电化学发光免疫测定
电化学发光免疫测定
电化学发光反应:电化学发光(electro-chemiluminescence,ECL是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应,实际上包括了电化学和化学发光两个过程。化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy3]2+(图1和电子供体三丙胺(TPA在阳电极表面同时各失去一个电子发生氧化反应(图2。二价的[Ru(bpy3]2+被氧化成三价,后者是一种强氧化剂。TPA 被氧化成阳离子自由基TPA+*(参见图2,后者很不稳定,自发地失去一个质子(H+,形成自由基TPA*,这是一种非常强的还原剂。这两个高反应基团在电极表面迅速反应,三价的[Ru(bpy3]3+被还原形成激发态的二价
[Ru(bpy3]2+*,能量来源于[Ru(bpy3]3+和TPA*之间存在的高电化学电位差。TPA*自身被氧化成二丙胺和丙醛。接着激发态的 [Ru(bpy3]2+*衰减成基态的[Ru(bpy3]2+,同时发射一个波长620nm的光子。这一过程在电极表面周而复始地进行,产生许多光子,使光信号得以增强。
图1 三联吡啶钌NHS
Ru2+*
-H+光子
TPA* Ru3+ Ru2+
TPA+*
TPA
+ -e -e +
图2 在电极表面的ECL反应
Ru2+: [ Ru(bpy3] 2+基态
Ru3+: [Ru(bpy3]3+氧化态
Ru2+*: [Ru(bpy3]2+* 激发态
二、电化学发光免疫测定
以三联吡啶钌作为标记物,标记抗原或抗体,通过免疫反应及ECL反应,即可进行电化学发光免疫测定(ECLIA。在实际应用中则尚有特定的仪器和试剂。瑞士罗氏公司(ROCHE的Elecsys ECLIA系统,综合了各种先进技术,具有独特的优越性,已在医学检验中取得广泛应用。
Elecsys全自动分析仪分成两个部分:在试管内化学反应部分和在流动池内的ECL反应部分。
(一试管内的化学反应
1、试剂的组成
在Elecsys试剂的制备中,包括电化学发光剂的标记和抗原或抗体的固相化,应用了多种先进技术,简述如下:
(1电化学发光剂的标记
[Ru(bpy3]2+需经化学修饰形成活化的衍生物后才能与抗体或抗原形成结合物。有多种活性基团可与[Ru(bpy3]2+分子中的砒啶基反应。在Elecsys试剂中采用的是N羟基琥珀酰胺酯(NHS(图1。该衍生物具有水溶性,可与抗体、蛋白质抗原、半抗原、激素、核酸等各种分子结合形成稳定的标记物。而且[Ru(bpy3]2+NHS分子量很小,与免疫球蛋白结合的分子比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免疫活性。
(2固相载体
Elecsys中采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8μm的聚苯乙烯微粒。其特点是表面积极大,吸附效率高;在液体中形成均匀的悬液,参与反应时类似液相,反应速度快。由于带有磁性,在游离标记物与结合标记物分离时,只需用磁铁吸引,方便迅速。
(3链霉亲和素与生物素系统的应用
链霉亲和素(streptoavidin,SA和生物素(biotin,B是具有很强的非共价相互作用的一对化合物。一分子SA 可与4分子B相结合。在Elecsys的试剂中,SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在磁性微粒上,形成通用的能与B结合的固相载体。另一试剂为与经活化的B衍生物化合的抗原或抗体。两种试剂混合时,B化合的抗原或抗体即结合在磁性微粒上。
2、在试管中的反应
反应分两个步骤。以双抗体夹心法测抗原为例,试剂含以下组分:
a、[Ru(bpy3]2+标记的抗体
b、生物素化合的抗体
c、SA磁性微粒
d、TPA溶液
e、洗涤液
(1步骤一
在试管中加试剂a、b及待测标本(含抗原,反应式如下(图3。反应在液相中进行,37o C下5-10分钟内完成。
(2步骤二:在上述反应液中加入试剂c,反应式如下(图4。
反应在接近液相的条件中进行,37OC下5-10分钟内完成。下一个步骤为结合的标记抗体与游离的标记抗体相分离,此步骤及以下的电化学发光反应,在Elecsys 的流动池中进行。
(二流动池中的电化学发光反应
1、流动池的基本结构
流动池是电化学发光过程中所有电化学发光反应进行的场所(图5。反应液由蠕动泵运送入流动池,反应后由流动池流出。一个激发电极在流动池的下方,两个测定电极安装在激发电极上方的两侧,留出一个清晰的窗口以便使发射的光子被光电倍增管收集。在流动池下装置可移动的用以吸引磁性微粒的磁铁。
2、电化学发光反应的步骤
(1将试管内两步反应结束的反应液输入流动池,由于磁铁吸引,磁性微粒被吸着在电极上,其余反应物流出流动池,完成游离的和结合的标记抗体的分离。
(2将TPA溶液送入流动池,将残余的游离标记抗体排出流动池,在流动池中充满TPA溶液。
(3撤下磁铁,电极上通电,三联吡啶钌与TPA发生电化学发光反应,发出的光被光电倍增管收集,测定光强度。
(4通过换算得出待测标本中的抗原浓度。
(5在流动池中送入清洗液,将反应物彻底冲洗,即可测定下一个标本。
一、主要技术特点
1、电化学发光反应原理
化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy3]2+和电子供体(TPA在阳极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。二价的[Ru(bpy3]2+被氧化成三价,这是一种很强的氧化剂。TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA+*,它很不稳定,可自发地失去一个质子(H+,形成自由基TPA*,这是一种很强的还原剂,可将一个电子递给三价的
[Ru(bpy3]3+使其形成激发态的[Ru(bpy3]2+*。激发态的三联吡啶钌[Ru(bpy3]2+*不稳定,很快发射出一个波长
620nm的光子,回复成基态的三联吡啶钌[Ru(bpy3]2+。这一过程可以在电极表面周而复始地进行,产生许多光子,使光信号增强。
2、电化学发光的标记物
电化学发光的标记物-三联吡啶钌的分子结构简单,分子量小,可以标记于任何抗原、抗体及核酸,在一个抗体等分子上可同时标记>20个标记物分子,不影响抗体的活性,用于核酸标记亦不影响探针杂交活性。三联吡啶钌是水溶性,高稳定的小分子,它可以确保电化学发光的高效性和稳定性,并无噪音干扰。
