答、用看，有没有质白质和RNA等物质的污染，还可以测OD，用OD260/280来判断，当OD260/OD280< ，表示蛋白质含量较高当OD260/OD280> ，表示RNA含量较高当OD260/OD280=～，表示DNA较纯。 实验二、植物总RNA的提取 1、RNA酶的变性和失活剂有哪些？其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种？ 答、有DEPC,Trizol，氧钒核糖核苷复合物，RNA酶的蛋白抑制剂以及SDS，尿素，硅藻土等；在总RNA提取中用PEPC,Trizol 2、怎样从总RNA中进行mRNA的分离和纯化。 答、、利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特点合成一段oligo(dT)的引物，根据碱基互补配对原则，可将mRNA从总RNA中分离出来 实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备 1、感受态细胞制备过程中应该注意什么？ 答、A）细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备的菌液。细胞生长密度以刚进入时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600为时，细胞密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 B）所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。 C）经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；D）化合物及的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； E）所使用的器皿必须干净。少量的或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率； 2、感受态细胞制备可用在哪些研究和应用领域？ 答、在中将导入受体细胞是如果受体细胞是细菌则将它用Ca2+处理变为质粒进入。 实验五、质粒在大肠杆菌中的转化和鉴定 1、在热激以后进行活化培养，这时的培养基中为什么不加入抗生素？ 答、活化培养用的一般是SOC培养基，这种培养基比LB培养基营养，此时进行的活化培养只是为了让迅速复苏，恢复分裂活性，此时的细胞还不具抗性，加入会细胞会死亡。 2、什么是质粒？根据在细菌中的复制，质粒有几种类型？用于基因重组的主要用到哪些质粒？ 答、是细菌体内的环状。
分子生物学技术信息 关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器 一、上游分子克隆 分子克隆技术是分子生物学的核心技术，这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，从而可以深入分析基因结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线： 1) 分离制备目的基因或DNA片段； 2) 目的DNA与载体在体外进行连接； 3) 重组DNA分子转入宿主细胞； 4) 筛选及鉴定阳性重组体； 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器：
二、核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选，基因组中特定基因序列的定量定性检测，基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。 核酸分子杂交中常用的仪器： 三、下游蛋白的表达及分离纯化 目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达 大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易，产量高和成本低廉等优点，使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是：表达缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养，繁殖快，便于基因操作等优点，渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达
