微生物检验原始记录
共页第页
检验日期：检验：
验讫日期：复核：
霍乱弧菌检验程序 一、检查对象 一天内腹泻三次或三次以上的病人。 二、标本采集及处理 1、采集时间：在未服用抗生素前采样。 2、采集方式：用棉拭子或采便管从肛门插入直肠3—5厘 米取样，必须看到有粪便黏附才可：对于自然排出的水样便、呕吐物及保存液保存的标本可直接接种分离或吸取 0.5ML、成形大便取黄豆左右大小。 3、标本送检：标本采集后应立即送检。若不能立即送检， 可保存于碱性蛋白胨水中尽快送检验。24小时以上才能送检的标本，应使用文一腊二氏保存液保存。 4、标本处理：将标本直接分离接种于4号琼脂及放入 8—10ML碱性蛋白胨水中增菌。 “两管三板”： 送检标本马上接种一个4号琼脂平板、同时碱性蛋白胨水培养管增菌；—8小时后接种增菌管内标本于第二块4号琼脂平板，同时转种第二管碱性蛋白胨水；6—8小时后继续接种第二管碱性蛋白胨水的标本于第三块4号琼脂平板上。
三、检验程序： 1、弧菌形态： 弧菌生长快、菌落大、培养4—5小时，原划线处有菌苔生长，8—10小时可长出小菌落，16小时菌落直径可达2毫米。菌落略带灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑湿润，培养时间延长或室温放置后，菌落略带黄色，中心厚而周围透明，培养基含亚碲酸钾使得菌落成灰色，中心形成黑色金属碲沉淀。在平皿上挑取典型菌落做玻片凝集试验。 2、玻片凝集试验： 首先要注意抗原抗体比例和保证抗原（菌株）的纯洁性，使用O1群和O139群两种诊断血清。如未获单个菌落，可挑取可疑菌苔边缘透明部分做玻片凝集。注意，凝集的菌落应以生理盐水作对照，检查有无自然凝集；然后用此玻片显微镜下看动力（动力活泼如流星样）；再将此玻片革兰氏染色看弧菌形态。 3、弧菌分型： 稻叶型和小川型诊断血清做玻片凝集试验进一步分型。四、报疫程序： 一旦发现阳性可疑标本立即用铁罐保存，通知送检科室，确认病人资料；上报医院总值班2460或2560，派车送海珠区防疫站确证。 五、标本处理：
霍乱弧菌检测的快速方法 霍乱是由霍乱弧菌引起的烈性肠道传染病, 发病急、来势凶猛、传播快是该病的特点, 因而及早培养鉴定出霍乱弧菌对控制该病的流行和治疗有极其重要的意义。本文作者在1995年9 月～ 2000 年9 月期间, 对我科1 256 例急性腹泻患者粪便和呕吐物培养霍乱弧菌的方法进行改进, 大大缩短了阳性结果的报出时间, 现总结如下。 1 材料与方法 1.1材料 1.1.1 标本来源1995 年9 月～ 2000 年9 月本院门诊及住院急性腹泻患者新鲜粪便样本1 042 份, 呕吐物214 份。 1.1.2 试剂所用培养基均购自杭州天和微生物制品厂, 霍乱弧菌单克隆抗体购自卫生部兰州生物制品研究所。 1.2 方法 用灭菌毛细吸管吸取1m l 患者米汤样粪便或直接将采便管棉拭子接种于10m l 1% 硷性蛋白胨水中, 置37℃培养箱作增菌培养。快速方法为增菌2 小时后取表面生长物或菌膜转种普通琼脂平板, 6 小时后即可挑取可疑菌落进行鉴定。另一方法为按常规方法增菌6～ 9 小时后转种于庆大霉素琼脂平板,均按《全国临床检验操作规程》进行鉴定。 2 结果 应用快速方法在10 小时内可报出阳性结果, 常规方法则20 小时报出阳性结果。1 256 份标本中, 共检出15 例霍乱弧菌,均为小川型, 两种方法的阳性率均为1119% (15?1 256) , 符合率100%。 3 讨论 霍乱是我国法定的甲类传染病, 国家要求在接诊24 小时内报出检验结果。本文在急性腹泻患者粪便霍乱弧菌培养方面采用缩短增菌时间和转种普通琼脂平板的方法, 从传统的增菌6～ 9 小时再转种选择性培养基改为增菌2 小时后开始转种普通琼脂平板, 能使阳性结果在10 小时内发出报告, 比常规方法快10 小时, 对霍乱的诊断治疗均有重要的意义。 增菌2 小时即可转种是由于: (1) 霍乱患者急性期粪便和呕吐物中含有大量的堆乱弧菌, 增菌 2 小时后霍乱弧菌已被增殖数十倍, 此菌数已足以转种。(2)
