基因工程原理
基因工程原理
内容提要
1.基因工程又称基因操作、重组DNA技术, 是P. Berg等于1972年创建的。基因工程技术涉及的基本过程包括“切、连、转、选”。该技术有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。
2.基因工程中使用多种工具酶，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合
成与修饰的酶类。
3.限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶，属于水解酶类。根据限制性内切核酸酶的
作用特点，被分为三大类。Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强,切割的方式有平切和交错切, 作用时需要Mg++作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。
第一个被分离的Ⅱ类酶是Hind Ⅱ。
4.连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。基因工程中使用的连接酶来自于原核生物，有两种类型的DNA连接酶∶E.coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶。基因工程中使用的主要是T4DNA连接酶，它是从T4噬菌体感染的E.coli
中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。
5.载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒，在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。
6.DNA重组连接的方法大致分为四种: 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连
接法。粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法,是指具有相同粘性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA。平末端连接是指在T4 DNA连接酶的作用下, 将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。同聚物加尾连接就是利用末
端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA 和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段, 但方法较繁, 需要λ核酸
外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用。将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切酶的识别序列), 加到载体或外源DNA的分子上, 然后通过酶切制造黏性末端的方法称为接头连接法。
7.基因文库分为基因组文库、cDNA文库等，是指在一种载体群体中, 随机地收集着某一生物DNA的各种克隆片段, 理想地包含着该物种的全部遗传信息。
8.DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。目前常用的诱导感受态转化的方法是CaCl2 法（图3-20），此外也可以用基因枪等方法转化外源DNA。
9.重组体筛选有遗传学方法、核酸杂交筛选法等。
10.基因工程技术是现代生物技术的核心，目前在工业、农业和医疗中已经显示了巨大的应用前景，并形成了一大批生物技术产业。
基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品；或是研究基因的结构和功能，揭示生命活动规律。基因工程技术诞生于20世纪70年代初，它是一门崭新的生物技术科学，它的创立和发展使生命科学产生了一次重大飞跃，证明并实现了基因的可操作性，使人类从简单地利用天然生物资源走向定向改造和创造具有新品质的生物资源的时代。基因工程技术诞生至今已经取得了辉煌的成就，成为当今生命科学研究领域中最有生命力和最引人注目的前沿学科之一，基因工程也是当今新的产业革命的一个重要组成部分。．
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第一节基因工程技术的诞生
基因工程又称基因操作(gene manipulation), 重组DNA(recombinant DNA)技术, 是70年代发展起来的遗传学的一个分支学科。
一、基因工程技术的诞生
1972年，P.. Berg等在PNAS上发表了题为∶“将新的遗传信息插入SV40病毒DNA的生物化学方法: 含有λ噬菌体基因和 E.coli 半乳糖操纵子的环状 SV40DNA”，标志着基因工程技术的诞生。 SV40病毒是猿猴病毒，是一种450的球形病毒，分子量为28×106道尔顿。SV40的DNA 是环状双链结构，全长5243个碱基对，编码三直径为个衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和一个T抗原。SV40DNA上有一个限制性内切酶E.coRⅠ的切点。 Berg等首先用化学方法构建了一个二聚体的环状SV40DNA(图3-1)。
et. al,1972)
Berg 二聚体的构建(引自SV40图3-1 重组的当时所用的连接方法是同聚物谱尾法，重组体的鉴定主要是通过电子显微镜比较分子量大小。当获得二聚体SV40DNA后，Berg等就证明了环状DNA被
并且能够同另DNA后能够重新环化，内切酶切成线性外的分子重组。于是他们进行第二步的实验就是从的半乳糖操纵子 E.coli 中制备含有λdvgal DNA 并获得成功。DNA，用上述同样的方法进行重组连接，等的工作是人类第一次在体外给遗传物质动手Berg1980术，标志着一个新时代的到来，为此他获得了年诺贝尔化学奖。和特点二、基因操作的基本过程
表示∶基因工程的操作可用图3-2
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图3-2 基因工程的基本过程(引自Old & Primrose,1980)
它所涉及的过程可用“分(合成)、切、连、转、选、鉴”六个字表示。
分(合成)∶指DNA的制备，包括从生物体中分离或人工合成。分离制备或合成制备DNA的方法都有很多种。
切∶即在体外将DNA进行切割，使之片段化或线性化。
连∶即在体外将不同来源的DNA分子重新连接起来，构建重组DNA分子。
转∶即将重组连接的DNA分子通过一定的方法重新送入或细胞中进行扩增和表达。
选∶从转化的全群体中将所需要的目的克隆挑选出来；
鉴∶就是进行对筛选出来的重组体进行鉴定，因为有些重组体并非是所需要的，必需通过分析鉴定。
基因工程有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。遗传重组是生物进化的推动力，自然界中发生的遗传重组主要是靠有性生殖。基因工程技术的诞生使人们能够在试管里进行分子水平上的操作，构建在生物体内难以进行的重组，然后将重组的遗传物质引入相应的宿主细胞，让其在宿主细胞中进行工作。这实际上是进行无性繁殖，即克隆，所以基因工程通常有称为基因克隆。
第二节限制性内切核酸酶
外科医生给患者动手术需要手术刀，基因工程师们给DNA分子(基因)动手术需要分子手术刀，这就是工具酶。基因工程中使用的工具酶很多，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合成与修饰的酶类，最重要的是限制性内切核酸酶。基因工程上把那些具有识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶统称为限制性内切核酸酶。
一、限制性内切核酸酶的发现
1952年Luria、Human在T偶数噬菌体、1953年weigle、Bertani在λ噬菌体对大肠杆菌的感染实验中发现了细菌的限制和修饰现象。正是对限制和修饰现象的深入研究，导致限制性内切核酸酶的发现。
噬菌体在某一特定细菌宿主中生长的能力，取决于它最终在其中繁殖的细菌是什么菌株。例如，将A噬菌体从一株大肠杆菌转移到另外一株，其生长效率往往会削弱，对这两个菌株的滴定度可差好几个数量级。第二个菌株释放的噬菌体能百分之百再感染同类菌株，但是若先将它们感染原来的宿主菌，再将释放的子代噬菌体重新感染第二个菌株时，感染率要大大下降。此种现象即为宿主控制的限制作用(host—Controlled restriction)。
用放射性同位素标记的噬菌体进行的实验结果表明，在受感染的宿主细胞中，噬菌体生长的限制伴有噬菌体DNA的迅速降解，然而，用作繁殖噬菌体的感染宿主菌株并不导致类似的噬菌体DNA 的降解。如果某一细菌细胞具有一种能选择性降解来自侵染病毒(或其他来源)的核酸酶，那么，它必须能将这种外来DNA同它自己的DNA区分开来，之所以能够如此，乃是通过稍为宿主控制的修饰作用(host-controlled modification)。
因此，限制(restriction)作用是指细菌的限制性核酸酶对DNA的分解作用，限制一般是指对外源DNA侵入的限制。修饰(modification)作用是指细菌的修饰酶对于DNA碱基结构改变的作用(如甲基化)，经修饰酶作用后的DNA可免遭其自身所具有的限制酶的分解。
到20世纪60年代中期，科学家推测细菌中有限制－修饰系统(restriction—modification system． R-M system)。该系统中有作用于同一DNA的两种酶，即分解DNA的限制酶和改变DNA 碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶，而且，这两种酶作用于同一DNA的相同部位。一般说来，不同种的细菌或不同种的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制-修饰系统。
1968年，Meselson从E．coli K株中分离出了第一个限制酶EcoK，同年Linn和Aeber从 E．coli B株中分离到限制酶EcoB。遗憾的是，由于EcoK和EcoB这两种酶的识别和切割位点不够专一，在基因工程中意义不大。
1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶，能够特异性地切割 DNA，这个酶后来命名为HindⅡ，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。由于这类酶的识别序列
和切割位点特异性很强，对于分离特定的DNA片段就具有特别的意义。
二、限制性内切核酸酶的命名和分类
基因工程原理（一）限制性内切核酸酶的命名按照国际命名法，限制性内切核酸酶属于水解酶类。由于限制性酶的数量众多，而且越来越多，并且在同一种菌中对限制性酶和Nathans 对内切酶的命名提出建议，1980年，Roberts发现几种酶。为了避免混淆，1973年Smith
的命名进行分类和系统化。株名的个一个首字母，再加上序号，将限制性内切核酸酶的命种名 + 限制性酶采用三字母的命名原则，即属名 +
3-1。名要点列于表
3-1 限制性内切核酸酶的命名要点表要点条目
株名+序号种名基本原则3-4个字母组成, 方式是:属名++取属名的第一个字母, 且大写首字母种名的第一个字母, 小写第二字母取, 则取词头后的第一字母代替①取种名的第二个字母, 小写; ②若种名有词头, 且已命名过内切酶第三字母根据原来的情况而定若有株名, 株名则作为第四字母, 是否大小写, 第四字母I, 则按先后顺序冠以、II、III,.....等顺序号若在同一菌株中分离了几个限制性内切核酸酶 K (大肠杆菌K: EcoK: Escherichia coli 株如)
（二）限制性内切核酸酶的分类
限制性内切核酸酶的作用特点，将它们分为三大类。
1. I类限制性内切核酸酶
I类限制性内切核酸酶的分子量较大, 一般在30万道尔顿以上, 通常由三个不同的亚基所组成。例如限制性酶EcoB是由R(135kD)，M(62kD)和S(55kD)三种亚基组成的复合酶，这三个亚基分别由不同的基因编码。全酶的总分子量为449kD,共5个亚基，其中R亚基和M亚基各两分子。Ⅰ类酶不仅是一种核酸内切酶, 同时在酶分子上还具有甲基化酶和ATPase的活性，所以是具有多种酶活性的复合酶类。作用时除了需要Mg++作辅助因子外, 还要求ATP和S腺苷甲硫氨酸(SAM)的存在。Ⅰ类酶具有特异的识别序列，大约15个碱基对。