医学分子生物学习题集 （参考答案） 第二章基因与基因组 一、名词解释 1.基因(gene)：是核酸中储存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息 所必需的全部核苷酸序列。 2.断裂基因(split gene)：真核生物基因在编码区内含有非编码的插入序列，结构基因 不连续，称为断裂基因。 3.结构基因(structural gene)：基因中用于编码RNA或蛋白质的DNA序列为结构基因。 4.非结构基因(non-structural gene)：结构基因两侧一段不编码的DNA片段，含有基 因调控序列。 5.内含子(intron)：真核生物结构基因内非编码的插入序列。 6.外显子(exon)：真核生物基因内的编码序列。 7. 基因间DNA (intergenic DNA)：基因之间不具有编码功能及调控作用的序列。 8. GT-AG 法则 (GT-AG law)：真核生物基因的内含子5′端大多数是以GT开始，3′ 端大多数是以 AG 结束，构成 RNA 剪接的识别信号。 9.启动子(promoter)：RNA聚合酶特异识别结合和启动转录的DNA序列。 10.上游启动子元件(upstream promoter element )：TATA合上游的一些特定的DNA序 列，反式作用因子，可与这些元件结合，调控基因转录的效率。 11.反应元件(response element)：与被激活的信息分子受体结合，并能调控基因表达的 特异DNA序列。 12.poly(A)加尾信号 (poly(A) signal) ：结构基因末端保守的 AATAAA 顺序及下游 GT 或T富含区，被多聚腺苷酸化特异因子识别，在mRNA 3′端加约200个A。 13.基因组(genome)：细胞或生物体一套完整单倍体的遗传物质的总称。 14.操纵子(operon)：多个功能相关的结构基因成簇串联排列，与上游共同的调控区和下 游转录终止信号组成的基因表达单位。 15.单顺反子(monocistron)：一个结构基因转录生成一个mRNA分子。 16.多顺反子(polycistron)：原核生物的一个mRNA分子带有几个结构基因的遗传信息，
分子生物学实验复习题 1.实验中为什么选用RNA而非DNA作为模板调取目的基 因？ 因为真核生物，DNA出了含有编码序列外还含有非编码序列（内含子），而我们只需目的基因这段序列。RNA是经过加工的，没有内含子，通过提取高质量的RNA再进行逆转录即可得到不含内含子的cDNA，即所需的目的基因。2.RNA提取过程中的注意事项有哪些？ （1）所有玻璃器皿均应于使用前180℃干烤3h或更长时间，塑料器皿可用0.1％DEPC浸泡或用氯仿洗涤。 （2）全部实验过程最好戴一次性手套，接触可能污染了RNA酶的物品后，应更换手套。 （3）配制的溶液应尽可能用0.1％DEPC在37℃处理12h 以上，然后高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，用经DEPC处理过的无菌蒸馏水配制，然后用0.22um 滤膜过滤除菌。 3.逆转录反应，有哪几种引物可用？如何进行选择？（1）引物：OligodT：①长度适宜，一般为15~30个碱基；G+C含量，一般为40%~60%；②4种碱基应随机分布；③引物自身不应存在互补序列；④2个引物之间不应有多于4个碱基的互补；⑤引物3′端不应有任何修饰；⑥引物5′端可以修饰 4.简述用氯化钙方法制备感受态细胞转化原理？ （1）正在生长的大肠杆菌在0℃下加入到低渗的CaCl2溶液中，便会造成细胞膨胀成球（感受态细胞）。（2）感受态细胞与外源质粒DNA形成一种粘着在细胞表面上的队DNAase抗性的羧基钙磷酸复合物。（3）42℃下作短暂的热刺激期间，这种复合物便会被细胞吸收。（4）进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。（5）将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子。 5.转化过程中要注意哪些因素 细胞生长状态和密度、质粒的质量和浓度、试剂的质量、防止杂菌和杂DNA的污染 6.简述质粒DNA提取原理 在pH12.0~12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性，但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，二质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA 及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 7.请列举4种阳性克隆的筛选方法和鉴定方法 （一）采用遗传学方法可筛选特定的重组体DNA 1.利用抗性标记可筛选出带有载体的细菌克隆 2.利用不同标记可筛选出带有重组体的细菌克隆 ①插入灭活法利用特定抗性基因的失活进行筛选②α-互补筛选是利用功能互补的基因片段 （二）核酸杂交法适合从文库中筛选特定的DNA （三）PCR技术可对特定的DNA进行直接鉴定 （四）酶切鉴定是利用限制酶酶切图谱鉴定特定的DNA 8.简单谈一下如何选定酶切鉴定时所用的酶 限制性内切酶的选用必须根据载体和插入片段上酶切微点来确定。 酶切鉴定是必须的，基于下述： 限制性图谱个体特异性，不同的载体或DNA分子物理图谱不同，酶切后片段大小不一样，电泳图谱一样。 统一载体连接不同的DNA片段，不同的载体连接统一片段（片段上也有位点）酶切图谱是不同的。插入法（单酶单切点）或替代法（双酶双位点）酶切，一般来说用3种限制酶切：可鉴定载体及插入片段的大小、方向、切后并电泳分析，以确定是否得到预期的rDNA。 9.