非发酵菌的鉴定 定义：非发酵菌（nonfermenters）指一群需氧或兼性厌氧、不发酵糖类，能在普通培养基上生长的革兰阴性杆菌。主要存在外界环境中，种类繁多，多为条件致病菌或医院内感染菌。 关于临床标本中NFB的意义，在混合培养物中见到时，必须考虑到患者的情况和标本来源。一般来说，以纯培养方式分离自正常无菌部位的NFB，一定要鉴定到种并进行抗生素敏感性试验。 目前CLSI中，K-B法除了假单胞菌属、不动杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌有抗生素敏感性实验的判断标准外，其他非发酵菌没有K-B法的标准。 一、鉴定原则： 1．血、无菌部位（脑脊液、胸水等），特殊病人，少见菌可用API-20NE或VIKET TWO-GN 卡鉴定。 2．其它部位如呼吸道标本、临床常见的非发酵，根据菌落形态、生化反应、抗生素耐药谱等综合分析手工法鉴定即可。 二、非发酵性菌基本分类： 假单胞菌属Pseudomonas spp.（20多个临床上重要菌种中，铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌等最常见。） 不动杆菌属Acinetoacter spp.（最常分离的种鲍曼不动杆菌、鲁氏不动杆菌、溶血不动杆菌等） 窄食单胞菌Stenotrophomonas spp.（嗜麦芽窄食单胞菌、非洲嗜麦芽窄食单胞菌） 伯克霍尔德菌Burkholderia spp.（洋葱伯克霍尔德菌、唐菖蒲伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌等） 鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas spp.（少动鞘氨醇杆菌） 无色杆菌属Achromobacter spp.（木糖氧化无色杆菌） 希瓦氏菌属Shewanella spp. （腐败希瓦氏菌海藻希瓦氏菌） 产硷菌属Alcaligenes spp. 黄杆菌属Flavoacterium spp. 莫拉菌属Moraxella spp. 罗尔斯通菌属 Ralstonia spp. 食酸菌属Acidovorax spp. 丛毛单胞菌属Comamonas spp. 甲基杆菌属Methylobacterium spp. 等还有一些未定名的菌群 三、辨认非发酵菌的基本要点 1. 分离培养基上的菌落有以下情况初步考虑非发酵菌的存在 a.培养基上生长较差或中国蓝上不生长的阴性菌。（如艾肯菌属、心杆菌属、金氏杆菌属） b.中国蓝平板上为不发酵乳糖的菌落，氧化酶阳性的高度怀疑非发酵菌。但并非所有的氧化酶阳性的均为非发酵菌。如弧菌属、气单胞菌属、邻单胞菌属、巴斯德菌属等。 c.革兰阴性菌在三糖管上培养，底层和斜面均不变色，疑为非发酵菌。但容易受影响。 2. 葡萄糖的利用大部分非发酵菌生长缓慢产生弱酸，而蛋白胨形成的产物即可升高培养基的PH值，中和非发酵菌产生的弱酸性产物。根据他的代谢特点，用氧化-发酵培养基鉴别分类该类菌。
2014年第二季度细菌耐药监测结果预警与应对策略由于抗菌药物的广泛不合理应用。细菌耐药现象日益严峻，临床出现大量多耐药和泛耐药菌株，给医院感染预防控制带来挑战。细菌耐药有一定的区域性和时间性，及时了解和掌握本院常见多耐药菌的流行现状及耐药特征，有利于临床医师合理选择抗菌药物，提高治疗效果，以达到减少为耐药菌的产生。现对2014年第二季度病原菌分布情况和耐药率进行公布，并向临床科室提供细菌耐药应对措施。
物，提示“慎用抗菌药物”；耐药率超过50%的抗菌药物，提示“参照药敏试验结果用药”；耐药率超过75%的抗菌药物，提示“暂停该类抗菌药物的临床应用”。 2细菌产生耐药性机制 2.1铜绿假单胞菌耐药机制
铜绿假单胞菌对生存环境和营养条件要求很低，在自然界分布广泛，甚至在医院内环境经常可见，其具有多药耐药性及耐药机制：（1）该菌能够产生破坏抗菌药物活性的多种灭活酶、钝化酶和修饰酶。（2）基因突变，作用靶位变异。（3）细胞膜通透性降低。（4）主动泵出机制将进入的药物排到体外。（5）产生生物膜，阻隔白细胞、多种抗体及抗菌药物进入细菌细胞内吞噬细菌。由于铜绿假单胞菌复杂的耐药机制导致其感染具有难治性和迁延性。 2.2大肠埃希氏菌耐药机制 大肠埃希菌是G－杆菌中分离率较高的机会致病菌，可引起人体所有部位的感染并且呈多重耐药性。 （1）β-内酰胺酶的产生 ①大肠埃希菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药主要是由超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）引起的，对头霉素类及碳青霉烯类药物敏感。ESBLs可分为五大类：TEM型、SHV型、CTX-M 型、OXA型和其他型，大肠埃希菌ESBLs酶以TEM型最常见。TEM型ESBLs呈酸性，可水解头孢他啶、头孢噻肟。SHV型ESBLs呈碱性，有水解头孢噻吩的巯基。CTX-M 型ESBLs呈碱性，对头孢噻肟水解能力强于头孢他啶。OXA型ESBLs呈弱酸性或弱碱性，主要水解底物是苯唑西林，OXA型酶主要见于铜绿假单胞菌中，在大肠埃希菌中的分离率较低。 ②AmpCβ-内酰胺酶AmpC酶主要作用于头孢菌素类抗菌药物，且不能被克拉维酸抑制。它是水解酶，与β-内酰胺环羧基部分共价结合，在水分子作用下导致β-内酰胺环开环，破坏β-内酰胺类抗菌药物抗菌活性。 ③对酶抑制剂药的耐药的β-内酰胺酶对酶抑制剂药的耐药的β-内酰胺酶（IRT）主要有TEM系列衍变而来，又称为耐酶抑制剂TEM系列酶。 （2）药物作用靶位的改变 （3）主动外排 （4）外膜通透性的下降 2.3肺炎克雷伯杆菌耐药机制 肺炎克雷伯杆菌属于阴性杆菌，通常存在于人类肠道、呼吸道，是除大肠埃希氏菌外导致医源性感染的最重要的条件致病菌。由于抗菌药物的大量使用，在选择性压力下多药耐药肺炎克雷伯杆菌（KPN）菌株不断出现，耐药率日益上升，KPN耐药机制包括：（1）产抗菌药物灭活酶 ①β-内酰胺酶包括产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、AmpC酶、耐酶抑制剂β-内酰胺酶、碳青霉烯酶(KPC酶)及金属β-内酰胺酶（MBLs）等。
