预防接种操作规程
预防接种是提高人群免疫水平的有效方法，是预防、控制或消灭传染病的一项重要措施。为使预防接种安全、有效地顺利开展，特制定预防接种操作规程。
一、准备工作：
（一）、利用每年4月25日“全国儿童预防接种日”及其它有利时机，开展健康教育活动，普及计划免疫科学知识。
（二）、参加接种的人员都必须具备执业资格，经过计划免疫专业培训，能正确掌握接种对象，疫苗性质，接种部位、剂量、方法和禁忌症、接种反应判断、处理方法，预防接种安全注射的基本知识和操作技能。实行持证上岗的制度。
（三）、接种使用的帐、证、注射器材、冷藏设备、消毒药品、急救药品和急救器械均要事先准备齐全。
二、现场操作步骤：
(一)、接种前应认真实行“预防接种前告儿童家长书”制度，常规地询问接种对象的健康状况，进行必要的体检，严格掌握禁忌症；实行预防接种前知情同意制度，所有预防接种必须由儿童家长知情同意并在预防接种通知单上签名后方可接种。
（二）、核对被接种者姓名、年（月）龄，询问病史，进行必要的体检。若有禁忌症，一律不予接种。
（三）、检查使用制品，核对标签、查看批号、有效期，检查
安瓿有无破裂或封口不严、苗液有无摇不散凝块、颗粒、霉变、冻干制品，须按说明书规定方法进行稀释。
（四）、接种操作：
1、皮肤消毒：
（1）确定接种部位，接种部位要避开疤痕、炎症、硬结和皮肤病变处。如果接种部位皮肤不清洁，先进行清洗。
（2）用灭菌镊子夹取75%乙醇棉球或无菌棉球蘸75%乙醇，螺旋式的由内向外消毒接种部位皮肤，涂擦直径≥5cm。消毒区不可用手触碰。
（3）接种部位的皮肤消毒，一般不用碘酒，尤其是接种活疫苗时不能碘酒消毒，局部用75%乙醇消毒时，待干后按规定的接种方法和剂量接种。
2、接种技术
（1）、皮内接种法
a）接种（皮试）部位： PPD试验和锡克氏试验应在左前臂掌侧中部，BCG接种应在左上臂三角肌外下缘皮内。
b）操作方法：用1ml注射器配4.5号针头吸取疫苗，皮肤常规消毒，待酒精干后，左手绷紧注射部位皮肤，右手持注射器，食指固定针筒，针头斜面向上，与皮肤呈10~15度角刺入皮内，左手拇指固定针管，然后注入疫苗或试验液，使注射部位形成一个圆形隆起皮丘，皮丘直径为8~10mm，并有毛孔可见。此时，针
管顺时针方向旋转45度角后，拔出针头。勿按摩注射部位。
（2）皮下接种法
a）接种部位：上臂外侧三角肌下缘。
b）操作方法：用1ml或2ml注射器配上5.5号针头，吸取疫苗后，皮肤常规消毒，左手绷紧局部皮肤，右手持注射器，食指固定针柄，针头斜面向上，与皮肤成30~40度角，快速刺入针头长度的1/3~2/3，放松皮肤，左手固定针管，回抽无血，注入疫苗，快速拔出针头。若有回血，应更换注射部位，重新注射。
（3）肌内接种法
a）接种部位：上臂外侧三角肌中部或臀部外上1/4处。
b）操作方法：用1ml或2ml注射器配上6号或5.5号针头吸取疫苗，接种对象取坐位或侧卧位（上臂三角肌接种取坐位或立位，注射侧的手叉腰），皮肤常规消毒，左手绷紧皮肤，右手持注射器（以执毛笔式），与皮肤成70~90度角，快速刺入针头长度的2/3，固定针管，放松皮肤，回抽无血，注入疫苗后快速拔出针头，用消毒干棉球稍加按压针眼部位。若有回血，应更换注射部位，重新注射。
（4）口服法
a）用于OPV的服用。
b）用消毒的药匙将脊髓灰质炎疫苗送入儿童口中，用凉开水送服咽下。
c）月龄小的儿童，喂服糖丸疫苗时可将糖丸碾碎，放入药匙内，加少许凉开水溶解成糊状服用，或将糖丸疫苗溶于5毫升凉开水中，使其完全溶化口服咽下。
d）口服疫苗时要看服下肚，如儿童服苗后吐出，应先饮少量凉开水，休息片刻后再服。
3、注意事项
（1）BCG要准确注入皮内，严禁皮下或肌内注射。
（2）OPV不能用热开水送服，并做到一人一匙。
（3）含有吸附剂的疫苗要采用肌内注射或皮下深部注射。
（4）MV接种后，不要用酒精棉球按压或涂擦注射部位。
（5）联合免疫时，接种要分部位。
4、接种时严格执行无菌操作。
（1）、预防接种一律使用一次性注射器，要严格执行使用后的回收销毁制度，严禁再次使用。
（2）、接种时应严格按技术规程的要求操作。
（3）、吸取疫苗和注射时，手不能触碰注射器的针芯。
（4）、无菌和使用过的注射器、针头要分开存放。
（5）、接种BCG的注射器要专用。
5、接种完毕，及时在预防接种证、帐册上正确记载所接种疫苗的年、月、日及批号，接种者签名。接种记录要书写工整不得其它符号代替。
6、接种完毕，接种对象应留在接种现场观察15~30分钟，观察有无反应。并告诉儿童家长或其监护人，接种后可能出现的反应和注意事项。
7、与儿童家长或其监护人预约下约下次接种疫苗的种类、时间和地点。
8、接种结束后要及时加强随访，遇有反应及时处理，并做好调查，逐级上报。
三、统计上报：各项生物制品接种结束后要及时做好统计上报工作。统计上报内容包括应初种人数、实际接种人数、接种率、未种人数及原因分析、疫苗供应、使用情况和预防接种异常反应及接种事故调查处理等。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程 1.适用范围 本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。 本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。 2.方法和原理 16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。 细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。 在16S rRNA分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。 16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。 由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。 3.设备和材料 3.1器材 移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal
一目的 建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。 二围 本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。 三容 1.1 试验菌株 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501] 白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)64941] 黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003] 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104] 生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(F)98001] 1.1.1 标准菌株 1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国或国外菌种收藏机构。 1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。 1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 1.1.2 工作菌株 1.1. 2.1 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。 1.1. 2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过 5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。 1.2 菌种确认试验的主要容
1.2.1 菌种的纯度确认 1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。 1.2.1.2 试验容 ①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。 ②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。 1.2.2 菌种的特性确认 1.2.2.1 生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代过程中所参与的物质分解和合成代的产物也不同，这些代产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。 1.3 菌种的确定方法 用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。 1.3.1 大肠埃希菌的确认 1.3.1.1 菌落形态 1.3.1.1.1 取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。 1.3.1.1.2 取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24h后，观察结果。 ①曙红亚甲蓝琼脂(EMB)平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。 ②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。 1.3.1.2 革兰染色、镜检 1.3.1. 2.1 革兰染色
预防接种副反应和事故处理制度 一、建立预防接种副反应和事故登记本，专人负责。 二、对预防接种一般反应、偶合反应进行对症治疗，对异常反应、群体性反应和接种事故要采取应急救护措施。 三、责任报告人在发现预防接种异常反应、疑似预防接种异常反应或接到相关报告后，应当及时向所在地的县级卫生行政部门、药品监督管理部门报告，并填写疑似预防接种异常反应报告卡。 四、发现怀疑与预防接种有关的死亡、群体性反应或者引起公众高度关注的事件时，责任报告人应当在发现后2小时内，向所在地县级卫生行政部门和药品监督管理部门报告。 五、接到报告后，县级卫生行政部门应当会同药品监督管理部门立即核实，组织调查。卫生部门调查组原则上由临床、流行病、免疫规划和实验室检验等有关专业人员组成。 六、与预防接种异常反应相关的诊断，应由县级以上预防接种异常反应诊断小组做出，其他任何医疗单位或个人均不得做出预防接种异常反应的诊断。 七、因预防接种异常反应造成受种者死亡、严重残疾或器官组织损伤的，应当给予一次性补偿。由接种第一类疫苗引起的，补偿费由省人民政府财政部门在预防接种工作经费中安排，由接种第二类疫苗引起的，补偿费由相关的疫苗生产企业承担。
八、过敏性休克处理原则：使病人平卧、头部放低、注意保暖；立即皮下注射肾上腺素（1/1000），小儿为0.01ml/kg/次，最大量为0.33（1/3支）ml，并同时通知临床医生进行有关抗休克处理。 九、晕厥处理原则：使病人平卧，松解衣扣，注意保暖；轻者可给予温开水、热糖水喝，必要时可针刺或用手掐人中穴；数分钟后仍不恢复者，可按过敏性休克处理，并通知临床医生救治。 预防接种服务流程 预防接种证、卡的建立流程 1、为6岁及以下儿童（包括流动人口儿童和计划外生育儿童）建立预防接种证、卡。儿童出生后一个月内通过查询金苗系统产院平台，
1．目的 建立菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。 2．依据 《中国药典》2010版二部 3．范围 本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。 4．责任 质量管理部，质量控制实验室 5．内容 5.1试验菌株 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44 102] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26 003] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63 501] 白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98 001] 黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003] 5.1.1标准菌株 5.1.1.1标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。 5.1.1.2标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。 5.1.1.3标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 5.1.2工作菌株 5.1.2.1标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株 5.1.2.2工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌
株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。 5.2菌种确认试验的主要内容 5.2.1菌种的纯度确认 5.2.1.1纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。 5.2.1.2试验内容 ①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。 ②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。 5.2.2菌种的特性确认 5.2.2.1生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。 5.3 菌种的确定方法 用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。 5.3.1大肠埃希菌的确认 5.3.1.1菌落形态 5.3.1.1.1取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。 5.3.1.1.2取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24h后，观察结果。 ①曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。 ②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。
预防接种工作制度（全） 预防接种工作制度 一、为保证这项工作经常性开展，乡防保所设立以所长为组长，乡防疫人员及接种员人员为骨干的计划免疫领导组，负责制订本乡生物制品计划，领发生物制品，实施预防接种，调查处理异常反应，“冷链”管理，以及对基层卫生人员计划免疫工作的业务培训、督促、检查等项工作。 二、乡计划免疫工作实行一卡、一证、两册、两簿、 两表制度。卡、簿、表乡防疫人员专柜保管，接种卡仅接种期间发至各接种点，接种完后仍交回乡卫生院管理。7岁后，接种卡片乡镇卫生院保管15年。儿童预防接种证交儿童家 长保管，0—7岁儿童年龄分组表每年统计一次并上墙公布。 三、建、管、用好0—7岁儿童免疫接种卡、证。20XX 年度建卡率、建证率不得低于99%卡、证填写符合率不得 低于95%以上，坚持每季全乡儿童出生人数与建卡数、建证 数核对。 四、接种人员应以高度责任心，严格的科学态度，掌握免疫程序，生物制品性质，接种方法、接种途径及接种前的询问和告知，禁忌症，以及接种后副反应的观察处理。为确保工作质量，接种前要仔细检查发现禁忌症，严禁使用过 期、冻接和变质的疫苗，实行一人一针一管，严格无菌操作。
五、做好接种前的调查摸底工作，接种中的组织实施；填写好接种卡证和接种登记册；接种后的统计汇总工作，按时向县疾控中心报出生物制品使用双月报表或工作总结。 六、积极处理预防接种中出现的异常反应，并及时向县卫生局、县食品、药品监督局报告，必要时，提请县异常反应诊断小组会诊，任何医疗单位或个人不得单方面出具诊断证明，所出证明一律无效。 预防接种安全注射制度 对疫（菌）苗应用灭菌的注射器和规范的操作进行注射，并对使用过的注射器具进行安全处理，称为安全注射，安全注射必须达到对接受注射者无害，对实施注射者无危险，注射后的物品不会给公共带来危害。根据以上要求，特制定安全注射制度。 一、预防接种要使用合格的注射器；二、实施预防接 种的人员要持技术合格证、上岗证上岗。三、预防接种必 须掌握各种疫苗的禁忌症。四、预防接种的操作要规范化。 五、预防接种的环境要符合工作要求。 六、接种后的接种器材及其废弃物品安全的回收、销毁工作制度 一、预防接种门诊每周定若干天数为预防接种日，为辖区内适龄儿童与流动人口儿童开展 常年免疫接种和业务咨询。预防接种门诊要设立登记咨 询点，接受群众咨询 二、严格按照卫生部颁发的《计划免疫技术管理规程》 和《安徽省预防接种免疫程序》
菌种抗生素的抗性检查标准操作规程 依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。 范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。 目的：验证该菌种的抗生素抗性是否与原始菌株相符。 原理：该菌种所携带的重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上能够生长。 责任：检定人员。 内容： 1 材料 1．1 材料 1．1．1 菌种：PBV 888/DH 5α ，来源于主种子批或工作种子批。 1．1．2 注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版的要求。1．1．3 药品 氯化钠 NaCl 分析纯 琼脂粉分析纯 酵母粉 OXOID 蛋白胨 OXOID 氨苄青霉素 C 16H 19 N 3 O 4 S 分析纯 无水乙醇 CH 3CH 2 OH 分析纯 1．1．4 器皿 三角烧瓶（1L）、量筒（500ml、1000ml）、烧杯（500ml）、平皿、盐水瓶（250ml、500ml、1000ml）。 1．1．5 其它材料 线绳、牛皮纸、硫酸纸、剪刀、接种环、煤气灯、脱脂棉。 1．2 设备 恒温培养箱 HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂 生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂 扭力天平TN-100B 上海第二天平厂