简述克隆大鼠的GAPDH基因的主要步骤 ①TRlzol试剂提取小鼠肝脏总RNA②核酸的定量③电泳检测④PCR产物4℃保存或琼脂糖凝胶电泳检测⑤从琼脂糖凝胶中分离回收PCR产物⑥6GAPDH基因的TA克隆、连接、转化 10.Trizo:是直接从细胞或组织中提取总RNA 的试剂，内含 异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来。异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶，保持RNA 的完整性。 11.荧光定量PCR中，请说明阈、基线、Ct值的概念。 Baseline（基线）： 在PCR开始几个循环内所发散的荧光信号，这段时间内定量PCR仪器还未能检测到PCR产物的扩增，缺省设置为3-15个循环的荧光信号（背景荧光信号）。 Threshold（阈值）： 用来确定Ct的荧光强度。是在荧光扩增曲线上认为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段在 任意位置上，一般荧光阈值的设置是基线（背景）荧 光信号的标准偏差的10倍。 Ct值：到达阈值荧光信号所需要的循环数。 12.在做荧光定量PCR实验时要注意些什么？ (1)在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套（经常替换）、一次性转移器吸头（带滤嘴自卸式），不能用手直接接触毛细管、离心管的底部。 (2)操作台、移液器、离心机、PCR扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或75%乙醇擦拭消毒。每次实验前后用10%次氯酸和70%乙醇擦拭移液器、操作台。 (3)配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反映体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡。 13.影响质粒转染效率的因素有哪些？ 转化率：转化效率/细胞总数
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
1．遗传病的最基本特征是：A. 家族性 B. 先天性 C. 终身性 D. 遗传物质的改变 E. 染色体畸变2．根据遗传因素和环境因素在不同疾病发生中作用不同，对疾病分类下列哪项是错误的?A．完全由遗传因素决定发病B．基本由遗传因素决定发病C．遗传因素和环境因素对发病都有作用D．遗传因素和环境因素对发病作用同等 E. 完全由环境因素决定发病*3．揭示生物性状的分离律和自由组合律的两个遗传学基本规律的科学家是A．Mendel B. Morgan C．Garrod D．Hardy．Wenberg E．Watson，Crick4. 关于人类遗传病的发病率，下列哪个说法是错误的?A. 人群中约有3%～5％的人受单基因病所累B．人群中约有0.5%～1％的人受染色体病所累C．人群中约有15％～20%的人受多基因病所累 D. 人群中约有20％～25%的人患有某种遗传病 E. 女性人群中红绿色盲的发病率约为5％*5．研究染色体的结构、行为及其与遗传效应关系的遗传学的一个重要支柱学科称为：A．细胞遗传学B．体细胞遗传学 C. 细胞病理学D．细胞形态学E．细胞生理学6．研究基因表达与蛋白质(酶)的合成，基因突变所致蛋白质(酶)合成异常与遗传病关系的医学遗传学的一个支柱学科为：A. 人类细胞遗传学B．人类生化遗传学 C. 医学分子生物学D. 医学分子遗传学E．医学生物化学 7．细胞遗传学的创始人是：A．Mendel B．Morgan C．Darwin D．Schleiden，Schwann E.Boveri，Sutton8．在1944年首次证实DNA分子是遗传物质的学者是；A．Feulgen B．Morgan C．Watson，Crick D．Avery E.Garrod9．1902年首次提出“先天性代谢缺陷”概念的学者是：A．Feulgen B．Morgan C．Watson，Crick D．Avery E．Garrod 10．1949年首先提出“分子病”概念的学者是：A．Mendel B．Morgan C．Darwin D．Paullng E．Boveri，Sutton*11．1956年首次证明人的体细胞染色体为46条的学者是: A. Feulgen B．Morgan C．蒋有兴(JH.Tjio)和Levan D．Avery E．Garrod 12．1966年编撰被誉为医学遗传学的“圣经”--《人类盂德尔遗传》一书的学者是：A．McKusick B．Morgan C．Darwin D．Schleiden，Schwann E．Boveri，Sutton*13．婴儿出生时就表现出来的疾病称为:A．遗传病B．先天性疾病 C. 先天畸形 D. 家族性疾病 E. 后天性疾病*14．一个家庭中有两个以上成员罹患的疾病一般称为：A．遗传病B．先天性疾病C先天畸形 D.家族性疾病 E.后天性疾病15．婴儿出生时正常，在以后的发育过程中逐渐形成的疾病称为:A．遗传病B．先天性疾病 C. 先天畸形 D. 家族性疾病 E. 后天性疾病16. 人体细胞内的遗传物质发生突变所引起的一类疾病称为：A遗传病B．先天性疾病 C. 先天畸形 D. 家族性疾病 E. 后天性疾病*17．