问题1：如何正确应用药物敏感结果？ 正确运用药敏试验结果应考虑以下3个方面： 首先要确定病原菌，如未找到真正的致病菌，药敏实验不但不能指导用药甚至可能误导临床； 重视耐药监测，这是经验用药的一个重要的参考； 考虑到药敏试验的局限性：体外报告敏感的药物体内治疗不一定有效，而体外报告耐药的药物体内治疗不一定无效。 问题2：是否MIC越低的药物越好？ 不一定。因为不同药物对同种细菌，同一药物对不同细菌的折点均可不同，并且若细菌产生某些特殊耐药机制时，即使体外敏感也应报耐药，另外尚需考虑药动学和耐受性。因此，不能单纯比较MIC值而认为MIC越低的药物就一定越好。 MIC只表示一种药物对某一株细菌抗菌作用的强弱，MIC越低（离中介值越远）说明该药物对相应的病原菌的作用越强。只能比较同一种药对同一株菌，若MIC值升高，可认为其耐药性提高。 问题3：是否所有报告的细菌均为病原菌？ 不一定。原因如下： 所报告细菌为污染菌或定植菌，细菌培养结果的临床意义大小与所取标本有关。如为血液等无菌标本则临床意义较大，但即使血培养阳性也可能为污染菌。某些标本易受污染如痰标本易于受咽喉部携带菌的污染，尿培养易受下尿道、尿道口寄居菌污染。 可能为应用抗菌药后的菌群交替或菌群失调。特别是原为复数菌感染时，针对优势菌治疗一段时间后可能非优势上升为优势菌，或广谱抗菌药治疗后可
能出现真菌感染。 有２种以上病原菌时因生长速度不同、营养要求不同，培养结果不能真实反映病原菌的种类、数量。 问题4：为什么有时痰涂片结果与痰培养结果不一致？ 由于痰标本进行培养和涂片时选取的部位不一致； 某些快生长菌所占比例并不多，但由于生长速度快、营养要求低，能在培养过程中迅速变为优势菌而掩盖其他菌的生长； 标本从采集到接种的时间过长，造成部分苛养菌死亡，在涂片中看到的只是菌的残骸而非活菌。 问题5：我们想用的药物在药敏试验中没有做？ 1.天然耐药 2.可能是药物的敏感性被其他药物所预报 问题6：为什么有的菌报告很多种药物，有的仅报告几种药物？ 报告的药物种类根据细菌种类的不同而有所不同，如铜绿假单胞菌报告的药物较多，而嗜麦芽窄食单胞菌报告的药敏较少。 问题7：是否能将所用的药都做药敏试验? 1.没有必要：通过耐药机制和标志性药物可以预测其他抗菌药物的敏感性 2.没有可能：不是所用药物都可以做药敏试验（需要药物在体外稳定，需要有操作标准和解释标准） 问题8：选择药敏报告敏感的药物，为什么临床治疗无效？ ①体外药敏试验只能预测体内治疗效果，并不等同；一般来说，耐药＝治疗无效；敏感≠治疗有效；
细菌耐药监测重要性及临床常见细菌的耐药性 魏莲花根据资料编辑整理 20世纪后期。抗菌药物的发现和应用控制了大多数由细菌引起的感染，明显降低了与感染相关的死亡率。但细菌耐药性的出现和传播使得某些抗菌药物逐渐失去其抗菌活性。抗菌药物耐药性的全球化，耐药菌株的传播，要求我们必须进行全球范围的细菌耐药性监测和研究工作。 一、细菌耐药性监测网 （一）国内细菌耐药性监测网 国内大型监测系统包括经上海复旦大学附属华山医院抗菌药物研 究所汪复教授为代表，有 14家医院参加的CHINET监测网；以北京大学临床药理李家泰教授和中国医学科学院北京协和医院陈民钧教 授分别代表中国细菌耐药监测研究组和医院内病原菌耐药性监测网，是国内跨地区细菌耐药性监测网网络，分别涵盖全国9个城市13家大型医院和10个城市32家医院；卫生部于2006年组织建立了卫生部细菌耐药监测网，参加单位已遍及全国29个省、市、自治区。我省于2009年成立了甘肃省细菌耐药监测网，目前有40家医院参加。以上监测网目的就是通过不同地区、不同级别的医院细菌耐药性监测数据收集和分析，阐明我国不同层次医院临床细菌分离株耐药性差异。 （二）国际细菌耐药性监测网 1994卫生组织总部传染疾病监测控制处理负责指导、协调各国的细菌耐药性监测工作。世界卫生组织细菌耐药性监测合作中心主任Thomas O′Brien教授启动了旨在收集全球细菌耐药性监测数据的WHONET系统。现国内、外多数监测网使用的分析软件属该系统。此外，约有315个医院和400多个实验室分别参加了美国医院感染监测系统（NNIS）和欧洲耐药性监测网（EARSS）。 二、常见细菌耐药性 抗菌药物的不合理应用导致耐药菌株引起的感染日趋增多。当前，细菌耐药性的监测/检测重点包括：（1）耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS）；（2）耐万古霉素的多重耐药的肠球菌(VRE)；（3）耐β-内酰胺类和大环内酯类的多重耐药和肺炎链球菌(PRSP)；（4）产超广谱β-内酰胺酶(ESBL S)及AmpC酶的革兰阴性杆菌；（5）非发酵糖菌群的