2 方法 2．1 准备工作 2．1．1 生产环境：在十万级洁净间中进行。场地摘下“清场合格”标志牌，挂上“使用中”标志牌。 2．1．2 器皿的洁净要求 玻璃器皿经本室洗刷组处理后，用二层硫酸纸、一层牛皮纸包好，用线绳系紧，送高压灭菌（121.3℃，60分钟）。脱脂棉用硫酸纸、牛皮纸包好，121.3℃60分钟高压灭菌。 2．1．3．1 确认扭力天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。 2．1．3．2 确认恒温培养箱运行状态良好，已挂有“运行”标志牌。 2．1．3．3确认生物安全台运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。 2．1．4 配液 2．1．4．1 LB琼脂培养基的配制（500ml） 摘下扭力天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。用扭力天平准确称取酵母粉2.5克，蛋白胨5克，NaCl 5克，琼脂粉10克，倒入500ml烧杯中，加入400ml 注射用水，用玻棒搅匀溶解，定容至500ml，混匀，倒入1L三角瓶中，分别用二层硫酸纸和一层牛皮纸包瓶口，用线绳系紧，115.6℃，30分钟高压灭菌。贴上标签，标明液体名称、批号、配制日期，备用。 2．1．4．2 75%酒精1000ml 用量筒量取750ml无水乙醇，加入250ml无菌注射用水，置1000ml盐水瓶中，摇匀，标明液体名称、批号、浓度、日期，室温备用。 2．1．5 LB琼脂平板培养基的制作 摘下生物安全台“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，用75%酒精棉擦拭台内，接通电源。打开电机，无菌风吹30分钟，待已灭菌LB琼脂培养基500ml冷却到50℃左右，加入25mg氨苄青霉素，轻轻摇匀，倒平板，每皿20-30ml，待培养基冷却后，贴上标签，并注明名称、批号、配制日期，置37℃孵箱中孵育，判定合格后置于4℃冰箱中保存，待用。 2．3 操作步骤 2．3．1 在生物安全台中，将接种环用火焰灭菌并冷却后，用接种环取一环菌
标准菌株使用标准 操作规程
标准菌株使用标准操作规程 1 检验目的 对实验室的标准菌株进行合理的保存，并规范合理的使用流程，保证菌株的性能稳定可靠。 2 范围 微生物实验室保存的标准菌株。 3 职责 微生物组工作人员正确执行本操作规程。 4 术语和定义 4.1标准菌株 其特征进行了分类和描述，有明确的来源。ATCC（American Type Culture Collection）美国标准菌株收藏中心。 4.2标准储备菌株 标准菌株经过一代转接后获得的同种菌株。 4.3 工作菌株 标准储备菌株传代后得到的同种菌株。 4.4 标准培养物 标准菌株、标准储备菌株、工作菌株的统称。 4.5质控菌株 ATCC最佳，但当无法获得时能够使用ATCC演化的菌株或中国国家菌种库储存的标准菌株。特殊情况，例如定性试验可用已知的菌种作为质控菌
株。室间质评的菌株即可。 5 保存程序 5.1标准菌株 5.1.1商业购买的ATCC标准菌株干粉，-80℃低温保存，能够2年以上。安瓿真空包装的，-80℃可长期稳定保存。将标准菌株进行编号和登记。 5.1.2复苏 用1ml无菌的小牛血清或营养肉汤溶解。根据菌种的生长特点，接种到新鲜培养基上选择适宜的培养条件培养18-24h。酵母菌要求3天，形成孢子的微生物宜保存孢子。 5.2标准储备菌株 5.2.1由复苏后的ATCC标准菌株制备。复苏后的标准菌株要检查其纯度，必要时进行生化试验检查。刮取培养物上的菌体，用足量的菌悬浮于防冻培养基中。防冻液能够是无菌脱纤维羊血、10%甘油肉汤。储存足够量的标准储备菌株，可用1-2年。一年52周需要52支以上。 5.2.2甘油肉汤保存法 成分有蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化钠、甘油、纯化木。相当于20%的甘油。挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。苛养菌能够适当增加菌量。-80℃保存。除链球菌和嗜血杆菌以外细菌均可使用。保存期限1-5年。 5.2.3全血保存法 成分为脱纤维羊血。挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。苛养菌能够适当增加菌量。-80℃保存。主要用于保存链球菌、嗜血杆菌及厌氧菌。保存期限1-5年。
预防接种工作制度(全) 预防接种工作制度一、为保证这项工作经常性开展，乡防保所设立以所长为组长，乡防疫人员及接种员人员为骨干的计划免疫领导组，负责制订本乡生物制品计划，领发生物制品，实施预防接种，调查处理异常反应，“冷链”管理，以及对基层卫生人员计划免疫工作的业务培训、督促、检查等项工作。二、乡计划免疫工作实行一卡、一证、两册、两簿、两表制度。卡、簿、表乡防疫人员专柜保管，接种卡仅接种期间发至各接种点，接种完后仍交回乡卫生院管理。7岁后，接种卡片乡镇卫生院保管15年。儿童预防接种证交儿童家长保管，0—7岁儿童年龄分组表每年统计一次并上墙公布。 三、建、管、用好0—7岁儿童免疫接种卡、证。2003年度建卡率、建证率不得低于99%，卡、证填写符合率不得低于
95%以上，坚持每季全乡儿童出生人数与建卡数、建证数核对。四、接种人员应以高度责任心，严格的科学态度，掌握免疫程序，生物制品性质，接种方法、接种途径及接种前的询问和告知，禁忌症，以及接种后副反应的观察处理。为确保工作质量，接种前要仔细检查发现禁忌症，严禁使用过期、冻接和变质的疫苗，实行一人一针一管，严格无菌操作。五、做好接种前的调查摸底工作，接种中的组织实施；填写好接种卡证和接种登记册；接种后的统计汇总工作，按时向县疾控中心报出生物制品使用双月报表或工作总结。 六、积极处理预防接种中出现的异常反应，并及时向县卫生局、县食品、药品监督局报告，必要时，提请县异常反应诊断小组会诊，任何医疗单位或个人不得单方面出具诊断证明，所出证明一律无效。预防接种安全注射制度对疫(菌)苗应用灭菌的注射器和规范的操作进行注射，并对使用过的注射器具