遗传病特指：A．先天性疾病B．家族性疾病C．遗传物质改变引起的疾病D．不可医治的疾病E．既是先天的，也是家族性的疾病18．环境因素诱导发病的单基因病为：A．Huntington舞蹈病B．蚕豆病C．白化病D．血友病A E．镰状细胞贫血19．传染病发病：A．仅受遗传因素控制B．主要受遗传因素影响，但需要环境因素的调节C．以遗传因素影响为主和环境因素为辅D．以环境因素影响为主和遗传因素为辅E．仅受环境因素影响20．Down 综合征是：A．单基因病B．多基因病C．染色体病D．线粒体病E．体细胞病21．脆性X综合征是：A．单基因病B．多基因病C．染色体病D．线粒体病E．体细胞病22．Leber视神经病是：A．单基因病B．多基因病C．染色体病D．线粒体病E．体细胞病23．高血压是： A．单基因病B．多基因病C．染色体病D．线粒体病E．体细胞病 1．下列哪些疾病不属于多基因遗传病?A．精神分裂症 B. 血友病A C．唇裂和腭裂D．开放性脊柱裂E．多指症2．人类遗传病包括下列哪些类型? A．单基因病 B. 多基因病C．染色体病 D. 线粒体病 E. 体细胞遗传病 *3．遗传病的特征多表现为：A．家族性B．先天性C．传染性 D．不累及非血缘关系者E．同卵双生率高于异卵双生率4．判断是否是遗传病的指
2012浙江大学医学分子生物学（乙）回忆版： 一．名词解释（3分*5） 1.The Central Dogma 2.Telomere 3.nuclear localization signal, NLS 4.Protein Motif 5.Splicesome 二．简答题：（5分*9） 1.一个基因有哪些结构组成？ 2.基因、染色体、基因组的关系？ 3.表观遗传机制改变染色质结果的机制？ 4.内含子的生物学意义？ 5.什么是蛋白质泛素化？其生物学意义是什么？ 6.蛋白质纯化的方法？ 7.MicroRNA是什么？它如何发挥作用？ 8.什么是全基因组关联研究（Genome Wide Association Studies,GWAS）？其研究目的是什么？ 9.分子生物学研究为什么需要模式生物？ 三．问答题：（10分*4） 1.人体不同部位的细胞其基因组相同，为什么表达蛋白质的种类和数量不同？ 2.用分子生物学知识，谈谈疾病发生机制？ 3.有一块肿瘤组织及癌旁组织，设计一个实验证明细胞内蛋白质在肿瘤发生发展中的作用？ 4.目前，基因靶点研究已成为新药开发的用药部分，结合目前药物靶点在新药开发中的应用，谈谈你的建议和观点？
2011浙江大学博士入学考试医学分子生物学试题回忆 一、英文名解 1、冈崎片段： 2、反式作用因子： 3、多克隆位点： 4、micro RNA： 5、分子伴侣： 二、简答 1、蛋白质四级结构。 2、真核转录调控点。 3、表观遗传学调控染色质。 4、真核RNA聚合酶类型及作用。 5、基因突变。 6、组学概念及举例。 7、简述兔源多克隆抗体的制备。
医学微生物学考试试卷（A） (临床医学本科、影像医学本科、中医药学本科、实验技术本科、预防医学本科) 班级学号姓名 注意事项： 1．在试卷上写上姓名、班级。在答题卡上填上学号，将相应的数字涂黑，并写上班级、姓名和试卷类型（A卷/B卷）。交卷时必须将答题卡与试卷一起上交，否则以零分计算！ 2．本份试卷由基础知识题和病例分析题组成，共150个选择题，请按题目要求，在备选答案中选择一个最佳答案，并在答题卡上将相应的字母涂黑，做在试卷上无效。 3．考试时请严格遵守考场纪律，原则上不允许上厕所。 第一部分、Ａ型选择题 （由一题干和５个备选答案组成，请选出一个最佳答案。共90个选择题） 1.哪种疾病的病原体属于非细胞型微生物： A.疯牛病 B.梅毒 C.结核病 D.沙眼 E.体癣 2.细菌属于原核细胞型微生物的主要依据是: A.单细胞 B.二分裂方式繁殖 C.对抗生素敏感 D.有由肽聚糖组成的细胞壁 E.仅有原始核结构，无核膜 3.革兰阳性菌细胞壁： A.肽聚糖含量少 B.缺乏五肽交联桥 C.对溶菌酶敏感 D.所含脂多糖与致病性有关 E.有蛋白糖脂外膜 4.青霉素杀菌机制是: A.干扰细胞壁的合成 B.与核糖体50S亚基结合，干扰蛋白质合成 C.影响核酸复制 D.与核糖体30S亚基结合，干扰蛋白质合成 E.损伤细胞膜 5.有关“细菌鞭毛”的叙述，哪一项是错误的: A.与细菌的运动能力有关 B.许多革兰阳性菌和阴性菌均有鞭毛 C.在普通光学显微镜下不能直接观察到 D.可用于细菌的鉴定 E.将细菌接种在固体培养中有助于鉴别细菌有无鞭毛(半固体) 6.有关“芽胞”的叙述，错误的是: A.革兰阳性菌和阴性菌均可产生（都是阳性） B.不直接引起疾病 C.对热有强大的抵抗力 D.代谢不活跃 E.通常在细菌处于不利环境下形成 7.用普通光学显微镜油镜观察细菌形态时，总放大倍数为: A.10倍 B.100倍 C.400倍 D.900～1000倍 E.10000倍 8.脑膜炎奈瑟菌和肺炎链球菌经结晶紫初染、碘液媒染、95%乙醇脱色后，菌体分别呈: A.红色和紫色 B.紫色和紫色