肺炎克雷伯菌 1.形态结构：肺炎克雷伯菌肺炎亚种为革兰阴性杆菌，无鞭毛，无芽孢，标本直接涂片 或在营养丰富培养基上的营养物可见菌体外有明显的荚膜。 2.培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，在初次分离培养基可形成较大、凸起灰白色黏 液型的菌落。菌落大而厚实、光亮，相邻菌落容易发生融合，用接种蘸取时可挑出长丝状细丝。在麦康凯琼脂（MAC）培养基上形成较大的黏液型、红色的菌落，红色可扩散至菌落周围的培养基中。在伊红美蓝琼脂（EMB）上为大、粘稠、红色、易融合成一片的菌落。在血琼脂上为灰白色、大而黏、光亮且形成菌丝的菌落。 3.生化特性：氧化酶阴性，葡萄糖产酸产气，动力阴性，吲哚阴性，脲酶阳性。 金黄色葡萄球菌 典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH 7.4。平板上菌
落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。在EMB培养基上基本不生长。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。 大肠埃希氏菌 1．形态与染色特性 菌体两端钝圆、中等大小，杆状(有时呈卵圆形)、1—3um X 0.6um、周生鞭毛，能运动，不产生荚膜，革兰氏阴性，而且一般是对碱性染料着色较好，但有时两端着色较浓，要与巴氏杆菌区分开来。 2．培养特性 1)需氧及兼性厌氧菌 2)对营养的要求不高，在普通琼脂上就生长良好，在15C-45℃范围内均可生长，但最适生长温度为37℃，最适pH为7.2—7.4。
临床常见非发酵菌分布特征及耐药性分析【摘要】目的监测临床常见非发酵病原菌的分布及耐药性的现状，为临床合理使用抗菌药物提供依据。方法临床标本按常规分离培养，用法国梅里埃ATB分析系统鉴定菌种，药敏试验数据采用K B 纸片法，按NCCLS规定的标准进行。结果从2006年10月至2008年6月共获得140株非发酵革兰阴性杆菌，其中列前3位的非发酵革兰阴性杆菌114株(占81.4%)，分别是铜绿假单胞菌75株(53.6%)，不动杆菌属22株(15.7%)，嗜麦芽寡养单胞菌17株(12.1％)，主要来源于痰、分泌物及中段尿。铜绿假单胞菌、不动杆菌属对亚胺培南、美罗培南、替卡西林／棒酸的耐药率均<20％，对阿米卡星、哌拉西林的耐药率在33%～43%；对三代头孢耐药率分别在37%～59%；嗜麦芽寡养单胞菌是非发酵革兰阴性杆菌中耐药率最高的菌株，其对亚胺培南天然耐药，对替卡西林／棒酸、哌拉西林/他唑巴坦、左氧氟沙星耐药率较低，均≤21％。结论非发酵革兰阴性杆菌是临床感染的主要病原菌之一，特别是铜绿假单胞菌、不动杆菌属、嗜麦芽寡养单胞菌，其耐药性差异有统计学意义。 【关键词】非发酵革兰阴性杆菌; 耐药性; 抗菌药物; 分析 【Abstract】 Objective To investigate the isolation and antimicrobial resistance of nonfermentative Gram negative bacmi(NFGNB) to provide laboratory evidence for clinically
selecting antibiotics．Methods All samples were identified by routine procedure and bioM
常见细菌的耐药趋势和 控制 WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-
常见细菌的耐药趋势和控制 北京大学第三医院宁永忠 细菌的耐药主要内容包括三个方面：一个是相关的基本知识；第二个是国内常见细菌耐药的现状和趋势；第三是耐药的控制。 一、相关的基本知识 首先我们来看一下基本的知识。第一我们来看一下微生物，微生物它就是肉眼看不见的一些微小的生物，它在微观的世界里有一个真实的存在。它会导致人类的感染，所以我们会称之为病原。目前临床上主要有四类微生物：病毒、细菌、真菌、寄生虫。这四大类微生物都出现了我们今天的主题--耐药，只不过它们的严重程度不一致而已。下面一个概念我们来看一下感染性疾病，它指的是微生物导致的有临床证据的这样一个疾病，这个临床证据包括症状、体征、免疫学反应和微生物学证据。在临床医学领域各个病种当中，感染性疾病的发病率最高。应该说我们所有的人都得过感染性疾病，感染性疾病很多时候还会表现为中、重度一个临床表现。这个时候是必须治疗的，因为不治疗预后不良，甚至会出现死亡。感染性疾病还有一个特点，就是有传播性，病原可以传播，感染性疾病的传播性甚至会影响到社会历史进程、影响到人类的行为和心理。这个是感染性疾病不同于其他临床医学病种的很重要的一个特征。刚才提到感染性疾病需要治疗，我们治疗用的特异性的药物就是抗微生物药物，它指的就是特异性的抑制、杀灭微生物的这样一些药物，在细菌领域里主要就是抗生素。目前抗微生物药物效力下降的主要的一个原因就是耐药，有些时候这个效力会完全消失。因此临床上治疗无效的时候，耐药是很主要的一个原因。 另外耐药涉及到的概念也比较多，比如说生物学耐药和临床耐药，环境介导的耐药和微生物介导的耐药，天然耐药和获得性耐药，这里面天然耐药和获得性耐药这一对概念比较重要，给大家展开说一下。天然耐药指的是这个菌种在鉴定到种的时候就可以明确的耐药，也就是说一个菌种内所有的菌株都具有的耐药的特点。这一类耐药特点，一般是人类在应用抗生素之前就已经存在的，是纯自然的情况下形成的一个耐药的特点。而获得性耐药，指的是这个基因在菌种的层面是不能够确定是否存在的，只有到具体的菌株的层面，同一个菌种内不同的菌株它的耐药性可能不同，有的菌株有这个耐药性，有的菌株没有这个耐药性。这一类耐药性基本上都是人类应用抗生素之后，在人类的抗生素使用的选择压力下产生的耐药。此外还有原发性耐药和继发性耐药，表型耐药和基因型耐药，交叉耐药和多重耐药，低水平耐药和高水平耐药，异质耐药性等等这些概念。