全国霍乱监测方案（试行） 一、概述 霍乱是由霍乱弧菌引起的一种急性肠道传染病，以发病急、传播快、波及范围广为特征，是《国际卫生条例》规定的国际检疫传染病之一，也是《中华人民共和国传染病防治法》规定的甲类传染病之一。《国内交通卫生检疫条例》也将其列为检疫传染病。 我国从1961年第七次霍乱世界大流行开始便受到波及，除西藏无病例报告外，其余各省（市、区）均有疫情发生。1993年开始，我国部分地区也相继发生O139霍乱的局部暴发与流行。随后出现了多菌群（型）混合流行的局面。 霍乱弧菌经水和食物传播，流行规律目前尚不十分明确，引起霍乱流行的自然因素和社会因素依然存在。沿海水域、河口和内陆河流、湖泊等自然水体是霍乱弧菌的自然生境，在自然水体中霍乱弧菌依附浮游生物生存，监测研究发现霍乱的暴发流行与气候和水温、浮游生物的繁殖有高度的关联。在我国这些水域同时也分布着海水、淡水产品（本方案统称为水产品）养殖基地。霍乱病人粪便常污染人群生活邻近水体。这些水体中以及水产品携带的产毒霍乱弧菌在人群霍乱的发生和传播中发挥作用。为进一步加强我国霍乱监测工作，及时发现新病例、识别暴发、确定传染源，同时进一步了解霍乱弧菌在外环境中的生存变化以及环境水体和食品污染与流行的关系，掌握霍乱的流行规律，为制定防治策略和措施提供科学依据，特制订本方案。 二、监测目的 1、及时发现霍乱病例，掌握疫情动态，早期识别暴发疫情，分析流行因素； 2、掌握我国霍乱菌株的型别、分布、毒力、耐药性变化情况，监测菌型变迁与
流行的关联性； 3、了解霍乱弧菌在我国水体中存在和动态变化情况、以及与沿海和内陆霍乱流行的关系。 三、监测定义 1、腹泻病例 指每日排便三次或以上,且具有大便性状异常的病例。 2、疑似病例 具有下列三项之一者： （1）凡有典型临床症状，如剧烈腹泻，水样便(黄水样、清水样、米泔样或血水样)，伴有呕吐，迅速出现脱水或严重脱水，循环衰竭及肌肉痉挛(特别是腓肠肌)的病例。 （2）霍乱流行期间，与霍乱病人或带菌者有密切接触史，并发生泻吐症状者。 （3）出现无痛性腹泻或伴有呕吐，且粪便或呕吐物霍乱弧菌快速辅助诊断检测试验阳性的病例。 3、临床诊断病例 具有下列三项之一者均可视为临床诊断病例： （1）疑似病例的日常生活用品或家居环境中检出O1群或/和O139群霍乱弧菌者； （2）疑似病例的粪便、呕吐物或肛拭子标本霍乱弧菌毒素基因PCR检测阳性者； （3）在一起确认的霍乱暴发疫情中，具有直接暴露史且在同一潜伏期内出现无痛性腹泻或伴呕吐症状者。 4、实验室确诊病例 （1）凡有腹泻症状，粪便、呕吐物或肛拭子样品培养O1群或/和O139群霍乱弧
霍乱弧菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 一、标本的采集和送检: 1.标本的采集： 1)粪便标本：应争取在发病早期、服用抗菌药物之前采集； 2)采便方法：可用棉拭采取自然排出的新鲜大便，亦可用直肠棉 拭采便管由肛门插入直肠内3～5厘米处采取。 3)采样要求： ?水样便采取1～2毫升，成形便采取指甲大小的粪量。病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可作为检材。 ?外环境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等。 ?按1:10比例臵入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。4）肛拭采集的注意事项： 1.棉拭子要用竹签，圆形、光滑以免采样时易断； 2.棉拭子做的要稍大而紧固(避免采集时脱落)； 3.采集者应穿戴一次性手套； 4.采集前将棉拭子用碱性蛋白胨水(APW)蘸湿，多余的液体紧靠管壁挤出； 5.采集时要求被采集者双腿分立、微屈、手扶墙或凳子趴下，劝其用
单手或双手协助分开股沟(或采集者用左手分开股沟)，右手持棉拭子轻轻旋转插入肛门内约4～5cm(幼儿约2～3cm)处，转动数秒钟从紧靠肛环边的隐窝旋转擦取直肠表面黏液后退出； 6.棉拭子在推进时如感觉遇到阻力，应调整角度后缓缓旋转推进，避免用力过大或推进太快造成肛壁出血而影响病原菌的检出；棉拭子进入的深度一定要够，否则采集的有效标本量会很少； 7.采集的标本拭子应立即臵入APW内，手接触的部分在管口折断弃去。填写采样登记表(单)，并在采样管上填写被采集者的样品编号、姓名、性别、年龄，尽快送检。 二、快速诊断： 1.直接镜检： 为争取最快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检(最好用暗视野)，可见具有流星状动力的细菌。 2.特异性制动试验： ?取检材或新鲜碱性蛋白胨水培养物一滴，臵于载玻片上，再加霍乱弧菌O1多价或O139诊断血清，加盖玻片，用暗视野显微 镜观察，3分钟内流行状运动细菌被抑制的即为阳性，此法优 点是快速而特异，操作简便，可 ?在几分钟之内做出初步诊断。但要求标本必须有较多数量的弧菌，免疫血清最好是不加防腐剂的。 3.早期玻片凝集试验： ?埃尔托弧菌在TCBS、4号琼脂及庆大霉素平皿上生长较快，37℃
霍乱弧菌检测 文章目录*一、霍乱弧菌检测的基本信息1. 定义2. 专科分类3. 检查分类4. 适用性别5. 是否空腹*二、霍乱弧菌检测的正常值和临床意义1. 正常值2. 临床意义*三、霍乱弧菌检测的检查过程及注意事项1. 检查过程2. 注意事项*四、霍乱弧菌检测的相关疾病和症状1. 相关疾病2. 相关症状*五、霍乱弧菌检测的不适宜人群和不良反应1. 不适宜人群2. 不良反应 霍乱弧菌检测的基本信息 1、定义霍乱弧菌检测对霍乱有诊断意义。阳性见于霍乱。霍乱弧菌检查常规方法是:直接涂片、染色检查、动力观察制动试验。阳性结果的临床分析显微镜检查可作为快速诊断的参考。革兰染色镜检可见典型革兰阴性弧菌。悬滴暗视野检查可见穿梭样活泼运动。免疫制动试验阳性,具有重要参考意义。上述结果只能做出初步诊断,最后的确诊仍需以培养结果为准。 2、专科分类传染病检查 3、检查分类病原微生物检查 4、适用性别男女均适用
5、是否空腹非空腹 霍乱弧菌检测的正常值和临床意义 1、正常值未检出霍乱弧菌。 2、临床意义异常结果: 阳性结果的临床分析:显微镜检查可作为快速诊断的参考。革兰染色镜检可见典型革兰阴性弧菌。悬滴暗视野检查可见穿梭样活泼运动。免疫制动试验阳性,具有重 要参考意义。上述结果只能做出初步诊断,最后的确诊仍需以培 养结果为准。 阳性:见于霍乱。 需要检测的人群: 频繁急剧腹泻、呕吐等怀疑为霍乱的病人。 霍乱弧菌检测的检查过程及注意事项 1、检查过程增菌 称取检样25g,加入装有225mL碱性蛋白胨水(APW)的广口瓶内。固体样品应以均质器9000r/min-10000r/min打碎,或以剪刀充分剪碎。(36±1)℃培养6h-8h和16h-24h。如为牡蛎样品,应同样制备另一份检样,置于APW中,42℃培养6h-8h和16h-24h。 分离 以3mm-5mm接种环取6h-8h和16h-24h增菌培养液的表面生长物一环分别划线家终于TCBS琼脂平板至少各一个,于(36±1)℃
