细菌原生质体融合实验步骤
一、实验目的
了解原生质体融合技术的原理。
学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技术。
二、实验原理
原核微生物基因重组主要可通过转化、转导、接合等途径，但有些微生物不适于采用这些途径，从而使育种工作受到一定的限制。1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上，有人提出微生物细胞原生质体融合这一新的基因重组手段。由于它具有许多特殊优点，所以，目前已为国内外微生物育种工作所广泛研究和应用。
(一)、原生质体融合的优点
(1)、克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。由于用酶解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。
(2)、基因重组频率高，重组类型多。原生质体融合时，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。原生质体融合后，两个亲株的整套基因组(包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。
(3) 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。
(4) 存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。
(二)、原生质体融合步骤
(1)、选择亲本选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。
(2)、制备原生质体经溶菌酶除去细胞壁，释放出原生质体，并置高渗液中维持其稳定。
(3)、促融合聚乙二醇加入到原生质体以促进融合。聚乙二醇为一种表面活性剂，能强制性的促进原生质体融合。在有Ca2+ 、Mg2+离子存在时，更能促进融合。
(4)、原生质体再生原生质体已失去细胞壁，虽有生物活性，但在普通培养基上不生长，必须涂布在再生培养基上，使之再生。
(5)、检出融合子利用选择培养基上的遗传标记，确定是否为融合子。
(6)、融合子筛选产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型，前者性能不稳定，要选出性能稳定的单倍重组体，反复筛选出生产性能良好的融合子。
(三)、原生质体再生率和融合率计算
三、实验材料
(一)、菌种：
枯草芽孢杆菌T4412 ade- his-、枯草芽孢杆菌TT2 ade-pro-
(二)、培养基(配制方法见下一页附录)：
(1)、完全培养基(CM，液体)；
(2)、完全培养基(CM，固体) 液体培养基中加入2.0%琼脂；
(3)、基本培养基(MM)；
(4)、补充基本培养基(SM) 在基本培养基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2％的纯化琼脂，75 Pa 灭菌20min；
(5)、再生补充基本培养基(SMR) 在补充基本培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖，1.0％纯化琼脂作上层平板，2.0％纯化琼脂作底层平板、75 Pa 灭菌20 min。
(6)、酪蛋白培养基(测蛋白酶活性用)。
(三)、缓冲液：
(1)、0.1mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液。
(2)、高渗缓冲液：于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。
(四)、原生质体稳定液(SMM)：
0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC1 、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。
(五)、促融合剂：
40％聚乙二醇(PEG-4000)的SMM 溶液。
(六)、溶菌酶液：
酶粉酶活为4000 u/g，用SMM 溶液配制，终浓度为2 mg/mL，过滤除菌备用。(七)、器皿：
养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、烧杯、离心管、吸管、显微镜、台式离心机、721 比色计、细菌过滤器。
四、实验步骤
(一)、原生质体的制备：
1、培养枯草芽孢杆菌：
取亲本菌株T4412、TT2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(CM)的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中，36℃振荡培养3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其终浓度为0.3 u/mL，继续振荡培养2 h。
2、收集细胞：
各取菌液10 mL，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮10 mL SMM 中，每mL 约含108～109 活菌为宜。
3、总菌数测定：
各取菌液0.5 mL，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基，36℃培养24 h 后计数。此为未经酶处理的总菌数。
4、脱壁：
二株亲本菌株各取5 mL 菌悬液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为100 ug/mL，混匀后于36℃水浴保温处理30 min，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，用4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于5 mL 高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。
5、剩余菌数测定：
取0.5 mL 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 mL，涂布于完全培养基平板上，36℃培养24～48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。
计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。原生质体形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数