3、专利的包被技术
罗氏公司应用了专利的链霉亲和素-生物素包被技术。链霉亲和素-生物素是最牢固特异的结合,因此可以达到牢固和均一的包被效果。一个链霉素亲和素可以和四个生物素结合,因此可以成倍增加生物素化抗体(抗原的包被量,具有信号放大的作用,提高了检测灵敏度。
4、独特的载体
由聚苯乙烯包被的直径为2.8微米的磁性微球作为载体,大而均一的表面积能包被最大量的链霉亲和素,载体悬浮在反应体系中,使异相反应类似均相反应,大大加快反应速度。
5、磁性分离技术
使用磁铁将结合标记抗原抗体复合物的磁性微粒（结合相）吸附于电极上，而游离相则由缓冲液冲走，电极表面的电化学发光的信号检测完成后，磁铁移走并使用系统清洗液冲走电极表面的结合标记抗原抗体复合物的磁性微粒（结合相），为下一次测定做准备，由于测量池清洗彻底，避免了交叉污染，实现了结合相和游离相的全自动化分离。 6、超越 7 个数量级的测定线性发光信号检测的宽线性加上电化学发光独特的标记物本身（发光底物）循环发光和专利的链霉亲和素-生物素包被技术的信号放大做用使电化学发光测定的线性范围最大超越 7 个数量级。 7、电化学发光试剂的稳定性电化学发光的标记物三联吡啶钌在无电场和递电子体（三丙胺）存在的自然环境下非常稳定，因此用它标记的抗原（抗体）试剂也非常稳定。 8、超高的测定灵敏度和线性先进的检测原理和应用技术配合高特异和高亲和力的抗体试剂，在待测抗原（抗体）极微量或达到期病理极限时，均能准确测定，避免了样本稀释重测定。
电化学发光（Elecsys）检测项目及其临床应用 一、甲状腺功能 甲腺原氨酸(T3, triiodothyronine) T3是甲状腺激素对各种靶器官作用的主要激素。T3（3、5、3’-三碘酪氨酸）主要在甲状腺以外，尤其是在肝脏由T4经酶解脱碘生成。因此，血清T3浓度反映出甲状腺对周边组织的功能甚于反映甲状腺分泌状态。T4转变成T3的减少会导致T3浓度的下降。见于药物的影响，如丙醇、糖皮质类固醇、胺碘酮等以及严重的非甲状腺疾病（N TI），称为“T3低下综合征”。与T4一样，99%以上的T3与运输蛋白质结合，但T3的亲和力要低10倍左右。T3测定可用于T3-甲亢的诊断，早期甲亢的查明和假性甲状腺毒症的诊断。 检测范围：0.300─10.00nmol/l或O.195-6.51ng/ml 正常参考值：1.3-3.1nmol/l或0.8-2.0ng/ml 甲状腺素(T4, thyroxine) T4是甲状腺分泌的主要产物,也是构成下丘脑-垂体前叶-甲状腺调节系统完整性不可缺少的成份。对合成代谢有影响作用。T4由二分子的二碘酪氨酸（DIT）在甲状腺内偶联生成。T4与甲状腺球蛋白结合贮存在甲状腺滤泡的残腔中，在TSH的调节下分泌释放。血清中99%以上的T4以与其它蛋白质结合的形式存在。由于血清中运输蛋白质的浓度易受外源性和内源性作用的影响，因此，在检测血清T4浓度的过程中需考虑到结合蛋白质的状况。如果忽略这一点，结合蛋白质浓度的变化（如怀孕期、服用雌激素或者患肾病综合征等），会导致反映甲状腺代谢状况检测的错误结果。T4测定可用于甲亢、原发性和继发性甲状腺功能减退的诊断以及TSH抑制治疗的监测。 检测范围：5.40─320.0nmol/l或O.420-24.86μg/dl 正常参考值： I. 66-181nmol/l或5.1-14.1μg/dl（标本取自德国和日本） II. 59－154nmol/l或4.6-12.0μg/dl, FT4指数57－147nmol/l或4.4-11.4ug/dl (标本取至美国) 游离T3(FT3- free triiodothyronine) 三碘甲腺原氨酸（T3）是血清中的甲状腺激素之一，起调节代谢作用。测定该激素的含量对鉴别诊断甲状腺功能是否正常、亢进或低下有重要意义。绝大多数的T3与其转运蛋白质（TBG、前白蛋白、白蛋白）结合，fT3是T3的生理活性形式。fT3测定的优点是不受其结合蛋白质浓度和结合特性变化的影响。因此不需另加测定结合参数（T -uptake，TBG）。 检测范围：0.400─50.00pmol/l或O.260-32.55pg/ml 正常参考值：2.8-7.1pmol/l或1.8-4.6pg/ml 游离T4(FT4- free thyroxine)
罗氏电化学发光仪器E170S O P 仪器简介： E170 是罗氏诊断公司出品的全自动电化学发光免疫分析仪，是全自动，随机进样的免疫分析系统，可以对许多种检测项目进行体外的定量或者定性的分析。该分析仪应用的是电化学发光技术(ECL)。每个E模块系统每小时的标本处理量为170个试验(最多可以将4个E模块连接)。只有在试验室条件下，经过培训的操作者方可操作E模块系统。 系统特色 ?可以24小时待机使用 ?标本条码扫描功能 ?试剂条码扫描功能 ?单个E模块的每小时处理能力为170个试验 ?自动保养功能 ?自动复查功能 ?自动发出定标信息 ?自动标本稀释功能 ?系统辅助的操作流程 ?一个E模块具有25个温控的试剂通道 ?1个模块可以安放672个反应杯 ?1个模块可以安放672个加样头 ?双向数据传输接口 运行条件： 水质要求 ◆无菌(< 10 cfu/ml)，去离子水 ◆ 1.5 M?电阻值(最大1.0 Ms/cm) ◆15-25 磅/英寸2 (0.5~3.5 kg/cm2 或49~343 kpa) ◆耗水量：每E170模块消耗18升/小时 环境条件 ◆无灰尘的、良好通风的环境 ◆无直接日照 ◆地面水平(角度：<1/200?o) ◆地面足够坚硬能够承受仪器的重量(详细情况请见本章中的系统特点) ◆温度：18~32摄氏度 ◆当系统启动时，温度的改变应该小于2度/小时 ◆屋内湿度：45%~85%
◆电源电压没有明显的波动 ◆在附近没有会产生电磁波的仪器 ◆有接地的三相电源 E170由三个类型的硬件单元组成：控制单元、核心单元以及检测单元。 控制单元介绍 包括： ?触摸屏幕的电脑 ?键盘 ?打印机 ?仪器管理电脑终端 核心单元介绍 核心单元将所有的标本从入口端经过E170仪器到出口端或者复查缓冲区。下面所列位核心单元的组成部分。 ?加样端 ?标本架转运通道 ?复查缓冲带 ?出口端 ?中心控制区 ?电源开关(在进样端的左侧面上) 检测单元介绍 分立式、随机进样的每小时170试验的免疫检测系统。下面所列为E170模块的组成部分： ◆试剂区位于分析模块的左边部分,它包含以下部分: 1.一个试剂盘,温度控制在20?3℃; 有25个试剂通道 2.一个用来将试剂以及磁珠从试剂盘中加入的试剂针,将之加到孵育器的反应杯中 3.一个条码扫描器,用来阅读试剂盒上的二维条码 4.一个用于试剂盒盖的开关的机械装置,以避免试剂的挥发 5.一个用于混匀磁珠的搅拌器.当磁珠被加入之前或额外的混匀步骤中,搅拌棒用来搅拌磁 珠 6.两个用来清洗探针以及搅拌器的冲洗站 7.一个探针清洗站,它含有两瓶探针洗液用来清洗探针的内部 ◆测量区位于分析模块的中部,它含有以下几个部分： 1.一个孵育器,含有54个孵育位,用来进行免疫反应 孵育池有54个孵育位置,位于仪器的中心部分,当标本和试剂加入到反应杯中后,该孵育池的温度维持在37℃±0.3℃. 当一个反应在准备测定时,该孵育盘需旋转,将反应杯转至需要的位置,在此处,适宜的单位将执行相应的功能. 2.一个用来将标本从标本容器中加入到反应杯中的标本探针