霍乱弧菌的检测 霍乱弧菌相关知识： 稻叶型（A、C） 古典型小川型（A、B、C少量） O1群霍乱弧菌：彦岛型（A、B、C） 稻叶型（A、C） 艾尔托型小川型（A、B、C少量） 彦岛型（A、B、C） 实验室准备： 1.培养基：碱性蛋白胨水、TCBS、4号或庆大霉素琼脂、营养平板、半固体菌种保存管。 2.试剂：拉丝实验用试剂（0.5%去氧胆酸钠水溶液）、氧化酶试剂（1%盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸对氨基四甲基苯胺水溶液。 3.诊断血清：O1群霍乱诊断血清、稻叶型霍乱血清、小川型霍乱血清、O139群霍乱血清。 4.快诊试剂：O1群霍乱胶体金标记快诊卡、O139群霍乱胶体金标记快诊卡。霍乱弧菌检验流程图： 标本 37度6-8小时TCBS、4号或庆大霉素琼脂 小时 胶体金快诊卡/ 制动等试验血清学凝集试验氧化酶实验拉丝实验O/129敏感试验 初步报告、菌种保存
一、采样 （一）水样便采取1-2毫升，成形便采取指甲大小的粪量。病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可做为检材； （二）外坏境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等； （三）按1：10比例置入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。 二、增菌、培养 （一）所有粪便标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗菌药物的病人标本含菌量少，单靠直接分离不易检出。需经碱胨水37度增菌6-8小时后分离(夏日可将运送时间计算在内)； （二）标本含菌量少时，为提高检出率可实行2次增菌，取第一次碱胨水增菌后的培养物表层液0.1-0.2毫升，接种于8-10毫升的碱胨水中，37度培养6-8小时后再做分离。 （三）霍乱弧菌好氧，易形成菌膜，故在取出增菌管时动作要轻，接种环于菌膜下取一满环，划线接种于TCBS或4号琼脂平板37℃10~14h孵育培养。 三、快速诊断 （一）、直接镜检：为争取最快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检（最好用暗视野），可见具有流星状动力的细菌。 （二）、早期玻片凝集试验：埃尔托弧菌在TCBS、4号琼脂及庆大霉素平皿上生长较快，37度培养8-10小时，在其他杂菌尚未生长或长出很小菌落情况下，埃尔托型菌落直径可达1-2mm。将已长出较大半透明菌落或湿润菌苔的平皿取出，直接用霍乱多价血清做玻片凝集，阳性者可初步报告。琼脂平皿继续培养，按常规培养时间再做一次复查。 （三）、要求及注意事项： 1．当霍乱弧菌在4号琼脂及庆大霉素培养基上生长过久（超过36小时）时，会出现菌落粘稠、血清凝集假阴性现象。 2．故应取新鲜培养物（10-14小时）作凝集试验，凝集的菌落立即转种营养琼脂平板。 3．小川型菌株有时在稻叶型单价血清中可出现弱凝集，这并非彦岛型，而是小川型含有少量C抗原成分的缘故。 4．有的标本可能同时存在非O1群霍乱弧菌，可疑菌落较多时，应挑选5个以上的菌落逐个进行玻片凝集检查； 5．