Ⅰ类酶虽然能够在一定序列上识别DNA分子, 并能同DNA分子作用, 因其识别DNA后, 要朝一个方向或两个方向移动一段距离(通常为1000个碱基左右)，并且要形成一个环才能切割DNA(图
3-3), 所以识别位点和切割位点不一致，产生的片段较大。
Lewin,1997)
引自 (类酶的作用方式3-3 I图
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2. Ⅲ类限制性内切核酸酶
Ⅲ类限制性内切核酸酶也是基因工程中不常用的酶，分子量和亚基组成类似于Ⅰ类酶, 作用方式基本同Ⅱ类酶。如Eco P1是由两个亚基组成，一个亚基(M亚基)负责位点识别和修饰。另一个亚基(R亚基)具有核酸酶的活性(图3-5)。切割DNA时需要ATP,Mg2+,也能被SAM激活，但并非必需。
图3-4 Ⅲ类限制性内切核酸酶(引自Lewin,1997)
3. Ⅱ类限制性内切核酸酶
这类酶的分子量较小. 一般在2-4万道尔顿, 通常由2-4个相同的亚基所组成。它们的作用底物为双链DNA, 极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA, 或DNA/RNA杂种双链。这类酶的专一性强, 它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求, 而且对更远的碱基也有要求, 因此, Ⅱ类酶既具有切割位点的专一性, 也具有识别位点的专一性, 一般在识别序列内切割。切割的方式有平切和交错切, 产生平末端的DNA片段或具有突出粘性末端的DNA片段(5'或3'粘性末端)。作用时需要Mg++作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。Ⅱ类酶与对应的甲基化酶在蛋白亚基上尚未发现有Hind Ⅱ。什么关系, 第一个被分离的Ⅱ类酶是三. Ⅱ类限制性内切核酸酶的性质
1. 识别序列的特异性
在3类限制性内切核酸酶中，Ⅱ类限制性内切核酸酶的特异性最强。
大多数Ⅱ类限制性内切核酸酶识别的序列是回文序列。如BamHI和BglI都是识别六个碱基的DNA 序列(图3-5)，都是完全的回文序列。这段序列有两个基本的特征，第一是能够中在间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对，第二个特点是两条互补链的5'到3'的序列组成相同，即将一条链旋转1800，则两条链重叠。
图3-5 Ⅱ类限制性内切核酸酶识别的回文序列（引自D.Voet & Vote J.G.1995）
2. 限制性内切核酸酶的切割频率与速度
切割频率是指限制性内切核酸酶在某DNA分子中预测的切点数。由于DNA是由四种类型的单核苷酸组成，假定DNA的碱基组成是均以的，而限制性内切核酸酶的识别位点是随机分布的，那么对于任何一种限制性内切核酸酶的切割频率，理论上应为1/4n，n表示该限制性内切核酸酶识别的碱基数。如识别4个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每256个碱基有一个识别序列和切点(1/44=1/256)，识别5个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每1024个碱基有一个识别序列和切点，余下类推。
实际上因DNA的分布是不均一的,且有大量的重复序列,加上内切酶的切点具有GC倾向,所以实际的频率偏低。如同EcoBamSalHpa II:200。HI:6000; 个碱基的限制性内切核酸酶，切割的频率相差很大∶是识别6I:8000;RI 4000;根据限制性内切酶切割DNA所产生的产物末端，发现限制性内切酶对DNA的切割有两种方式，即平切和交错切。所谓平切，就是限制性内切酶在DNA双链的相同位置切割DNA分子，这样产生的末端就是平末端。交错切就是限制性。3-6)图(片段的末端不是平齐的DNA，产生的DNA双链的不同位置切割DNA内切酶在．
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图3-6 平末端与黏性末端(Hartl,1991)
Ⅱ类限制性内切酶的切割产物有平末端和粘性末端(cohesive end)。粘性末端是指DNA分子的两端具有彼此互补的一段突出的单链部分, 这一小段单链部分和同一分子的另一端或其它分子末端的单链部分如果互补的话，则能通过互补碱基之间的配对, 形成双链。并在DNA连接酶的作用下, 使同一DNA分子的两端连接成环状,或使两个分子连成一大的线状分子。不同限制性内切酶切割DNA产生的三种不同类型的末端(表3-3)。
表 3-3 某些限制性内切酶及产生的末端
5'-粘性末端 3'粘性末端平末端
识别序列识别序列酶识别序列酶酶
Alu I T/CGA
Taq I
Pst I CTGCA/G
AG/CT
FnuCla Sac I AT/CGAT GAGCT/C CG/CG DⅡ I
SphDpnMbo I GCATG/C I I GA/TC /GATC
Bde BglHae I GG/CC A/GATCT GGCGC/C ⅡⅢ
ApaPvu Bam I CAG/CTG GGGCC/C HI G/GATCC ⅡKpnSmaBcl I T/GATCA CCC/GGC GGTAC/C
I I
HindNae I GCC/GGC Ⅲ A/AGCTT
NcoHpa I C/CATGG I GTT/AAC
XmaNru I I C/CCGGG TCG/CGA
XhoBal I C/TCGAG I TGG/CCA
EcoMst R I I G/AATTC TGC/GCA
SalMhaⅢ G/TCGAC I TTT/AAA
Xba Eco R I T/CTAGA
GAT/ATC
Ⅴ基因的分子手术是相当复杂的过程，除了需要限制性内切酶外，还需要其他一些工具酶包括连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸酶、末端修饰酶等，对DNA或RNA进行各种各样的修饰。其中最重要的是连接酶。
第三节基因工程载体
载体(vector, vehicle) 的本意就是媒介体，基因工程上的载体是能将分离或合成的基因导入细
胞的DNA分子，称为克隆载体。基因工程中有三种主要类型的载体∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒，其中质粒DNA是最常用的载体，但运载能力低，柯斯质粒是质粒和λ噬菌体DNA的结合体，运载能力最高(图3-7)。在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。．
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图3-7 三种类型的载体(引自Greene,1998 )
一、质粒载体
质粒(plasmid)是染色体以外的遗传物质，它是双链闭合环状DNA分子，其大小可从1kb到200kb 左右，能够在宿主内利用宿主的酶系统进行复制。质粒是基因工程的主要载体。
(一)质粒概念
1946—1947年间，Lederberg和Tatum发现了细菌的接合现象，这是细菌的有性繁殖方式。此后不久，便弄清了这种接合是两种不同的交配型(接合型)，遗传信息总是从供体(雄性)转移到受体(雌性)。当两种不同的交配型的细菌相互识别和接合以后，雄性细胞的致育因子，通过细胞的表面结构传递到雌性细胞，这种致育因子后来称为F因子。
1952年，Lederberg指出，细菌的F因子与高等生物细胞质中染色体外的遗传单元极为相似，并正式提出了“质粒”这一名称，以区别于染色体的遗传单元。
一般来讲，质粒是细胞中能够独立复制的复制子，并在细胞分裂时能稳定传递给子代细胞。虽然质粒对细胞的生存没有影响，但质粒DNA上也有一些编码基因，赋予宿主细胞一些特性。自发现能赋予细菌性别特征的F因子以后，又在大肠杆菌中发现了一种能够编码抗菌物质——大肠杆菌素的Col质粒，包括ColB，ColV，ColE等。由这些因子产生的抗菌物质称细菌素(bacleriocin)，是细菌所合成的一种蛋白质，对于同种或近缘种具有毒性。合成细菌素的能力和对于细菌素的抗性，都由染色体外的遗传因子所控制。
在1959一1960年间，日本科学家在研究用强效抗生素治疗菌痢患者时，发现病原菌志贺氏菌含有使其同时能抗几种抗生素的基因，而且，这种抗药性基因能以和F因子非常相似的方式转移给其他肠道细菌，这就是抗药因子(R因子)。抗药因子(resistance factor)实际上是控制细菌抗药性的一种质粒，能在细菌间转移，由抗药性转移因子和抗药性基因两部分组成。每个抗药因子上常具有几个抗药性基因。
（二）质粒DNA的基本性质
大多数质粒DNA是是环状双链的DNA分子。如果两条链都是完整的环，这种质粒DNA分子称为共价闭合环状和SC DNA)，DNA( supercolied DNA有两种构型，超螺旋CCC DNA。DNA(covalently closed circular, CCC DNA)．
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松弛的DNA(Relaxed DNA),分别是由DNA促旋酶(DNA gyrase) 和拓朴异构酶(topoisomerase)作用的结果。如果质粒DNA中有一条链是不完整的，那么这种DNA分子就称为开环的(open circles,OC DNA)，开环的DNA通常是由内切酶或机械剪切造成的图3-8)。从细胞中分离质粒DNA 时，质粒DNA常常会转变成超螺旋的构型。
图3-8 质粒DNA的三种构型(引自Old & Primrose,1980)
溴化乙啶(ethidium bromide，EtBr)是一种扁平的分子，能够插入到DNA分子的碱基对之间，引起双螺旋的部分解的体积和密度。旋，从而改变了DNA
3-9 相对分子质量相同构型图 DNA的琼脂糖凝胶电泳不同的质粒 Old & Primrose, 1980）（引自它们在琼脂糖凝胶电泳中的的量不同，插入由于不同构型的DNAEBL 泳动速度最慢，的泳动速度最快，OC DNA迁移率也不同，CCC DNA染色的方法将不EB图3-9)，所以很容易通过凝胶电泳
和DNA居中( 分别开来。同构型的DNA质粒分类（三）
根据质粒的拷贝数将质粒分为松弛型质粒和严紧型质粒。质粒拷贝是指细胞中单一质粒的份数同染色体数(plasmid copy numbers)数每染色体来表示。不同的质粒在宿主细胞中的常用质粒数/之比值,,
拷贝数不同的复制只受本身的遗传结构的控制，松弛型质粒(relaxed plasmid)每染色体。并且可以在氯霉素作用下进个/10—15而不受染色体复制机制的制约，因而有较多的拷贝数。通常可达。这类质粒多半是分子)3000个1000每染色体(ColE1, 可由24个达到至行扩增，有的质粒扩增后，可达到3000/ 不具传递能力的质粒。基因工程中使用的多是松弛型质粒。量较小,
在寄主细胞内的复制除了受本身的复制机构的控制外，还受染色体的严紧控制，严紧型质粒(stringent plasmid) 每染色体。这种质粒一般不能用氯霉素进行扩增。2—个/因此拷贝数较少，一般只有1 严紧型质粒多数是具有自我传递能力的大质粒。质粒的复制特性是受复制子控制的。基因工程中使用的质粒多数是松弛性质粒载体。（四）载体的条件10)∶复制区，含有复制起点；选择图3-()(DNA就克隆一个基因片段来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分的插入。DNA标记，主要是抗性基因；克隆位点，便于外源．
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就复制特性来讲，要求载体必需有独立的复制起点, 最好是松弛型复制，这样便于得到大量的拷贝。有时需要有多个复制起点，能够在不同的宿主细胞中复制，扩大宿主范围。
具有合适的克隆位点, 便于外源DNA的插入。克隆位点实际上限制性酶切位点，最好是具有多种限制性内切酶的单切点，这样适应性强，克隆方便，如果一种酶在载体上有多个切点，就会限制该切点的使用。
具有可检测的选择标记, 也是一个重要的基本条件，这种选择标记最好是能够赋予宿主易于检测的表型。选择标记就是常说的报告基因(report genes)，包括抗生素抗性标记，以及一些生化表型的标记。
另外，一个理想的质粒载体必需具有低分子量，因为小分子的质粒DNA易于操作，不容易被损伤，也容易被分离纯化。一般说小分子量的质粒分子的拷贝数比较高，酶切位点也少。
图3-10 质粒载体的基本结构
二、杂合载体
除了质粒载体外，噬菌体的DNA也可作为载体，不过都是改造过的，自然病毒的DNA不能作为载体。目前在基因工程中使用的载体大多是质粒和噬菌体的杂合载体。
（一）柯斯质粒(cosmid)载体
cosmid 是英文 cos site-carrying
本意是带有粘性末端的缩写, plasmid
柯斯质粒是人工建因此, 位点的质粒,