(二)、原生质体再生：
用双层培养法，先倒再生补充基本固体培养基(SMR)作底层，取0.5 mL 原生质体悬液，用SMM作适当稀释，取10-3、10-4、10-5 稀释液各1mL，加入底层平板培养基的中央，再倒入上层再生补充半固体培养基混匀，36℃培养48 h。分别计算二亲株的原生质体的再生率，并计算其平均数。
(三)、原生质体融合：
取两个亲本的原生质体悬液各1 mL 混合，放置5 min 后，2500 r/min 离心10 min，弃上清液。于沉淀中加入0.2 mL SMM 溶液混匀，再加入1.8 mL PEG 溶液，轻轻摇匀，置36℃水浴保温处理2 min，2500 r/min 离心10 min，收集菌体，将沉淀充分悬浮于2 mL SMM
液中。
(四)、检出融合子：
取0.5 mL 融合液，用SMM 液作适当稀释，取0.1 mL 菌液与灭菌并冷却至50℃的再生补充基本培养基软琼脂中混匀，迅速倾入底层为再生补充基本培养基的平板上，36℃培养
2 d，捡出融合子，转接传代，并进行计数，计算融合率。
(五)、融合子的筛选：
挑选遗传标记稳定的融合子，凡是在再生补充基本培养基平板上长出的菌落，初步认为是融合子，可接入到酪蛋白培养基平板上，再挑选蛋白酶活性高于亲本的融合子。由于原生质体融合后会出现两种情况：一种是真正的融合，即产生杂核二倍体或单倍重组体，另一种只发生质配，而无核配，形成异核体。两者都能在再生基本培养基平板上形成菌落，但前者稳定，而后者则不稳定。故在传代中将会分离为亲本类型。所以要获得真正融合子，必须进行几代的分离、纯化和选择。
植物原生质体的分离及融合 生93沈睿2009012372同组：古梦婷 实验日期：2011年11月2日 一．实验原理 1.原生质体分离 原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。 2.原生质体融和 诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。本实验用PEG诱导原生质体融和。 PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子。Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。 PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。二．实验步骤 1.原生质体的制备 （1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。 （2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。 （3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。 （4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。 （5）配平后，在700rpm下离心5min，弃去上清液；加洗涤液约3ml，吹打均匀，700rpm、5min重复离心一次，彻底去除酶液。 （6）加200μl洗涤液，悬浮原生质体。 （7）镜检原生质形态和浓度，看看是否有碎片；如碎片较多，利用蔗糖溶液漂浮1-2次。（8）蔗糖漂浮方法： 取部分原生质体悬浮液，加入洗涤液定容至1ml。用注射器吸取20%蔗糖溶液，装上长针头后小心插入盛有原生质体悬浊液的离心管底部，缓缓、轻柔地将蔗糖溶液挤出。由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。配平后在700rpm下离心5min。用装有长针头的注射器小心吹吸底部沉淀，连同底部碎片一起将底层蔗糖溶液吸出，再小心除去上清液，得到纯净完整的原生质体。 2.PEG融和
动物医学进展,2008,29(5):64267 Progress in Veterinary Medicine 微生物原生质体融合技术研究进展3 王春平1,2,韦 强1,鲍国连13,刘 燕1,邵泽香1,2,季权安1 (1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江杭州310021;2.山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018) 摘 要:原生质体融合技术在遗传学、动植物远缘杂交育种、生物学、免疫学、兽医学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值,文章就原生质体制备、再生及其融合过程中的影响因素做了综述,另外还对原生质体融合方法和融合子的筛选方法进行了比较,为选择适宜有效的诱导融合方法和筛选方法提供依据。 关键词:原生质体融合;影响因素;融合方法;筛选方法 中图分类号:Q813.2文献标识码:A文章编号:100725038(2008)0520064204 原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交,是指细胞通过介导和培养,在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程[1]。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy L 等[2]采用离心力诱导的方法,报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合,从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术,并从微生物种内融合扩展到界间的融合。路玲玲等[3]采用融合技术成功构建耐高温高产酒精酵母,至此,原生质体融合技术成为工业菌株改良的重要手段之一。原生质体融合技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大[4]。 1 原生质体融合技术 微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备,原生质体融合,原生质体再生[5]。1.1 原生质体制备与再生过程中的影响因素 制备原生质体的最大障碍就是细胞壁,现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法,使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶,具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多,不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上,多采用对数生长中后期的细菌,这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肽聚糖含量最低,细胞壁对酶的作用最敏感。