必要时，取原划线菌苔边缘透明部分再做玻片凝集（对一次流行的首批病人进行检验时尤应注意）。 6．平皿分离未获分散的单个菌落，而在密集部位仍有可疑菌落时，应将该部分再做分离或经增菌后再做分离； 7．从恢复期病人分离出菌落典型但不凝集的弧菌，这时应以霍乱粗糙型血清做玻片凝集，以确定是否为粗糙型或NAG弧菌。 四、初步鉴定试验： 1．氧化酶实验：在非选择性或非鉴别性培养基如营养琼脂的新鲜培养物上滴加氧化酶试剂1滴，并使其流开。或将菌落用竹签或牙签挑至滴有试剂的滤纸上，在1分钟内出现粉红-紫红-紫蓝色（有的最后呈黑紫色）。为氧化酶阳性。 肠杆菌科细菌多不变色或变成粉红色后很快退色为氧化酶阴性。 注意事项：试验时避开含铁物质（如接种环）。不能直接取产酸培养基上的菌落，
霍乱弧菌的检验程序 临床细菌实验室接到高度疑似患者标本，应尽快地进行检验。具体处理方法如下。 1.临床标本（患者排泄物、呕吐物、肛拭、肛管内容物及残留、 剩余食物等）直接涂片，观察动力，再做制动试验以及革兰染色，镜检发现革兰阴性、细小、直的、微弯、逗号状的杆菌。疑似者即予电话报告 2.标本直接接种：①血琼脂平板；②弧菌鉴别性平板（4号琼脂 平板、碱性琼脂平板）；③接种碱性胨水 3.保留原始标本（不可置于冰箱冷藏） 4.35℃孵育上述所有平板及胨水 5.6~8h后：①取碱性胨水培养物涂片（直接观察动力、做制动 试验）染色镜检；②移种鉴别性琼脂平板和血琼脂平板；③霍乱红试验；④观察血琼脂平板，见有微小菌落生长。立即涂片染色，霍乱多价血清凝集，氧化酶试验。如符合霍乱弧菌的推断性鉴定，可作出早期初步报告。 6.继续孵育过夜后，做玻片凝集试验。自分离平板上挑取可疑 菌落与霍乱多价诊断血清做玻片凝集试验，所用血清的效价应在1：80～1：160，如过浓，则稀释后再做凝集。将稀释血清滴加在洁净的载玻片上，挑取可疑菌落混悬于血清内，即刻（一般不超过10s）出现肉眼可见的明显凝集者为阳性。菌落应以生理盐水作对照，不发生凝集。为了提高阳性检出率，
应多挑可疑菌落进行玻片凝集。将O1群霍乱多价血清凝集阳性菌落再做氧化酶、涂片染色镜检，初步推断性鉴定，将此高度疑似菌株，报告当地疾病控制中心做最后鉴定。 霍乱弧菌的检测 1.涂片检查：取新鲜送检标本涂片2张，干燥后，用乙醇或甲醇固定，分别用革兰染色剂1：10稀释的石碳酸复红染色，用油镜检查，观察有无革兰阴性呈鱼群排列的弧菌。 悬滴检查：取患者粪便，制成悬滴标本或圧滴标本，检查细菌的动力，霍乱弧菌古典型和EL-Tor型常呈穿梭状及活泼的活动，在悬滴涂片中加O1群霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。 2.培养：取疑似患者粪便直接接种于碱性蛋白胨水中，进行增菌，同时划线接种于碱性琼脂平板或TCBS平板及血液琼脂平板，孵育于35℃。增菌培养孵育6h后，取表面菌膜移种于上述平板上，进行分离培养，并同时涂片，革兰染色和悬滴标本，检查形态及活动力。 各种分离培养的平板在孵育18~24h后观察菌落，挑取可疑菌落，先与生理盐水混匀，观察有无自凝现象。再用O1群霍乱多价血清做玻片凝集试验，立即出现明显凝集者为阳性，有条件者再做血清分型。 如在选择培养基生长典型菌落，运动活泼呈穿梭状，氧化酶