序列和质粒复制的cos造的的含有λDNA 子的特殊类型的质粒载体。柯斯质粒的构建一般都是利用质粒的复位点序cos加上λ的制子、选择标记,
列及与包装有关的序列，构建的科斯质粒。图3-11)可以很好地用于基因克隆(
Lodish (引自图3-11 柯斯质粒载体克隆et al,1986)
早期构建的科斯质粒载体有一些不足，如克隆位点较少，抗性标记单一，容栽能力不大，后来进行了一些改进，克服了这些不足。:
柯斯质粒具有如下特点目前构建的柯斯具有质粒复制子。1.复制子或pMB1质粒大多具有所以进入寄主细复制子, ColE1, 胞后能够象质粒一样进行复制并且能够被氯霉素扩增。．
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2.具有质粒载体的抗生素抗性基因的选择标记。如果在这些标记中有克隆位点的话可用插入失活法进行筛选。例如上面构建的MuA-3就具有四环素抗性基因。
3.具有λ噬菌体的包装和转导特性。由于柯斯质粒具有λDNA的cos位点和相应的包装序列, 因此在克隆了适当大小的外源DNA以后可以被包装进入噬菌体蛋白颗粒, 并能进行转染。转导的能力比纯的质粒大3个数量级。进入寄主细胞后, 又可以自我环化。但它不能同寄主的染色体DNA 整合, 也不会产生子代噬菌体裂解寄主。
4.溶载能力大。这是柯斯质粒的最大优点。被克隆的DNA大小具有上限和下限, 这是因为柯斯质粒最后是被包装到噬菌体颗粒, 它的最后大小应在噬菌体基因组的75%-105%之间。由于载体分子一般在5kb左右, 所以克隆的最大片段在45kb;如果载体的分子量为15kb的话, 克隆的最小片段为19kb。因此柯斯质粒适合构建真核生物的基因库, 而不适合克隆原核生物的基因。（二）pUC载体系列的构建
美国加州大学的Vieira和Messing利用pBR322和M13载体的优点，构建了一个更小的载体，称为 pUC7（图3-12），并在此基础上发展了pUC载体系列。
图3-12 pUC载体的构建(引自Winnacker,1987)
pUC载体具有很多优点∶①多克隆位点；②松弛复制；③有氨苄青酶素抗性；④可通过化学显色筛选。
现在最常用的pUC载体是pUC18(图3-13),它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的分子标记，并且是松弛型复制，在正常情况下，它的拷贝数可达上千个，所以不需要用氯霉素进行扩增。．
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图3-13 pUC18质粒载体图谱
二、基因文库技术
基因文库(Gene Library)是指在一种载体群体中, 随机地收集着某一生物DNA的各种克隆片段, 理想地包含着该物种的全部遗传信息(图3-18)。因此, 基因文库是人工构建的某一生物基因的“活期储蓄所”, 根据构建方法的不同,分为基因组文库、cDNA文库等。根据基因库的含量,又
分为全库和特异性的库,全库含有某一生物的全部遗传信息,而特异性的库是不完整的,如差示库。
早期将通过构建基因文库来筛选所需克隆的方法称为鸟枪法。
图3-18 基因文库技术（J.J.Greene & Rao V.B.,1998）
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第三节体外重组
一、体外重组的方法
DNA重组连接的方法大致分为四种: 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。1. 粘性末端连接法
粘性末端连接(Cohesive end ligation)是指具有相同粘性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA(图3-14)。粘性末端可由识别回文序列的内切酶所产生, 或是用末端转移酶来制备。凡是识别回文序列的内切酶切割DNA产生的末端都是粘性末端, 只有用同一种酶切割产生的相同粘性末端才能通过末端单链的碱基配对并在DNA连接酶的作用下
进行连接。
图3-14 黏性末端连接法（引自 Snyder & Champness , 1977）
粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法, 酶切片段基本不需作什么处理就可以用于连接, 既
经济又省时。由于大多数限制性内切酶都可以产生粘性末端, 操作方便。另外,通过粘性末端连接的重组体, 其外源片段很容易回收,
只要用原来的酶切割重组体就可以了。
另外，也可以通过双酶切来获得黏性末端，并可进行定向重组连接（图3-15）。
图3-15 双酶切进行定向重组连接（引自 Snyder & Champness , 1977）
平末端连接(blunt end ligation)是指在T4 DNA连接酶的作用下(可加入适量的RNA连接酶), 将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。
平末端连接的效率比粘性末端连接的效率低得多,所以通常在连接反应体系中要适量添加促进大分子凝聚的凝聚剂,一是可将平末端连接的效率提高: 可以起到两个作用, 加入后PEG8000, 连
接的效率。常用的是DNA以提高平末端
基因工程原理
1-3个数量级; 二是改变连接产物的分布, 抑制分子内的连接, 促进分子间的连接, 得到的连
接产物主要是重组体。
平末端连接的不利之处是连接效率低, 需要大量的连接酶, 有时为了提高连接效率, 通常要补加RNA连接酶。连接后, 缘由的限制性内切酶内切酶的切点要消失, 所以不易回收插入的外源DNA片段。
3. 同聚物加尾法
所谓同聚物加尾(homopolymer tails joining)连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA 的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段, 但方法较繁, 需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用（图3-16）。
同聚物接尾法实际上是一种人工粘性末端连接法, 具有很多优点:①首先不易自身环化,这是因为同一种DNA的两端的尾巴是相同的, 所以不存在自身环化。②因为载体和外源片段的末端是互补的粘性末端, 所以连接效率较高。③用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接, 所以是一种通用的体外重组的方法。
图3-16 同聚物尾连接法(引自Old & Primrose,1980)
1. 基因组DNA文库
所谓基因组文库(genomic DNA Library), 就是用基因工程的方法,人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段的克隆群。一般以改造的噬菌体DNA或柯斯质粒作为载体, 包括下列过程(图3-19): ①高分子量染色体DNA的制备, ②体外重组连接, ③包装蛋白的制备, ④重组体的体外包装, ⑤将重组DNA导入寄主细胞, ⑥筛选。建造基因组文库不仅可以大量扩增含量极少的单拷贝的结构基因, 也可以克隆调控基因, 有利于研究基因的结构、功能和调控机理。
基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(gene pool)是指在行有性生殖的某一群体中, 能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中, 由于使用的载体不同, 分为噬菌体载体和柯斯质粒载文库。BAC文库、YAC体构建的基因组文库、．
基因工程原理
et al.1996) Griffiths(引自图3-19 基因组文库技术2. cDNA文库
同mRNA互补的DNA称为cDNA。mRNA为模板合成的cDNA可以用于基因的克隆化, 也可用这种方法制备特异性的杂交探针。cDNA文库是以某一生物的总mRNA为模板, 在无细胞系统中, 在反向转录酶的作用下, 首先合成一互补的DNA, 即第一链, 破坏RMA模板后, 再以第一链为模板合成第二链, 得到的双链DNA称为cDNA基因。选用适合的载体, 将合成的cDNA基因重组导入寄主细胞, 经筛选得到的cDNA基因的克隆群称为cDNA文库( completement DNA 因此是克隆真核生物基因的一种通用方法。, 技术合成的是不含内含子的功能基因cDNA。由于3-20)图Library) (
基因工程原理
图3-20 cDNA文库构建(引自Old & Primrose,1980)
由于细胞内的基因在表达的时间上并非是统一的,具有发育的阶段性和时间性,有些则需要特殊的环境条件。所以,cDNA文库是不可能构建得十分全,也就是说任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物全部编码基因。所以在构建cDNA文库时应根据研究目的的不同而选用不同的生物材料作为RNA分离的出发材料,有些甚至要经过特殊的诱导处理以提高所需DNA的丰度。
第五节重组DNA的转移、筛选与鉴定
转化是基因工程操作中一项十分重要的工作。DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化(transformation)。
重组体的筛选有两层涵义,一是将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来,二是将将携带有特定外源插入片段的重组体挑选出来。鉴定则是对筛选的重组体进行最后的鉴别。
一、重组DNA的转化
能够接受转化作用的细菌的生理状态叫感受态。细菌的感受态是在适当的生长条件下获得的一种生理特征。要强调的是: 感受态是有关转化因子被吸收的生理状态, 而不是有关转化因子进入细胞后能否被接受的生理状态。处于感受态的受体细菌，其吸收转化因子的能力为一般细菌生理状态的千倍以上，而且不同细菌间的感受态差异往往受自身的遗传特性、菌龄、生理培养条件等诸多因素的影响。
在自然条件下, 大多数类型的细菌不出现感受态，也不发生转化。然而可以通过某些化学诱导的方法来制备感受态，用这种方法得到的感受态就称为人工诱导的感受态细胞。目前常用的诱导感受态转化的方法是CaCl2 法（图3-21），。DNA此外也可以用基因枪等方法转化外源．
基因工程原理
图3-21 钙诱导的转化
二、重组体的遗传学筛选法
所谓遗传学方法(genetic selection)主要是根据受体细胞接受了重组DNA分子后所发生的遗传表型的变化直接选择重组体的方法。遗传表型的变化包括抗药性、缺陷基因的功能互补表型及噬菌斑的变化等。这些表型的变化, 有些是载体提供的表型特征, 有些则是插入序列提供的表型特征。选择的方法主要是根据平板上可见的表型变化, 用于选择的平板包括普通抗生素平板、插入失活抗生素平板、插入表达抗生素平板、显色平板等, 由于这些方法都是直接从平板上筛选,所以又称为平板筛选法。
（一）插入失活筛选法
从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活(insertional inactivation) 。
图3-22 插入失活的原理
图3-23 聚合酶链反应
et al, 1992）（引自 Watson
1.抗性基因插入失活筛选法
根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法是重组体常用的筛选方法。如非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的, 表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但是,
如果在该质粒的四环素抗性基因内插入外援片段, 就会造成四环素抗性基因失活, 变成AprTcs, 携带这种质粒的宿主菌可以在氨苄青霉素的平板上生长, 而不能在四环素抗性平板上生长(图
3-22)。
2. 蓝白斑筛选法
根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法需要进行大大增, 才能够将所需的重组
体挑选出来, 菌落平板的影印复制．
基因工程原理
加了筛选的工作量。后来, 人们设计了以β-半乳糖苷酶的产生作为颜色筛选标记的载体, 简化了筛选程序, 提高了灵敏度。这类载体系统包括M13噬菌体、pUC质粒系统、pEGM质粒系统。它们的共同特点是载体上携带一段细菌的lacZ基因, 它编码β-半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的α-肽, 载体转化的受体菌为lacZΔM15基因型。这样, 载体同宿主通过互补, 具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。如果在载体的lacZ基因中插入外源DNA, 造成lacZ基因失活, 不能合成α-肽, 失去同宿主的互补, 不能形成有功能的β-半乳糖苷酶, 失去分解X-gal的能力。在X-gal 平板上, 含阳性重组体的细菌为物色菌落(质粒载体)或无色噬菌斑(M13噬菌体载体); 非重组