王燕[6]对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备的过程中,用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶混合浓度比为5∶3∶1的酶液混合使用能提高去壁效果。使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用一种酶的效果好,在一定范围内,酶作用的时间和酶作用的浓度都与原生质体的形成率成正相关,而与再生率成反相关。另外,ED TA作为螯合剂,可以避免金属离子对酶的抑制作用而提高酶脱壁效果,从而提高原生质体的形成率。据报道,对大肠埃希菌来说,用ED TA洗涤后,可以除去对酶解不利的金属离子[7]。另一方面,在原生质体制备前,用适量的青霉素对菌体进行预处理,可以抑制肽聚糖合成过程中的转肽作用,有利于原生质体的形成。根据酶反应动力学原理,酶解温度直接影响酶促反应的速度,如放线菌的最适酶解温度为28℃～37℃,真菌的最适酶解温度为30℃～35℃[8]。在高渗Tris 溶液中添加15mL/L聚乙烯吡咯烷酮(PV P)等原生质体扩张剂,有利于溶液中细菌的分散,有助于制备原生质体,添加0.02mol/L镁离子,有利于原生质体的稳定。关于原生质体的再生,吴孔兴等[9]报道在原生质体高渗再生培养基中加入0.3mol/L的蔗糖和0.2mol/L的丁二酸钠是合适的,王玉华等[10]报道在高渗再生培养基中加入0.5mol/L的蔗糖是适宜的,这可能要根据不同的微生物种类而定。 1.2 原生质体融合过程中的影响因素 1974年,匈牙利的Ferenczy报道了离心力诱导法对白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合。随后人们相继用NaCl、KCl和Ca(NO3)2等作为诱变剂进行融合,但融合频率都很低。聚乙二醇在适量 3收稿日期:2008202203 基金项目:浙江省重点科技攻关项目(2005C12021,2005E60014) 作者简介:王春平(1982-),男,山东淄博人,硕士研究生,主要从事动物传染病研究。3通讯作者
专题噬菌体侵染细菌的实验 T2噬菌体侵染细菌的部分实验如下图所示。下列叙述正确的是 A．①中噬菌体为子代DNA复制提供了模板和逆转录酶 B．适当时间保温后进行②操作，使细菌外的噬菌体外壳与细菌分离C．由该图分析可知，实验结果可说明DNA是主要的遗传物质 D．该实验得到的子代噬菌体中，大多数含有放射性32P 【参考答案】B “二看法”判断子代噬菌体标记情况 1．下列关于T2噬菌体侵染细菌实验的叙述，正确的是
A．T2噬菌体的蛋白质外壳中只含有S元素 B．T2噬菌体侵染细菌时利用细菌的DNA作为模板进行DNA复制 C．35S标记的T2噬菌体侵染细菌后，沉淀物中含有少量放射性可能是因为35S进入了宿主细胞 D．32P标记的T2噬菌体侵染细菌后，释放的大量子代T2噬菌体中含32P的个体所占的比例很小 2．1952年，赫尔希和蔡斯用35S和32P分别标记T2噬菌体时，做法是 A．分别用含35S和32P的人工培养基培养T2噬菌体 B．分别用含35S和32P的培养基培养细菌，再分别用上述细菌培养T2噬菌体 C．分别将35S和32P注入鸡胚，再用T2噬菌体感染鸡胚 D．分别用含35S和32P的动物血清培养T2噬菌体 3．有a、b两类噬菌体，它们均己被32P或35S中的一种标记过。将a、b噬菌体分别侵染甲、乙两管大肠杆菌，经保温、搅拌和离心后，检测离心管内放射性物质的位置，结果如下图。下列叙述正确的是 A．实验结果表明a的蛋白质外壳和b的DNA均有放射性 B．可以确定甲管的放射性来自32P，乙管的放射性来自35S C．检测结果表明噬菌体的DNA和蛋白质可侵入大肠杆菌内 D．伴随着噬菌体DNA的复制，乙管内沉淀物的放射性将逐渐增强 4．在噬菌体侵染细菌的实验中，随着培养时间的延长，培养基内噬菌体与细菌的数量变化如图所示，下列相关叙述不正确的是 A．噬菌体增殖所需的原料、酶、能量均来自细菌 B．在t0~t1时间内，噬菌体还未侵入到细菌体内 C．在t1~t2时间内，噬菌体侵入细菌体内导致细菌大量死亡 D．在t2~t3时间内，噬菌体因失去寄生场所而停止增殖
噬菌体侵染细菌的实验误差分析 贵州省思南中学勾华强 在噬菌体侵染细菌的实验中，赫尔希和蔡斯分别用35S和32P标记的T2噬菌体侵染大肠杆菌，在理论上，用35S标记的T2噬菌体侵染大肠杆菌后，上清液具有很高的放射性，下层沉淀物中不含放射性。用32P标记的噬菌体侵染大肠杆菌后，上清液中不含放射性，下层沉淀物中具有很高的放射性；而实际上，实验的最终结果显示：用35S标记的T2噬菌体侵染大肠杆菌后，在离心的下层沉淀物中，具有一定的放射性，而上清液中的放射性强度比理论值略低。用32P标记的T2噬菌体侵染大肠杆菌后，在离心的上层清液中，具有一定的放射性，而下层沉淀物中的放射性强度比理论值略低。 在此实验中，是什么原因导致实验数据与理论数据之间存在着误差呢？我们不妨来对此实验过程进行一下误差分析： 一、误差的主要来源： （一）35S标记的T2噬菌体侵染大肠杆菌的误差来源： 1、在实验中，35S标记的T2噬菌体与大肠杆菌混合培养后，在搅拌器中搅拌不充分，使吸附在大肠杆菌外被35S标记的噬菌体蛋白质外壳没有与大肠杆菌完全分离开，所以离心后下层沉淀物中存在放射性，而上清液中的放射性比理论值略低。
2、在实验中，被35S标记的一部分噬菌体没有侵染到大肠杆菌细胞内，经离心后少量存在于沉淀物中，使沉淀物中出现放射性，而上清液中的放射性比理论值略低。 （二）32P标记的T2噬菌体侵染大肠杆菌的误差来源： 1、在实验中，32P标记的噬菌体和大肠杆菌混合培养的时间过长，噬菌体在大肠杆菌细胞内增殖后释放出来，经离心后分布于上清液，使上清液出现放射性，而下层的放射性强度比理论值略低。 2、在实验中，仍然有一部分噬菌体没有侵染到大肠杆菌细胞内，经离心后少量分布于上清液中，使上清液出现放射性，而下层沉淀物中的放射性强度比理论值略低。 二、减小误差的主要方法： 在此实验中要减小实验数据和理论数据之间的误差，应注意以下几点。 1、用被35S和32P标记的T2噬菌体侵染大肠杆菌时，要控制好条件，使之让T2噬菌体处于最适于侵染的环境中，达到充分侵染的目的。 2、严格控制好从噬菌体和大肠杆菌混合培养到用离心机分离的时间，时间过短未充分侵染，时间过长侵染进入大肠杆菌细胞内的噬菌体增殖后释放出来，都会使实验误差增大，故严格控制好时间是减小误差的关键因素之一。