群霍乱弧菌的鉴定和分型 l 血清分型 用普通琼脂或碱性琼脂培养基上的菌苔进行血清分型。分型使用小川型及稻叶型的单价血清作玻片凝集反应。 l.1 在小川型单价血清凝集，在稻叶型单价血清不凝集者为小川型。 l.2 在小川型单价血清不凝集，在稻叶型单价血清凝集者为稻叶型。 1.3 在小川型、稻叶型单价血清均呈明显凝集者为彦岛型。 2 试管凝集试验 用生理盐水自1:20开始对倍连续稀释01群霍乱多价血清，每管含稀释血清O 历mL。将被检菌在营养琼脂的16～18h培养物用0.2%福尔马林生理盐水制成每毫升约含18亿菌体(相当于细菌标准比浊管浓度)的悬液，每稀释血清管加入0.5mL;另将菌悬液0.5mL加入0.5mL生理盐水中作对照。摇匀，置37℃3h观察初步结果。再放4℃或室温过夜，观察最后结果。生理盐水对照不出现自然凝集，能便试验菌出现十十凝集的血清最高稀释倍数为凝集滴度，凝集滴度达到或超过血清原效价一半的即可确定为01群霍乱弧菌。 对一次流行的首批病例菌株和玻片凝集反应不典型的菌株应做本试验。 3 古典型和埃尔托型的鉴别 3.1 按表l所列的试验鉴别01群霍乱弧菌的两个生物型。 注:括弧内为少数菌株结果。 3.2 试验方法: a. 第N组霍乱噬菌体裂解试验: 本项试验与噬菌体分型在同一平皿上进行，方法见C4.1.2。 b. 多粘菌素B敏感试验:将1.5%普通琼脂加热溶化，待冷却至5O℃z左右，按每毫升培养基加入50单位多粘菌素B，摇匀后倾注平皿，凝固后备用。在平皿背面用玻璃笔划出若干方格。将被检菌2～ 3h肉汤培养物一接种环点在培养基表面，
待干后放37℃培养过夜，观察结果。被检菌不生长或生长不足10个菌落为敏感，记录为十号。 c. 鸡血球凝集试验:在清洁平皿内划出方格，用直径4mm的接种环取一滴生理盐水滴在每个方格内，取被检菌18h琼脂培养物少许。在生理盐水中制成浓厚菌悬液。再用接种环各加一滴经洗涤三次的2.5%鸡血球生理盐水悬液，充分摇匀，肉眼观察结果。1min内出现血球凝集者为阳性，血球呈均匀分散状态者为阴性。埃尔托型为阳性。古典型一般为阴性。 d. V-P试验:将被检菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胰水，37℃培养2～3天。然后取出lmL培养物加5%0a-奈酚乙醇溶液0.6mL，振荡5s，加入40%氢氧化钾液0.2mL,再振荡5s，去掉棉塞置室温。在lh内出现红色反应者为阳性。阴性者在试剂加入后逐渐出现浅褐色。古典型为阴性，而埃尔托型多为阳性。 e. 溶血试验:取被检菌24h普通肉汤(中试管装8～1OmL)培养物lmL，l%绵羊红血球(生理盐水洗3次，最后l次离心速度为20OOr/min，离心lOmin)lmL。混匀后放37℃ ,2h观察初步结果，再放4℃冰箱过夜观察最后结果。试验应有已知溶血椭、不溶血株和肉汤管做对照。达半数血球溶解者为溶血阳性。为证明为不耐热溶血素。可将被检菌的培养物加热56℃ 3Omin而后再做溶血试验。古典型不产生可溶性溶血素。埃尔托型有些产生，有些不产生不耐热的可溶性溶血素。 4 噬菌体-生物分型 4.1噬菌体分型 4.1.1 利用五株国内分离的弧菌噬菌体(VPl～Vp5)将埃尔托型霍乱弧菌分成32个噬菌体型(表2)。 4.1.2 噬菌体分型方法:在1.5%普通琼脂平皿的背面，用玻璃笔划出9个方格，再将被检菌2～3h肉汤培养物0.2mL加至已融化并冷至5O℃的0.7%4mL半固体琼脂中，混匀后倾注于琼脂平皿上。待干后，于第1～5格分别滴加VPl～VP5分型噬菌体的原液(l08～109/mL);第6、7格分别滴加第IV组霍乱噬菌体原液(109/mL)及常规稀释液(106/mL);第8、9格滴埃尔托型霍乱弧菌的溶原噬菌体两个代表株(溶原性菌株的18～20h肉汤培养物，经56C3Omin水浴杀菌后使用)，作为对溶原噬菌体敏感性的测定。待干后放37℃培养过夜，观察结果。依据被检菌对VP～lVP5噬菌体的敏感性，按表2判定其噬菌体型别。 4.2 埃尔托型霍乱弧菌的生物分型 4.2.1根据菌株的溶原性、对溶原噬菌体的敏感性、山梨醇发酵试验和溶血试验等四个生物学性状，将埃尔托型霍乱弧菌分成12个生物型(表3)。 4.2.2 溶原性测定:从埃尔托型霍乱弧菌复愈型抗链霉素株SM6的普通琼脂平皿培养物上挑取光滑圆整的典型菌落接种普通肉汤，37℃培养8～12h，作为指示菌。在直径9cm平皿中倾注一薄层1.5%普通琼脂培养基，待凝固后，于平皿底的背面用
