1.双抗体夹心法
双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。
其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结合，则属于双位点夹心法。若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合，则是双抗原夹心法。
操作步骤：
⑴将特异性抗体包被固相载体McAb。孵育一定时间，使形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体和杂质。
⑵加待检标本，孵育，使标本中的抗原与固相载体上的抗体充分反应，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
⑶加酶标抗体，孵育，使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物。洗涤除去未结合酶标抗体。
⑷加底物显色。固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗原的量。
现多采用针对单一抗原决定簇特异性的单克隆抗体做固相化和酶标抗体，则受检样品和酶标抗体可一次性加入，简化流程，缩短反应时间。若标本中待测抗原浓度过高，抗原可分别与酶标抗体和固相抗体结合而不形成上述夹心复合物(类似于免疫沉淀反应中抗原过剩时的后带现象)，使最终结果低于实际含量(钩状效应)，甚至出现假阴性现象。因此对此类标本应适当稀释后再测定。另外，当血清中存在类风湿因子（RF）时，类风湿因子（RF）可充当抗原，而形成固相抗体-类风湿因子-酶标抗体夹心复合物，从而出现假阳性结果。
2.间接法
此法是测定抗体最常用的方法,属非竞争结合试验。其原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗(针对受检抗体的抗体，如羊抗人IgG抗体)与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。
操作步骤
⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭,阻止待检血清中非特异IgG吸附固相。
⑶加待检血清，孵育，使固相抗原和待检抗体充分结合，洗涤除去未结合的非特异抗体及其他血清成分。
⑷加酶标抗体或酶标SPA，孵育，形成固相抗原-待检抗体-酶标抗抗体(或酶标SPA)复合物。
⑸加底物显色。
间接法由于采用的酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子(如抗人IgG),因此该法只需要换固相抗原，即可用一种酶标二抗检测各种与抗原相应的抗体，具有更广泛的通用性。
3.竞争法
竞争法ELISA可用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行检测。其方法和特点是：①酶标记抗原（抗体）与样品或标准体中的非标记抗原或抗体具有相同的与固相抗体（抗原）结合的能力；②反应体系中，固相抗体（抗原）和酶标抗原（抗体）是固定限量，且前者的结合位点少于酶标记与非标记抗原（抗体）的分子量和；③免疫反应后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原（抗体）的量（酶活性）与样品或标准品中非标记抗原（抗体）的浓度成反比。
操作步骤
⑴将已知抗体包被载体,形成固相抗体。洗涤除去未结合物。
⑵加入待检标本和酶标抗原，孵育，使两者与固相抗体竞争结合。洗涤除去未结合到固相上的游离酶标抗原及其他未结合物。
⑶加底物显色。颜色深浅与待测抗原量成反比。
同理，也可用固相抗原和酶标抗体作试剂，使固相抗原和标本中的待检抗原竞争结合酶标抗体。待检抗原竞争抑制酶标抗体和固相抗原结合，即待检抗原越多，显色越浅。
以抗原测定为例，先将特异性抗体连接于固相载体，分别设置对照管和样品测定管；对照管中仅加酶标抗原，加样后，无非标记抗原竞争，酶标抗原即与固相抗体充分结合；而测定管抗原与后者的结合受到抑制而减少。加酶底物显色后，对照管因固相抗体上结合的酶标抗原多，显色深，测定管则依被检抗原和酶标抗原竞争结合固相抗体程度不同而显色深浅有异：被检抗原多，酶标抗原与固相抗体结合少，底物显色反应弱，色浅；反之呈色深。即结合于固相的酶标抗原量与样品中被检抗原浓度负相关。计算测定管与对照管颜色深度（OD 值）之差，即可确定被检抗原量。
4.捕获法
捕获法（亦称反向间接法）ELISA，主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定。以目前最常用的IgM测定为例，因血清中针对某种抗原的特异性IgM和IgG同时存在，则后者可干扰IgM的测定。因此捕获法的工作原理设计为：先将针对IgM的第二抗体（如羊抗人IgMμ链抗体）连接于固相载体，用以结合（“捕获”）样品中所有IgM（特异或非特异），洗涤出去IgG等无关物质，然后加入特异抗原与待检IgM结合；再加入抗原特异的酶标抗体，最后形成固相二抗- IgM-抗原-酶标抗体复合物，加酶底物作用显色后，即可对样品中待检IgM是否存在及其含量进行测定。
5.其他ELSA
ELSA法由于测定灵敏、特异、操作简便、易于自动化，且无放射性污染等诸多优点，使其不仅成为目前应用最广而且发展最快的一种免疫测定技术。而且在方法学上的改进和衍化，使其不断有各具特点的新测定法问世，如应用生物素-亲和素放大系统（biotin-axidin system，BAS）的ELISA；利用酶催化底物发荧光的酶联免疫荧光测定（enzyme linked immunofluorecence assay，ELFIA），斑点-ELISA（dot-ELISA）和酶联免疫电转移印迹法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB）以及酶联免疫化学发光测定（enzyme linked immunochemiluminescence assay，ELICLA）等。新方法不仅进一步提高了测定灵敏、特异性，而且使ELISA技术在提高自动化程度的同时，也便于单份样本测定和简化设备条件，尤其试用于急诊、社区诊所及家庭化验。