体转化的细菌为蓝色菌落或蓝色噬菌斑。
显色反应筛选方法比较简单, 但是β-半乳糖苷酶的合成需要诱导。实验中起诱导作用的是安慰诱导物--IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷), 作用底物是X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。通常是将X-gal和IPTG混合后, 涂布在固体平板的表面。
(二) PCR法
聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种体外扩增特定DNA序列的新技术，这种DNA的体外扩增是通过同 DNA双链互补的两个引物在DNA聚合酶的作用下，进行引物延伸来完成的。在反应系统中，需要有：①模板(含有特定序列的 DNA分子)。②两个寡聚核苷酸引物，这两个引物可同双链DNA分子的互补链杂交，并且位于靶DNA欲扩增区的两侧。③耐热DNA
聚合酶。④4种脱氧核糖单核苷酸。然后经过不同温度的循环进行DNA扩增(图3—23)。这一技术是Kary Mullis在1985年发明的，并于1993年获得诺贝尔化学奖。
PCR应用十分广泛，并且可通过菌液PcR进行重组克隆的快速筛选。基本方法是从抗性平板上挑取单菌落接种至250
μL的LB培养基中，200r/min 振荡培养8h 以后，取1μL菌液进行裂解制备模板进行PCR筛选。（三）核酸杂交筛选法
核酸杂交又叫分子杂交(molecular hybridization), 是鉴定和筛选重组体的一种方法。原理是: 两条具有碱基互补序列的DNA分子变性后, 在溶液中一起进行复性时, 可以形成杂种双链DNA
分子。同样, 一条DNA链与之具有互补碱基序列的RNA链在一起复性时, 也能形成双链结构(DNA-RNA杂交体)。杂交包括下列过程: ①DNA的“熔解”,
即变性, 目的是使双螺旋解开成为单链, 这可将DNA溶液的温度升高超过Tm值(解链温度)即可;
②退火, 即DNA的复性, 将加热过的DNA溶液缓慢冷却即可发生。
杂交的双方是待测的核苷酸序列及探针。待测核酸序列可以是克隆的基因片段, 也可以是未经克隆的基因组DNA或是细胞总RNA。核酸杂交方法的两个特点是高度特异性及高度灵敏性。
1. 菌落杂交
在大量筛选重组的细菌细胞时, 需要从中寻找出为数极少的含有目的序列的细胞。另外. 在利用插入失活、显色反应等手段得到含重组质粒的细菌细胞后, 还需要证明这些重组质粒是否含所需要的目的序列。若将所得菌落逐个扩大培养, 提取质粒DNA, 然后用Southern杂交法固然可以鉴定重组质粒, 不仅工作量大, 又耗费财力, 用菌落杂交(colony hybridization) (图3-24), 就方便得多。
首先要将转化的受体菌在合适的琼脂平板上制成单菌落,然后将菌落复制到硝酸纤维素滤膜上, 保留主平板,将硝酸纤维素滤膜上的菌落进行原位溶菌、原位释放DNA、原位进行DNA变性、中和洗涤后进行原位固定。然后同特异对照主平板则可将重组体选择出来。,有杂交信号的即为重组体,通过放射自显影后,的探针进行杂交．
基因工程原理
图3-24 菌落杂交的基本过程(引自Old & Primrose,1980)
2. Southern 杂交
Southern 杂交(Southern hybridization)是1975年Southern建立起来的一种杂交方法, 属固相-液相杂交。该法的主要特点是利用可毛细现象将DNA转移到固体支持物上,称为Southern转移或Southern 印迹(Southern
blotting)。它首先用合适的限制性内切酶将DNA切割后, 进行电泳分离后, 利用干燥的吸水纸产生毛细作用, 使液体经过凝胶, 从而使DNA片段由液流携带而从凝胶转移并结合在固体支持物表面，然后进行杂交( 图3-25)。
et al.2002) Alberts(引自DNA图3-25 Southern 杂交中的转移3. Northern 杂交
Northern 杂交(Northern Hybridization)是分析RNA的一种方法,它的基本原理是将RNA样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离,再转移到尼龙膜等固相膜载体上,用放射性同位素标记的DNA 或RNA特异探针对固定于膜上的mRNA分子在电泳中的迁移位mRNA将杂交的对杂交信号进行分析。,经放射自显影,洗膜去除非特异性杂交信号,进行杂交．
基因工程原理
置与标准分子量分子进行比较,即可知道细胞中特定的基因转录产物的大小,对杂交信号的强弱比较, 可以知道该基因表达mRNA的强弱。这一技术应用十分广泛,常用于基因表达调控、基因结构与功能、遗传变异及病理研究。主要用来检测外源基因在受体细胞中是否转录成RNA。Northern 印迹的原理同Southern 印迹。但有两点不同: 其一是转移的对象不同, Northern 印迹是将RNA变性及电泳分离后, 将其转移到固相支持物上的过程。其二, 虽然RNA电泳前不需向DNA那样进行酶切, 但也需要变性。不过变性方法是不同的, 它不能用碱变性, 因为碱变性会导致RNA的水解。
Northern杂交与Southern杂交的主要区别是在变性剂存在下, 用琼脂糖进行电泳分离RNA。变性剂的作用是防止RNA的二级结构发夹环的形成, 保持其单链线性状态。
第六节生物技术及应用
基因工程技术的发展推动了生物技术(biotec}lnokogy)的发展，现代生物技术作为一门综合性的学科，与现代微生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学、分子生物学和化学工程等多学科密切相关。生物技术产业从20世纪80年代开始起步，经过20年的发展，目前在农牧业、食品、医药等领域得到广泛的应用。生物技术产业市场逐渐形成，其前景广阔，将成为21世纪经济的支柱产业。
(一) 细胞工程
细胞工程(cell engineering)是利用细胞的全能性，在细胞或细胞器水平上改变细胞的某些遗传特性，以改良其性状、获得有用基因产物或加速细胞及生物体繁殖的综合技术，可分为微生物细胞工程、植物细胞工程和动物细胞工程，是以细胞培养技术为基础，通过细胞融合、细胞核移植、动物克隆、染色体工程和生物反应器来实现。
1．细胞融合
细胞融合(cell fusion)又称体细胞杂交(somatic hybridization)，是指两个不同来源的细胞，彼此融合成杂交细胞，使来自两个亲本细胞的基因有可能都被表达，打破远缘生物不能杂交的屏障，形成新物种或新品种的技术。1975年，英国剑桥大学的科学家科莱尔(G．Kohler)和米尔斯坦(C．Milstein)用细胞融合技术将能分泌抗体的B淋巴细胞(绵羊红细胞、免疫小鼠脾细胞)与具有无限生长能力的肿瘤细胞(小鼠骨髓瘤细胞)融合，得到了既能持续产生单一抗体又能在体外无限繁殖的杂合细胞(杂交瘤细胞，hybridoma cell)(图3—26)，通过细胞培养将杂合细胞克隆为单纯的细胞系(单克隆系)，由此类细胞系可获得结构和特性完全相同的高纯度抗体，即单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)。这一技术的创立在生物医学领域取得重大突破，两位科学家因而荣获1984年诺贝尔生理医学奖。．
基因工程原理
图3—26 利用细胞融合技术制备单克隆抗体 (引自Kuby，1994)
如今这种细胞融合技术已在动物间实现了小鼠和田鼠，小鼠和小鸡，甚至于小鼠和人等许多远缘
和超远缘的体细胞杂交。虽然目前动物的杂交细胞还只停留在分裂传代的水平，不能分化发育成完整的个体，但在理论研究和基因定位上都有重大意义。而植物间的细胞融合所得到的杂交细胞，获得了新的杂交植物，如西红柿与马铃薯细胞融合获得“西红柿马铃薯”，羽衣甘蓝与白菜型油菜细胞融合得到“甘蓝型油菜”等。
2．细胞核移植
细胞核移植是将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的显微操作技术。由于主要遗传物质存在于细胞核内，因而此技术可获得遗传上具同质性状的动物，对动物优良杂交种的无性繁殖和濒临绝迹的珍贵动物的传种具有重大意义。1952年，美国科学家布里格斯(R．Briggs)首次利用豹纹蛙卵细胞建立了细胞核移植技术。1981年，瑞士科学家 K．111menses 率先对哺乳动物小鼠卵细胞进行核移植获得成功。他将灰鼠的细胞核注入到除去了精核和卵核的黑鼠的受精卵内，然后再将这一f'Fh黑鼠细胞质和灰鼠细胞核组成的卵细胞体外培养，得到的仔鼠是灰色的，说明仔鼠的性状取决于细胞核的来源。
在细胞核移植技术上发展起来的动物体细胞克隆技术在1997年因克隆羊“多莉”(Dolly)的诞生而取得了重大突破。英国科学家维尔穆特(I．wilmut)等1997年2月27日在《自然》描述了“多莉”的克隆过程(图3—27)。他们取出六龄的芬兰多塞特白绵羊母羊的乳腺细胞核，将此核导入苏格兰黑绵羊去核的卵细胞内，待手术完成之后，以相同频率的电脉冲刺激换核卵，让苏格兰黑绵羊的卵细胞质与芬兰多塞特白绵羊母羊乳腺细胞的核相互协调，使这个“组装”细胞在体外发育成早期胚胎，然后将胚胎植入另一只母羊的子宫内，产下了小绵羊“多莉”。“多莉”不是由母羊的卵细胞和公羊的精细胞受精的产物，而是体细胞核加去核的卵细胞质，不经两性结合诱导出来的胚胎产生的。“克隆羊”的诞生表明：动物体中执行特殊功能、具有特定形态的所谓高度分化的细胞与受精卵一样具有发育成完整个体的潜在能力。．
基因工程原理
图3—27克隆羊“多莉”诞生的过程 (引自Glick & Pasternak，1998)
1998年，日本科学家利用成年动物体细胞克隆的两头牛犊诞生；同年，美国科学家用成年鼠的体细胞成功地培育出了第三代共50多只克隆鼠；1999年，夏威夷大学的科学家利用成年鼠体细胞克隆出第一只雄性老鼠；2000年1月，美国科学家宣布克隆猴成功，这只恒河猴被命名为“泰特拉”；同年3月，曾参与克隆小羊“多莉”的英国PPL公司宣布，他们成功培育出5头克隆猪。2002年，我国科学家成功克隆出牛和山羊，使我国成为少数掌握体细胞克隆哺乳动物关键技术的国家之一。2003年，美国、意大利等国科学家分别培育出世界上第一匹克隆骡子和克隆马。中国和法国科学家合作首次克隆出大鼠。
(二) 蛋白质工程
蛋白质工程是根据分子设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对其所编码的蛋白质的改造，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的，具有了人类所需要特性的特殊蛋白质。天然蛋白质都是通过漫长的进化过程自然选择而来的，而蛋白质工程对天然蛋白质的改造，能更快、更有效地为人类服务。
重组人p干扰素(IFN p)的人工改造是蛋白质工程的一个成功范例。干扰素(interferon)是人体细胞分泌的一种蛋白质，具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能，是人体防御系统的重要组成部分。重组人IFNβ是采用重组DNA技术，克隆人β干扰素基因，构建合成干扰素的基因工程菌，经发酵、提纯、纯化制备而成。其基因工程产物活性为10万U/mg，仅是天然IFN口产物活性的10%。蛋白质结构分析发现，人IFNβ由154个氨基酸组成，在17、41、141位有3个半胱氨酸(Cys)，人体天然产物在41、141间形成二硫键，基因工程产物二硫键位置有偏差，17位 Cys 的
巯基参与二硫键，形成无活性的二聚体或寡聚体。由于丝氨酸(Ser)与半胱氨酸在结构上除羟基(-OH)与巯基(-SH)外完全一样，因此将17位Cys点突变为Ser，结果证明人工改造的IFN口产物活性提高100倍，稳定性好于天然产物。
(三) 酶工程
酶工程(enzyme engineering)就是通过对酶的修饰改造，提高酶的催化效率并在某一生物反应器中大规模生产的技术过程，主要包括酶的发酵生产、酶的分离纯化、酶分子修饰、酶和细胞固定化、酶反应动力学与反应器、酶的应用等。
酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中(表3—4)。例如，固定化青霉素酰化酶用于连续裂解青霉素生产；α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶连续作用于淀粉，就可以生产出各类糖浆；利用葡萄糖苷酶可生产出低糖啤酒；蛋白酶用于除去毛皮中的特定蛋白，软化皮革等。加酶洗衣粉、用蛋白酶生产的嫩肉粉等，都是酶工程的产物。此外，酶工程还用于农副产品的加工利用。美国利用大豆生产出200余种产品，包括营养食品、药品、食品添加剂等，例如高纯度大豆卵磷脂、大豆蛋白等。目前工业生产的酶有60余种，其中规模化生产仅20 余种。