常见微生物标本的采集、处理与检测 标本采集的基本原则：尽早采集、根据可疑的病原体，选择不同采集时机和标本种类、在抗生素应用前采集、遵守无菌操作、正确保存和运送。容器应密封不易碎，标本不得污染容器的口和外壁。 1.血液标本正常人的血液是无菌的。当细菌侵入时可引起严重的菌血症或败血症。 一般情况下在患者发热初期或发热高峰时采集；持续性菌血症可随时采集；间歇性菌血症，应预测其体温上升期进行采血。一般在使用抗生素前采集2~3次；多部位采集，如两侧肘静脉或动、静脉同时采取；对于已使用抗生素而无法停止的患者，也应在下次用药前采取。在感染局部的附近血管中采血，可提高阳性率。采血量成人一般5~10ml，婴幼儿1~2ml。 采集的血液标本注入培养瓶中先进行增菌培养，培养基和血液标本量的比例应>10：1，将血液中的各类杀（抑）菌物质充分稀释。需氧菌常用培养基有胰酪蛋白大豆胨肉汤和葡萄糖酚红肉汤等，常加入对氨基苯甲酸（PABA）50μg/ml中和磺胺类，青霉素酶2单位/ml破坏青霉素类，硫酸镁中和链霉素、四环素、土霉素、金霉素、新霉素及多粘菌素等抗生素。加入0.03~0.05%的聚茴香磺酸钠（sodium polyanethol sulfonate, SPS）可抑制血清中的抗菌物质，并对氨基糖苷类和多肽类抗生素有灭活效果。并加入Ⅹ、Ⅴ因子等生长因子。 培养瓶每天观察一次。如发现①培养瓶内液体浑浊；②血球层上面出现颗粒状的生长物，并且有自下而上的溶血；③有明显的凝块；④液体表面有菌膜，培养液清晰或浑浊等，表明有细菌生长。直接进行涂片染色初步报告。同时分别接种血平板、巧克力（色）平板，普通培养和5%CO2 35℃培养。也可直接进行体外药敏试验。无细菌生长迹象的培养瓶孵育至第7d，接种血平板、巧克力（色）平板，分别进行普通培养和5%CO2环境35℃孵育24h。为了提高检出的速度，在培养的第2~3d时应移种一次。 有厌氧菌感染时，同时注入需氧瓶和厌氧瓶，厌氧培养基通常用硫乙醇酸盐培养基、牛心脑浸液肉汤等；培养液中有刃天青，无氧时无色，有氧时呈红色。需氧瓶和厌氧瓶同时浑浊，或需氧瓶无生长而厌氧瓶液体浑浊，提示厌氧菌生长。分别接种血平板和厌氧血平板，置需氧和厌氧环境中，如果都只生长1种细菌，则为兼性厌氧菌；如果仅在厌氧环境中生长，可以直接报告“有厌氧菌检出”。 若长期应用抗细胞壁类抗生素，应考虑细菌L型存在，将血液接种高渗培养基中，分别进行需氧、厌氧和5%CO2环境培养。每周移种2~3次于高渗固体培养基上，观察有无细菌L型菌落生长。 2.呼吸道标本 正常上呼吸道有正常菌群。下呼吸道正常情况下无细菌或仅有少量细菌侵入
临床应掌握的常见多重耐药菌 多重耐药菌（Multidrug-Resistant Organism，MDRO），主要是指对临床使用的三类或三类以上抗菌药物同时呈现耐药的细菌。常见多重耐药菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）、产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）细菌、耐碳青霉烯类抗菌药物肠杆菌科细菌（CRE）（如产Ⅰ型新德里金属β-内酰胺酶[NDM-1]或产碳青霉烯酶[KPC]的肠杆菌科细菌）、耐碳青霉烯类抗菌药物鲍曼不动杆菌（CR-AB）、多重耐药/泛耐药铜绿假单胞菌 （MDR/PDR-PA)和多重耐药结核分枝杆菌等。 一、MRSA：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。由于MRSA通常对其它耐酶半合成青霉素也耐药，因此美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐用苯唑西林来代替检测MRSA。苯唑西林在贮存过程中药效不易降低，且对不均一耐药性检测效果更好，所以国内多数实验室都采用苯唑西林（我院也是）。 1．MRSA的治疗 MRSA感染的治疗是临床十分棘手的难题之一，关键是其对许多抗生素有多重耐药。因其耐药机制是PBPs（青霉素结合蛋白）性质的改变，因此，MRSA几乎对所有的β-内酰胺类抗生素耐药，且在同时，还可能对大环内酯类抗生素、氨基糖苷类抗生素等多种抗菌药物表现出耐药性。目前最常用，也是疗效最肯定的抗生素为万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁等。其次，对于以上药物有禁忌症，或是不可耐受的患者，也可使用其他的抗菌药物，如夫西地酸钠。而在某些国家和地区，也可使用头孢吡普、替加环素、利奈唑胺、达托霉素等，均有较好的疗效。 2．MRSA预防 首先是合理使用抗生素。目前临床滥用抗生素的现象，对MRSA的流行起了一定的扩散作用，因此，在选择抗生素时应慎重，以免产生MRSA菌株，如对大手术后预防深部葡萄球菌感染，使用第一代和第二代头孢菌素为好(如头孢唑啉、头孢呋肟等)，第三代头孢菌素抗葡萄球菌效果反而不如第一代效果好。第三代头孢菌素的长期使用与MRSA的出现率呈平行关系。、3.早期检出带菌者 医院应加强对新入院及MRSA易感者的检查，尤其是烧伤病区、ICU、呼吸内科病房、血液科和儿科的病人。同时微检室应选用准确的检测手段，发现MRSA，及时向临床报告，以便控制感染和隔离治疗。 二、VRE：耐万古霉素肠球菌。 三、ESBLs+阳性菌为产超广谱β- 内酰胺酶的细菌，对大多数抗生素耐药，此时抗菌素的使用一般采用碳氢霉烯类+β- 内酰胺酶抑制剂的联合用药。 