膜载体的酶免疫测定
固相膜免疫测定（solid phase membrane-based immuoassay ）与固相酶免疫测定（ELISA）相类似，其特点是以微孔膜作为固相。标记物可用酶和各种有色微粒子，如彩色乳胶、胶体金、胶体硒等，以红色的胶体金最为常用。固相膜的特点在于其多孔性，像滤纸一样。固相膜可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行。利用这种性能建立了两种不同类型的快速检测方法。常用的固相膜为硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜。
㈠斑点酶免疫吸附试验
斑点-ELISA（dot-ELISA）实验原理与常规的ELISA相同，不同之处在于斑点-ELISA 所用载体为蛋白质具有极强吸附力（近100%）的硝酸纤维素（NC）膜，此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC染色实验方法为：加少量（1~2μl）抗原于膜上，由于NC膜吸附能力强,故需在干燥后进行封闭；然后滴加样品血清，其中的待检抗体即与NC膜上抗原结合；洗涤后再滴加酶标二抗，最后滴加能形成不溶有色物的底物溶液（如HRP标记物，常用二氨基联苯胺）；阳性者即可在膜上出现肉眼可见的染色斑点。斑点-ELISA的优点为：NC膜吸附蛋白力强，微量抗原吸附完全，故检出灵敏度可较普通ELISA高6~8倍；试剂用量教ELISA节约约10倍；操作简单，实验及结果判断不需特殊设备条件；吸附抗原（抗体）或已有结果的NC膜可长期保存（-20℃可长达半年），不影响其活性。
㈡免疫渗滤实验
免疫渗滤实验（IFA）的基本原理是：一硝酸纤维素（NC）膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。免疫渗滤实验最初是从斑点ELISA基础上发展建立起来的，应用的结合物是酶标记的。20世纪90年代初发展了以胶体金为标记物的金免疫渗滤实验（GIFA），省却了酶对底物的反应，更加简单、快速。渗滤装置是IFA中的主要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水塑料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分著称。塑料小盒可以是多种形状的，盒盖的中央有一直径约为0.4~0.8cm的小圆吸孔，盒内垫放吸水塑料，NC膜片安放在正对盒盖的圆孔下，紧密关闭盒盖，是NC膜片贴紧水塑料。如此即制备成一渗滤装置。整个反应过程都在渗滤装置中进行，因此又常称位扁平长方形渗滤装置为反应板。
以双抗体夹心HCG为例，于小孔内滴加标本1~2滴，待完全渗入。此时标本中的HCG 与NC膜上的抗βHCG相结合。再于小孔内滴加结合物试剂1~2滴，待完全渗入，金标记的抗αHCG抗体与NC膜上的HCG形成双抗体夹心复合物。因胶体金为红色，在NC膜上出现红色斑点。在膜中央有清晰的淡红色或红色斑点显示者判断为阳性反应；反之，则为阴性反应，斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。有将包被斑点由圆点式改成短线条式的：质控斑点横向包被成横线条，如“－”‘反应斑点纵向包被成竖线条，如“│”；两者相交成“+”。这样，阳性反应结果在膜上显示红色的正号（+），阴性结果则为负号（－），目视判断直观、明了。
㈢免疫层析实验
免疫层析实验（ICA）是继IFA之后反站起来的另一种膜固相免疫测定。与IFA利用微孔膜的过滤性能不同，ICA中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般。移动过程中被分析物与固定于膜上某一区域的抗原或抗体结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分离，然后通过标记物的显色来判定实验结果。以胶体金为标记物的实验称为金免疫层析实验（GICA）。ICA中所用的试剂全部为干试剂，它们被组合在一试剂条上。试剂条的底版为一单面胶塑料片，A、B两端粘贴有吸水材料。加样端A为样品垫，可用的材料有滤纸、多孔聚乙烯和玻璃纤维等，按分析物和试剂的不同选择合适的
材料。B端为吸水垫，材料则为吸水性强的滤纸为佳。G处为结合物垫，胶体金结合物干燥固定在玻璃纤维膜等材料上。G、B之间粘贴吸附有抗原或抗体的硝酸纤维素膜，抗原或抗体往往以直线的形式包被在膜上。一双抗体夹心法测HCG为例。试条中G处为金标记的抗αHCG，NC膜上T处包被抗βHCG，C处包被抗小鼠IgG抗体。测试时在A端加尿液（或将A端浸入尿液中），通过层析做HCG-HCG复合物；移行至T区，形成金-抗α-HCG-HCG-抗βHCG复合物，在T区显示红色线条，为阳性反应。多余的金标记抗αHCG移行至C 区时被抗小鼠IgG抗体捕获，而显示出红色对照线条。如尿液中不含HCG，在T区不出现红色线条，仅在C区出现红色线条，实验结果为阴性。如C区无红色线条出现，表示实验无效。
双抗体夹心法
⑷加底物显色。固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗原的量。
双位点一步法
操作步骤
⑴将1个McAb与固相载体联结,形成固相McAb。洗涤除去未结合物。
⑵同时加入待测标本和酶标McAb,孵育,使待检抗原和固相McAb及酶标McAb反应形成双抗体夹心复合物。洗涤除去未结合物。
⑶加底物显色。
间接法
操作步骤
⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭,阻止待检血清中非特异IgG吸附固相。
⑶加待检血清,孵育,使固相抗原和待检抗体充分结合,洗涤除去未结合的非特异抗体及其他血清成分。
⑷加酶标抗体或酶标SPA,孵育,形成固相抗原-待检抗体-酶标抗抗体(或酶标SPA)复合物。
⑸加底物显色。
双抗原夹心法
操作步骤
⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原。洗涤除去未结合物。
⑵加入待检标本,孵育,使待检抗体和固相结合。洗涤除去未结合物。
⑶加入酶标抗原,孵育,形成固相抗原-待检抗体-酶标抗原复合物。洗涤除去未结合物。
⑷加底物显色。
竞争法
操作步骤
⑴将已知抗体包被载体,形成固相抗体。洗涤除去未结合物。
⑵加入待检标本和酶标抗原,孵育,使两者与固相抗体竞争结合。洗涤除去未结合到固相上的游离酶标抗原及其他未结合物。
⑶加底物显色。颜色深浅与待测抗原量成反比。
同理,也克用固相抗原和酶标抗体作试剂,使固相抗原和标本中的待检抗原竞争结合酶标抗体。待检抗原竞争抑制酶标抗体和固相抗原结合,即待检抗原越多,显色越浅。
1.双抗体夹心法 双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。 其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结合，则属于双位点夹心法。若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合，则是双抗原夹心法。 操作步骤： ⑴将特异性抗体包被固相载体McAb。孵育一定时间，使形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体和杂质。 ⑵加待检标本，孵育，使标本中的抗原与固相载体上的抗体充分反应，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。 ⑶加酶标抗体，孵育，使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物。洗涤除去未结合酶标抗体。 ⑷加底物显色。固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗原的量。 现多采用针对单一抗原决定簇特异性的单克隆抗体做固相化和酶标抗体，则受检样品和酶标抗体可一次性加入，简化流程，缩短反应时间。若标本中待测抗原浓度过高，抗原可分别与酶标抗体和固相抗体结合而不形成上述夹心复合物(类似于免疫沉淀反应中抗原过剩时的后带现象)，使最终结果低于实际含量(钩状效应)，甚至出现假阴性现象。因此对此类标本应适当稀释后再测定。另外，当血清中存在类风湿因子（RF）时，类风湿因子（RF）可充当抗原，而形成固相抗体-类风湿因子-酶标抗体夹心复合物，从而出现假阳性结果。 2.间接法 此法是测定抗体最常用的方法,属非竞争结合试验。其原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗(针对受检抗体的抗体，如羊抗人IgG抗体)与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。 操作步骤 ⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。 ⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭,阻止待检血清中非特异IgG吸附固相。 ⑶加待检血清，孵育，使固相抗原和待检抗体充分结合，洗涤除去未结合的非特异抗体及其他血清成分。 ⑷加酶标抗体或酶标SPA，孵育，形成固相抗原-待检抗体-酶标抗抗体(或酶标SPA)复合物。 ⑸加底物显色。 间接法由于采用的酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子(如抗人IgG),因此该法只需要换固相抗原，即可用一种酶标二抗检测各种与抗原相应的抗体，具有更广泛的通用性。
1. 双抗体夹心法双抗体夹心法,属于非竞争结合测定.它是检测抗原最常用的ELISA, 适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原,而不能用于小分子半抗原的检测. 其基本工作原理是:利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合,形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物.由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量 与待测抗原的含量成正比（在方法可检测范围内）. 测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量（OD 值）,即可确定待测抗原含量. 若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结合,则属于双位点夹心法.若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合,则是双抗原夹心法. 操作步骤: ⑴将特异性抗体包被固相载体McAb. 孵育一定时间,使形成固相抗体,洗涤除去未结合的抗体和杂质. ⑵加待检标本,孵育,使标本中的抗原与固相载体上的抗体充分反应,形成固相抗原抗 体复合物.洗涤除去其他未结合物质. ⑶加酶标抗体,孵育,使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物.洗涤除去未结合酶标抗体. ⑷加底物显色.固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗原的量. 现多采用针对单一抗原决定簇特异性的单克隆抗体做固相化和酶标抗体,则受检样 品和酶标抗体可一次性加入,简化流程,缩短反应时间.若标本中待测抗原浓度过高,抗原可分别与酶标抗体和固相抗体结合而不形成上述夹心复合物（类似于免疫沉淀反应中抗原过剩时的后带现象）,使最终结果低于实际含量（钩状效应）,甚至出现假阴性现象.因此对此类标本应适当稀释后再测定.另外，当血清中存在类风湿因子（RF）时，类 风湿因子（RF）可充当抗原而形成固相抗体-类风湿因子-酶标抗体夹心复合物，从而出现假阳性结果. 2. 