表3—4酶工程的主要应用领域
主要用途类酶应用领域
基因工程原理
淀粉酶类葡萄糖、麦芽糖生产，啤酒酿造，面包、饼干等, 烘烤食品制作等
嫩肉粉、饼干、蛋白胨、乳酪生产，啤酒澄清，肉类加工( 蛋白酶类如香肠熟化等)
淀粉液化，糊精降解糖化酶
食品工业葡萄糖异构酶高果糖浆生产
低糖啤酒生产葡萄糖苷酶
乳酪生产凝乳酶果胶酶果酒、果汁去浊淀粉酶类纺织品褪浆纤维素酶处理纤维制品，提高棉毛纺织品质量纺织工业
蛋白酶类丝制品脱胶处理加酶洗涤剂、加酶护肤品与化妆品生产蛋白酶类
淀粉酶类加酶洗涤剂生产日化工业超氧化物歧化酶化妆品生产
糖酐酶牙膏添加剂
皮革去毛、软化制革工业蛋白酶类青霉素酰化酶青霉素、头孢霉素生产
氢化可的松生产羟化酶
生产)多巴(主治帕金森病酪氨酸酶
氨基酸、蛋白水解液生产，治疗消化不良，消肿，降压等蛋白酶类葡萄糖脑苷酯酶治疗高雪病(葡萄糖脑苷酯酶缺乏症)
治疗白血病医药工业天冬酰胺酶
溶菌酶消炎，镇痛，止血等尿激酶治疗心肌梗死、结膜出血等超氧化物歧化酶治疗红斑狼疮、皮肌炎、辐射损伤等
链激酶治疗血栓性静脉炎、血肿等) 多种疾病诊断(如葡萄糖氧化酶诊断糖尿病，胆碱酯酶诊断肝其他多种酶炎等淀粉酶类处理造纸工业废水处理高有机物含量废水溶菌酶环保工业
丁酸梭菌酶系处理酿酒工业废水
如胆碱酯酶监测有机磷农药，硫氰酸酶监测氰(环境监测试剂其他多种酶 )
化物等(四) 发酵工程
发酵工程(fermentation engineering)是利用微生物的特性，通过现代化工程技术，在反应器中生产目的产物或提供所需服务的技术过程。“发酵”一词来源于拉丁语动词 fervere(发泡)，意指利用酵母以果汁或麦芽汁为原料生产酒精饮料时出现的现象。传统的发酵技术有悠久的历史，
基因工程原理 内容提要 1.基因工程又称基因操作、重组DNA技术, 是P. Berg等于1972年创建的。基因工程技术涉及的基本过程包括 “切、连、转、选”。该技术有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。 2.基因工程中使用多种工具酶，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合成与修饰的酶类。 3.限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶，属于水解酶类。根据限制性内切核酸酶的作用特点，被分为 三大类。Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强,切割的方式有平切和交错切, 作用时需要Mg++作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。第一个被分离的Ⅱ类酶是Hind Ⅱ。 4.连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。基因工程中 使用的连接酶来自于原核生物，有两种类型的DNA连接酶∶E.coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶。基因工程中使用的主要是T4DNA连接酶，它是从T4噬菌体感染的E.coli中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。 5.载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒， 在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。 6.DNA重组连接的方法大致分为四种: 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。粘性末端 连接法是最常用的DNA连接方法,是指具有相同粘性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA。平末端连接是指在T4 DNA连接酶的作用下, 将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。同聚物加尾连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段, 但方法较繁, 需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用。将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切酶的识别序列), 加到载体或外源DNA的分子上, 然后通过酶切制造黏性末端的方法称为接头连接法。 7.基因文库分为基因组文库、cDNA文库等，是指在一种载体群体中, 随机地收集着某一生物DNA的各种克隆 片段, 理想地包含着该物种的全部遗传信息。 8.DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变 其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。目前常用的诱导感受态转化的方法是CaCl2 法（图3-20），此外也可以用基因枪等方法转化外源DNA。 9.重组体筛选有遗传学方法、核酸杂交筛选法等。 10.基因工程技术是现代生物技术的核心，目前在工业、农业和医疗中已经显示了巨大的应用前景，并形成了一大 批生物技术产业。 基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品；或是研究基因的结构和功能，揭示生命活动规律。基因工程技术诞生于20世纪70年代初，它是一门崭新的生物技术科学，它的创立和发展使生命科学产生了一次重大飞跃，证明并实现了基因的可操作性，使人类从简单地利用天然生物资源走向定向改造和创造具有新品质的生物资源的时代。基因工程技术诞生至今已经取得了辉煌的成就，成为当今生命科学研究领域中最有生命力和最引人注目的前沿学科之一，基因工程也是当今新的产业革命的一个重要组成部分。
基因工程原理复习题思考题 5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。 同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。 同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。） 6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？ 类型：DNA连接酶和RNA连接酶 异同点： 相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。 不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。 7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。（传说中的网上答案） 1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。 2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。 3、足够多的载体和插入片段是最重要的。 4、平端的连接对于离子浓度很敏感 5、尽可能缩小连接反应的体积 6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好 8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？ 1）大肠杆菌DNA聚合酶 2）Klenow fragment 3）T7 DNA聚合酶 4）T4 DNA聚合酶 5）修饰过的T7 DNA聚合酶 6）逆转录酶 7）Taq DNA聚合酶 第四章基因克隆的载体系统 1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）； 具有合适的筛选标记； 具有较高的外源DNA的载装能力； 具有多克隆位点（MCS）； 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？ 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 4、质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？
Chapter I Introduction 1)什么是基因？基因有哪些主要特点？ 基因是一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。 ①不同基因具有相同的物质基础.②基因是可以切割的。③基因是可以转移的。④多肽与基因之间存在 对应关系。⑤遗传密码是通用的。⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。 2)翻译并解释下列名词 genetic engineering遗传工程 gene engineering基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物获得新的遗传性状的操作。 gene manipulation基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。 recombinant DNA technique重组DNA技术 gene cloning基因克隆：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。 molecular cloning分子克隆 3)什么是基因工程？简述基因工程的基本过程？p2 p4 4)简述基因工程研究的主要内容？p5 5)简述基因工程诞生理论基础p2和技术准备有哪些p3？ 6)基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 否，密码子简并性 7)举例说明基因工程技术在医学、农业、工业等领域的应用。 医学:人胰岛素和疫苗 农业:抗虫BT农药 工业:工程酿酒酵母
Chapter ⅡThe tools of trade 1)什么是限制性核酸内切酶？简述其主要类型和特点？ 是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。类型特点p11 2)II型核酸内切酶的基本特点有哪些p12-14？简述影响核酸内切酶活性的因素有哪些 p14？ 3)解释限制酶的信号活性？抑制星号活性的方法有哪些？ 4)什么是DNA连接酶p15？有哪几类p16？有何不同p16？ 5)什么叫同尾酶、同裂酶p12？在基因工程中有何应用价值？ 同裂酶：识别位点、切割位点均相同，来源不同。在载体构建方面往往可以取得巧妙的应用。应用较多的同裂酶比如Sma1和Xma1，它们均识别CCCGGG，但前者切后产生钝末 同尾酶：来源各异，识别序列各不相同，但切割后产生相同的粘性末端。由同尾酶(isocaudomer)产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。 6)什么是DNA聚合酶？根据DNA聚合酶使用的模板不同，可将其分为哪两类？各有什么活 性？p17-18 聚合酶：在引物和模板的存在下，把脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3‘-OH 末端，催化核苷酸的聚合作用。 ①依赖于DNA的DNA聚合酶 ②依赖于RNA的DNA聚合酶 7)Taq DNA聚合酶：是一种从水生嗜热菌中分离得到的一种耐热的dna聚合酶，具有5-3聚 合酶活性和3-5外切酶活性，在分子中主要用于PCR。 逆转录酶：RNA指导的DNA聚合酶， 8)Klenow片段的特性和用途有哪些？举例说明。p17 9)名词解释：S1核酸酶、核酸外切酶、磷酸化酶激酶、 甲基化酶