1．什么是ESBLs？ ESBLs是英文Extended—Spectyumβ—Lactamase缩写，中文意思是超广谱β—内酰胺酶，属质粒介导，它是当前抗生素出现的新的耐药趋势之一。 2．产ESBLs菌株的耐药特点？ 如果临床出现产ESBLs菌株，则对第三代头孢菌素（它们是头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮、头孢曲松等）耐药，及对单环酰胺类抗生素（氨曲南）耐药。ESBLs在实验室有一专门的检测方法，如果病人的药敏报告单已注明为产ESBLs 菌株，则表明已经实验室确证。如果病人药敏报告单未注明为产ESBLs菌株，三代头孢菌素和单环酰胺类抗生素中有一种MIC≥2ug/ml，或符合CAZ（头孢他定）
常见标本采集指南 起草日期：2013 年7月5 日生效日期2013年9 月1日批准人：丁正林 Ⅰ.目的：标本的采集是实验前质控的重要环节,直接影响到检验结果的可靠性和准确性,制定本采集指南是为了规范标本的正确采集,减少采集误差，有效提高检验质量。 Ⅱ.适用范围：适用于全检验科。 Ⅲ. 实施办法、程序： 一.静脉血采集 1.带上手套，并注意常规安全防护。 2.核对检验申请医嘱或检验申请单上的病人信息及检验项目是否吻合。 3.信息核对无误后绑定真空采血条码管，门诊病人可通过诊疗卡调出相应信息。 4. 受检者取坐位或卧位，前臂水平伸直置于抽血台枕垫上或病床上，选择容易固定、明显可见的肘前静脉或手背静脉，幼儿可用颈外静脉采血。 5.在穿刺点上方约6cm处系紧压脉带，嘱受检者紧握拳头，使静脉充盈显露。 6.用25g/l碘酊自所选静脉穿刺处从内向外、顺时针方向消毒皮肤，待碘酊挥发后，再用75%乙醇以相反方向脱碘，待干。 7.采血：拔除采血穿刺针的护套，以左手固定受检者前臂，右手拇指和十指持穿刺针，沿静脉走向使针头与皮肤成300角，快速刺入皮肤，然后成500角向前刺破静脉壁进入静脉腔，见回血后将刺塞针端（用橡胶管套上的）直接刺穿真空采血管盖中央的胶塞中，血液自动流入试管内，如需多管血样，将刺塞端拔除，刺入另一真空采血管中即可。达到采血量后，松压脉带，嘱受检者松拳，拔下刺塞端的采血试管，将消毒棉签压住穿刺孔，立即拔除穿刺针，嘱受检者继续按压针孔数分钟。抗凝血需立即轻轻颠倒混匀6-8次。 8. 将已使用过的针放入医疗硬器盒内。 附注: 1)采血部位通常选择肘前静脉，如此处静脉不明显，可采用手背、手腕、腘窝和外踝部静脉。幼儿可采用颈外静脉。 2) 压脉带捆扎时间不应超过1分钟，否则会使血液成分浓度发生改变。 3) 如果一次要求采血多管样本时，应按以下顺序采血：血培养蓝头管黑头管黄头管红头管橘黄头管绿头管紫头管灰头管 4)如采血时发生晕针，应立即拔出针头，让其平卧。必要时可用拇指压掐或针刺人中、合谷等穴位，或嗅吸芳香酊等药物，严重时立即送急诊室救治。 二、动脉血采集 1 填写血气检测申请单，并对病史、诊断和用药情况、抽血时体温、是否用氧及流量等进行填写。 2标本采集：选择股动脉、肱动脉或桡动脉穿刺点，经皮肤消毒后，用动脉采集专用针穿刺动脉血管，当动脉血压力推动空针活塞采集所需动脉血后。拨出针用小橡皮封针头，隔绝空气，立即将注射器放在手中双手来回搓动混匀防止凝固，并立即送检。 三、浆膜腔积液采集 由临床医生按相关操作规范采集。标本包括胸腔积液、腹腔积液、心包积液。 采集标本分三管留取，每管１-２ml。 第一管供细菌学检查，必须置于无菌管中，如浆膜腔积液培养。 第二管供化学及免疫学检查，如浆膜腔积液生化检查。 第三管供细胞学检查（置于帽为紫色的试管中抗凝），如浆膜腔积液常规检查。 四、脑脊液采集 由临床医生按相关操作规范采集。
临床常见细菌及其特点 一般分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌 一、革兰氏阳性球菌 主要包括葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属等 凝固酶阳性常见金黄色葡萄球菌 （一）葡萄球菌属表皮葡萄球菌 人型葡萄球菌 凝固酶阴性溶血葡萄球菌 腐生葡萄球菌 A：凝固酶阳性 金黄色葡萄球菌 (1)生物学特点：凝固酶阳性，β溶血，耐盐。 (2)传染源与传播途径：；金黄色葡萄球菌可存在于人类鼻咽部粘膜和皮肤表面，可经 手，打喷嚏，皮肤伤口传播。 (3)疾病：①金黄色葡萄球菌引起的食物中毒， ②化脓性感染中最常见的病原菌。皮肤和皮下组织感染如：疖痈、脓肿等 ③严重的肺炎 ④脑膜炎、心内膜炎等甚至败血症、脓毒血症等全身性感染、同时也可引起 中毒性休克综合症 ⑤接受血液透析治疗的晚期肾脏疾病患者特别容易感染金葡菌。 ⑥金葡菌尤其耐药金葡菌感染是引起住院患者感染和死亡的主要原因之一 (4)耐药性：耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA），对各类青霉素，头孢菌素和其他 β-内酰胺类均交叉耐药。mecA基因是MRS特有的耐药基因。 B：凝固酶阴性
（二）链球菌 （三）肠球菌属原属链球菌 常见为粪肠球菌和屎肠球菌 1、生物学特性：溶血或不溶血，触酶阴性 2、传染源和途径：胃肠正常菌群，伤口感染，机会感染的致病菌 3、致病：已作为医院感染重要的致病菌，国外上升为第3位的院感菌，泌尿道感染 比较常见 4、耐药性：（1）对头孢菌素，苯唑西林，单环类天然耐药，对青霉素敏感性较链球 菌低， 耐药由β-内酰胺类亲和力降低的低分子量的PBPs引起 （2）耐药性最严重的为耐万古霉素的VRE表型共有VanA、VanB、VanC、 VanD、VanE、VanG六型，最常见为VanA、VanB (3).屎肠球菌的耐药性较粪肠球菌高。