名词解释： 基因是核酸中贮存遗传信息的遗传单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。 基因组（gencme）：细胞或生物中，一套完整单倍体遗传物质的总和（包括一种生物所需的全套基因及间隔序列）称为基因组。基因组的功能是贮存和表达遗传信息。 SD序列(Shine-Dalgarno sequence,SD sequence) 是mRNA能在细菌核糖体上产生有效结合和转译所需要的序列。SD序列与16S rRNA的3’末端碱基(AUUCCUCCAC-UAG-5’)互补，以控制转译的起始 分子克隆：克隆（clone）：是指单细胞纯系无性繁殖，现代概念是将实验得到的人们所需的微量基因结构，引入适当的宿主细胞中去，在合适的生理环境中进行无性繁殖，从而利用宿主的生理机制繁衍人们所需要的基因结构，并进行表达。由于整个操作在分子水平上进行，所以称为分子克隆（molecular cloning）。 动物克隆(Animal cloning)就是不经过受精过程而获得动物新个体的方法. 基因诊断：就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构 （DNA水平）及其表达水平（RNA水平）是否正常，从而对疾病做出诊断的方法。 基因治疗就是将有功能的基因转移到病人的细胞中以纠正或置换致病基因的一种治疗方法，是指有功能的目的基因导入靶细胞后有的可与宿主细胞内的基因发生整合，成为宿主细胞遗传物质的一部分，目的基因的表达产物起到对疾病的治疗作用。 转基因动物就是把外源性目的基因导入动物的受精卵或其囊胚细胞中，并在细胞基因组中稳定整合，再将合格的重组受精卵或囊胚细胞筛选出来，采用借腹怀孕法寄养在雌性动物（foster mother）的子宫内，使之发育成具有表达目的基因的胚胎动物，并能传给下一代。这样，生育的动物为转基因动物。 探针：在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标记。这种带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为探针。 限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）是一类专门切割DNA 的酶，它们能特异结合一段被称为限制酶识别顺序的特殊DNA序列并切割dsDNA。 载体：要把一个有用的基因（目的基因-研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 限制性片段长度多肽性分析(RFLP):DNA片段长度多态性分析（restriction fragment length polymer-phism,RFLP）基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序发生改变,会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失. 用限制酶对不同个体基因组进行消化时，其电泳条带的数目和大小就会产生改变，根据这些改变可以判断出突变是否存在。 简答题： 1.蛋白质的生物合成过程中的成分参与，参与因子，作用？ mRNA是合成蛋白质的“蓝图（或模板）” tRNA是原料氨基酸的“搬运工” rRNA与多种蛋白质结合成核糖体作为合成多肽链的装配机（操作台） tRNA mRNA是合成蛋白质的蓝图，核糖体是合成蛋白质的工厂，但是，合成蛋白质的原料——20种氨基酸与mRNA的碱基之间缺乏特殊的亲和力。因此，需要转运RNA把氨基酸搬运到核糖体中的mRNA上 rRNA 核糖体RNA（rRNA）和蛋白质共同组成的复合体就是核糖体，核糖体是蛋白质合成的场所。
分子生物学实验技术 目录 实验一细菌的培养 2 实验二质粒DNA的提取 3 实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4 实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5 实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7 实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8 实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9 实验八 RNA提取与纯化 11 实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13 实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15 实验十一感受态细胞的制备及转化 16 实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18 实验十三 DNA分析——Southern杂交 19 一基本操作 实验一、细菌培养 实验二、质粒DNA提取 实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化 二、目的基因获取