实验六植物原生质体的分离与融合 一、实验目的： 1、掌握原生质体分离的方法； 2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。 二、实验原理： PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。 该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。 三、实验材料： （1）韭菜或大蒜叶； （2）红辣椒 四、实验步骤： Ι 植物原生质体的分离与纯化 1、酶解：将撕去表皮的植物叶片和果肉置于酶液（PH 5.4_5.8, 去表皮面接触酶液），在适宜温度条件下，避光酶解数小时。 2、过滤：用350目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。 3、原生质体收集：在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清 液。红辣椒800转/分离心5分钟。 4、洗涤：弃上清液，留沉淀约1ml，加入4ml13%CPW洗
液，相同条件下再离心，弃上清液。 弃上清液，留沉淀约1ml，混匀呈悬浮备用。 5、纯化： **蔗糖漂浮法去除碎片法： （1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液约3ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出，由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。或者（1*）换一洁净离心管加入20%蔗糖溶液约3ml，然后小心将原生质体悬液平铺于离心管表面。（以上任一方法皆能看到明显界面） (2)离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处 (3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中。注意下步镜检决定是否需要:加入3～4ml13%CPW洗液离心，离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），收集沉淀，最终原生质体体积控制在0.5ML左右。 Ⅱ细胞融合 1．不同的原生质体各300μl与带盖离心管中，另加入300μl 40% PEG液，30℃水浴中温浴15min； 2．融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度，不能太
XXXX学校XXXXXX学院毕业设计（论文）文献综述 学生姓名：学号： 专业：生物工程 班级： 设计（论文）题目： 指导教师： 二级学院： 2010年月日
题目 学生：学号：班级： 导师： 摘要：原生质体融合技术是细菌遗传育种的有效方法之一,发展迅速,应用广泛.文中综述了亲本菌株选择性遗传标记方法、影响原生质体制备与再生因素、原生质体融合方法和条件。介绍了原生质体融合技术在微生物遗传育种中的应用,并展望了原生质体融合技术的发展前景。 关键词： 引言：原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交,是指细胞通过介导和培养,在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程[1]。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy L等[2]采用离心力诱导的方法,报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合,从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术,并从微生物种内融合扩展到界间的融合。路玲玲等[3]采用融合技术成功构建耐高温高产酒精酵母,至此,原生质体融合技术成为工业菌株改良的重要手段之一。原生质体融合技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大[4]。 1 原生质体融合技术 微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备、原生质体融合、原生质体再生[5]。 1.1 原生质体制备与再生过程中的影响因素 制备原生质体的最大障碍就是细胞壁,现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法,使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶,具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多,不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上,多采用对数生长中后期的细菌,这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肽
噬菌体侵染细菌-真题练习 随堂·真题演练 1.（2016·江苏卷，1）下列关于探索DNA是遗传物质实验的相关叙述，正确的是（） A.格里菲思实验中肺炎双球菌R型转化为S型是基因突变的结果 B.格里菲思实验证明了DNA是肺炎双球菌的遗传物质 C.赫尔希和蔡斯实验中T2噬菌体的DNA是用32P直接标记的 D.赫尔希和蔡斯实验证明了DNA是T2噬菌体的遗传物质 解析格里菲思实验中肺炎双球菌R型转化为S型是基因重组的结果，A错误；格里菲思实验证明了S型细菌中存在一种转化因子，使R型细菌转化为S型细菌，B错误；T2噬菌体营寄生生活，需先标记细菌，再标记噬菌体，C错误；赫尔希和蔡斯的T2噬菌体侵染细菌实验证明了DNA是T2噬菌体的遗传物质，D 正确。 答案 D 2.（2013·海南，13）关于T2噬菌体的叙述，正确的是（） A.T2噬菌体的核酸和蛋白质中含硫元素 B.T2噬菌体寄生于酵母菌和大肠杆菌中 C.RNA和DNA都是T2噬菌体的遗传物质 D.T2噬菌体可利用寄主体内的物质大量增殖 解析核酸中不含硫元素，故A错误；T2噬菌体不能寄生在酵母菌细胞中，故B错误；任何生物的遗传物质只能是DNA或RNA中的一种，T2噬菌体的遗传物质是DNA，故C错误；T2噬菌体作为病毒，只能利用宿主细胞的物质进行增殖，D正确。 答案 D 3.（2012·江苏，2）人类对遗传物质本质的探索经历了漫长的过程，下列有关叙述正确的是（） A.孟德尔发现遗传因子并证实了其传递规律和化学本质 B.噬菌体侵染细菌实验比肺炎双球菌体外转化实验更具说服力 C.沃森和克里克提出在DNA双螺旋结构中嘧啶数不等于嘌呤数
