细胞内AhR 信号转导通路的机制研究*
庞朋沙
过倩萍
伍会健△
（大连理工大学生命科学与技术学院辽宁大连116024）
摘要：芳香族化合物受体（(Aryl hydrocarbon receptor,AhR ）是一个属于碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix (bHLH)）Per-Arnt-Sim 同源域(Per-Arnt-Sim homology domain (PAS))家族的转录因子。在外界环境激素2,3,7,8-四氯-二苯并-对-二恶英（2,3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,2,3,7,8-TCDD ）的刺激下，AhR 从细胞质中转运入细胞核中，与另一个蛋白AhR 核转运蛋白(AhR nuclear transportor ，ARNT)结合，形成异二聚体，结合在下游靶基因上，使相应基因，如细胞色素(cytochrome P4501A1/cytochrome P4501B1,CYP1A1/CYP1B1)等异常表达，从而干扰动物的内分泌，引起免疫毒性，甚至导致癌症的发生。AhR 的激活过程，涉及多种蛋白修饰的变化，如磷酸化、泛素化等，这些修饰调控了蛋白的定位、活性、稳定性等。AhR 信号转导通路，与其他的很多通路，如E2-ER,MAPK 通路等相互交叉。本文旨在描述细胞内AhR 通路的激活过程，功能，以及与其他通路之间相互的调控作用，以期为TCDD 引发的相关疾病的预防和治疗提供思路。关键词：AhR ；TCDD ；磷酸化；泛素化
中图分类号：Q78文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2010）
13-2567-04Biological Role of AhR Signaling Pathway*
PANG Peng-Sha,GUO Qian-Ping,WU Hui-Jian △
(School of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian,116024,China)
ABSTRACT:AhR (Aryl hydrocarbon receptor)is a transcription factor belongs to the basic helix-loop-helix (bHLH)Per-Arnt-Sim homology domain (PAS)family.When binds with the ligand 2,3,7,8-TCDD (2,3，
7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin),AhR is activated and translocates from cytoplasm to nuclear,forming heterodimer with ARNT (AhR nuclear transportor)and binding to DNA elements and leading to abnormal expression of the target genes such as CYP1A1/CYP1B1(cytochrome P4501A1/cytochrome P4501B1),which finally causes several diseases including cancer.There are several modifications during the activation of AhR,including phosphorylation and ubiquitination and so on,which are related to the localization,activity and stability of proteins.AhR signal pathway also cross-talks with E2-ER and MAPK pathways.This article aims to describe the activation and functions of AhR,and the interactions with other path-ways,hoping to give insights into the prevention and therapy of diseases caused by TCDD.
Key Words:AhR ；TCDD ；Phosphorylation ；Ubiquitination Chinese Library Classification:Q78Document code:A Article ID:1673-6273(2010)13-2567-04