实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA 三、目的基因的克隆和表达 实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应 实验十一、感受态细胞的制备及转化 实验十二、克隆的筛选和快速鉴定 实验十三、DNA分析——Southern杂交 实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到 1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养 基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 （一）实验材料 大肠杆菌 （二）试剂 1、胰蛋白胨 2、酵母提取物
医学分子生物学 名词解释： 结构基因(structural genes)： 可被转录形成 mRNA，并转译成多肽链，构成各种结构蛋白质，催化各种生化反应的酶和激素等。 ORF 开放阅读框架（ open reading frame，ORF ）： 是指DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为止的一个连续编码。 C值(C-value)： 一种生物体单倍体基因组DNA的总量，用以衡量基因组的大小。 C值矛盾/ C值悖论： C值和生物结构或组成的复杂性不一致的现象。 基因组（genome）： 是指生物体全套遗传信息，包括所有基因和基因间的区域 重叠基因 是指同一段DNA片段能够参与编码两种甚至两种以上的蛋白质分子。 SNP单核苷酸多态性（singl e nucleotid e polymorphism） 是由基因组DNA上的单个碱基的变异引起的DNA序列多态性。是人群中个体差异最具代表性的DNA多态性，相当一部分还直接或间接与个体的表型差异、对疾病的易感性或抵抗能力、对药物的反应性等相关。SNP被认为是一种能稳定遗传的早期突变 蛋白质组(proteomics): 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律. 质谱技术mass spectrometry,MS 样品分子离子化后，根据不同离子间质核比（m/z）的差异来分离并确定分子量 开放阅读框=ORF 基因工程
又称为重组DNA技术，是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE) 是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。 逆转录酶 依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板、4种dNTP为底物，催化合成DNA，其功能主要有：1)逆转录作用；2)核酸酶H的水解作用；3)依赖DNA的DNA聚合酶作用。 粘性末端 被限制酶切割后突出的部分就是粘性末端（来自360问答） 载体vector 指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。多克隆位点 载体上具有多个限制酶的单一切点（即在载体的其他部位无这些酶的相同切点）称为多克隆位点 报告基因（reporter gene）： 是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来反映上游待测基因功能的基因，又称报道基因。 转化 以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程称为转化（transformation） 感受态细胞 细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞称谓感受态细胞(competent cell)。 碱裂解法 在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。 核酸变性 变性（denaturation）:在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。 核酸复性
分子生物学复习题 实验一DNA的制备 （1）为什么分子生物学实施时要担心EB？ 溴化乙锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌) （2）DNA加样缓冲液的用途是什么？ 由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。 线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1 （4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 （5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？ 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA 含量。 （6）制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用？ CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来 氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁 实验二RNA的制备 1.