噬菌体侵染细菌的实验教学设计 王莹 一、教材内容分析 《噬菌体侵染细菌的实验》是苏教版普通高中生物必修2《遗传与进化》中第4章第1节的内容。本部分内容之前已经介绍了格里菲斯和艾弗里的“肺炎双球菌的转化实验”。“噬菌体侵染细菌”的实验是更具有说服力的实验，其设计思路科学而缜密，值得学生借鉴和学习。本内容是从分子层面上认识遗传物质的本质，为学习DNA的复制，基因的表达和基因突变打下了基础 二、学习对象分析 高中必修一也在介绍原核生物与真核生物时，也了解了病毒是一种寄生的没有细胞结构的生物。可以简要跟学生介绍大肠杆菌和噬菌体，引发回忆。高中学校没有成熟的实验条件供学生亲自做噬菌体侵染细菌的实验，因此教师应该形象直观地展示科学探索的过程，引导学生的思路再现一遍科学家的实验探究过程，达到发展学生科学思维能力的目的。根据新课程理念，高中生物学教学重在培养学生的科学思维、科学探究，因此，本节课以“自主探究科学发现的过程”为设计理念，切实落实主体性教学，提高学生的探究能力，训练学生科学的思维方法。 三、教学策略 由“格里菲斯和艾弗里肺炎双球菌转化实验”的不足之处引入新内容，让学生思考如何对这一问题进行研究，提高说服力，培养他们分析问题和解决问题的能力，激发他们了解科学家当年的研究过程和方法的兴趣。通过重温科学家的探究历程，领会实验选材的巧妙、思维的严谨和实验方法的科学；通过实验结果的分析理解DNA是主要的遗传物质根据主体性教学目标，以“自主性、探究性、合作性”为学生学习的三个基本维度，以培养学生的科学素质为指导，以侧重科学方法教育为归宿，本节课采用“引导探究”教学模式，融合讨论法、比较法、归纳法等多种教学方法，并配以多媒体辅助教学，引导学生模拟科学发现过程，进行分析、讨论、归纳和总结。 采用“设疑导入→问题引导呈现探究过程→讨论实验结果→归纳总结→反馈运用”的教学程序。 四、教学目标 1、知识与技能： （1）进行“噬菌体侵染细菌”的实验设计； （2）描述“噬菌体侵染细菌”的实验步骤 2、情感态度和价值观： (1) 探讨实验技术在证明DNA是主要遗传物质中的作用。体验科学探索的艰辛过程； (2) )领悟科学研究的过程和方法，培养学生的实验探究能力。 五、教学重点和难点 1、重点：
原生质体融合技术的局限性 植物原生质体是指用特殊方法去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生团。这种裸露细胞在适当的外界条件下，还可形成细胞壁，进行有丝分裂，形成愈伤组织和诱发再生植株，因而仍然具有细胞的全能性。 植物原生质体融合技术是借鉴于动物细胞融合的研究成果，在原生质体分离培养的基础上建立起来的，以植物的原生质体为材料，通过物理、化学等因素的诱导，使两个原生质体融合在一起以致形成融合细胞的技术。它不是雌雄孢子之间的结合，而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合，是2种原生质体间的杂交。通过原生质体融合可以把带有不同的基因组的两个细胞结合在一起，与有性杂交相比，无疑可以使“杂交”亲本组合的范围扩大，不但可以利用细胞核内基因资源，还可以利用包含在细胞质中的诸如叶绿体和线粒体DNA的遗传资源。 原生质体培养是细胞杂交的基础，但是直到目前为止，也只有360多个种的原生质体培养再生了完整的植株，大多数重要的植物尤其是木本植物如葡萄、棕榈、橡胶、茶、香蕉、椰子和芒果等的原生质体再生仍然很困难，或者还未进行深入研究。在原生质体再生的物种中，茄科占了将近1/4，并且用于育种目的的大多数体细胞杂种和细胞质杂种也比较集中于茄属、烟草属、苜蓿属、柑橘属、芸薹属和番茄属等6个属中。因此，为了有效地进行植物遗传改良，不但要使杂种细胞再生成完整植物，而且还必须提高植株再生的频率，以便有足够的群体进行有效的选择。但目前存在的一个普遍的问题使许多原生质体再生的程序似乎较低，重复性较差，并且还具有基因型的依赖性。为了将体细胞杂交技术应用于更多的植物中，还需要更加深入地研究植物细胞的分化、脱分化和再分化等发育机制。 1.技术局限性 植物细胞杂交的本质是将两种不同来源的原生质体，在人为的条件下进行诱导融合。由于植物细胞的全能性，因此融合之后的杂种细胞，可以再生出具有双亲性状的杂种植株。因此，细胞融合也叫原生质体融合或细胞杂交。其包括三个主要环节：诱导融合；选择融合体或杂种细胞；杂种植株的再生和鉴定。 1.1诱导原生质体融合 诱导原生质体融合是体细胞杂交的最基本的技术环节。融合方法的选择受到很多实验条件的限制。常用的化学方法有化学方法与电融合方法。化学方法中用的最多的是聚已二醇（PEG）融合技术。但是这种方法中PEG与高PH强加于原生质体的非常生理条件，PEG 的相对分子质量、纯度、浓度、处理时间、原生质体的状况和密度等都会影响PEG融合技术，而且其融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害作用；而影响电融合的因素有电融合技术中交流电的强弱、处理时间的长短、电脉冲的大小电极的材料和间距、直流脉冲的强度、宽幅以及次数等。 而且对于不同的植物材料需要经过多次实验，才能找出这些参数的适当值。这就制约了原生质体融合技术成为常规育种方法。 1.2杂种细胞的选择 为了将杂种细胞与未融合的、同源融合的亲本细胞区分开，一般有以下选择方法： 1.2.1利用或诱导各种缺陷型或抗性细胞系，用选择培养基将互补的杂种细胞选择出来； 互补选择一般要求有相应的突变体。在体细胞杂交的研究中，虽然人们已经建立和利用了各种各样的突变体，但是在植物中要建立突变细胞系比较困难，如果要使突变细胞系保持再生能力就更难了，因此在实际应用中受到很大的限制。 1.2.2机械选择法 利用荧光素标记分离杂种细胞取得了一定的成效，但是显微镜操作费工费时，选择出异
细胞工程 实验六植物原生质体的分离与融合 实验概要 本实验介绍了原生质体分离的方法及利用PEG原生质体融合的原理和方法。 实验原理 植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。许多化学、物理学和生物学方法可诱导原生质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇（PEG）法、高钙高pH法和电融合法；聚乙二醇（PEG）作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高钙高pH法进行清洗，使原生质体融合得以完成。聚乙二醇（PEG）诱导如何的机理：聚乙二醇（PEG）由于含有醚键而具有负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当聚乙二醇（PEG）分子足够长时，可作为临近原生质表面之间的分子桥而使之粘连、聚乙二醇（PEG）也能连接钙等阳离子，钙可在一些负极化基团和聚乙二醇（PEG）之间形成桥，因而促进粘连。从而引起原生质体融合：高钙高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时渗透压冲击也可能起作用。原生质体分离纯化后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法时原生质体培养中最基础也是最关键的环节。PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。 主要试剂 1. 20%蔗糖； 2. 13%CPW洗液： 27.2mg/L 磷酸二氢钾（KH2PO4）