菌种管理制度 1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。 3、定义 标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏 管理中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定 保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面 培养后，作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发 一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代。 4、职责 4.1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。 4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 5、规程 5.1菌种的申购 部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。 5.2菌种的接收 菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标准菌株库存记录》上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。
5.3菌种的保存 5.3.1工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同，细菌：每个月转种一次；酵母菌及芽胞：3~6个月转种一次；丝状真菌每年转种一次。 5.3.2传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。 5.3.2.1甘油冷冻管保存法 用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度20%），即为10%甘油菌悬液，轻轻振摇，使内容物充分混合，分装于无菌小试管，在-30℃冷冻条件下保存。此甘油冷冻管为第2代（G2）。可以每隔2年转种一代。使用时，取出一支放至室温，转种增菌培养或接种至琼脂斜面复苏，挑取纯菌落传代或工作用。此种方法主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏（如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌）。 5.3.2.2液体石蜡保存法 5.3.2.2.1无菌液体石蜡的制备：选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，在121℃灭菌30分钟,置40℃恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。 5.3.2.2.2液体石蜡管的制备：将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中，在适宜条件下培养结束后，在层流台下用无菌吸管吸取上述无菌液体石蜡至培养好的菌种管内，并使石蜡高出菌种表面约1cm使菌体与空气隔绝，并将试管直立，置于-20℃冷冻或2～8℃冰箱中保存。此法主要适用于霉菌、厌氧菌、放线菌、芽孢杆菌的保存（如枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等）。 5.3.3各菌种的保存方法、条件及期限，见下表1 表1 传代用菌种保存方法、保存温度、保存期限
标准菌种确认标准操作规程 一目的 建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。 二范围 本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。 三内容 1.1 试验菌株 大肠埃希菌(Escherichia coli )[CMCC(B)44102] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )[CMCC(B)26003] 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis )[CMCC(B)63501] 白色念珠菌(Candida albicans ) [CMCC(F)64941] 黑曲霉(Aspergillus niger ) [CMCC(F)98003] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa ) [CMCC(B)10104] 生抱梭菌 (Clostridium sporogenes ) [CMCC(F)98001] 1.1.1 标准菌株 1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。
1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌 1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 1.1.2 工作菌株 1.121 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。 1.122 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种收藏 机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。 1.2 菌种确认试验的主要内容 1.2.1 菌种的纯度确认 1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。 1.2.1.2 试验内容 ①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适 宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布 培养，检测是否重复出现相同特征。 ②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽抱等特征应相似。 1.2.2 菌种的特性确认 1.2.2.1 生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过 程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的