精品文档 《基因工程原理与技术》标准答案及评分标准 一、名词解释（本大题共5小题，每题2分，总计10分） 限制性内切酶的Star活性：限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH 等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。 受体细胞：又称为宿主细胞或寄主细胞等，从试验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从试验目的讲是有应用价值和理论研究价值的细胞 T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA 该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 克隆基因的表达：指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过 程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。 a -互补：3 -半乳糖苷酶（B -gal）是大肠杆菌lacZ基因的产物，当培养基中的一种色素元（X-gal ）被3 -gal切割后，即产生兰色。大肠杆菌的3一半乳糖苷酶由1021个氨基酸构成，只有在四聚体状态下才有活性。大肠杆菌lacZ基因由于a区域缺失，只能编码一种在氨基端截短的多肽，形成无活性的不完全酶，称为a受体；如果载体的lacZ 基因在相反方向缺失，产生在羧基端截短的多肽，这种部分3 -半乳乳糖苷酶也无活性。 但是这种蛋白质可作为a供体。受体一旦接受了供体（在体内或体外），即可恢复3 -半乳糖苷酶的活性，这种现象称为a互补. 由载体产生的a供体能够与寄主细胞产生 的无活性的a受体互作形成一种八聚体，从而恢复3 -半乳糖苷酶的活性。如果培养基 中含有X-gal的诱导物IPTG时，凡是包含有3 -半乳糖苷酶活性的细胞将转变为蓝色，反之不含有这种酶活性的细胞将保持白色。 、填空题（本大题共7小题，每空1分，总计20 分） 1、质粒按自我转移的能力可分为—接合型—质粒和—非接合型—质粒；按复制类型可分为松 弛性质粒和严紧型质粒。 2、为了防止DNA的自身环化，可用碱性磷酸酶除去双链DNA 5'—端的磷酸基团 。 3、人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为_0匸—时吸附DNA在温度为_42乜__ 时摄人 DNA 4、仅克隆基因（DNA片段）用途而言，最简单的质粒载体也必需包括三个组成部分： 复制区：含有复制起点__、选择标记：主要是抗性基因 ________ 、__克隆位点：便于外源_ DNA的插入_。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 5、Southern blotting 杂交能够检测外源基因是否整合进受体细胞基因组；外源基 因的转录表达需要通过—northern_杂交或_ RT-PCR_来揭示；而外源基因_____ 翻 译—水平的表达则需通过免疫学检测或Western杂交才能揭示，其使用的探针是 —蛋白质____ 。 6、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位有—细胞质_、_ —周质_、一细胞外 _。 7、Vir区基因的激活信号有三类，它们是—酚类化合物_、_中性糖和酸性糖_、— _ pH 值_。 简答题（本大题共7 小题，总计50 分） 1欢迎下载
基因工程原理练习题及其答案 一、填空题 1．基因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2．基因工程的两个基本特点是：(1)____________，(2)___________。 3．基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和__________。 4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的___________。 5．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_______，第二、三两个字母取自_________，第四个字母则用___________表示。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。 7．第一个分离的限制性内切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_____________。8．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是_________，它们属于_____________。 9．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_____________切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：(1)____________；(2)________________的活性。 10．为了防止DNA的自身环化，可用_____________去双链DNA__________________。 11．EDTA是____________离子螯合剂。 12．测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有_____________酶的活性，而没有_______酶的活性。 13．切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用_________的_______和______的作用。 14．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_________或_______________。15．反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有____________的作用，可以将DNA- RNA杂种双链中的___________水解掉。 16．基因工程中有3种主要类型的载体：_______________、_____________、______________。 17．就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：_______________、_____________、______________。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 18．一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测 不出质粒，这种现象叫。 19．pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于。 20．Y AC的最大容载能力是，BAC载体的最大容载能力是。 21．pSCl01是一种复制的质粒。 22．pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过 和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp 抗性基因则是来自。 23．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。 24．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是 和。 25．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。 26．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。 27．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。 28．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基 因组的的范围内。 29．在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是 。 30．用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加人单价的阳离子，如NaCl和NaAc， 其目的是。 31．引物在基因工程中至少有4个方面的用途：(1) (2) (3) (4) 。 32．Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出 碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的。 33．在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在 。 34．乙醇沉淀DNA的原理是。 35．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：
基因工程原理 内容提要 1. 基因工程又称基因操作、重组DNA技术，是P. Berg等于1972年创建的。基因工程技术涉及的基本过程包括 “切、连、转、选”。该技术有两个基本的特点：分子水平上的操作和细胞水平上的表达。 2. 基因工程中使用多种工具酶，包括限制性内切核酸酶、DNA 连接酶和其他一些参与DNA 合成与修饰的酶类。 3. 限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶，属于水解酶类。根据限制性内切核酸酶的作用特点，被分为 三大类。n类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强，切割的方式有平切和交错切，作用时需要Mg++作辅助因子，但不需要ATP和SAM。第一个被分离的n类酶是Hi nd n。 4. 连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶，有DNA 连接酶和RNA 连接酶之分。基因工程中 使用的连接酶来自于原核生物，有两种类型的DNA 连接酶： E.coliDNA 连接酶和T4-DNA 连接酶。基因工程中使用的主要是T4DNA 连接酶，它是从T4 噬菌体感染的 E.coli 中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。 5. 载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型：质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒， 在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。 6. DNA 重组连接的方法大致分为四种: 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。粘性末端 连接法是最常用的DNA 连接方法，是指具有相同粘性末端的两个双链DNA 分子在DNA 连接酶的作用下，连接成为一个杂合双链DNA 。平末端连接是指在T4 DNA 连接酶的作用下，将两个具有平末端的双链DNA 分子连接成杂种DNA 分子。同聚物加尾连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA 的3'端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如dA（dG）和dT （dC）,然 后在DNA连接酶的作用下，连接成为重组的DNA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段，但方法较繁，需要入核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用。将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子（在这一小段DNA 分子上有某种限制性内切酶的识别序列），加到载体或外源DNA 的分子上，然后通过酶切制造黏性末端的方法称为接头连接法。 7. 基因文库分为基因组文库、cDNA 文库等，是指在一种载体群体中，随机地收集着某一生物DNA 的各种克隆片段， 理想地包含着该物种的全部遗传信息。 8. DNA 重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变 其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA 分子的转化。目前常用的诱导感受态转化的方法是CaCl2 法（图3-20），此外也可以用基因枪等方法转化外源DNA。 9. 重组体筛选有遗传学方法、核酸杂交筛选法等。 10. 基因工程技术是现代生物技术的核心，目前在工业、农业和医疗中已经显示了巨大的应用前景，并形成了一大批生物技术 产业。 基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因（DNA分子），按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品；或是研究基因的结构和功能，揭示生命活动规律。基因工程技术诞生于20世纪70年代初，它是一门崭新的生物技术科学，它的创立和发展使生命科学产生了一次重大飞跃，证明并实现了基因的可操作性，使人类从简单地利用天然生物资源走向定向改造和创造具有新品质的生物资源的时代。基因工程技术诞生至今已经取得了辉煌的成就，成为当今生命科学研究领域中最有生命力和最引人注目的前沿学科之一，基因工程也是当今新的产业革命的一个重要组成部分。