罗氏电化学发光免疫分 析 标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]
罗氏电化学发光免疫分析 技术是罗氏公司开发的，但全自动机械制造却由日本的日立公司承担，所以仪器上还有Hitachi的标志。这个仪器让大家吃惊的一大原因就在于一直在实验室研究的电致化学发光居然已经真正地产业化了，其中我们一直无法解决的诸多问题（尤其是重现性）均已得到解答，看来罗氏的确花了不少心血开发这款仪器。 罗氏电化学发光免疫分析技术的性能特点——创新的技术，与众不同 一、最先进的检测原理 电化学发光免疫测定，是目前最先进的标记免疫测定技术，是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术，具有敏感、快速和稳定的特点，在固相标记免疫测定中技术上居领先地位。 电化学发光（ECL）是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上是电化学和化学发光两个过程的完美结合。电化学发光与普通化学发光的主要差异在于前者是电启动发光反应，循环及多次发光，后者是通过化合物混合启动发光反应，是单次瞬间发光。因此ECL反应易精确控制，重复性极好。 电化学发光免疫测定是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合的产物，直接以[Ru(bpy)3]2+标记抗体，反应时标记物直接发光。且[Ru(bpy)3]2+在电极表面的反应过程可以周而复始进行，产生许多光子，使光信号得以增强。 二、专利的包被技术 链霉亲和素（streptoavidin，SA）和生物素（biotin，B）是具有很强的非共价相互作用的一对化合物，特异性强且结合紧密。一分子SA可与四分子B 相结合，增大了抗体结合量，达到放大效果。在ECL的试剂中，SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在磁性微粒上，形成通用的能与B结合的固相载体，另一试剂为活化的B衍生物化合的抗原或抗体。两种试剂混合时，抗原或抗体即包被在磁性微粒上。
化学发光免疫分析技术原理简介 20 世纪60 年代即有人利用化学发光法测定水样中细菌含量和菌尿症患者尿液检查。1977 年Halman 等将化学发光系统与抗原抗体反应系统相结合，创建了化学发光免疫分析法，保留了化学发光的高度灵敏性，又克服了它特异性不足的缺陷。近年来对技术与仪器的不断改进，使此技术已成为一种特异，灵敏，准确的自动化的免疫学检测方法。1996 年推出的电化学发光免疫技术，在反应原理上又具有一些新的特点。这两种技术目前已在国内一些大型医院实验室用于常规免疫学检验。 一、化学发光免疫分析法 化学发光免疫分析法( chemiluminescence immunoassay , CLlA) 是把免疫反应与发光反应结合起来的一种定量分析技术，既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析法的高度特异性。在CLIA中，主要有两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统与放射免疫测定中的抗原抗体反应系统相同化学发光系统则是利用某些化合物如鲁米诺( luminol) 、异鲁米诺(isolu-minol) 、金刚烷( AMPPD) 及吖啶酯( AE) 等经氧化剂氧化或催化剂催化后成为激发态产物，当其回到基态时就会将剩余能量转变为光子，随后利用发光信号测量仪器测量光量子的产额。将发光物质直接标记于抗原(称为化学发光免疫分析)或抗体上(称为免疫化学发光分析) ，经氧化剂或催化剂的激发后，即可快速稳定的发光，其产生的光量子的强度与所测抗原的浓度可成比例。亦可将氧化剂(如碱性磷酸酶等)或催化剂标记于抗原或 抗体上，当抗原抗体反应结束后分离多余的标记物，再与发光底物反应，其产生的光量子的强度也与待测抗原的浓度成比例。发光免疫分析的灵敏度高于包括RIA 在内的传统检测方法，检测范围宽，测试时间短，仅需30 - 60min 即可。试
罗氏电化学发光免疫分析 技术是罗氏公司开发的,但全自动机械制造却由日本的日立公司承担,所以仪器上还有Hitachi的标志。这个仪器让大家吃惊的一大原因就在于一直在实验室研究的电致化学发光居然已经真正地产业化了,其中我们一直无法解决的诸多问题(尤其是重现性均已得到解答,看来罗氏的确花了不少心血开发这款仪器。 罗氏电化学发光免疫分析技术的性能特点——创新的技术,与众不同 一、最先进的检测原理 电化学发光免疫测定,是目前最先进的标记免疫测定技术,是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术,具有敏感、快速和稳定的特点,在固相标记免疫测定中技术上居领先地位。 电化学发光(ECL是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应,实际上是电化学和化学发光两个过程的完美结合。电化学发光与普通化学发光的主要差异在于前者是电启动发光反应,循环及多次发光,后者是通过化合物混合启动发光反应,是单次瞬间发光。因此ECL反应易精确控制,重复性极好。 电化学发光免疫测定是电化学发光(ECL和免疫测定相结合的产物,直接以[Ru(bpy3]2+标记抗体,反应时标记物直接发光。且[Ru(bpy3]2+在电极表面的反应过程可以周而复始进行,产生许多光子,使光信号得以增强。 二、专利的包被技术 链霉亲和素(streptoavidin,SA和生物素(biotin,B是具有很强的非共价相互作用的一对化合物,特异性强且结合紧密。一分子SA可与四分子B 相结合,增大了抗体结合量,达到放大效果。在ECL的试剂中,SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在磁性微粒上,形成通用的能与B结合的固相载体,另一试剂为活化的B衍生物化合的抗原或抗体。两种试剂混合时,抗原或抗体即包被在磁性微粒上。 三、独特的载体