*基金项目：国家自然科学基金(30670409；30771221)，科技部863计划(2006AA02Z120)作者简介：庞朋沙(1987-)，女，硕士研究生，主要研究方向：乳腺癌的发病机制，电话：
+86-411-84709105，E-mail:pangpengsha126@https://www.doczj.com/doc/9714534813.html, △通讯作者：伍会健，电话：+86-411-84706105，传真：+86-411-84706105，E-mail:wuhj@https://www.doczj.com/doc/9714534813.html, （收稿日期：2010-05-05接受日期：2010-05-31）
前言
二恶英(Dioxin)，是一种无色无味具有强毒性的环境污染物，主要来源于城市和工业垃圾的焚烧。二恶英由两大类有机化合物组成，分别是多氯二苯并二恶英（polychlorinated diben-zo-p-dioxin ，PCDDs ）和多氯二苯并呋喃（polychlorinated diben-zofuran ，PCDFs ）。由于脂溶性的性质，二恶英极易在人体内富集，对人类健康造成极大的威胁。
在众多的二恶英当中，以2,3,7,8-四氯-二苯并-对-二恶英（2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,2,3,7,8-TCDD ，以下简称TCDD)的毒性最强。其毒性主要表现为：
干扰机体内的分泌，阻遏免疫系统。此外，TCDD 还有极强的致癌性，可引发软组织癌等在内的多种肿瘤。根据动物实验与流行病学研究的结果，国际癌症研究机构（IARC ）在1997年的时候将TCDD 确
定为I 类人类致癌物。
在防治二恶英对人体造成毒害的过程中，一方面应该采取措施减少二恶英的产生，另外一方面，为治疗二恶英已造成的疾病，对二恶英引发疾病机制的研究势在必行。TCDD 对人体的毒害作用主要是由转录因子AhR 介导的。
1AhR 的结构定位与激活过程
AhR 在脊椎动物中存在两个亚型AhR1和AhR2。AhR1最初在小鼠中被发现，之后被证明在所有的脊椎动物中均有表达，AhR2只在鱼类中表达。因此，我们通常所研究的AhR 指的是AhR1。
AhR 是一个碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix (bHLH)）Per-Arnt-Sim 同源域(Per-Arnt-Sim homology domain ，PAS)蛋白，属于bHLH 超家族的转录因子。AhR 发挥作用时，
需要与另一个bHLH 家族成员ARNT 形成二聚体，才能实现激活的作用。
人源的AhR 由848个氨基酸组成，从N 末端往C 末端分为3个区域(图1)：
bHLH 域、PAS 域和转录激活域（transactivation domain,TAD
）。bHLH 域又分为碱性域和HLH 域，碱性域主要介导蛋白与DNA 的作用，HLH 域介导AhR 与其他蛋白的二聚化，并决定二聚化蛋白的特异性。PAS 域包含两个疏水的重复序列A 和B ，作为AhR 与ARNT 二聚化的界面，也影响靶DNA 的构象[1]。AhR 的TAD 域主要介导AhR 对下游基因的转录激活。
在未与配体结合的情况下，大部分AhR 定位于细胞质中，与热激蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)二聚体及乙型肝炎病毒X 蛋白结合蛋白2(hepatitis B virus X protein-associated protein 2,XAP2)结合，形成复合物。HSP90的结合使AhR 维持在一种非活化的、可与配体结合的状态。HSP90也与新合成AhR 的起始折叠有关，起稳定AhR 构象及抑制AhR 与ARNT 二聚化的作用。
XAP2一方面改变AhR 被入核蛋白importin β识别的能力，使AhR 锚定在细胞骨架（肌动蛋白丝）上，定位于细胞质中；另一方面抑制AhR 的泛素化降解，从而增强AhR 的转录活性。AhR 在细胞质中的定位，与自身序列上的核输出信号(nuclear export signal,NES)相关。AhR 的序列中存在两个NES ，分别位于bHLH 和PAS 域。配体非结合和结合的AhR 会利用不同的NES ，
前者利用的是PAS 域中的NES ，后者利用的是bHLH 域中的NES 。AhR 在细胞质中的定位，促进其自身的降解循环，而XAP-2抑制这种泛素化降解，
使AhR 蛋白稳定[2]。除HSP90和XAP2外，
AhR 复合物中还包括其他的蛋白因子，如p23等，p23增强AhR 与DNA 的结合能力，并促进基因的转录。