临床应掌握的常见多重耐 药菌 Revised final draft November 26, 2020
多重耐药菌（Multidrug-Resistant?Organism，MDRO），主要是指对临床使用的三类或三类以上抗菌药物同时呈现耐药的细菌。常见多重耐药菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）、产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）细菌、耐碳青霉烯类抗菌药物肠杆菌科细菌（CRE）（如产Ⅰ型新德里金属β-内酰胺酶[NDM-1]或产碳青霉烯酶[KPC]的肠杆菌科细菌）、耐碳青霉烯类抗菌药物鲍曼不动杆菌（CR-AB）、多重耐药/泛耐药铜绿假单胞菌 （MDR/PDR-PA)和多重耐药结核分枝杆菌等。 一、MRSA：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。由于MRSA通常对其它耐酶半合成青霉素也耐药，因此 美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐用来代替检测MRSA。苯唑西林在贮存过程中药效不易 降低，且对不均一耐药性检测效果更好，所以国内多数实验室都采用苯唑西林（我院也是）。 1．MRSA的治疗 MRSA感染的治疗是临床十分棘手的难题之一，关键是其对许多抗生素有多重耐药。因其耐药机制是PBPs（青霉素结合蛋白）性质的改变，因此，MRSA几乎对所有的耐药，且在同时，还可能对、等多种抗菌药物表现出耐药性。目前最常用，也是疗效最肯定的抗生素为、、等。其次，对于以上药物有禁忌症，或是不可耐受的患者，也可使用其他的抗菌药物，如。而在某些国家和地区，也可使用、、、等，均有较好的疗效。 2．MRSA预防 首先是合理使用抗生素。目前临床滥用抗生素的现象，对MRSA的流行起了一定的扩散作用，因此，在选择抗生素时应慎重，以免产生MRSA菌株，如对大手术后预防深部葡萄球菌感染，使用第一代和第二代头孢菌素为好(如头孢唑啉、头孢呋肟等)，第三代头孢菌素抗葡萄球菌效果反而不如第一代效果好。第三代头孢菌素的长期使用与MRSA的出现率呈平行关系。、3.早期检出带菌者 医院应加强对新入院及MRSA易感者的检查，尤其是烧伤病区、ICU、呼吸内科病房、血液科和儿科的病人。同时微检室应选用准确的检测手段，发现MRSA，及时向临床报告，以便控 制感染和隔离治疗。 二、VRE：耐万古霉素肠球菌。 三、ESBLs+阳性菌为产超广谱β-内酰胺酶的细菌，对大多数抗生素耐药，此时抗菌素的使用一 般采用碳氢霉烯类+β-内酰胺酶抑制剂的。 1．什么是ESBLs？ ESBLs是英文Extended—Spectyumβ—Lactamase缩写，中文意思是超广谱β—内酰胺酶，属介导，它是当前抗生素出现的新的耐药趋势之一。 2．产ESBLs的耐药特点？ 3． 如果临床出现产ESBLs菌株，则对（它们是、、、等）耐药，及对单环酰胺类抗生素（）耐药。ESBLs在实验室有一专门的检测方法，如果病人的药敏报告单已注明为产ESBLs菌株，则表 明已经实验室确证。如果病人药敏报告单未注明为产ESBLs菌株，三代和单环酰胺类抗生素中有一种MIC≥2ug/ml，或符合CAZ（头孢他定）≤22mm、（氨曲南）≤27mm、CTX（头孢噻肟） ≤27mm、（头孢曲松）≤25mm其中一个，则提示菌株可能产超广谱β—内酰胺酶，这种情况下，即使实验室报告为敏感的第三代头孢菌素和单环酰胺类抗生素，在临床也不推荐使用。 4．哪些细菌容易产生ESBLs？ 目前（大肠杆菌）、肺炎是最常见ESBLs菌株的细菌，其次，阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、弗劳地枸橼酸菌、也可出现产ESBLs菌株的细菌。 5．细菌为什么会产生β—内酰胺酶？ 由于菌株产生β—内酰胺酶水解青霉素G和。细菌所产生的重要抗生素灭活酶主要有β—内酰胺酶和氨基糖类抗生素酶。β—内酰胺酶能青霉素族和头孢菌素族抗生素的基本结构β—内酰
肠道菌群粪便涂片检查—用于菌群失调的诊断和防治理论和基础 一、粪便直接涂片的优缺点： 1、优点：①设备简单②操作简单③时间短④形象直观，直接了解粪便菌群的“像”，熟练者对诊断菌群失调有较高的准确性。 2、缺点：①检验者必须有一定的经验，否则易判断错误②主要是定性检查，确定分度较困难。 二、操作技术： 1、涂片将新鲜大便直接涂抹在洁净的玻片上，粪便不可稀释以防细菌变形。标本务求新鲜，涂片厚薄适宜。 2、外观肉眼检查外观颜色、形状（若含有膜状物的大便应补做艰难梭菌培养）。 3、镜检染色技术是诊断准确成功的关键，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌要对比鲜明。镜检时应将涂片视野全面观览，切不可看几个视野就计数或报告。 三、检查方法： 1、细菌总数：观察菌群涂片首先要总览细菌总数。了解涂片上细菌的数量是增多还是减少，有无优势菌或真菌。细菌总数过多的情况较少见或不易引起重视。菌群失调时细菌总数多在正常、减少或消失。 细菌总数评定标准 每油镜视野细菌数评价 ＜10显著减少 11—100明显减少 101—500略微减少 501—5000正常 ＞5000增多 2、观察革兰氏阳性、阴性杆菌及球菌的比率改变 革兰氏阳性杆菌：革兰氏阴性杆菌：革兰氏阳性球菌：革兰氏阴性球菌（包括球菌/杆菌）比率反映了粪便菌群的质素，它一般不受粪便稀释或浓缩的影响，所以较细菌总数有更大的意义，更能反映菌群的本质和预后。 选定有代表性视野中的部分区域作细菌分类计数，需要数100—200个细菌以求得比例。不同年龄的人的比例都不一样，一般杆菌与球菌比例约为75：25。 各年龄组细菌比率平均值的正常参考值（%） 年龄革兰氏阳性杆菌革兰氏阴性杆菌革兰氏阳性球菌革兰氏阴性球菌 1d30.7—61.538.5—60.90—2.20—0.01 2d60.0—71.634.8—36.93.0—3.50—0.01 3d66.9—82.716.0—31.41.3—1.60—0.05 4d79.2—86.212.4—19.21.4—1.70—0.1