间接法此法是测定抗体最常用的方法,属非竞争结合试验.其原理是将抗原连接到固相载体上,样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物,再用酶标二抗（针对受检 抗体的抗体,如羊抗人IgG 抗体）与固相免疫复合物中的抗体结合,形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物,测定加底物后的显色程度,确定待测抗体含量. 操作步骤 ⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原.洗涤除去未结合的抗原及杂质. ⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭，阻止待检血清中非特异IgG吸附固相. ⑶加待检血清,孵育,使固相抗原和待检抗体充分结合,洗涤除去未结合的非特异抗体及其他血清成分. ⑷加酶标抗体或酶标SPA,孵育,形成固相抗原彳寺检抗体-酶标抗抗体（或酶标SPA复合物. ⑸加底物显色. 间接法由于采用的酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子（如抗人IgG）,因此该法只需要换固相抗原,即可用一种酶标二抗检测各种与抗原相应的抗体,具有更广泛的通用性. 3. 竞争法
１。双抗体夹心法 双抗体夹心法,属于非竞争结合测定、它就是检测抗原最常用得ELISA,适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇得多价抗原,而不能用于小分子半抗原得检测。 其基本工作原理就是:利用连接于固相载体上得抗体与酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合,形成固相抗体—抗原－酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体与酶标抗体得量相对于待测抗原就是过量得,因此复合物得形成量与待测抗原得含量成正比(在方法可检测范围内)、测定复合物中得酶作用于加入得底物后生成得有色物质量(OＤ值),即可确定待测抗原含量、若固相载体上得抗体与酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同得抗原决定簇结合,则属于双位点夹心法。若采用固相载体上得抗原与酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合,则就是双抗原夹心法、 操作步骤: ⑴将特异性抗体包被固相载体MｃAb。孵育一定时间,使形成固相抗体,洗涤除去未结合得抗体与杂质。 ⑵加待检标本,孵育,使标本中得抗原与固相载体上得抗体充分反应,形成固相抗原抗体复合物、洗涤除去其她未结合物质。 ⑶加酶标抗体,孵育,使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物。洗涤除去未结合酶标抗体。 ⑷加底物显色。固相上得酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗原得量、 现多采用针对单一抗原决定簇特异性得单克隆抗体做固相化与酶标抗体,则受检样品与酶标抗体可一次性加入,简化流程,缩短反应时间、若标本中待测抗原浓度过高,抗原可分别与酶标抗体与固相抗体结合而不形成上述夹心复合物(类似于免疫沉淀反应中抗原过剩时得后带现象),使最终结果低于实际含量(钩状效应),甚至出现假阴性现象。因此对此类标本应适当稀释后再测定。另外,当血清中存在类风湿因子(RF)时,类风湿因子(RF)可充当抗原,而形成固相抗体—类风湿因子－酶标抗体夹心复合物,从而出现假阳性结果、 ２。间接法 此法就是测定抗体最常用得方法,属非竞争结合试验、其原理就是将抗原连接到固相载体上,样品中待测抗体与之结合成固相抗原—受检抗体复合物,再用酶标二抗(针对受检抗体得抗体,如羊抗人IgG抗体)与固相免疫复合物中得抗体结合,形成固相抗原-受检抗体—酶标二抗复合物,测定加底物后得显色程度,确定待测抗体含量。 操作步骤 ⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原。洗涤除去未结合得抗原及杂质。 ⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭,阻止待检血清中非特异ＩgＧ吸附固相。 ⑶加待检血清,孵育,使固相抗原与待检抗体充分结合,洗涤除去未结合得非特异抗体及其她血清成分。 ⑷加酶标抗体或酶标SPA,孵育,形成固相抗原－待检抗体-酶标抗抗体(或酶标ＳPA)复合物。 ⑸加底物显色、 间接法由于采用得酶标二抗就是针对一类免疫球蛋白分子(如抗人IgＧ),因此该法只需要换固相抗原,即可用一种酶标二抗检测各种与抗原相应得抗体,具有更广泛得通用性。 3、竞争法 竞争法ＥLISA可用于抗原与半抗原得定量测定,也可对抗体进行检测。其方法与特点
ELISA操作步骤（双抗体夹心法） 1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照): 将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体，(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)。 2 PBS洗3次，每次3分钟。 具体为.吸干或甩干孔内反应液；.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；吸干孔内液体，可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；.重复操作涤3次。 3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度): 检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl。将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔100μl，置于37℃,40-60min。 4 PBS洗3次，每次3分钟。 5. 加入酶标抗体: 酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度，37℃,30-60min 之间，短于30min往往结果不稳定，每孔加100μl。 6 PBS洗3次，每次3分钟。 7. 加入底物液(现用现配): TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O232μl，底物加入量每孔100μl（TMB空白显色孔除外）,置37℃避光放置20-25分钟。 8. 终止反应: 每孔加入终止液50μl(2M H2SO4)终止反应,此时蓝色立转黄色，于20min内测定实验结果。 9 结果判断: 可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。也可测吸光值：在ELISA检测仪上，TMB反应产物检测需要450nm波长，检测时一定要首先进行空白孔系统调零。用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为抗体的效价即大于阴性对照吸光值的2倍，(数值的大小依具体检测要求而定)。
双 抗体夹心 法原理 以FABP 为例（检测抗原） 阳性反应 Y1=F14A （标记了胶体金） Y2=F104B （固定在NC 膜上即T 线） Y3=羊抗鼠IgG （固定在NC 膜上即C 线） 此方法较常用，主要用于较大分子量的蛋白（抗原）的检测。要求两株抗体针对一个抗原的不同位点才可以。也有个别的检测项目是双抗原夹心检测抗体的，原理类似。 竞争法原理 以吗啡为例（检测抗原） 样品（血清）含FABP 蛋白 金标记F14A 抗体 金-F14A-FABP 金-F14A-FABP-F14A 金-F14A-羊抗鼠IgG 金-F14A-FABP 羊抗鼠IgG 显示红色 显示红色 金标记F14A 抗体 不显色 显示红色 金-F14A-羊抗鼠IgG 阴性反应 阳性反应
阳性反应 Y1=胶体金标记的吗啡单抗 Y2=吗啡-BSA 偶联物 Y3=羊抗鼠 此方法主要用于小分子抗原（毒品、农药、肽链等）的检测。由于抗原分子量小不能直接固定于NC 膜上，常常用化学方法把小分子偶联到BSA 等大分子物质上再固定于NC 膜上。此结果与双抗原夹心法相反，阴性CT 两条都是红线，阳性只有C 线一条红线。 间接法原理 以HIV 为例（检测抗体） 金-吗啡抗体-吗啡 吗啡-BSA 金标记吗啡抗体 显示红色 不显色 金-吗啡抗体-吗啡 羊抗鼠 样品（尿液）含吗啡 显示红色 显示红色 金标记吗啡抗体 金-吗啡抗体-羊抗鼠 阴性尿液抗体-吗 显示红色 显示红色 阴性反应 阳性反应
此方法主要用于血清中抗体检测，纯化或者重组的抗原固定于NC 膜上，标记多为蛋白A(ProteinA 或叫SPA ，抗体Fc 端结合而与其它蛋白质不结合)。此方法要求胶体金过量，一般来说样品再加入前需要稀释或者加极少量后再加缓冲液。 斑点免疫渗滤法使用就是间接法。 显示红色 不显色
双抗体夹心ELISA法检测CEA 一、实验目的 1. 阐述酶联免疫吸附测定(ELISA)的原理，列举ELISA类型 2. 完成ELISA的基本操作 3. 学会分析实验结果 4. 能根据需要设计相应的ELISA实验流程 二、实验原理 酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。 ELISA 类型：直接法（一步法）；间接法（间接ELISA、双抗体/原夹心法，竞争性ELISA、BAS-ELISA）。 1. 已知的抗原或抗体结合到特定的固相载体表面（聚苯乙烯微量反应板，利用蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附），并保持其免疫学活性。 将抗原或抗体固定在固相载体表面的过程称为包被(coating)。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。 包被用抗原分为——天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。 合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。 2. 抗原抗体的特异性结合：可用于以已知抗原检测未知抗体或以已知抗体检测未知抗原。本实验采用以已知抗体检测未知抗原。 3. 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。结合在固相载体上的酶量与标本中待测抗原或抗体的量成正比。 （制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。抗原必须是高纯度的。） 4. 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果,还可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶催化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定（30min内），否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 ELISA法中所用的酶要求纯度高，催化反应的转化率高，转一性强，性质稳定，继续保留它的活性部位和催化能力。 HRP的色原底物： OPD（邻苯二胺）被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由过氧化氢(H202) 氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯(DAB）。缺点：实际工作中，用强酸尤其