罗氏电化学发光仪器E170 SOP 仪器简介： E170 是罗氏诊断公司出品的全自动电化学发光免疫分析仪，是全自动，随机进样的免疫分析系统，可以对许多种检测项目进行体外的定量或者定性的分析。该分析仪应用的是电化学发光技术(ECL)。每个E模块系统每小时的标本处理量为170个试验(最多可以将4个E模块连接)。只有在试验室条件下，经过培训的操作者方可操作E模块系统。 系统特色 ?可以24小时待机使用 ?标本条码扫描功能 ?试剂条码扫描功能 ?单个E模块的每小时处理能力为170个试验 ?自动保养功能 ?自动复查功能 ?自动发出定标信息 ?自动标本稀释功能 ?系统辅助的操作流程 ?一个E模块具有25个温控的试剂通道 ?1个模块可以安放672个反应杯 ?1个模块可以安放672个加样头 ?双向数据传输接口 运行条件： 水质要求 ◆无菌(< 10 cfu/ml)，去离子水 ◆ 1.5 M?电阻值(最大1.0 Ms/cm)
◆15-25 磅/英寸2 (0.5~3.5 kg/cm2 或49~343 kpa) ◆耗水量：每E170模块消耗18升/小时 环境条件 ◆无灰尘的、良好通风的环境 ◆无直接日照 ◆地面水平(角度：<1/200 o) ◆地面足够坚硬能够承受仪器的重量(详细情况请见本章中的系统特点) ◆温度：18~32摄氏度 ◆当系统启动时，温度的改变应该小于2度/小时 ◆屋内湿度：45%~85% ◆电源电压没有明显的波动 ◆在附近没有会产生电磁波的仪器 ◆有接地的三相电源 E170由三个类型的硬件单元组成：控制单元、核心单元以及检测单元。 控制单元介绍 包括： ?触摸屏幕的电脑 ?键盘 ?打印机 ?仪器管理电脑终端
、概念 电化学发光免疫测定Electrochemiluminescence immunoassay,ECLI。 ECLI 是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术。电化学发光法源于电化学法和化学发光法，而ECLI 是电化学发光ECL和免疫测定相结合的产物，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，包括了电化学和化学发光二个过程。 ECL 不仅可以应用于所有的免疫测定，而且还可用于DNA／RNA探针检测。 二、反应底物 ECL 反应底物有两种： ·三氯联吡啶钌[Rubpy3]2+络合物： 钌Ruthenium, Ru，原子序数44，原子量101.07。元素名来自拉丁文，原意是"俄罗斯"。1827年俄国化学家奥赞在铂矿中发现钌；1844年俄国化学家克劳斯肯定它是一种新元素。钌在地壳中的含量约为十亿分之一，是铂系元素中含量最少的一个。钌常与其它铂系元素一起分散于冲积矿床和砂积矿床中。钌有7种天然稳定同位素：钌96、98、99、100、101、102、104。 钌为银白色金属，熔点2310℃，沸点3900℃，密度12.37×103/m3。 钌的化学性质不活泼，在空气和潮湿环境中稳定；不溶于酸和王水，溶于熔融的强碱、碳酸盐、氰化物等；加热到900℃，时能与氧反应；加热时能与氟、氯、溴反应；钌有形成配位化合物的强烈倾向，还有良好的催化性能。 钌是铂和钯的有效硬化剂；金属钛中加入0.1%的钌就可大大提高耐腐蚀性；钌钼合金是一种超导体；含钌的催化剂多用于石油化工。 ·三丙胺Tripropylamine，TPA： 结构式： 点击浏览/下载该文件 三、电化学发光反应原理 电化学反应过程：在工作电极上阳极加一定的电压能量作用下，二价的三氯联吡啶钌 [Rubpy3]2+ 释放电子发生氧化反应而成为三价的三氯联吡啶 钌 [Rubpy3]3+，同时，电极表面的TPA也释放电子发生氧化反应而成为阳离子自由基 TPA+ ，并迅速自发脱去一个质子而形成三丙胺自由基 TPA·，这样，在反应体系中就存在具有强氧化性的三价的三氯联吡啶钌 [Rubpy3]3+ 和具有强还原性的三丙胺自由基 TPA·。 化学发光过程：具有强氧化性的三价的三氯联吡啶钌 [Rubpy3]3+ 和具有强还原性的三丙胺自由基 TPA·发生氧化还原反应，结果使三价的三氯联吡啶
总甲状腺素（TT4）测定试剂盒（电化学发光免疫分析法） 适用范围：本试剂盒用于体外定量测定人体血清样本中总甲状腺素（TT4）的含量。 1.1产品型号/规格：100人份/盒、200人份/盒。 1.2主要组成 试剂盒由磁分离试剂（M）、试剂a（Ra）、试剂b（Rb）和定标品（TT4-Cal）（选配）组成。组成及含量如下： 2.1 外观 2.1.1 试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏； 2.1.2 磁分离试剂摇匀后应为棕色含固体微粒的均匀悬浊液，无明显凝集、无絮状物； 2.1.3 其它液体组分应澄清，无异物，沉淀物或絮状物； 2.1.4 包装标签应清晰、无磨损、易识别。 2.2 空白限 应不大于0.420μg/dL 。 2.3 准确度 用T4国家标准品（150551）进行检测，实测值与理论值之比应在0.850-1.150之间。 2.4 线性 在[1.0，24.86]μg/dL范围内，线性相关系数的绝对值（|r|）应不小于0.9900。 2.5 精密度 2.5.1 分析内精密度
在试剂盒的线性范围内，浓度为（5.0±1.0μg/dL）和（20.0±4.0μg/dL）的样品检测结果的变异系数（CV）应不大于8%。 2.5.2 批间精密度 在试剂盒的线性范围内，用3个批号试剂盒分别检测浓度为（5.0±1.0μg/dL）和（20.0±4.0μg/dL）的样品，检测结果的变异系数（CV）应不大于15%。 2.6 特异性 2.6.1与三碘甲状腺原氨酸（T3） 测定浓度不低于500ng/mL的T3样品，其测定结果应不高于1.5μg/dL； 2.6.2 与反三碘甲状腺原氨酸（rT3） 测定浓度不低于50ng/mL的rT3样品，其测定结果应不高于1.5μg/dL。 2.7 效期末稳定性 本产品效期为15个月，试剂盒在2～8℃下保存至有效期末进行检测，检测结果应符合2.1、2.2、2.3、2.4、2.5.1的要求。 2.8 溯源性 依据GB/T21415-2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》的要求，校准品溯源至国家标准品（编号150551）。