临床常见微生物标本采集方法 血培养标本采集方法 一、概述 当微生物侵入血液迅速繁殖超出免疫系统清除这些微生物的能力时形成菌血症或真菌菌血症。血液和骨骼的细菌学培养对菌血症的诊断具有重要意义。 临床菌血症按病程可分为一过性菌血症、间歇性菌血症、持续性菌血症。菌血症患者多为间歇性菌血症，病原菌周期性出现在血液中，随之为无菌时期。不管临床症状经历的严重程度，患者血液中病原菌浓度相当低，因此要求临床多次采集血液标本进行培养，但24小时内一般不超过3次。菌血症是临床医学急症，应尽快采集血液进行培养。 二、采集指征 发热(大于等于38°)或低体温(小于等于36°)，寒战，白细胞计数增多(大于10×109L，特别有核左移时)，皮肤黏膜出血、昏迷、多器官衰竭，血压降低，C反应蛋白升高及呼吸加快，血液病患者出现粒细胞减少、血小板减少等。 当患者同时具备上述几种体征而临床可疑菌血症时，应采集血液培养。新生儿可疑菌血症可增加尿液和脑脊液培养。 对入院危重感染患者应在未进行抗菌药物治疗之前及时做血培养。 三、采集方法 1、物品准备：专用血培养瓶【一套血培养包括需养血培养瓶（蓝色帽）、厌氧血培养瓶（红色帽）】、棉签、碘伏、压脉带、20ml注射器、橡胶手套。 2、操作流程：配戴帽子口罩，手消毒，核对检验申请单和患者。选择采血部位，清洁消毒采血部位皮肤，松开压脉带，打开血培养瓶塑料盖用75%酒精或0.5%碘伏消毒血培养瓶橡皮塞，用0.5%碘伏从穿刺点向外画圈消毒，消毒区域直径达5厘米以上，涂擦穿刺皮肤两
遍，作用2分钟待干燥。对碘过敏者可以用75%酒精消毒，待酒精挥发干燥后采血。用无菌注射器抽取血液从橡皮塞处注入血培养瓶内，混匀以免血液凝固（采血量：成人采血量是每瓶10ml，小儿2-5ml。其中新生儿约0.5ml左右，一般只抽一瓶需养瓶进行培养，无需常规做厌氧瓶。）立即送检（全自动血培养的专用培养瓶注入血液后不需再消毒瓶塞，也不用再盖塑料盖，直接送检）。 四、血培养次数和采血时问 1、采血应该尽量在使用抗菌药之前进行，在患者发热期间越早越好，以发热高峰前1小时内或病人寒战和发热开始时采集为宜。在30-60分钟内或同时于不同部位采集2-3份血标本(一次静脉采血注入到多个培养瓶中视为单份血培养)。在采取血培养后的2-5天内，不需要再重复采血培养，因为进行治疗后的2-5天血液中的感染细菌不会马上消失。 2、怀疑导管相关血流感染时根据是否保留血管内导管采取不同采集方法： 保留导管：中央导管采血1套加外周静脉采血1-2套。 不保留导管：从外周静脉采血1-2套培养，加中央导管尖端段5cm进行半定量培养。 中央导管采血方法：夹闭中央导管，使用75％乙醇消毒中央导管接头2遍，待干，采血。 中央导管尖端段5cm采集方法：穿刺部位使用皮肤消毒剂消毒后拔除中央导管，使用无菌剪刀剪去导管尖端5cm置入干燥试管或血琼脂营养平皿送检。切勿放入营养肉汤管中送检。 五、操作注意事项 1、从静脉采血，不建议从动脉采取，在穿刺前或穿刺期间，为防止静脉滑动，可戴乳胶手套固定静脉，但不可接触穿刺点。 2、用注射器无菌采血后勿换针头直接注入消毒后的血培养瓶。 3、多次采血应在不同部位的血管穿刺以排除皮肤菌丛污染的可能。
随着抗生素的广泛使用，耐药菌株已成为引起临床感染较为常见的病原菌。特别是医院内耐药菌株的感染使病死率大幅增加，其治疗已成为临床上的难题。现对临床常见耐药菌及抗菌药物研究进展进行简单介绍。 1 临床常见耐药菌 目前临床常见的重要耐药革兰阳性菌有耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA）、对青霉素耐药的肺炎球菌（PRSP）和万古霉素耐药的肠球菌（VRE）。我国各地报道耐中氧西林金葡菌（MRSA）感染发生率在20%～80%之间，耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS）引起的感染也明显增多。耐药革兰阴性杆菌主要有：产超广谱β内酰胺酶（extended-spectrum betalactamases,ESBLs）的肺炎克雷伯杆菌、大肠杆菌，具有多重耐药特性的铜绿假单胞菌、不动杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌，此外，耐氟康唑的念珠菌、耐药的结核杆菌的比例也在增加。 肺炎链球菌是社区获得性脑膜炎、中耳炎、菌血症的常见病原菌，多年来青霉素一直是治疗肺炎链球菌感染的首选药物，但自从20世纪70年代出现耐青霉素的肺炎链球菌报道以来，其分离率已在世界范围明显上升，特别是在某些欧洲国家、美国一些地区、东南亚某些国家和地区，PRSP分离率已高达40%～50%。