《医用基因工程》复习思考题 第一章基因和基因组及基因工程的概念 一、名词概念 ①移动基因(插入序列；转位子)；②断裂基因；③RNA剪辑； ④内含子(间隔序列)与表达子；⑤重叠基因；⑥重复序列；⑦假基因；⑧启动子与终止子；⑨起始位点、终止位点。 二、讨论题 1.什么叫基因?何谓基因的新概念?基因的主要功能是什么? 2.一种基因一种酶的提法妥否？ 3.基因密码子三联体间是否存在着逗号？ 4.基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 5.何谓转位子和转位作用?转位的后果如何? 6.基因中最小的突变单位和重组单位是什么？ 7.基因工程应包括哪些内容？何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明? 8.真核细胞基因组中常有内含子存在，能否在原核细胞获得表达？能，为什么？不能，为什么？ 第二章基因工程中常用的工具酶 1.什么是限制性核酸内切酶？ 2.什么是R/M现象？如何解释？ 3.II型核酸内切酶的基本特点有哪些？ 4.影响II型核酸内切酶活性的因素有哪些？如何克服和避免这
些不利因素？ 5.DNA连接酶有哪两类？有何不同？ 6.甲基化酶有哪两类？有何应用价值？ 7.什么叫同尾酶、同裂酶？在基因工程中有何应用价值？ 8.平末端连接的方法有哪些？(图示) 9.Klenow酶的特性和用途有哪些？举例说明。 10.反转录酶的特性有哪些？有何应用价值？ 11.列举碱性磷酸酶BAP/CAP的应用之一。 12.列举末端核苷酸序列转移酶的应用之一。 13.质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？ 14.基因片段与载体的平末端连接的方法有哪些？ 15.用寡核苷酸和衔接物DNA的短片段连接时为使基因内部的切点保护，常用何种办法解决？ 第三章基因克隆载体 1.基因工程常用的载体有哪5种？其共同特性如何？ 2.什么是质粒？质粒分哪几种？有哪两种复制类型，质粒的分子生物学特性有哪些？ 3.质粒存在的三种形式是什么？ 4.分离质粒的基本步骤有哪些？ 5.分离纯化质粒的方法有哪几种？简述CsCl密度梯度(浮密度)分离法、碱变性法的原理，如何选择合适的分离方法？ 6.作为理想质粒载体的基本条件有哪些？ 7.什么叫插入失活，举例说明之。 8.构建pBR322质粒载体的亲本质粒有哪些？ 9.什么叫插入型和替换型噬菌体载体?插入型和替换型入噬菌体
名词解释 生物技术、RAPD、酶单位、载体、质粒、基因工程，退火，基因组文库，cDNA文库，PCR，转化，DNA甲基化，RFLP，ISSR，植物基因工程，感受态细胞，受体细胞，工具酶、YAC、探针、AFLP、基因芯片、质粒、基因治疗、基因打靶、基因疗法、原位杂交、分子标记、核酸分子杂交 选择题（单选和多选） 1、第一个作为重组DNA载体的质粒是( ) (a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl8 2、Ⅱ型限制性内切核酸酶( ) (a)有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列 (b)仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供 (c)限制性识别非甲基化的核苷酸序列(d)有外切核酸酶和甲基化酶活性 (e)仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供 3、在下列试剂中，那一种可以螯合Ca2+离子( ) (a)EDTA (b)柠檬酸钠(c)SDS (d)EGTA 4、同一种质粒DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是( ) (a)OCDNA>SCDNA>LDNA (b)SCDNA>LDNA>OCDNA (c)LDNA>OCDNA>SCDNA (d)SCDNA>OCDNA>LDNA 5、黏粒(cosmid)是一种人工建造的载体( ) (a)它具有COS位点，因而可进行体外包装(b)它具有质粒DNA的复制特性 (c)进入受体细胞后，可引起裂解反应(d)进入受体细胞后，可引起溶源化反应 6、用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为( ) (a)染色体DNA断成了碎片(b)染色体DNA分子量大，而不能释放 (c)染色体变性后来不及复性(d)染色体未同蛋白质分开而沉淀 7、根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。在下列文库中 ( )属cDNA文库 (a) YAC文库(b) MAC文库(c) 扣减文库(d) BAC文库 8、关于感受态细胞性质的描述，下面哪一种说法不正确( ) (a)具有可诱导性(b)具有可转移性 (c)细菌生长的任何时期都可以出现(d)不同细菌出现感受态的比例是不同的 9、在利用lacZ失活的显色反应筛选法中，IPTG的作用是( ) (a)诱导宿主的α肽的合成(b)诱导宿主的ω肽的合成 (c)作为酶的作用底物(d)作为显色反应的指示剂 10、基因工程发展史上理论上的三个重要发现是（）
基因工程原理 1、典型的DNA重组实验通常包括哪些步骤？（20分） 重组DNA技术一般包括四步：①获得目的基因；②与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；③用重组DNA分子转 化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；④对转化子筛选和鉴定。⑤对获得外源基因的细胞或生物体通过培养， 获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。 2、在PCR扩增时，（1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或 小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，为什么？有何对策？ （2）PCR扩增后有时出现涂抹带或片状带，其原因是什么？应该如何改进？ （20分） (1)其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低， 及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。 (2)出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。 3、获得一个功能未知的基因克隆后，怎样研究该基因的功能？请提出具体的 研究方案。（20分） 基因功能的研究思路主要包括: 1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度, 不同组织/器官)表达谱; 2.基因在转录水平的调控(可以通过genome walking PCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域, 通过单杂交或ChIP 等技术, 寻找该基因的转录调控蛋白)
0、基因工程的技术基础和理论基础 1）理论基础： 40年代确定遗传信息携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，明确了物质基础 50年代确定DNA的双螺旋模型和半保留复制机理，明确自我复制和传递 60年代提出中心法则和操纵子学说，破译遗传密码，阐明信息流向和表达。 2）技术基础： 60年代的琼脂糖凝胶和Southern转移杂交技术，用于DNA分离和检测 60年代初70年代末，发现限制性内切酶和DNA连接酶，实现体外切割 70年代中期，实现DNA分子的核苷酸序列分析技术 80年代实现体外重组DNA并进入宿主细胞 1、基因工程研究的主要内容或步骤 ①从生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段； ②在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制载体分子上，形成重组DNA分子； ③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖； ④从大量细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子的受体细胞克隆； ⑤从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用； ⑥将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要物质。 2、三位一体的基因概念 ①基因既是携带生物体遗传信息的结构单位，又是控制一个特定性状的功能单位。 ②基因是染色体上的实体 ③基因象链珠(bead)一样，孤立地呈线状地排列在染色体上 基因是功能、突变、交换“三位一体”的最小的、不可分割的、基本的遗传单位。 3、一位一体的基因概念 基因是一个具有特定功能的、完整的、不可分割的最小的遗传单位。基因内可以较低频率发生基因内的重组和交换。 4、顺反子假说 1个顺反子决定1条多肽链。能产生1条多肽链的是1个顺反子，Cistron是基因的同义词。在一个顺反子内，有若干个突变单位：突变子(muton)。在一个顺反子内，有若干个交换单位：交换子（recon）。 5、全同等位基因 在同一基因座位(locus)中，同一突变位点（site）向不同方向发生突变所形成的等位基因(homoallele)。 6、非全同等位基因 在同一基因座位（locus）中，不同突变位点（site）发生突变所形成的等位基因(heteroallele)。 7、重叠基因的概念及其生物学意义 概念： 大多数由一条DNA序列组成的基因，仅有编码一种蛋白质的功能(尽管基因在两端有非编码区，并且在编码区内有内含子)。但是，有些情况下，一条序列编码不止一种蛋白质。 生物学意义： a)原核生物进化的经济原则(较小的C值编码较多的基因信息)； b)提高蛋白质的疏水性,以增强生物体自然选择的适应性。
基因工程复习题 题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。 第一章绪论 1.名词解释： 基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。 遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。狭义：基因工程。 克隆：无性(繁殖)系或纯系。指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。 2．什么是基因克隆及基本要点? 3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。 A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用； C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。 4.基因工程研究的主要内容是什么？ 基础研究： 基因工程克隆载体的研究 基因工程受体系统的研究 目的基因的研究 基因工程工具酶的研究 基因工程新技术的研究 应用研究：