食品生物技术课程论文原生质体细胞融合技术
原生质体细胞融合技术 摘要：细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术己在农业、医药、环保等领域得到了迅速发展和应用。综述了细胞融合技术中的常用方法:细胞融合仙台病毒诱导法、细胞融合PEG（聚乙二醇)诱导法、细胞融合电场诱导法、细胞融合激光诱导法;以及最新研究进展:基于微流控芯片的细胞融合技术、高通量细胞融合芯片、空间细胞融合技术、离子束细胞融合技术、非对称细胞融合技术等，并对它们的优缺进行简要的评述。 关键词：原生质体细胞融合技术影响因素融合方法发展 正文： 原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交，是指细胞通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程。利用现代科学技术，把来自于不同种生物的单个细胞融合成一个细胞，这个新细胞得到了来自两个细胞的遗传物质，具有新的遗传或生物特性。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy 等采用离心力诱导的方法，报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合，从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术，并从微生物种内融合扩展到界间的融合。目前，通过原生质体融合进行体细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。细胞融合核技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理念领域的研究提供了有力的手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方而都有广泛的应用价值。特别是在单克隆抗体的制备、哺乳动物的克隆以及抗癌疫苗的研发等技术中细胞融合技术已成为关键技术。 1 原生质体融合技术 微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备，原生质体融合，原生质体再生。 1. 1 原生质体制备与再生过程中的影响因素 制备原生质体的最大障碍就是细胞壁，现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法，使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶，具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多，不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上，多采用对数生长中后期的细菌，这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肤聚糖含量最低，细胞壁对酶的作用最敏感。对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备的过程中，用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶混合浓度比为5:3: 1的酶液混合使用能提高去壁效果。使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用
酵母原生质体融合 ××××××××××酵母有发酵工业的灵魂之称，其发酵性能的好坏直接影响发酵产品的质量，同时也决定着发酵工艺流程和运转周期及运转费用[1]。因此，选育优良的酵母菌种在发酵工业中具有重要的意义[2]。对酿酒酵母的选育始终是酿酒工作者所要从事的重要工作之一。好的酿酒酵母能够提高酒的质量和产量，赋予酒良好的风味；能够简化工艺流程，减少设备投资；能够缩短发酵周期，降低运转费。 原生质体融合育种( protoplast fusion)是20世纪60年代发展起来的基因重组技术。通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。1960年法国的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象，同时日本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探索。国内外对原生质体融合技术的研究都比较成熟, 一般认为酵母菌原生质体融合技术的关键点有原生质体的制备和再生、原生质体的融合以及融合子的筛选等。传统的对酿酒酵母的选育方法主要有自然分离、连续培养和诱变育种[3]。近年来重组技术，基因工程和原生质体融合技术迅速发展，得到了广泛应用。 两个或两个以上的细胞经过自然的或者人为的作用合并成为一个细胞叫融合细胞，这个过程就称为细胞融合过程。用微生物作材料进行细胞融合，必须消除细胞壁和细胞膜。通常采用酶解作用破除细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。细胞融合之后，还经过细胞质融合，细胞核重组，细胞壁再生等一系列过程才能形成具有生活能力的新菌株。融合后的细胞有两种可能：一是染色体DNA不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。另一类是两亲本细胞核染色体DNA真正发生重组。通过连续传代分离纯化可以区别这两类融合。应该指出，即便是真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。因此，必须经过多次分离纯化才能够获得稳定的融合子。 本实验将通过酿酒酵母2.339与酿酒酵母2.70的融合，以期获得具有更高发酵效率的酿酒酵母新品种并应用于制酒工业，在节省酿酒粮食的投入量前提下提高发酵产量。以期获得更好的经济价值。 1.材料与方法 1.1 材料