促肾上腺皮质激素(ACTH)测定试剂盒（电化学发光免疫分析法） 适用范围：本试剂盒用于体外定量测定人体血清样本中促肾上腺皮质激素（ACTH）的含量。 1.1包装规格：50人份/盒、100人份/盒。 1.2主要组成成分 试剂盒由磁分离试剂（M）、试剂a（Ra）、试剂b（Rb）和定标品（ACTH-Cal）（选配）组成。组成及含量见下表： 注：1、定标品靶值批特异，详见靶值单。 2、试剂盒条码卡内含主校准曲线。 2.1 外观 2.1.1 试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏； 2.1.2 磁分离试剂摇匀后应为棕色含固体微粒的均匀悬浊液，无明显凝集、无絮状物； 2.1.3 其它液体组分应澄清，无异物，沉淀物或絮状物； 2.1.4 包装标签应清晰、无磨损、易识别。 2.2 空白限
应不大于1.0pg/mL。 2.3 准确度 将已知浓度的ACTH标准溶液加入到血清中，其回收率应在(85%～115%)范围内。 2.4 线性 在[3.00，2000.0]pg/mL范围内，线性相关系数（r）应不小于0.9900。 2.5 精密度 2.5.1 重复性 在试剂盒的线性范围内，测定高、低两个水平的样品，检测结果的变异系数（CV）应不大于8%。 2.5.2 批间差 在试剂盒的线性范围内，用3个批号试剂盒分别测定高、低两个水平的样品，检测结果的变异系数（CV）应不大于15%。 2.6 效期末稳定性 本产品效期为15个月，试剂盒在2～8℃下保存至有效期末进行检测，检测结果应符合2.1、2.2、2.3、2.4、2.5.1的要求。 2.7 溯源性 依据GB/T 21415-2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》的要求提供促肾上腺皮质激素（ACTH）定标品的来源、赋值过程以及测量不确定度等内容，定标品溯源至企业工作校准品。
电化学发光的基本原理 电化学发光免疫测定（ECLI）是一种在电极表面由电化学引发 的特异性发光反应，包括电化学和化学发光两个部分。分析中应用 的标记物为电化学发光的底物三联吡啶钌或其衍生N-羟基琥珀酰胺（NHS）酯，可通过化学反应与抗体或不同化学结构抗原分子结合，制成标记的抗体或抗原。ECLL的测定模式与ELISA相似。 基本原理：发光底物二价的三联吡啶钉及反应参与物三丙胺在 电极表面失去电子而被氧化。氧化的三丙胺失去一个H+而成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原为激发态的二价钌，随即释放光子而 恢复为基态的发光底物。医学教育网搜|集整理这一过程在电极表面 周而复始地进行，不断地发出光子而常保持底物浓度的恒定。 电化学发光是化学发光方法与电化学方法相互结合的产物，是 指通过电化学方法来产生一些特殊的物质，然后这些电生的物质之 间或电生物质与其它物质之间进一步反应而产生的一种发光现象。 电化学发光保留了化学发光方法所具有的灵敏度高、线性范围宽、观察方便和仪器简单等优点；同物时具有许多化学发光方法无 法比拟的优点，如重现性好、试剂稳定、控制容易和一些试剂可以 重复使用等优点，广泛地应用于生物、医学、药学、临床、环境、 食品、免疫和核酸杂交分析和工业分析等领域。在21世纪中必将继 续为解决人类面临的各种重大问题发挥更加显著的作用。因此有必 要对电化学发光在分析中的应用有更加全面的了解。
电化学发光的应用 1、电极表面活性分布的表征 利用电化学发光成像法可以很好地观察电极表面电化学发光强度的分布情况，而电化学发光强度对电极表面的活性具有很大的依赖性，因此利用电化学发光成像法可以直观地反映电极表面活性分布。 该方法是由Engstrom等于1987年提出的，他们观察到在新抛光的玻碳电极上电化学发光强度分布十分均匀，而在环氧树脂浸渍过的网状玻碳电极上，电化学发光强度的分布不均匀，通过与其它方法相对照，发现电化学发光强度分布能够很好地反映出电极表面活性分布，并且具有微米级的空间分辨能力。在此基础上，他们把电化学发光成像法用于研究碳糊电极表面活性点的分布，观察到碳糊电极表面存在。着活性区域和非活性区域，对于了解碳糊电极的电化学行为具有一定的意义。 由于电化学发光成像法具有直观和简单等优点，许多科学工作者先后将该方法用于表征化学修饰电极表面的活性分布。如Hopper 等用该方法研究了电极表面的电荷对电子转移性质的影响；Pantano 等用该方法研究了电极表面羧基的分布对电子转移性质的影响；ShuItz等用该方法研究了聚合物在电极上的附着情况。从上面的文献可以看出，电化学发光成像法对于了解电极表面的活性分布及其与电极性能之间的关系，进而制备出具有特定功能的电极具有较好的参考价值。
罗氏电化学发光免疫分析总结 罗氏电化学发光免疫分析总结 技术是罗氏公司开发的，但全自动机械制造却由日本的日立公司承担，所以仪器上还有Hitachi的标志。这个仪器让大家吃惊的一大原因就在于一直在实验室研究的电致化学发光居然已经真正地产业化了，其中我们一直无法解决的诸多问题（尤其是重现性）均已得到解答，看来罗氏的确花了不少心血开发这款仪器。 罗氏电化学发光免疫分析技术的性能特点——创新的技术，与众不同 一、最先进的检测原理 电化学发光免疫测定，是目前最先进的标记免疫测定技术，是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术，具有敏感、快速和稳定的特点，在固相标记免疫测定中技术上居领先地位。电化学发光（ECL）是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上是电化学和化学发光两个过程的完美结合。电化学发光与普通化学发光的主要差异在于前者是电启动发光反应，循环及多次发光，后者是通过化合物混合启动发光反应，是单次瞬间发光。因此ECL反应易精确控制，重复性极好。 电化学发光免疫测定是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合的产物，直接以[Ru(bpy)3]2+标记抗体，反应时标记物直接发光。且[Ru(bpy)3]2+在电极表面的反应过程可以周而复始进行，产生许多光子，使光信号得以增强。 二、专利的包被技术 链霉亲和素（streptoavidin，SA）和生物素（biotin，B）是具有很强的非共价相互作用的'一对化合物，特异性强且结合紧密。一