菌种生化反应检查标准操作规程 依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。 范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。 目的：通过生化试验鉴定所用的菌种是否为标准的大肠杆菌。 原理：枸椽酸盐利用试验原理：枸椽酸盐培养基中仅含一种氮源（铵盐）和唯一碳源（枸椽酸钠）一般细菌能利用磷酸二氢铵作为氮源，但不一定能分解枸椽酸盐而取得碳源，因此可否利用该盐，能将不同细菌鉴别。 吲哚试验原理：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，吲哚本身没有颜色，不能直接观察，所以加入二甲基氨基苯甲醛试剂，使之与吲哚作用形成红色的玫瑰吲哚。 甲基红试验原理：大肠杆菌和产气杆菌在糖代谢中都能分解葡萄糖产生丙酮酸。产气杆菌能将两个分子丙酮酸脱羧生成一个分子中性乙酰甲基甲醇，故培养物中形成酸类较少，使酸碱度PH可在5.4以上，因此加入甲基红指示剂后呈桔黄色，是为甲基红试验阴性，而大肠杆菌能进一步分解丙酮酸，产生酸类较多，使培养物的酸碱度在PH4.5或更低，故甲基红指示剂呈红色，是为甲基红试验阳性。 V-P试验原理：测定细菌分解葡萄糖后能否产生乙酰甲基甲醇，产气杆菌可使丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇，在碱性条件下被空气中的氧气氧化成二乙酰，后者又与培养基蛋白胨中精氨酸所含胍基起作用，生成红色化合物，称为U-P试验阳性。 内容： 1 材料、设备 1．1 材料： 1．1．1 菌种：PBV 888/DH 5α ，来源于主种子批或工作种子批。 1．1．2注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。
1．1．3 试剂 蛋白胨 氯化钠 NaCl 分析纯 葡萄糖 C 6H 12 O 6 分析纯 溴麝香草酚兰 C 27H 28 Br 2 O 5 S 分析纯 对二甲基氨基苯甲醛 C 9H 11 NO 分析纯 戊醇 C 5H 15 O 分析纯 浓盐酸 HCl 分析纯 甲基红 C 15H 15 N 3 O 2 分析纯 无水乙醇 CH 3CH 2 OH 分析纯 氢氧化钠 NaOH 分析纯氢氧化钾 KOH 分析纯α-萘酚 C10H7OH 分析纯 硫酸镁 MgSO 4?7H 2 O分析纯 磷酸氢二钾 K 2HPO 4 分析纯 磷酸二氢铵 NH 4H 2 PO 4 分析纯 枸椽酸钠 C 6H 5 Na 3 O 7 ·2H 2 O 分析纯 琼脂粉分析纯 1．2 器皿 盐水瓶、中试管、胶头滴管、烧杯、量筒（100ml、500ml、1000ml）、吸管（10ml）、试剂瓶（250ml、500ml）。 1．3 仪器、设备 PH计 PHC-3C型上海大中分析仪器厂 电子秤 ES-200A型沈阳腾龙电子仪器公司 电子天平 ACS 太原 恒温培养箱 HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂 水浴箱 6 Liter LKB 生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂 1．4 其它材料 硫酸纸、牛皮纸、片带、橡皮膏、吸球（1ml及10ml）玻棒、接种环、透气栓。
不同生物安全级别微生物菌种操作规程 国家自然科技资源平台 不同生物安全级别微生物菌种操作规程（试行） 《自然科技资源收集整理保存技术规程研究制定》 项目组 二〇〇四年十二月十日 目次 前言 (2) 引言 (3) 1 范围 (4) 2 规范性引用文件 (4) 3 术语、定义、符号、缩写语 (4) 4 确定微生物的危害等级时必须考虑的因素 (6) 4.1 微生物本身的致病特征 (6)
4.2 其它因素 (6) 5. 微生物实验室生物安全防护的基本原则 (6) 6. 不同生物安全级别微生物菌种操作规程 (6) 6.1 生物安全等级Ⅰ级微生物菌种操作规程 (6) 6.1.2 实验室设计和建造的特殊要求 (7) 6.2 生物安全等级Ⅱ级微生物菌种操作规程 (7) 6.2.2 特殊要求 (8) 6.3 生物安全等级Ⅲ级微生物菌种操作规程 (9) 6.4 生物安全等级Ⅳ级微生物菌种操作规程 (10) 前言 本规程由自然科技资源平台建设项目提出。 本规程起草单位：中国农业科学院土壤肥料研究所、中国兽医药品监察所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所、中国食品发酵工业研究院。 本规程主要起草人：叶强、姜瑞波、顾金刚、周宇光、朴春根、张月琴、陈敏、程池等。
引言 微生物可根据其自身或其所产生的毒素的危害程度分为四个不同的生物安全等级。对健康成年人（动物）已知无致病作用的微生物的生物安全级别为一级；对人（动物）或环境具有中等潜在危害的微生物的生物安全级别为二级；主要通过呼吸途径使人（动物）传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物（通常已有预防传染的疫苗）的生物安全级别为三级；对人体（动物）具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物的生物安全级别为四级。 不同生物安全级别微生物菌种的操作，如分离、培养、鉴定和保藏，应在相应生物安全防护的条件下进行。本规范根据当前国家自然科技资源平台建设的总体要求，结合微生物菌种资源的特点制定，便于在微生物菌种资源的收集、保存、鉴定、评价、研究和利用过程中，尽量避免环境和人员受到微生物本身及其代谢产物的危害，实现菌种资源的高效共享和可持续利用。 不同生物安全级别微生物菌种操作规程 1 范围 本规程规定了微生物生物安全分类标准，以及不同生物安全级别防护级别进行微生物的操作规程。 本规程适用于各菌种保藏单位所保藏的菌种资源的操作，如分离、培养、鉴定和保藏。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改（不包括勘误内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。 《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院第424条令） 《兽医实验室生物安全管理规范》（2003年农业部302号公告） WS233-2002 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 OIE 2003 国际动物卫生法典 WHO《实验室生物安全手册》第二版