制备RNA时通常要注意些什么？为什么？ 应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入; 由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。 2.制备的RNA通常有哪些用途？制备的DNA通常又有哪些用途？ 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。 质粒DNA构建克隆载体,分离目的基因 3.RNA制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏？为什么？
第2章基因、基因组和基因组学 基因(gene)：携带有遗传信息的DNA或RNA序列，也称为遗传因子。基因是合成有功能的蛋白质或RNA所必 需的全部DNA，包括编码蛋白质或RNA的核酸序列，也包括为保证转录所必需的调控序列。基因的功能：传递遗 传信息，控制个体性状表现。结构基因(structural genes)：可被转录形成mRNA，并转译成多肽链，构成各种结构 蛋白质，催化各种生化反应的酶和激素等。调节基因(regulatory genes) ：某些可调节控制结构基因表达的基因。 其突变可影响一个或多个结构基因的功能，或导致一个或多个蛋白质(或酶)量的改变。eg. miRNA, siRNA, piRNA 核糖体RNA 基因(ribosomal RNA genes) 与转运RNA 基因(transfer RNA genes)：只转录产生相应的RNA而不翻 译成多肽链。真核生物的RNA聚合酶( 3种)：RNA 聚Array合酶I, II, III. 开放阅读框架(open reading frame，ORF)：在DNA 链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为 止的一个连续编码序列。断裂基(split gene)：真核生物 结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨 基酸组成的完整蛋白质。 基因组(genome)：一个细胞内的全部遗传信息，包括染色体基因组和染色体外基因组。基因组中的DNA包括 编码序列和非编码序列。部分病毒基因组--RNA。 C值(C-value)：一种生物体单倍体基因组DNA的总量，用以衡量基因组的大小。通常，进化程度越高的生物其基因组越大，但从总体上说，生物基因组的大小同生物在进化上所处地位的高低无关。存在C-value paradox （C值悖理）。生物复杂性越高，其基因的密度越低。 病毒基因组的大小: 与细菌或真核细胞相比，病毒的基因组很小。不同的病毒之间基因组大小相差很大。乙肝病 毒DNA：3kb，编码4种蛋白质；痘病毒的基因组：300kb，编码几百种蛋白质。病毒基因组的大小通常与其对宿主 的依赖程度有关，基因组越大，依赖性越小。RNA 病毒基因组编码序列具有节段性:有些病毒的基因组RNA由 不连续的几条核酸链组成（如流感病毒，轮状病毒等）。分段基因组的病毒一般感染效率较低；分段基因组容易 发生重组，故病毒容易变异。目前未发现DNA病毒有此状况。 病毒基因存在基因重叠:基因重叠：同一段DNA片段能够参与编码两种甚至两种以上的蛋白质分子。这种现象在 其它的生物细胞中仅见于线粒体和质粒DNA。此结构意义在于使较小的基因组能够携带较多的遗传信息。基因重 叠的方式:1）一个基因完全在另一个基因里面。2）几个基因部分重叠。3）两个基因之间只有一个碱基重叠。重 叠基因的DNA序列可能大部分相同，但由于翻译时的读码框架不同、或起始部位不同而产生不同的蛋白质。有些 真核病毒的部分序列，对某一个基因来说是内含子，而对另一个基因而言却是外显子。病毒基因组的大部分序列 具有编码功能：病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的，只有非常小的一部份没有编码翻译功能。ΦX174基因 组中不编码的序列只占217/5375。乳头瘤病毒基因组约8.0Kb，其中不编码的部分约为1.0kb。少数真核生物病毒 的基因组也存在内含子结构。 病毒基因组的转录单元是多顺反子:多顺反子mRNA (polycistronie mRNA) ：病毒基因组DNA序列中功能上相关 的蛋白质的基因或rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位，形成一个功能单位或转录单元。它们 可被一起转录成含有多个mRNA 的分子。 病毒基因组都是单倍体：除了逆转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次。 逆转录病毒带有逆转录酶，能使RNA反向转录生成DNA，因此其基因组可拥有两个拷贝。噬菌体基因具有连续性： 噬菌体的基因是连续的，而真核细胞病毒的基因是不连续的，具有内含子。 原核生物基因组通常比较简单，其基因组大小在106bp～107bp之间，所包含的基因数目几百个到数千个之间。原 核生物基因组通常由一条环状的双链DNA分子组成，在细胞中与蛋白质结合成染色体的形式，在细胞内形成一个