双抗体夹心法原理 以FABP 为例（检测抗原） 阳性反应 Y1=F14A （标记了胶体金） Y2=F104B （固定在NC 膜上即T 线） Y3=羊抗鼠IgG （固定在NC 膜上即C 线） 此方法较常用，主要用于较大分子量的蛋白（抗原）的检测。要求两株抗体针对一个抗原的不同位点才可以。也有个别的检测项目是双抗原夹心检测抗体的，原理类似。 样品（血清）含FABP 蛋白 金标记F14A 抗体 金-F14A-FABP 金-F14A-FABP-F14A 金-F14A-羊抗鼠IgG 金-F14A-FABP 羊抗鼠IgG 显示红色 显示红色 金标记F14A 抗体 不显色 显示红色 金-F14A-羊抗鼠IgG 阴性反应 阳性反应
竞争法原理 以吗啡为例（检测抗原） 阳性反应 Y1=胶体金标记的吗啡单抗 Y2=吗啡-BSA 偶联物 Y3=羊抗鼠 此方法主要用于小分子抗原（毒品、农药、肽链等）的检测。由于抗原分子量小不能直接固定于NC 膜上，常常用化学方法把小分子偶联到BSA 等大分子物质上再固定于NC 膜上。此结果与双抗原夹心法相反，阴性CT 两条都是红线，阳性只有C 线一条红线。 金-吗啡抗体-吗啡 吗啡-BSA 金标记吗啡抗体 显示红色 不显色 金-吗啡抗体-吗啡 羊抗鼠 样品（尿液）含吗啡 显示红色 显示红色 金标记吗啡抗体 金-吗啡抗体-羊抗鼠 阴性尿液抗体-吗 阴性反应 阳性反应
间接法原理 以HIV 为例（检测抗体） 显示红色显示红色 显示红色 不显色 此方法主要用于血清中抗体检测，纯化或者重组的抗原固定于NC膜上，标记多为蛋 白A(ProteinA或叫SPA，抗体Fc端结合而与其它蛋白质不结合)。此方法要求胶体金 过量，一般来说样品再加入前需要稀释或者加极少量后再加缓冲液。 斑点免疫渗滤法使用就是间接法。
ELISA双抗体夹心法 点击次数：320 作者：百奥迈科发表于：2009-03-13 16:18转载请注明来自丁香园 1、原理 ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 2、特点 某些分泌型蛋白，用siRNA 干扰后可以用ELISA 进行检测。 3、ELISA 实验流程示图（以双抗体夹心法为例） 4、试剂与耗材 （1）包被缓冲液（pH 9.6 0.05 M 碳酸盐缓冲液）： （2）洗涤缓冲液（pH 7.4，0.15 M PBS）：
（3）稀释液： （4）终止液（2 M H2SO4）： （5）底物缓冲液（pH 5.0）： （6）四甲基联苯胺（TMB）使用液： （7）2，2’-连氮基-双-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS）使用液：
（8）抗原、抗体和酶标记抗体：按说明书处理。 （9）标准品：用稀释液稀释成梯度浓度溶液。 （10）96 孔聚苯乙烯塑料板（酶标板）。 2、实验步骤（双抗体夹心法）： （1）包被：用包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10 μg/mL。在酶标板反应孔中加0.1 mL，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。 （2）加样：加一定浓度稀释的待检样品（同时做空白对照，阴性对照孔及阳性对照）0.1 mL 于上述已包被的反应孔中，置湿盒中，37℃， 1 hr。用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。 （3）加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。 37℃，0.5 - 1 hr，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。 （4）加底物液显色：于各反应孔中加入现配的TMB 底物溶液0.1 mL，37 ℃，10 - 30min。 （5）终止反应：于各反应孔中加入终止液0.05 mL。 （6）结果判定：将酶标板在酶标仪上，于450 nm （若ABTS 显色，读410 nm），读数，输出到Excel 中。 （7）以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，生成标准曲线和直线回归方程式，根据公式计算未知样品的浓度，并记录。
E L I S A操作步骤(双抗 体夹心法)
ELISA操作步骤（双抗体夹心法） 1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照): 将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体，(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)。 2 PBS洗3次，每次3分钟。 具体为.吸干或甩干孔内反应液；.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；吸干孔内液体，可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；.重复操作涤3次。 3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度): 检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl。将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔100μl，置于37℃,40-60min。 4 PBS洗3次，每次3分钟。 5. 加入酶标抗体: 酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度，37℃,30-60min之间，短于30min往往结果不稳定，每孔加100μl。 6 PBS洗3次，每次3分钟。 7. 加入底物液(现用现配): TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O232μl，底物加入量每孔100μl（TMB空白显色孔除外）,置37℃避光放置20-25分钟。 8. 终止反应: 每孔加入终止液50μl(2M H2SO4)终止反应,此时蓝色立转黄色，于20min内测定实验结果。 9 结果判断: 可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。也可测吸光值：在ELISA检测仪上，TMB反应产物检测需要450nm波长，检测时一定要首先进行空白孔系统调零。用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为抗体的效价即大于阴性对照吸光值的2倍，(数值的大小依具体检测要求而定)。