分子SA可与四分子B相结合，增大了抗体结合量，达到放大效果。在ECL的试剂中，SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在磁性微粒上，形成通用的能与B结合的固相载体，另一试剂为活化的B 衍生物化合的抗原或抗体。两种试剂混合时，抗原或抗体即包被在磁性微粒上。 三、独特的载体 ECL中采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8?m的聚苯乙烯微粒。其特点是反应面积极大，比板式扩大20－30倍，使反应在近乎液相中进行，反应速度大大加快，利用氧化铁的磁性，使用电磁场分离结合态和游离态，方便迅速，实现了精确的全自动化。 四、独到的磁分离技术 实现了结合相和游离相的完全自动化分离，且检测池在无电场时彻底清洗，避免了交叉污染。 五、超高的测定灵敏度和测定线性 发光信号检测的宽线性加上电化学发光独特的标记物本身（发光底物）循环发光和专利的链霉亲和素-生物素包被技术的信号放大作用，使电化学发光测定的检测下限可达10-12和10-18级，线性范围最大超越7个数量级，在待测抗原（抗体）极微量或达到病理期极限时，均能准确测定，避免了样本稀释重测定，既节约时间，又节省试剂。 六、稳定的试剂 电化学发光标记物三联吡啶钌在无电场和递电子体（三丙胺）存在的自然环境下非常稳定，保证了用它标记的抗体（抗原）试剂也非常稳定，2－8℃可稳定一年以上，批内和批间变异系数分别为<4%和<7%，在首日使用之后也可以稳定3个月。 七、简便创新的定标概念 每个测定项目的基本定标曲线已由罗氏公司完成，并已存入试剂的二维条形码，自动读入仪器，用户只需进行二点重定标即可。
电化学发光检测项目及其临床应用 一、甲状腺功能 甲腺原氨酸(T3, triiodothyronine) T3是甲状腺激素对各种靶器官作用的主要激素。T3（3、5、3’-三碘酪氨酸）主要在甲状腺以外，尤其是在肝脏由T4经酶解脱碘生成。因此，血清T3浓度反映出甲状腺对周边组织的功能甚于反映甲状腺分泌状态。T4转变成T3的减少会导致T3浓度的下降。见于药物的影响，如丙醇、糖皮质类固醇、胺碘酮等以及严重的非甲状腺疾病（NT I），称为“T3低下综合征”。与T4一样，99%以上的T3与运输蛋白质结合，但T3的亲和力要低10倍左右。T3测定可用于T3-甲亢的诊断，早期甲亢的查明和假性甲状腺毒症的诊断。 甲状腺素(T4, thyroxine) T4是甲状腺分泌的主要产物,也是构成下丘脑-垂体前叶-甲状腺调节系统完整性不可缺少的成份。对合成代谢有影响作用。T4由二分子的二碘酪氨酸（DIT）在甲状腺内偶联生成。T4与甲状腺球蛋白结合贮存在甲状腺滤泡的残腔中，在TSH的调节下分泌释放。血清中99%以上的T4以与其它蛋白质结合的形式存在。由于血清中运输蛋白质的浓度易受外源性和内源性作用的影响，因此，在检测血清T4浓度的过程中需考虑到结合蛋白质的状况。如果忽略这一点，结合蛋白质浓度的变化（如怀孕期、服用雌激素或者患肾病综合征等），会导致反映甲状腺代谢状况检测的错误结果。T4测定可用于甲亢、原发性和继发性甲状腺功能减退的诊断以及TSH抑制治疗的监测。 游离T3(FT3- free triiodothyronine) 三碘甲腺原氨酸（T3）是血清中的甲状腺激素之一，起调节代谢作用。测定该激素的含量对鉴别诊断甲状腺功能是否正常、亢进或低下有重要意义。绝大多数的T3与其转运蛋白质（TBG、前白蛋白、白蛋白）结合，fT3是T3的生理活性形式。fT3测定的优点
电化学发光免疫检测原理 电化学发光免疫测定的基本原理 (Electrochemiluminescence immunoassay,ECLI) 是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术，是电化学发光(ECL)和免疫测定相结合的产物。它的标记物的发光原理与一般的化学发光(CL)不同，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。ECL 不仅可以应用于所有的免疫测定，而且还可用于DNA,RNA探针检测。 2+其检测原理(以TSH检测为例):第一步:结合了活化的三联吡啶钌衍生物即[Ru(bpy)] + N3羟基琥珀酰胺酯(NHS)的TSH抗体和结合了生物素的TSH抗体与待测血清同时加入一个反应杯中孵育9分钟。 第二步:将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育9分钟，使生物素通过与亲和素 的结合将磁珠、TSH抗体连接为一体，形成双抗体夹心法。
2+下一步，蠕动泵将形成的 [Ru(bpy)],抗体,抗原,抗体,磁珠复合体吸入流动测量室，此3 时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的TSH抗体(与生物素结合的和2+与[Ru(bpy)]结合的抗体)也被吸出测量室。 3 紧接着，蠕动泵加入含三丙胺(TPA)的缓冲液，同时电极加电压，启动ECL反应过程。发光2+剂 [Ru(bpy)]和电子供体TPA在阳极表面可同时各失去一个电子而发生氧化反应，使二价的32++?[Ru(bpy)]被氧化成三价，后者是一种强氧化剂;另一方面，TPA 被氧化成阳离子自由基TPA，3+?后者很不稳定，可自发失去一个质子(H)，形成自由基TPA，这是一种很强的还原剂，可将3+2+一个电子给三价的[Ru(bpy)]，使其形成激发态的[Ru(bpy)]，而TPA自身被氧化成二丙胺332+和丙醛。激发态的[Ru(bpy)]通过荧光机制衰减，发射出一个波长620nm的光子，重新生成32+基态的[Ru(bpy)]。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光32+强度，光强度与[Ru(bpy)]的浓度呈线性关系,故可测出待测抗原的含量。 3