基因工程药物研究 转基因动植物的研究 在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究 第二章基因克隆的工具酶 1.名词解释： 限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。 回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。 同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。 同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列 黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。 平末端：DNA片段的末端是平齐的。 限制性核酸内切酶的酶活性单位（U）：在酶的最适反应条件下，在50μl容积中，60分钟内完全切割1g DNA所需的酶量为1个酶活性单位（unit 或U） 限制性核酸内切酶的星活性：指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的DNA片段的现象。 连杆（linker）：化学合成的8～12个核苷酸组成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对称，其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识别序列，酶切后可产生一定的粘性末端，便于与具有相同粘性末端的另一DNA片段连接。 衔接头（adaptor）：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。其一端或两端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端。 底物位点优势效应：酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同。 激酶：对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。 2.说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 用属名第一个字母和种名的头两个字母组成的3个字母斜体的略语表示寄主菌的物种名以
一、分子遗传学的传承与发展 1、经典遗传学阶段 孟德尔最初提出了遗传因子的概念；摩尔根创立了遗传的染色体理论。 2、生化遗传学阶段（或微生物遗传学阶段） 3、分子遗传学阶段 1953年，Watson和Crick提出了DNA的双螺旋模型。 4、基因工程阶段 (1)、基因工程诞生的理论基础 ①在40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从 而明确了遗传的物质基础问题； ②在50年代揭示了DNA分子的双螺旋模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复 制和传递的问题； ③在50年代末期和60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破 译了遗传密码子，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。 (2)、基因工程诞生的技术基础 核酸内切限制酶、DNA连接酶、核酸杂交技术、琼脂糖凝胶电泳技术、克隆载体以及大肠杆菌转化体系的建立。（PCR技术不能作为基因工程诞生的技术基础，因为PCR 技术是在基因工程诞生后建立起来的。） (3)基因工程的优点 ①具有跨越天然物种屏障能力； ②能够使目的基因在大肠杆菌体内得到极大扩增，因此能对基因进行表达调控等基 因工程研究； ③确立了反向遗传学的研究途径。 5、基因组学阶段 基因组学包括：结构基因组学、功能基因组学（转录本组学、蛋白质组学、代谢组学）、基础基因组学、应用基因组学、比较基因组学 6、表观遗传学阶段 研究生命机体在发育与分化过程中，导致表型性状特征发生改变，但是相应核苷酸序列结构却没有发生改变的遗传学成为表观遗传学。 一、遗传信息的三个组成层次 1、有基因组DNA当中的蛋白质编码基因（<2%）构成的第一个层次； 2、仅仅包含非编码RNA(siRNA、miRNA)，存在在广袤的RNA当中； 3、表观遗传信息包含在DNA周围与DNA相互作用的大分子—蛋白质。 二、基因的分子结构中的若干概念 1、5’侧翼序列：位于mRNA转录起点之前的序列为5’侧翼序列，也成为启动区。 在启动区有几个控制基因转录的信号：①决定mRNA转录起点的信号；②决定mRNA 转录起始的信号；③对环境刺激因素作出反应的信号；④对法语程序作出反应的信号； ⑤增强子 2、3’侧翼序列：指位于mRNA分子3’-末端的一段非转译的序列。 在3’侧翼序列区有3种信号：①控制转录终止信号；②控制mRNA末端加工信号； ③多数真核生物3’末端多聚腺苷酸化信号。 4、前导序列区：位于mRNA 5’端起始密码子之前的数百个核苷酸（不转译RNA区段），
论文题目：基因工程原理及进展课程名称：化学与人类文明 学院： 专业： 年级： 学号： 学生姓名： 指导教师： 完成时间：20XX年XX月XX日
目录 一、前言 二、摘要 三、关键词 四、正文 1、外源目标基因的分离、克隆及功能结构分析 2、构建能在受体生物细胞中表达的重组目标基因 3、外源重组目标基因的导入 4、转基因细胞或个体的鉴别和筛选 5、转基因品系的效益分析 6、生态与进化安全保障 7、消费安全评价 （1）消费安全评价一般要考虑以下一些主要的方面 （2）让我们来了解一下基因工程在农业、工业及环境保护、医 药、食品等方面的应用 （3）我们了解一下基因工程的进展状况 五、参考文献
前言 基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。所谓基因工程（genetic engineering)是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 科学界预言，21世纪是一个基因工程世纪。基因工程是在分子水平对生物遗传作人为干预，要认识它，我们先从生物工程谈起：生物工程又称生物技术，是一门应用现代生命科学原理和信息及化工等技术，利用活细胞或其产生的酶来对廉价原材料进行不同程度的加工，提供大量有用产品的综合性工程技术。 生物工程的基础是现代生命科学、技术科学和信息科学。生物工程的主要产品是为社会提供大量优质发酵产品，例如生化药物、化工原料、能源、生物防治剂以及食品和饮料，还可以为人类提供治理环境、提取金属、临床诊断、基因治疗和改良农作物品种等社会服务。
基因工程原理 基因工程原理 内容提要 1.基因工程又称基因操作、重组DNA技术, 是P. Berg等于1972年创建的。基因工程技术涉及的基本过程包括“切、连、转、选”。该技术有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。 2.基因工程中使用多种工具酶，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合 成与修饰的酶类。 3.限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶，属于水解酶类。根据限制性内切核酸酶的 作用特点，被分为三大类。Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强,切割的方式有平切和交错切, 作用时需要Mg++作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。 第一个被分离的Ⅱ类酶是Hind Ⅱ。 4.连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。基因工程中使用的连接酶来自于原核生物，有两种类型的DNA连接酶∶E.coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶。基因工程中使用的主要是T4DNA连接酶，它是从T4噬菌体感染的E.coli 中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。 5.载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒，在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。 6.DNA重组连接的方法大致分为四种: 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连 接法。粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法,是指具有相同粘性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA。平末端连接是指在T4 DNA连接酶的作用下, 将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。同聚物加尾连接就是利用末 端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA 和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段, 但方法较繁, 需要λ核酸 外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用。将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切酶的识别序列), 加到载体或外源DNA的分子上, 然后通过酶切制造黏性末端的方法称为接头连接法。 7.基因文库分为基因组文库、cDNA文库等，是指在一种载体群体中, 随机地收集着某一生物DNA的各种克隆片段, 理想地包含着该物种的全部遗传信息。 8.DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。目前常用的诱导感受态转化的方法是CaCl2 法（图3-20），此外也可以用基因枪等方法转化外源DNA。 9.重组体筛选有遗传学方法、核酸杂交筛选法等。 10.基因工程技术是现代生物技术的核心，目前在工业、农业和医疗中已经显示了巨大的应用前景，并形成了一大批生物技术产业。
基因工程原理复习题思考题 考试时间：2009.06.21 上午9：00-11：00 地点5D305 基因工程绪论 1、基因工程的定义与特征。 定义：在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。 特征：1、具跨越天然物种屏障的能力。 2、强调了确定的DNA片段在新寄主细胞中的扩增。 2、试述基因工程的主要研究内容。 1）、目的基因的分离 2）、DNA的体外重组（载体、受体系统等） 3）、重组DNA分子转移到受体细胞及其筛选 4）、基因在受体细胞内的扩增、表达、检测及其分析。 3、基因工程在食品工业上有何应用发展？ 主要是通过基因重组，使各种转基因生物提高生产谷氨酸、调味剂、酒类和油类等有机物的产率；或者改良这些有机物组成成分，提高利用价值。 4、转基因是一把双刃剑，请客观谈谈对转基因及转基因食品安全性的认识。 转基因技术所带来的好处是显而易见的，在人类历史进步和发展中起到了积极作用。 首先，通过该项技术可以提供人们所需要的特性，改良培育新品种； 第二，延长食品保存时间或增加营养成分； 第三，将抗虫防菌基因转入到作物中，使作物本身产生抵抗病虫害侵袭的能力，减少了农药的使用量，有利于环境保护； 第四，转基因技术及基因食物在医学方面得到广泛研究和应用。 人们对转基因技术的主要担忧在于环境方面。外源基因的导入可能会造就某种强势生物，产生新物种或超级杂草、损害非目标生物、破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性，也即转基因生物存在潜在的环境安全问题。 转基因作物的大面积种植已有数年，食用转基因食品的人群至少有10亿之多，但至今仍未有转基因食品对生命造成危害的实例；更何况目前每一种基因工程食品在上市前，都要经过国家法律认可，食品卫生部门和环境部门的严格检测。只有测试合格了，才能投放市场。因此公众完全可以安全地消费、大胆地食用转基因食品。 第一章DNA的分子特性与利用 1、原核生物和真核生物的基因表达调控有何差别？ 1）原核基因表达调控的三个水平：转录水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控原核基因表达调控主要是在转录水平上的调控。 2）真核生物基因表达的特点： ●1．基因组DNA存在的形式与原核生物不同； ●2．真核生物中转录和翻译分开进行； ●3．基因表达具有细胞特异性或组织特异性； ●4．真核基因表达的调控在多个水平上进行：DNA水平的调控、转录水平调控、转 录后水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控；