霍乱弧菌的分离及鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 一、标本的采集和送检: １.标本的采集： 1)粪便标本：应争取在发病早期、服用抗菌药物之前采集; 2)采便方法：可用棉拭采取自然排出的新鲜大便,亦可用直肠棉拭 采便管由肛门插入直肠内3～5厘米处采取。 3)采样要求: ?水样便采取1～２毫升，成形便采取指甲大小的粪量.病人呕吐 物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可作为检材。 ?外环境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等。 ?按１:1０比例置入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。４）肛拭采集的注意事项： 1.棉拭子要用竹签,圆形、光滑以免采样时易断; ２。棉拭子做的要稍大而紧固（避免采集时脱落); 3。采集者应穿戴一次性手套; 4。采集前将棉拭子用碱性蛋白胨水（ＡPW）蘸湿，多余的液体紧靠管壁挤出; 5。采集时要求被采集者双腿分立、微屈、手扶墙或凳子趴下,劝其用单手或双手协助分开股沟（或采集者用左手分开股沟)，右手持棉拭
子轻轻旋转插入肛门内约４～５cm（幼儿约2~3cm）处，转动数秒钟从紧靠肛环边的隐窝旋转擦取直肠表面黏液后退出； ６。棉拭子在推进时如感觉遇到阻力,应调整角度后缓缓旋转推进,避免用力过大或推进太快造成肛壁出血而影响病原菌的检出；棉拭子进入的深度一定要够，否则采集的有效标本量会很少; 7。采集的标本拭子应立即置入ＡＰW内,手接触的部分在管口折断弃去。填写采样登记表（单），并在采样管上填写被采集者的样品编号、姓名、性别、年龄，尽快送检。 二、快速诊断： 1。直接镜检: 为争取最快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检（最好用暗视野），可见具有流星状动力的细菌。2.特异性制动试验: ?取检材或新鲜碱性蛋白胨水培养物一滴，置于载玻片上，再加 霍乱弧菌Ｏ1多价或Ｏ1３9诊断血清,加盖玻片,用暗视野显微 镜观察，3分钟内流行状运动细菌被抑制的即为阳性,此法优点 是快速而特异，操作简便，可 ?在几分钟之内做出初步诊断。但要求标本必须有较多数量的弧 菌，免疫血清最好是不加防腐剂的. 3.早期玻片凝集试验： ?埃尔托弧菌在ＴCBS、4号琼脂及庆大霉素平皿上生长较快，3 ７℃培养８～10小时，在其他杂菌尚未生长或长出很小菌落的
霍乱弧菌2种核糖体分型方法比较(一) 作者：严寒秋，卢桂兰，骆海朋，黄芳，刘园，刘桂荣，孙玉兰，吴疆 【关键词】分型方法 目前分子杂交技术已广泛用于霍乱弧菌检测中，是霍乱疫情中追踪传染源的主要检测方法之一〔1〕。本文以16S-23S-5SrRNA为探针，对霍乱疫情中分离的霍乱弧菌进行Southern杂交后，使用2种限制性内切酶普通变形杆菌Ⅱ型酶（PVUⅡ）和大肠埃希菌RI型酶(ECORⅠ)，对2种核糖体分型（RT）方法的图谱进行分析比较。现将结果报告如下。 