电化学发光免疫测定 电化学发光免疫测定 电化学发光反应：电化学发光（electro－chemiluminescence，ECL)是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光两个过程。化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+(图1）和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面同时各失去一个电子发生氧化反应（图2）。二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，后者是一种强氧化剂。TPA 被氧化成阳离子自由基TPA+*（参见图2），后者很不稳定，自发地失去一个质子（H+），形成自由基TPA*，这是一种非常强的还原剂。这两个高反应基团在电极表面迅速反应，三价的[Ru(bpy)3]3+被还原形成激发态的二价 [Ru(bpy)3]2+*，能量来源于[Ru(bpy)3]3+和TPA*之间存在的高电化学电位差。TPA*自身被氧化成二丙胺和丙醛。接着激发态的 [Ru(bpy)3]2+*衰减成基态的[Ru(bpy)3]2+，同时发射一个波长620nm的光子。这一过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号得以增强。 图1 三联吡啶钌NHS Ru2＋* -H+光子 TPA* Ru3+ Ru2＋ TPA+* TPA ＋ -e -e ＋ 图2 在电极表面的ECL反应 Ru2＋: [ Ru(bpy)3] 2+基态 Ru3＋: [Ru(bpy)3]3+氧化态 Ru2＋*: [Ru(bpy)3]2+* 激发态 二、电化学发光免疫测定 以三联吡啶钌作为标记物，标记抗原或抗体，通过免疫反应及ECL反应，即可进行电化学发光免疫测定（ECLIA）。在实际应用中则尚有特定的仪器和试剂。瑞士罗氏公司（ROCHE）的Elecsys ECLIA系统，综合了各种先进技术，具有独特的优越性，已在医学检验中取得广泛应用。 Elecsys全自动分析仪分成两个部分：在试管内化学反应部分和在流动池内的ECL反应部分。 （一）试管内的化学反应 1、试剂的组成 在Elecsys试剂的制备中，包括电化学发光剂的标记和抗原或抗体的固相化，应用了多种先进技术，简述如下： （1）电化学发光剂的标记 [Ru(bpy)3]2+需经化学修饰形成活化的衍生物后才能与抗体或抗原形成结合物。有多种活性基团可与[Ru(bpy)3]2+分子中的砒啶基反应。在Elecsys试剂中采用的是N羟基琥珀酰胺酯（NHS）（图1）。该衍生物具有水溶性，可与抗体、蛋白质抗原、半抗原、激素、核酸等各种分子结合形成稳定的标记物。而且[Ru(bpy)3]2＋NHS分子量很小，与免疫球蛋白结合的分子比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免疫活性。 （2）固相载体 Elecsys中采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8μm的聚苯乙烯微粒。其特点是表面积极大，吸附效率高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相，反应速度快。由于带有磁性，在游离标记物与结合标记物分离时，只需用磁铁吸引，方便迅速。 （3）链霉亲和素与生物素系统的应用
电化学发光免疫法与放射免疫法检测血清FT3、FT4、TSH的方法比较 【关键词】电化学发光免疫法 【摘要】目的探讨电化学发光免疫法检测替代放射免疫法检测的可靠 性及在方法学上前者是否更具优势。方法利用2种方法法分别检测血清FT3、FT4、TSH，并进行精密度、准确度、患者结果可报告范围、分析灵敏度、分析 特异性、回收率等几方面的比较。结果 2种方法法检测结果差异有显著性（P ＜0.05），并且电化学发光免疫法在患者结果可报告范围、精密度、分析灵敏 度、抗干扰能力、准确度试验方面均优于放射免疫法。结论电化学发光免疫 法完全能够替代放射免疫法，并且还具有报告范围宽，精密度、分析灵敏度高，抗干扰能力强的优点。 【关键词】电化学发光免疫法；检测低限；抗干扰试验 由于放射免疫法（RIA）检测血清FT3、FT4、TSH成本较低，目前还有部分 实验室仍在采用，但因该法报告时间长，结果不稳定，且存在同位素污染问题，在国外已趋于淘汰。近年来国内推出的电化学发光免疫法（ECLIA）检测具有快速、准确、重复性好并安全无毒等优点，受到临床和实验室的关注。本文分别 采用2种方法对血清FT3、FT4、TSH检测做了患者结果可报告范围、精密度、 分析灵敏度、抗干扰试验、准确度试验，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 美国罗氏公司生产的2010型电化学发光免疫分析仪，美国生产的Cap- Ria-16型全自动γ计数仪。电化学发光免疫分析试剂购于罗氏公司，放射免 疫分析试剂购于天津九鼎公司。 1.2 方法与结果 1.2.1 精密度 分别取FT3、FT4、TSH 3种不同浓度的混合血清，见表1。其中一半重复 测定20次，另外一半分成10份，装入塑料离心管置于-20℃冰箱，每天1次共 测定10次，测定结果，见表2。表1 FT3、FT4、TSH 3项不同浓度的混合血 清（略）表2 电化学发光免疫法和放射免疫法检测的精密度情况（略） 1.2.2 分析灵敏度 用2种方法分别对空白零标准做批内20次检测，分别记录放射强度和发光 强度并做统计，再计算检测低限（LLD）［1］。公式：LLD=均值BIK+2SBLK。 结果ECLIA法检测FT3、FT4、TSH低限分别为0.15pmol/L、0.15pmol/L、 0.07mu/L，RIA法检测FT3、FT4、TSH低限分别为1.12pmol/L、1.87pmol/L、 0.25mu/L。 1.2.3 患者结果可报告范围 用FT3、FT4、TSH零标准（L）和浓度分别为180pmo/L、200pmol/L、 180mu/L的高值标准（H），按不同比例关系各自混合形成系列评价样品，每个 样品分别用2种方法批内共测定8次。然后在坐标图上以X表示各样品的预期 值，以Y表示各样品的实测值，直线所达的限值即为患者结果可报告范围。结 果2种方法检测FT3、FT4、FSH的可报告范围分别为：电化学发光免疫法