噬菌体侵染细菌实验 1.实验材料 T2噬菌体和大肠杆菌。 （1）噬菌体的结构及生活方式 （2）噬菌体的复制式增殖 增殖需要的条件内容 模板噬菌体的DNA 合成噬菌体DNA的原料大肠杆菌提供的四种脱氧核苷酸 合成噬菌体蛋白质原料大肠杆菌的氨基酸场所大肠杆菌的核糖体 2.实验方法 同位素标记法。该实验中用35S、32P分别标记蛋白质和DNA。 3.实验过程 （1）标记噬菌体 （2）侵染细菌
4.实验结果分析 （1）噬菌体侵染细菌时，其DNA进入细菌细胞中，而蛋白质外壳留在外面。（2）子代噬菌体的各种性状是通过亲代DNA遗传的。 5.结论 DNA是遗传物质。 ■助学巧记 “二看法”判断子代噬菌体标记情况 1.真题重组判断正误 （1）证明光合作用所释放的O2来自于水与用T2噬菌体侵染大肠杆菌证明DNA 是遗传物质所用核心技术相同（2016·课标Ⅲ，2B）（√） （2）赫尔希与蔡斯以噬菌体和细菌为研究材料，通过同位素示踪技术区分蛋白质与DNA，证明了DNA是遗传物质（2015·江苏卷）（√） （3）T2噬菌体可利用寄主体内的物质大量增殖（2013·海南，13D）（√）（4）T2噬菌体侵染大肠杆菌实验证明了DNA是遗传物质（2013·新课标Ⅱ，5改编）（√） （5）噬菌体增殖需要细菌提供模板、原料和酶等（2012·山东，5B）（×）“遗传物质的探索过程”的高考命题主要聚焦两大经典实验设计的思路、实施的过程、结果及相应结论等；关注实验方法的考查，如细菌的培养、噬
菌体的同位素标记等；重视实验结论的提炼。考查主要以选择题为主，涉及细菌、病毒的结构和生活方式等相应的知识储备。 2.教材P46“思考与讨论”改编 （1）以细菌或病毒作为遗传物质探索的实验材料有何优点？ 提示细菌和病毒作为实验材料，具有的优点是：（1）个体很小，结构简单，容易看出因遗传物质改变导致的结构和功能的变化。细菌是单细胞生物，病毒无细胞结构，只有核酸和蛋白质外壳。（2）繁殖快。细菌20～30 min就可繁殖一代，病毒短时间内可大量繁殖。 （2）尽管艾弗里、赫尔希等人的实验方法不同，但其最关键的实验设计思路却有共同之处，你能否具体指出？ 提示最关键的实验设计思路是设法把DNA与蛋白质分开，单独地、直接地去观察DNA或蛋白质的作用。 噬菌体侵染细菌实验分析 1.（2012·经典高考）赫尔希和蔡斯于1952年所做的噬菌体侵染细菌的著名实验进一步证实了DNA是遗传物质。这项实验获得成功的原因之一是噬菌体（） A.侵染大肠杆菌后会裂解宿主细胞 B.只将其DNA注入大肠杆菌细胞中 C.DNA可用15N放射性同位素标记 D.蛋白质可用32P放射性同位素标记 解析组成噬菌体的结构物质有蛋白质和DNA，对蛋白质和DNA进行标记要用特有元素35S和32P，不能用共有元素15N，故C项错误。蛋白质的组成元素中一般没有P，故D错误。噬菌体侵染细菌时把DNA注入大肠杆菌中，而蛋白质外壳留在外面，这一特性将蛋白质和DNA分离开，使实验结果更科学、更准确，故B项正确。 答案 B 2.（2017·江淮十校联考）下面是噬菌体侵染细菌实验的部分实验步骤示意图，有关叙述正确的是（）
微生物原生质体融合育种技术及其应用 摘要： 工业微生物菌种选育在发酵工业中占有重要地位。微生物原生质体融合(microbialprotoplast fusion)技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整等优点,是微生物育种最常用的方法之一。结合相关研究进展,分析了原生质体融合技术的组成,包括制备、再生、融合的影响因素以及融合子的筛选方法,重点评述了原生质体融合技术应用在微生物育种中的最新进展,以及微生物原生质体融合技术的发展前景。 关键词：微生物原生质体融合遗传育种基因组重组 引言： 微生物菌种是发酵工业中的一个关键因素,它决定了发酵过程的成败及某一发酵产品是否具有工业化价值。自然界中的原始菌株大多不具有很高的工业化价值,因此需要对菌株进行选育和改良,以提高产品的质量,降低成本。原生质体融合技术是起源于20世纪60年代的一项重要的菌种改良技术,是将亲株细胞分别去除细胞壁后进行融合,经基因组间的交换重组,获得融合子的过程。与其他育种技术相比,原生质体融合技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整且不需要完全了解作用机制等优点,因而被国内外微生物育种学者广泛应用。 1974年,匈牙利的Ferenczy成功将白地霉(Geotrichum candidum)营养缺陷型突变株的原生质体进行融合,使原生质体融合技术首次应用于微生物中。接下来的几十年,该技术的基本实验方法逐步完善,现已作为一项十分有用的技术广泛应用于工业微生物菌种选育中。本文就原生质体融合技术的过程及其应用于微生物育种方面的最新进展做了简要综述,并分析了目前存在的问题及未来的发展方向。 1 资料和方法： 1.1 资料来源 由第一作者在CNKI进行检索。网址：https://www.doczj.com/doc/992842597.html,/。英文资料的检索时间范围为2007/2012；中文资料的检索时间范围为2007/2012。英文检索词为“protoplast fusion、research、progressions”；中文检索词为“原生质体融合、应用、研究进展”。 1.2 入选标准 纳入标准：①原生质体融合技术过程及其影响因素。②原生质体在微生物工程中的应用③原生质体技术应用的工业实例。
大型真菌原生质体融合技术研究进展 1 发展史 由于原生质体技术的形成，去除了细胞壁的障碍，使得种内、种间甚至属间杂交成为可能。原生质体融合起源于60年代，而真菌原生质体融合的第一篇报道是以白地霉(Geotrichum candidum Link)营养缺陷型突变株为材料，采用离心方法进行原生质体融合，其融合率低于10-6。之后，人们又利用一些化学试剂，如NaNO2，Ca(NO3)2，NaCl，KCl等进行融合，效果得到改进。1976年安(Ann)等把用聚乙二醇(PEG)诱导植物原生质体融合的方法引入到真菌原生质体的融 合中来，使融合率达到10-2量级。PEG诱导原生质体融合的成功，推动了真菌原生质体融合的发展。1979年匈牙利的佩斯蒂(Pesti)首先报道了融合育种提高青霉素产量，从而开创了原生质体融合在实际工作中的应用。 日本、英国、加拿大、中国等对双孢蘑菇、香菇、木耳、平菇等食用菌原生质体的分离、再生、融合做了大量卓有成效的工作。在过去的几十年中，人们已从54种食用菌中分离到原生质体；已进行了种内10种、种间19种，属间5种、目间3种的原生质体融合研究。然而PEG等化学方法诱导原生质体融合对细胞损伤大，有残留毒性。1979年森达(Senda)，1980年齐默尔曼(Zimmermann)等人报道了电场诱导细胞融合的新技术，电融合技术操作简单、无化学毒性，对细胞损伤小，融合率高。以后几年里，人们把这种新的融合手段从动、植物扩展到微生物的原生质体融合研究中，导致了原生质体融合技术的新突破。1988年张闻迪等又报道了激光诱导动物细胞融合。1998年又有报道螯合剂对原生质体融合具有促进作用。 2 原生质体融合中亲本的选择标记 原生质体融合前首先必须对亲本进行遗传标记，从而有利于挑选融合子。在融合中，可采用营养缺陷型、抗药性、灭活原生质体、荧光染色、形态差异和自然生态标记等方法。