ELISA双抗体夹心法检测抗原 实验时间：实验地点：实验人： 1实验目的 1.阐述ELISA（酶联免疫吸附测定）的原理，列举ELISA类型 2.完成ELISA的基本操作 3.学会分析实验结果 4.能根据需要设计相应的ELISAS实验流程 2实验原理 ELISA：是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。 ELISA双抗体夹心法常用于检测抗原。将已知道抗体吸附于固相载体上，加入待检含相应抗原的标本使之结合反应。然后洗涤，再加入酶标抗体和底物进行测定。但该方法只适用于检测多价大分子抗原，不适合检测小分子半抗原。 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。通过加入与酶反应的底物后显色，根据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量，进行定性或定量的分析，可以间接放大免疫反应结果。所以说ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果,还可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 3实验材料 1.酶标反应板（包被有抗CEA抗体） 2.CEA标准品（0ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml） 3.样品1和样品2 4.酶标抗体（酶结合物） 5.底物液A和底物液B（显色剂A和B） 6.终止液 7.洗涤液
ELISA（双抗体夹心法）—检测HBsAg 摘要： 以已知抗体(抗HBs)包被载体，然后将含有抗原的待检标本加入，共同孵育后，抗原结合于包被抗体上，再加入酶标记特异抗体(酶标抗HBs)，酶标抗体连接到抗原上，最后加入底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。【材料】HBsAg试剂盒，本试剂盒含: 1、包被抗-HBs反应条 1瓶 2、酶结合物 1瓶 3、HBsAg阳性对照 1瓶 4、HBsAg阴性对照 1瓶 5、洗涤液:用前每瓶作1：20稀释 1瓶 6、显色剂（ 相关专题 以已知抗体(抗HBs)包被，然后将含有的待检标本加入，共同孵育后，结合于包被抗体上，再加入酶标记特异抗体(酶标抗HBs)，酶标抗体连接到抗原上，最后加入底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。 【材料】HBsAg试剂盒，本试剂盒含: 1、包被抗-HBs反应条 1瓶 2、酶结合物 1瓶 3、HBsAg阳性对照 1瓶 4、HBsAg阴性对照 1瓶 5、洗涤液:用前每瓶作1：20稀释 1瓶 6、显色剂(TMB)A
1瓶 7、显色剂(TMB)B 1瓶 8、终止液 1瓶 【方法】 1、加入待测标本每孔0.05ml，并设HBsAg阳性对照2孔，HBsAg阴性对照2孔，空白对照1孔，然后加入酶结合物每孔1滴(0.05ml、空白对照孔不加)，充分 混匀后置37℃孵育30分钟。 2、洗板:弃去反应条孔内液体、拍干、用洗涤液注满每孔，弃去拍干，反复五 次后拍干。 3、显色剂:先加显色剂A每孔1滴(0.05ml)，然后再加显色剂B每孔1滴 (0.05ml)，混匀，37℃孵育10分钟。 4、每孔加终止液1滴(0.05ml)，混匀。 【结果】 比色法:波长450nm，先用空白孔校零点，然后读取各孔光密度值。 样品OD值/阴性对照平均OD值≥ 2.1判断为阳性，否则为阴性。 备注：阴性对照平均OD值低于0.05作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。阳性对照OD值≥0.8，实验结果有效。 【注意事项】 1、试剂盒置2℃～8℃保存。 2、使用前试剂应摇匀，并弃去1～2滴后垂直滴加。 3、从冷藏环境中取出试剂盒内全部瓶装试剂及待测标本所需微孔条，置室温平衡30分钟后再行测试，余者应及时封存于冰箱中以备后用。
E L I S A双抗体夹心法—检 测H B s The latest revision on November 22, 2020
ELISA（双抗体夹心法）—检测HBsAg 摘要： 以已知抗体(抗HBs)包被载体，然后将含有抗原的待检标本加入，共同孵育后，抗原结合于包被抗体上，再加入酶标记特异抗体(酶标抗HBs)，酶标抗体连接到抗原上，最后加入底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。【材料】HBsAg试剂盒，本试剂盒含: 1、包被抗-HBs反应条 1瓶 2、酶结合物 1瓶 3、HBsAg阳性对照 1瓶 4、HBsAg阴性对照 1瓶 5、洗涤液:用前每瓶作1：20稀释 1瓶 6、显色剂（ 相关专题 以已知抗体(抗HBs)包被，然后将含有的待检标本加入，共同孵育后，结合于包被抗体上，再加入酶标记特异抗体(酶标抗HBs)，酶标抗体连接到抗原上，最后加入底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。 【材料】HBsAg试剂盒，本试剂盒含: 1、包被抗-HBs反应条 1瓶
2、酶结合物 1瓶 3、HBsAg阳性对照 1瓶 4、HBsAg阴性对照 1瓶 5、洗涤液:用前每瓶作1：20稀释 1瓶 6、显色剂(TMB)A 1瓶 7、显色剂(TMB)B 1瓶 8、终止液 1瓶 【方法】 1、加入待测标本每孔，并设HBsAg阳性对照2孔，HBsAg阴性对照2孔，空白对照1孔，然后加入酶结合物每孔1滴、空白对照孔不加)，充分混匀后置37℃孵育30分钟。 2、洗板:弃去反应条孔内液体、拍干、用洗涤液注满每孔，弃去拍干，反复五次后拍干。 3、显色剂:先加显色剂A每孔1滴，然后再加显色剂B每孔1滴，混匀，37℃孵育10分钟。 4、每孔加终止液1滴，混匀。 【结果】