PRSP分离率上升与β-内酰胺类抗生素如头孢菌素与非β-内酰胺类抗生素如大环内酯类等抗生素大量使用及某些治疗方案不合理有很大关系，例如头孢曲松对PRSP有很强抗菌作用，但如单剂治疗，使治疗后的血药浓度虽高于抗敏感肺炎链球菌但低于抗耐药肺炎链球菌的浓度，这样治疗呼吸道感染结果PRSP分离率明显高于对照组阿莫西林/克拉维酸10d治疗后的PRSP分离率。治疗PRSP感染，制定合理治疗方案十分重要。 由于畜牧业大量使用糖肽类药物，使多种动物产生VRE。而临床上广泛使用糖肽类药万古霉素治疗革兰阳性菌株感染，更加使VRE引起院内感染的比例迅速上升。近年来对万古霉素或其他糖肽类药物中度耐药的金黄色葡萄球菌（vancomycin or other glycopeptide intermediately resistant Stap hylococcus aureus,VISA/GISA）及万古霉素依赖性肠球菌 （vancomycin-dependent enterococci,VDE）引起的感染呈增多趋势，临床治疗更加困难，虽可通过体外试验测定最小抑制浓度（MIC），从而遴选出有效的药物，但加强耐药株的监测，严格实施感染控制和合理应用药物尤为重要。 有些病原菌可对多种抗菌药物耐药或高度耐药，如鲍曼不动杆菌及嗜麦芽窄食单胞菌（stenotrophomonas maltopailia）。嗜麦芽窄食单胞菌是一个在环境中广泛存在的非发酵革兰阴性菌，亦可寄居于人的呼吸道和肠道中，为条件致病菌，容易在患有严重基础性疾病的住院患者中发生感染，病死率较高，对碳青霉烯类抗生素天然耐药。近年来嗜麦芽窄食单胞菌分离率逐渐增高，成为医院感染的重要致病菌，可引起呼吸道、消化道感染，心内膜炎及败血症等。高龄、严重的基础疾病、应用广谱抗生素、免疫抑制剂和机械通气等是感染的易感因素，其病死率高。 随着头孢菌素的广泛使用，阴沟肠杆菌（enterobacter cloacae）已成
痰液标本细菌学检验（一） 关键词：细胞库菌株培养中心 atcc 北京标准物质网 一、检验程序 痰及呼吸道标本的细菌学检验程序见图34—1。 二、检验方法 (一)显微镜检查 1．一般细菌涂片检查挑取标本中脓性或带血部分涂片进行革兰染色镜检，描述观察到的细菌的染色性、形态及排列等特征，可发出初步报告。 2．结核分枝杆菌涂片检查挑取标本干酪样或脓性部分做抗酸染色和金胺“O”荧光染色，前者用油镜，后者用荧光显微镜检查。具体操作详见第十五章分枝杆菌属检验。 3．放线菌及诺卡菌涂片检查将痰液用生理盐水反复洗涤数次，挑取黄色颗粒(硫黄颗粒)或不透明着色斑点，置玻片上并覆以盖玻片，轻压后置高倍镜下观察。如见中央为交织的菌丝，其末端粗杆呈放线状排列时揭去盖玻片，待干后做革兰染色及抗酸染色镜检。 4．下呼吸道其他标本检查支气管肺泡灌洗液等直接取自下呼吸道的标本，不易受上呼吸道杂菌的污染，涂片检菌的意义较大。可取离心沉淀物进行革兰染色与抗酸染色检查。 (二)培养和鉴定 1．痰培养标本的前处理于痰标本中加入一定量无菌生理盐水，剧烈振荡5～10秒后，将沉淀于管底的脓痰小片取出，置于另一试管中，同法再处理2次，可洗去痰中的正常菌群。然后向洗涤过的痰液中加入等量pH 7. 6的1％胰酶溶液，放置35℃环境90分钟，使痰液均质化后备用。 2．培养基与培养环境 (1)血琼脂平板：适用于分离多种细菌，需氧环境，可分离β-溶血性链球菌，葡萄球菌；置于5％CO 环境培养，分离肺炎链球菌和β-溶血性链球菌。根 2
据血琼脂平板生长的菌落特征及镜检形态，得出初步结果，再按各类细菌特性做进一步鉴定。 环境培养，常用于分离嗜血杆菌和脑膜 (2)巧克力色琼脂平板：置于5％CO 2 炎奈瑟菌等有特殊营养需求的细菌。 (3)中国蓝琼脂平板／麦康凯平板：需氧环境培养，常用于分离肠杆菌科细菌。 (4)TTC-沙保弱培养基：需氧环境培养，用于分离白假丝酵母菌及其他酵母菌、诺卡菌、放线菌以及烟曲霉菌等。 (5)厌氧血平板：厌氧环境培养，用于培养厌氧菌。 环境培养，改良罗氏培养基、 (6)结核分枝杆菌培养基：需氧或5％～10％CO 2 米氏7H10培养基或其他合适的培养基，用于培养结核分枝杆菌。 (7)军团菌专用培养基：置于2．5％～5. 0％CO 环境培养，药用炭酵母琼 2 脂(CYE)培养基、F-G琼脂，用于培养军团菌。 3．标本的培养 (1)普通细菌培养：将处理后的痰标本接种于血琼脂平板、中国蓝琼脂平板 环境／麦康凯平板、巧克力色琼脂平板上，分别放入普通环境和5％～10％CO 2 中，35℃培养18～24小时，观察菌落特征，并涂片进行革兰染色，根据菌体的形态特点做进一步鉴定。有条件或必耍时进行厌氧培养。具体操作详见第十七章厌氧性细菌检验。 (2)结核分枝杆菌培养：将处理后的痰标本接种于改良罗氏培养基或米氏 环境中培养。根据初步生长出菌落时间和7H10培养基，置35℃、5％～10％CO 2 是否产生色素等特点，加以判定。 (3)标本的菌落计数培养：液体标本，如保护性支气管肺泡灌洗吸出液(PBAL)、气管穿刺抽吸液(TTA)、保护性标本刷洗液(PSB)标本或定量稀释均质化处理的痰标本，可做菌落计数培养。 常用的改良Gould法是一种半定量的方法，先将平皿分为A、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等4个区，阻3mm接种环取一满环液化痰液(或定量采集的PBAL、TTA、PSB)接种于血琼脂平板或巧克力色琼脂平板，先在A区画线20~40条，然后在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区分别画线4条。在做Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分区画线前，接种环均须经烧灼灭菌。接种后的