预防接种技术操作规范 （一）皮内接种法 1.适用疫苗：卡介苗。 2.注射部位：左上臂三角肌外下缘皮内。 3.操作方法： (1)家长抱紧儿童，露出儿童左胳膊； (2)用1ml一次性注射器或蓝芯注射器配4.5号针头吸取1人份摇匀后的疫苗，皮肤常规消毒，等酒精干后，左手绷紧注射部位皮肤，针头斜面向上，与皮肤呈10°～15°角刺入皮内。再用左手拇指固定针管，但不要接触针头部分，然后注入疫苗，使注射部位形成一个圆形皮丘，针管顺时针方向旋转180°角后，拔出针头。勿按摩注射部位。 （二）皮下接种法 1.适用疫苗：麻疹疫苗、乙脑疫苗、流脑疫苗、风疹疫苗和腮腺炎疫苗。 2.接种部位：上臂外侧三角肌下缘附着处皮肤。 3.操作方法： (1)如在儿童左上臂接种，家长取坐位，儿童应坐于家长腿上；家长左臂抱紧儿童，使儿童头部靠在家长左肩部；将儿童右臂置于家长身后；家长用左臂固定儿童双腿，右手握住儿童左手，防止在接种过程中乱动。 (2)接种人员用1ml注射器配上5.5号针头，吸取1人份疫苗后，皮肤常规消毒，左手绷紧局部皮肤，右手持注射器，食指固定针柄，针头斜面向上，与皮肤呈30°～40°角，快速刺入针头长度的1/3～2/3，放松皮肤，左手固定针管，回抽无血，注入疫苗，快速拔出针头，用消毒干棉球稍加按压针眼部位。若有回血，应更换注射部位，重新注射。
（三）肌内接种法 1.适用疫苗：白百破联合疫苗、白破联合疫苗、乙肝疫苗。 2.接种部位：乙肝疫苗为上臂外侧三角肌中部或大腿中部前外侧肌肉。 3.操作方法：上臂外侧三角肌注射 ①如在儿童左上臂接种，家长取坐位，儿童应坐在家长腿上；家长左臂抱紧儿童，使儿童头部靠在家长左肩部；将儿童右臂置于身后；家长用左臂固定儿童双腿，右手握住儿童左手，防止在接种过程中乱动。大年龄儿童可取坐位或立位，注射侧的手叉腰。右上臂接种时相反。 ②用0.5ml或1ml注射器配上6号或5.5号针头吸取1人份疫苗后，皮肤常规消毒，左手将三角肌绷紧，右手持注射器(以执毛笔式)，与皮肤呈90°角，快速刺入针头长度的2/3，固定针管，放松皮肤，回抽无血，注入疫苗后快速拔出针头，用消毒干棉球稍加按压针眼部位。若有回血，应更换注射部位，重新注射。 4.接种白百破联合疫苗、白破联合疫苗、乙肝疫苗等，要将疫苗充分摇匀。 （四）口服法 1.用于口服脊灰疫苗的接种。 2.用消毒的药匙将脊灰疫苗送入儿童口中(液体疫苗可直接滴入)，用凉开水送服咽下。 3.月龄小的儿童，推荐使用液体疫苗。若喂服脊髓灰质炎糖丸疫苗时可将糖丸碾碎，放入药匙内，加少许凉开水溶解成糊状服用，或将糖丸疫苗溶于5ml凉开水中，使其完全溶化口服咽下。 4.口服疫苗时要看服下肚，如儿童服苗后吐出应先饮少量凉开水，休息片刻后再服。
一、由经过培训的人员负责疫苗管理工作。 二、每月制定免疫规划疫苗需用量计划，并上报。 三、免疫规划用疫苗进货渠道正常，符合规定。 四、疫苗领发账目正规齐全，账、苗相符。 五、疫苗储存、运输温度符合要求。 六、领取或分发疫苗时要遵循“先短效期、后长效期”和同批号疫苗“先入库、先 出库”的原则。 七、原则上接种门诊可供一定时间使用的疫苗贮存量，不得超过1个月。 八、疫苗报废需经报告批准。 九、接种实施时严格核对接种疫苗品种，检查外观质量。凡过期、变色、污 染、发霉、有摇不散凝块或异物，无标签或标签不清，安瓿有裂纹的疫苗或冻结过的百白破疫苗、乙肝疫苗，一律不得使用。 平遥县卫生防站
一、疫苗实行专人管理，供应渠道严格执行：市—县—（乡）镇—接种门诊 （接种点）。健全疫苗领发保管制度，建立疫苗领发登记，疫苗的出入账物相符，登记必须有疫苗的名称、数量、生产厂名、批号、失效期、进出数量、结余数量、领取人、备注等。 二、根据现行的免疫程序，本辖区的总人口数，出生率，各年龄组人口数及疫 苗的损耗系数等制订疫苗计划，每年三月前将下一年度的计划免疫用苗数量报上级疾病预防控制机构。 三、疫苗的运输、贮存和使用要严格按照有关的温度要求进行。按照疫苗的品 种、批号分类整齐码放，疫苗纸箱(盒)之间、与冰箱冰柜壁之间均应留有冷气循环通道。分发使用疫苗按照“先短效期、后长效期”和同批疫苗按“先入库，先出库”的原则，存放要整齐，包装标志明显，疫苗之间留出冷气循环通道。 四、健全冷链设备管理制度，建立冷链设备帐目，记录各种设备的品名、型 号、到货时间、数量；建立设备运转与维修记录簿，记录发生故障与维修情况。疫苗过期应及时做好报损手续。 五、冷链设备做到专人管理，定期保养，建立维修、温度记录。冷链设备要有 专人保养，经常擦拭保洁，每日2次观察记录冰箱冰柜运转温度；冷藏包每次用后及时擦净晾干备用，冰排用后及时送回冷冻室冻存。 六、冷链冰箱和冰柜应安放在干燥、通风、避免直射、远离热源的地方，后部 要留有空间，底部要垫搁架，电源线路与插座应专线专用。 七、所有计划免疫冷链设备仅专用于贮存疫苗，任何单位和个人不得挪用，存 放疫苗的冰箱和冷库严禁存放其他物品、过期疫苗。 平遥县卫生防站
百白破/白破联合疫苗接种操作规程 一、接种人员要持证上岗，工作衣帽穿戴整洁。 二、接种前要进一步核实接种对象。同时要向儿童家长或监护人详细询问儿童近期的健康状况、既往疾病史、过敏史及接种疫苗的反应史，凡有禁忌症的应不予接种或暂缓接种，并在接种证、卡上做好记录。 三、疫苗要冷藏保存，使用一次性注射器，严格“一人一针一管一苗”制度。 四、检查疫苗是否有效后，充分摇匀，无菌开启安瓿，准确吸取0.5ml。 五、接种儿童取侧卧位，选臀部外侧1/4处酒精常规消毒，待干后，左手绷紧皮肤，右手持注射器与皮肤呈70～90度角，快速刺入针头的2/3，放松皮肤，回抽无血后注入疫苗，快速拔出针头，用消毒干棉棒稍加按压针眼部位。 六、向儿童家长交代可能出现的反应和注意事项。 七、接种完毕后，让接种对象在观察室内停留30分钟，无反应后方可离开接种门诊。 八、对接种后废弃的注射器和安瓿要正确妥善处理。 脊髓灰质炎疫苗接种操作规程 一、接种人员要持证上岗，工作衣帽穿戴整洁。 二、接种前要进一步核实接种对象。同时要向儿童家长或监护人详细询问儿童近期的健康状况、既往疾病史、过敏史及接种疫苗的反应史，凡有禁忌症的应不予接种或暂缓接种，并在接种证、卡上做好记录。 三、疫苗要放在冷藏包内，做到“苗不离冰”，严格“一人一杯一勺”制度。 四、服苗方法： （一）用一次性小勺将脊髓灰质炎疫苗送入儿童口中（液体疫苗可直接滴入），用凉开水送服咽下。 （二）月龄小的儿童，喂服糖丸疫苗时可将糖丸放入口杯内，加少许凉开水碾碎，溶解成糊状服用。 （三）口服疫苗时要看服下肚，如儿童服苗后吐出，应先饮少量凉开水，休息片刻后再服。 五、向儿童家长交代可能出现的反应和注意事项。 六、接种完毕后，让接种对象在观察室内停留30分钟，无反应后方可离开接种门诊。
菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程
菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程 依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。 范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。 目的：检查该菌种的菌落形态是否与标准大肠杆菌菌落形态一致，并检查是否染有杂菌。原理：将该菌种在LB琼脂平板上划线分离培养，以检查菌落形态以及是否染有杂菌。 内容： 1 材料 1．1 材料 1．1．1 菌种：PBV 888/DH 5α ，来源于主种子批或工作种子批。 1．1．2 注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版的要求。1．1．3 药品 氯化钠 NaCl 分析纯 琼脂粉分析纯 酵母粉 蛋白胨 无水乙醇 CH 3CH 2 OH 分析纯 1．1．4 器皿 平皿、三角烧瓶（3L）、量筒（1L）、玻棒、试剂瓶。1．1．5 其它材料 线绳、牛皮纸、硫酸纸、剪刀、接种环、煤气灯。 1．2 仪器设备 生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂 恒温培养箱 HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂扭力天平 TN-100B型上海第二天平厂 2 方法
2．1 准备工作 2．1．1 生产环境：在十万级洁净间进行。场地摘下“清场合格”标志牌，挂“使用中”标志牌。 2．1．2 器皿的洁净要求 玻璃器皿经洗刷组处理完毕后，用硫酸纸及牛皮纸包好，用线绳系紧，送高压灭菌（121.3℃60分钟）。脱脂棉用硫酸纸、牛皮纸包好，高压灭菌121.3℃60分钟。 2．1．3 调试仪器设备 2．1．3．1确认扭力天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。 2．1．3．2确认恒温培养箱运行状态良好已挂有“运行”标志牌。 2．1．3．3确认生物安全台运行状态良好已挂有“备用”标志牌。 2．2 溶液的配制 2．2．1 LB琼脂培养基的配制1000ml 摘下扭力天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。用扭力天平称取酵母粉5克，蛋白胨10克，NaCl 10克，琼脂粉20克，倒入三角烧瓶中，加注射用水1000ml，用玻棒搅匀，分别用硫酸纸、牛皮纸包口，用线绳扎紧，标明名称、配制时间， 115.6℃30分高压灭菌。 2．2．2 75%酒精溶液1000ml 取750ml无水乙醇，加注射用水定容1000ml，混匀，装入试剂瓶中，贴标签，标明液体名称、浓度、配制日期，室温备用。 2．3操作步骤 2．3．1 摘下生物安全台“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。用75%酒精棉擦拭台内，接通电源，打开风机，无菌风吹30分钟，待已灭菌LB琼脂培养基冷却至50℃左右，倒平板，每皿20-30ml，待凝固后，放入恒温培养箱中，37℃倒置培养24小时，如无杂菌生长，即可继续实验用。 2．3．2 划线分离：用接种环（经火焰灭菌，冷却后）取1环菌种于LB平板上划线分离。 2．3．3 将划线分离的平板置于37℃恒温培养箱中培养24小时。 2．3．4操作结束后，场地摘下“使用中”标志牌，挂上“待处理”标志牌。 3 结果判定 3.1判定标准：菌落形态如为圆形，湿润、光滑，中等大小（直径约2-3mm），即为典型大肠杆菌菌落。
目的：保证微生物检定试验的正常进行。 范围：适用于本公司产品检验中需用的检定用菌种。 责任：质量检验科、菌检室。 内容 1原则 1.1检定用标准菌种。按规定使用由福州市检验所提供的菌种。 1.2应按现行版中国药典附录，传代和制备。 2.菌种的传代 2.1准备需用的培养基，标记上菌名及接种日期。 2.2接种前用1：1000新洁尔灭擦拭工作台面并用紫外光灯照射30分钟以上进行灭菌。 2.3自冰箱取出菌种斜面，应在室温放置20分钟，待其至室温。 2.4进入缓冲间换鞋、戴帽和口罩，用1：1000新洁尔灭洗手，并将培养基及菌种移入接种室。 2.5点燃酒精灯，将菌种斜面的硅胶囊塞通过火焰转动使其松动，以免接种时粘住打不开。酒精灯应放在铺有1：1000新洁尔灭布的糖瓷方盘内，接种操作应在盘上进行，以防止细菌洒出，避免污染。 2.6接种操作，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手持接种棒后端，将白金耳烧红约3-6分钟，随后将全部白金丝及金属棒部份在火焰上烧灼，往返通过3次。右手用无名指、小指及掌部夹住硅胶囊，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拨开硅胶囊，夹在无名指、小指及掌部间并勿使其与任何物品接触，用右手的拇指、食指、中指操作接种棒，将白金耳伸入菌种管内，先在近管壁的琼脂表面靠一下，以稍冷却，再移至菌苔上刮取少量菌苔随即取出接种棒，并使菌种试管口在火焰旁将塞堵上，然后取培养基斜面，照上法在火焰旁打开塞，将白金耳伸入管内至规定的培养基斜面的底部，由底向上，将白金耳轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上，注意只划动一次，切勿重复划动。 2.7取出接种棒，在火焰旁将培养基管的塞堵上，然后将接种过细菌的白金耳在火焰上烧灼灭菌，注意烧灼时，先将白金耳离粘有细菌端的白金丝烧灼至红，使其传热至白金耳，使白金耳上残留的苔烧枯焦，炭化后，才将白金耳移至火焰中直接强热烧灼至红约30分钟。2.8接种完毕后，将菌种及已接种的培养基置于试管架的同一排上，排列整齐，便于操作完毕后进行核对。 3.注意事项 3.1无芽孢的菌种可每月移种一次。 3.2每周必须检查保藏菌种的冰箱的温度、湿度、一次检查菌种管的塞是否松动，如有异常应及时处理。 3.3每次移植培养后，应与原种的编号、名称逐一核对，检查培养特征无误时，在继续保藏。 3.4凡用琼脂斜面保藏菌种时，须用连续三代的培养物对照检查。 3.5保藏细菌的培养基应无糖，其他菌类含糖应≤2%为宜，以免产酸过多，影响菌种保藏。