钩状效应是指在双抗体夹心法测抗原的一步法ELISA中，测定显色随着待测标本中抗原浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直到不显色，而出现假阴性结果。 抗原抗体最适比例 在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物（沉淀）的量见图1。曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带（zone of equivalence）。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定中称为带现象（zone phenomenon）。抗体过量称为前带（prezone），抗原地过量称为后带（postzone）。在用免疫学方法测定抗原时，应使反应系统中有足够的抗体量，否则测得的量会小于实际含量，甚至出现假阴性。 图1沉淀反应中沉淀量与抗原抗体的比例关系 （RF）的双抗体夹心法测抗原 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： 1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。 3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。 如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。 在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），
E L I S A（双抗体夹心法）—检测H B s A g 摘要： 以已知抗体(抗HBs)包被载体，然后将含有抗原的待检标本加入，共同孵育 后，抗原结合于包被抗体上，再加入酶标记特异抗体(酶标抗HBs)，酶标抗体 连接到抗原上，最后加入底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。【材 料】HBsAg试剂盒，本试剂盒含: 1、包被抗-HBs反应条 1瓶 2、酶结合物 1 瓶 3、HBsAg阳性对照 1瓶 4、HBsAg阴性对照 1瓶 5、洗涤液:用前每瓶作1：20稀释 1瓶 6、显色剂（ 找产品，上生物帮 >> >> 相关专题 ELISA免疫实验技术 以已知抗体(抗HBs)包被载体，然后将含有抗原的待检标本加入，共同孵育后，抗原结合于包被抗体上，再加入酶标记特异抗体(酶标抗HBs)，酶标抗体连接到抗原上，最后加入底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。 【材料】HBsAg试剂盒，本试剂盒含: 1、包被抗-HBs反应条 1瓶
2、酶结合物 1瓶 3、HBsAg阳性对照 1瓶 4、HBsAg阴性对照 2、洗板:弃去反应条孔内液体、拍干、用洗涤液注满每孔，弃去拍干，反复五次后拍干。 3、显色剂:先加显色剂A每孔1滴(0.05ml)，然后再加显色剂B每孔1滴(0.05ml)，混匀，37℃孵育10分钟。 4、每孔加终止液1滴(0.05ml)，混匀。 【结果】
比色法:波长450nm，先用空白孔校零点，然后读取各孔光密度值。 样品OD值/阴性对照平均OD值≥ 2.1判断为阳性，否则为阴性。 备注：阴性对照平均OD值低于0.05作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。阳性对照OD值≥0.8，实验结果有效。 【注意事项】 1、试剂盒置2℃～8℃保存。
ELISA双抗体夹心法 摘要： ELISA双抗体夹心法(enzyme linked immunosorbent assay——sandwich technique)的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待 检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复 合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原 含量。以检测HbsAg为例。 找产品，上生物帮>> >> 相关专题 生物帮之抗体制备 【原理】 ELISA双抗体夹心法(enzyme linked immunosorbent assay——sandwich technique)的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待 检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复 合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原 含量。以检测HbsAg为例。 【材料】 酶标抗体(HRP-抗HBs-IgG)、抗HBs-IgG、待检血清 包被液 pH9.5 0.05 mol/L CB 稀释液 pH7.4 0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液 底物液0.1 mol/L Na2HPO4(Na2HPO4·12H2O 35.8 g/L)5.14 ml，0.05 mol/L 枸橼酸(10.5g/L)4.86 ml混匀，加入邻苯二胺(OPD)4 mg，置棕色小瓶中，临 用时加30% H2O2 4.0μl，混匀。 终止液 2 mol/L H2SO4 温箱、酶标反应板、酶标分光光度计 【方法】 1. 包被取包被液适当稀释的抗HBS-Ig 0.1 ml，加到聚苯乙烯反应板各孔中。加盖，4℃ 24h。次日用洗涤液充分洗涤3次，甩干。