电化学发光免疫测定 （Electrochemiluminescence immunoassay,ECLI） 是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术，是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合的产物。 它的标记物的发光原理与一般的化学发光（CL）不同，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。ECL 不仅可以应用于所有的免疫测定，而且还可用于DNA／RNA探针检测。 其检测原理（以TSH检测为例）：第一步：结合了活化的三联吡啶钌衍生物即[Ru(bpy) 3 ]2++ N 羟基琥珀酰胺酯（NHS）的TSH抗体和结合了生物素的TSH抗体与待测血清同时加入一个反应杯中孵育9分钟。 第二步：将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育9分钟，使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、TSH抗体连接为一体，形成双抗体夹心法。 下一步，蠕动泵将形成的 [Ru(bpy) 3 ]2+－抗体－抗原－抗体－磁珠复合体吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的TSH抗体（与生物素结合的和 与[Ru(bpy) 3 ]2+结合的抗体）也被吸出测量室。 紧接着，蠕动泵加入含三丙胺（TPA）的缓冲液，同时电极加电压，启动ECL反应过程。发光 剂 [Ru(bpy) 3 ]2+和电子供体TPA在阳极表面可同时各失去一个电子而发生氧化反应，使二价的 [Ru(bpy) 3 ]2+被氧化成三价，后者是一种强氧化剂；另一方面，TPA 被氧化成阳离子自由基TPA+●，后者很不稳定，可自发失去一个质子（H+），形成自由基TPA●，这是一种很强的还原剂，可将 一个电子给三价的[Ru(bpy) 3]3+，使其形成激发态的[Ru(bpy) 3 ]2+，而TPA自身被氧化成二丙胺 和丙醛。激发态的[Ru(bpy) 3 ]2+通过荧光机制衰减，发射出一个波长620nm的光子，重新生成 基态的[Ru(bpy) 3 ]2+。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光 强度，光强度与[Ru(bpy) 3 ]2+的浓度呈线性关系,故可测出待测抗原的含量。
1.1 电化学发光简介 近年来，电化学发光(ECL)作为一种高灵敏度和高选择性的分析方法已引起人们极大的究兴趣。电化学发光是指通过电化学方法来产生一些特殊的物质，然后这些电生的物质之间或电生物质与其它物质之间进一步反应而产生的一种发光现象。它是化学发光方法与电化学方法相互结合的产物。它保留了化学发光方法所具有的灵敏度高、线性范围宽、观察方便和仪器简单等优点；同时具有许多化学发光方法无法比拟的优点，如重现性好、试剂稳定、控制容易和一些试剂可以重复使用等优点，从而引起人们的注意。目前，ECL技术已广泛应用于免疫分析、核酸杂交分析和其他生化物质的测定，不仅大大推动了生物化学和分子生物学的研究，而且带来了临床诊断的又一次技术革命。 1.1.2 电化学发光反应原理 电化学发光分析是通过电极对含有化学发光物质的某化学体系施加一定的电化学信号（包括电压和电流），一直产生某种新物质，该物质能与体系中存在的化学物质反应或自身进行分解反应，反应不但提供足够的能量，而且还能产生合适的发光体并接受该反应的释放能量，形成激发态发光体，不稳定的激发态返回基态时便发出与该发光体性质相一致的发射光，用光电倍增管等普通光学手段测量发光光谱或发光强度从而对物质进行痕量分析。如果按激发态分子或离子产生的历程，可将电化学发光分为四种类型。[7-8] 1.1. 2.1 通过单重激发态途径的电化学发光（S-Route） 一般是在电极上施加一定的电压，是分子R在电压作用下氧化或还原产生R+或R-，然后，R+和R-互相反应产生单重激发态，激发态回到基态时发光。用方程式表示如下： R → R+ + e R + e → R- R- + R+→ 2R* R*→ R +hv 大多数芳香族化合物的电化学发光是按此机理进行。 1.1. 2.2 通过三重激发态途径的电化学发光（T-Route） 一般是在电极上施加一定的电压，使分子R在电压作用下氧化或还原产生R+或R-，然后，R+或R-互相反应产生三重激发态，激发态回到基态时发光，用方程式表示如下：
电化学发光原理 一、概念 电化学发光免疫测定 Electrochemiluminescence immunoassay, ECLI. ECLI 是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测 定以后得新一代标记免疫测定技术。 电化学发光法源于电化 学法和化学发光法，而ECLI 是电化学发光ECL 和免疫测定相 结合的产物，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学 发光反应，包括了电化学和化学发光二个过程。 ECL 不仅可以应用于所有的免疫测定，而且还可用于DNA/RNA 探针检测。 二、反应底物 ECL 反应底物有两种： 三氯联吡啶钌[Rubpy3]2 + 络合物： 钌Ruthenium ，Ru ，原子序数44，原子量101.07.元素名来自拉丁文，原意是“俄罗斯”。1827年俄国化学家奥赞在铂矿中发现钌;1844年俄国化学家克劳斯肯定它是一种新元素。钌在地壳中的含量约为十亿分之一，在铂系元素中含量最少的一个。钌常与其他铂系元素一起分散于冲积矿床和砂积矿床中。钌有7种天然稳定同位素：钌96、98、99、100、101、102、104。 钌为银白色金属，熔点2310℃，沸点3900℃，密度12.37*103/m3. 钌的化学性质不活泼，在空气和潮湿环境中稳定；不溶于酸和王水，溶于熔融的强碱、碳酸盐、氰化物等；加热到900℃，时能与氧反应；加热时能与氟、氯、溴反应；钌有形成配位化合物的强烈倾向，还有很好的催化功能。 钌是铂和钯的有效硬化剂；金属钛中加入0.1%的钌就可大大提高耐腐蚀性；‘钌钼合金是一种超导体；含钌的催化剂多用于石油化工。 三、电化学发光反应原理 电化学反应过程；在工作电极上阳极加一定的电压能量作用下，二价的三氯联吡啶钌 [Rubpy3]2+释放电子发生氧化反应而成为三价的三氯联吡啶。 钌[Rubpy3]3+，同时，电极表面的TPA 也释放电子发生氧化反应而成为阳离子自由基TPA+，并迅速自发脱去一个质子而形成三丙胺自由基TPA ，这样，在反应体系就存在具有强氧化性的三价的三氯联吡啶钌[Rubpy3]3+ 和具有强还原性的三丙胺自由基TPA ； 化学发光过程：具有强氧化性的三价的三氯联吡啶钌[Rubpy3] 3+ 和具有强还原性的三丙胺自由基TPA 发生氧化还原反应，结果使三价的三氯联吡啶钌[Rubpy3 ]3+ 还原成激发态的二价的三氯联吡啶钌[Rubpy3] 2+，其能量来源于三价的三氯联吡啶钌[Rubpy3] 3+ 与三丙胺自由基TPA 之间的电势差，激发态[Rubpy3] 2+ 以荧光机制衰变并以释放出一个波长为620nm 光子的方式释放能 流式微信：流式专家