材料与方法 （1）菌株来源：暴发疫情分离株27株，先后分离自本市2004年2起霍乱疫情，其中11株来自食用某快餐公司盒饭引起腹泻的11例患者粪便标本，4株为该快餐公司的盒饭加工环境涂抹标本；7株分离自某养殖场消毒前养殖水标本，5株为该养殖场消毒后养殖水标本。散发病例分离株3株，1999年2株，2001年1株。（2）试剂与仪器：培养基、霍乱诊断血清和噬菌体生物分型试剂(中国疾病预防控制中心)；限制性内切酶PVUII、ECORⅠ，16S-23S-5SrRNA基因探针和染色体DNA提取试剂盒（美国杜邦公司）；RiboprinterMicrobialCharacterizationSystem（美国杜邦公司）。（3）菌株常规鉴定：参考文献〔2〕。（4）分型方法比较：2种RT方法按美国杜邦公司提供的仪器和试剂盒说明书进行。染色体DNA分别经ECORⅠ、PVUII酶切，16S-23S-5SrRNA基因探针杂交后，根据杂交条带的数目和片段大小的差异，判断RT结果。 结果 （1）血清学和噬菌体生物分型：30株分离株均为01群霍乱弧菌，其中分离自腹泻患者及盒饭加工环境的15株霍乱弧菌，血清学分型均为01小川型，噬菌体生物分型为221和91；分离自消毒前养殖水标本的7株，血清学分型均为01稻叶型，噬菌体生物分型5f、1e和1f，分离自消毒后养殖水标本的5株，血清学分型均为01小川型，噬菌体生物分型1e和1f；散发株中，1株为01小川1b(1999),1株为01稻叶1d(2001)，1株为01稻叶8k(1999)。（2）2种核糖体分型：①ECORⅠ分型：30株01群霍乱弧菌经ECORⅠ分型,得到2个型,分别为RT5,29株(条带拷贝分别为102，26,40kb)；RT6,1株(条带拷贝分别为102，13，26，40kb)。分离自腹泻患者的15株和消毒前后养殖水的12株均为RT5，1999年的2株散发分离株分别为RT5和RT6，2001年的1株散发株为RT5。②PVUII分型：30株01群霍乱弧菌经PVUII 分型，得到4个型，分别为RT1，15株（条带拷贝分别为60，68，94，130，325kb）；RT2，11株（条带拷贝分别为60，68，90，100，150，325kb；RT3,3株（条带拷贝分别为60，64，90，100，141，220，325kb）；RT4，1株（条带拷贝分别为60，70，75，90，100，125，141，325kb）。分离自腹泻患者的15株均为RT1，分离自消毒前养殖水的7株中6株为RT2，1株为RT3；分离自消毒后养殖水的5株均为RT2。1999年2株散发株为RT3和RT4，2001年散发株为RT3。③2种方法比较：用PVUII对菌株分型，得到4个RT型，其中快餐盒饭疫情分离株虽然血清学和噬菌体生物分型为01小川22l和9l，但RT分型均为RT1，表明这15株菌属同一克隆体系，而与RT2、RT3和RT4等菌株亲源关系较远，提示该起疫情可能与快餐公司盒饭污染密切相关。而分离自消毒前养殖水的6株和消毒后的5株，虽血清噬菌体生物分型分别为01稻叶型5f、1e、1f和01小川型1e和1f，但RT分型均为RT2，表明这11株属同一克隆体系，而与RT1、RT3和RT4等菌株亲源关系较远，提示该起疫情养殖水中的霍乱弧菌可能因消毒剂作用其血清型已发生变异，可排除消毒后养殖水二次污染的推断。消毒前养殖水中有1株为血清学和噬菌体生物分型为01稻叶1e，RT分型为RT3，而消毒后的5株菌为RT2，提示RT3型霍乱弧菌可能在消毒时已被杀灭。1999和2001年的散发分离株中存在RT3型，养殖水中12株分别为RT2和RT3，从时间上先有RT3，而RT2是否为RT3突变而来，还有待深入研究。