细菌原生质体融合实验步骤 一、实验目的 了解原生质体融合技术的原理。 学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技术。 二、实验原理 原核微生物基因重组主要可通过转化、转导、接合等途径，但有些微生物不适于采用这些途径，从而使育种工作受到一定的限制。1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上，有人提出微生物细胞原生质体融合这一新的基因重组手段。由于它具有许多特殊优点，所以，目前已为国内外微生物育种工作所广泛研究和应用。 (一)、原生质体融合的优点 (1)、克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。由于用酶解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。 (2)、基因重组频率高，重组类型多。原生质体融合时，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。原生质体融合后，两个亲株的整套基因组(包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。 (3) 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。 (4) 存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。 (二)、原生质体融合步骤 (1)、选择亲本选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。 (2)、制备原生质体经溶菌酶除去细胞壁，释放出原生质体，并置高渗液中维持其稳定。 (3)、促融合聚乙二醇加入到原生质体以促进融合。聚乙二醇为一种表面活性剂，能强制性的促进原生质体融合。在有Ca2+ 、Mg2+离子存在时，更能促进融合。 (4)、原生质体再生原生质体已失去细胞壁，虽有生物活性，但在普通培养基上不生长，必须涂布在再生培养基上，使之再生。 (5)、检出融合子利用选择培养基上的遗传标记，确定是否为融合子。 (6)、融合子筛选产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型，前者性能不稳定，要选出性能稳定的单倍重组体，反复筛选出生产性能良好的融合子。 (三)、原生质体再生率和融合率计算 三、实验材料 (一)、菌种： 枯草芽孢杆菌T4412 ade- his-、枯草芽孢杆菌TT2 ade-pro- (二)、培养基(配制方法见下一页附录)： (1)、完全培养基(CM，液体)； (2)、完全培养基(CM，固体) 液体培养基中加入2.0%琼脂； (3)、基本培养基(MM)； (4)、补充基本培养基(SM) 在基本培养基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2％的纯化琼脂，75 Pa 灭菌20min； (5)、再生补充基本培养基(SMR) 在补充基本培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖，1.0％纯化琼脂作上层平板，2.0％纯化琼脂作底层平板、75 Pa 灭菌20 min。 (6)、酪蛋白培养基(测蛋白酶活性用)。 (三)、缓冲液：
噬菌体侵染细菌的过程 噬菌体小组 在浙科版必修2中，噬菌体侵染细菌是经典实验之一，也是考试高频考点， 需要重视井了解发展史，教学中也需要补充噬菌体感染细菌的过程（浙科版 没有此内容）O 噬菌体侵染细菌实验 、一 ?释放注入核酸4 装配合成核酸和蛋白质问题：噬菌体侵染细菌过程的研究过程？ 在分子生物学发展史上，有一个闻名遐迩的研究集体一美国长岛冷泉港的噬菌体小组。 噬菌体小组是由徳尔布吕克（M.Delbriik）领导创建的?徳尔布吕克最初学的是物理学，20年代末，曾到丹麦哥本哈根玻尔（N.Bohr）那里作了两年物理学的研究。玻尔是当时对生物学有浓厚兴趣的少数著名物理学家之一，曾做过“光和生命”的公开演讲，并于1933年发表同名文章。徳尔布吕克受玻尔的影响，对当时蓬勃发展的遗传学产生了浓厚的兴趣。1937年，他决心放弃物理学的研究，到美国遗传学研丸的中心、摩尔根所在的加州理工学院生物系，专门从事遗传学的研丸。
他很快选择了与正在进行噬菌体研究的埃利斯(E.L.Ellis)共同合作。1940年他巧遇了从意大利来的、从事噬菌体研究的卢里亚 (S. Luria),共同的目标使他们很快结合起来。 1943年，徳尔布吕克又遇到正在从事噬菌体研究的赫尔希 (A.D.Hershey).此后，由他与卢里亚和赫尔希三人组成著名的噬 菌体小组，吸引了许多科学工作者，开展了一系列的工作。 他们一方而对噬菌体及其突变体进行系统的研究，取得了丰富的成果; 一方而培训了大批研丸人员，为分子生物学的研丸提供了理想的实验材料和研究力量。他们的重要成就之一就是赫尔希一蔡斯(M.Qlase)的噬菌体感染实验，它有力地证明了遗传信息载体是DNA,明确阐明了基因的化学本质。 徳尔布吕克.卢里亚和赫尔希因其在噬菌体生物学方面的出色工作, 于1969年 一同获得了诺贝尔医学奖。 1.感染阶段 噬菌体侵染宿主细胞的第一步是“吸附”，即噬菌体的尾部附着在细菌的细胞壁上，然后进行“侵入” °噬菌体首先释放溶菌酶，在细菌的细胞壁上打开一个缺口，尾鞘做类似肌动蛋白和肌球蛋白的收缩，露出尾轴，伸入细胞壁内，像注射器一样把头部的DNA注入细菌细胞，其蛋白质外壳留在壁外，不参与增殖过程。 2.增殖阶段 噬菌体DNA进入细菌细胞后，会引起一系列的变化：细菌的DXA合成停止，酶的合成也受到阻抑，噬菌体逐渐控制了细胞的代谢。 子代噬菌体的形成是借助于细菌细胞的代谢机制，由噬菌体本身的核酸物质操纵的。噬菌体的DNA巧妙地利用宿主细胞的“机器",大量复制子代噬菌体的DNA 和蛋白质，并形成完整的噬菌体颗粒。 据观察，当噬菌体侵入细菌细胞后，细胞质里很快便充满了DNA细