AhR 与配体TCDD 结合后，与HSP90解离，转运入细胞核中。这个过程与AhR N 末端的核输出信号(nuclear localization signal,NLS)相关。由于该NLS 与bHLH 有部分重叠，所以无配体结合时，被HSP90所掩蔽。HSP90的解离，使AhR 的NLS 暴露出来，与入核复合物结合，转运入核,再与细胞核中的ARNT 形成二聚体，结合到靶基因的DNA 基序生物异源物质效应元件(xenobiotic-responsive element ，XRE ，也称为DRE )上，启动下游基因的转录（图2）。关于细胞质中的AhR 如何与细胞核中的ARNT 形成异二聚体，目前存在两种理论。第一种理论认
为：配体与AhR 结合后，复合物中的其他成分解离出来，游离的AhR 进入细胞核中与ARNT 结合。
第二种理论认为：配体的结合，引起整个AhR 复合物转运到细胞核中。当AhR 与ARNT 相互作用后，复合物中的其他成分才解离[3]。而多数人更倾向于前面一种。
ARNT 是一种组成型的细胞核蛋白，也属于bHLH PAS 蛋白家族[2](图1)。除了与AhR 形成异二聚体外，也可形成同二聚体，或与缺氧诱导因子1a (hypoxia-inducable factor 1a,HIF1a)形成HIF1a/ARNT 异二聚体，参与缺氧所诱导的反应。由于结构上与HIFa 相似，
ARNT 也被称为HIF β。AhR 与ARNT 形成的二聚体识别并结合靶基因的XRE ，召募一系列的辅激活因子，如p300/CREB 结合蛋白(p300/CREB-binding protein,p300/CBP),ER 相关蛋白140(ER-associated protein 140,ERAP140),类固醇受体辅激活蛋白11(steroid receptor coactivator-1,SRC-1)，和受体作用蛋白140(receptor-interacting protein 140,RIP140)等[4]，进而调控一系列基因的表达。这些基因主要包括细胞色素CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1，环氧酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)。另外，AhR 阻遏蛋白(AhR repressor,AhRR)也会被AhR 激活表达。AhRR 在结构上与AhR 相似，都由bHLH 和PAS 域组成，但不具备转录活性。作为阻遏蛋白，
它一方面与AhR 竞争，同ARNT 形成无活性的异二聚体AhRR-ARNT ；
另一方面，AhRR-ARNT 竞争性地结合到靶基因上，抑制了AhR-ARNT 对基因的转录，从而起到反馈阻遏的作用[5]。
2AhR 的修饰方式
2.1AhR 的磷酸化修饰
AhR NLS 上有3个蛋白激酶C (protein kinase C,PKC)的磷酸化基序：S12、T22、S36。其中S12和S36的磷酸化，对AhR 的入核起负调控作用，并且影响AhR 与DNA 的结合能力。NES 附近残基的磷酸化，可调节AhR 在细胞中的定位。丝裂原活化的蛋白激酶p38(p38mitogen-activated protein kinases ，p38)对AhR NES 中S68的磷酸化，就可使AhR
从细胞质向细
图1人源AhR 和ARNT 的结构图Fig 1The structure of human AhR and ARNT
图2TCDD 对于AhR 的激活过程Fig 2The activation of AhR by TCDD
胞核中转运。AhR入核之后，S36又重新被磷酸化，增强的AhR/ARNT/XRE活性，促进基因的转录[6]。
AhR的磷酸化不仅与上游的激酶相关，也受到自身氨基酸的影响。研究表明，AhR的Y9，虽然不是磷酸化残基，但是对于DNA结合是必需的。如果将其突变为F，会削弱AhR对XRE 的结合，降低AhR对靶基因的转录。这可能是因为Y9在PKC 对S/T的识别中具有重要的作用，促进PKC对AhR的磷酸化，从而在AhR的活性调节上具有关键作用。
2.2AhR的泛素化修饰
活化的AhR诱导靶基因转录后，很快进入降解阶段。在体外，小鼠肝细胞和hepatama细胞中，位于细胞质的AhR可由Ca2+依赖的方式、经calpain II-like蛋白酶降解。完整的细胞中，TCDD诱导的AhR降解是由26S蛋白酶体介导的，使AhR 的半衰期由28h降至3h，对活化的AhR起负调控的作用。而TCDD不影响ARNT的稳定性。
AhR的泛素化位点位于TAD域。泛素化降解部分依赖于AhR/ARNT异二聚体的形成，以及该异二聚体与DNA的结合[7]。除了作为泛素化的靶蛋白之外，AhR在介导其他蛋白的泛素化过程中也起着重要的作用。研究表明，当AhR被3-甲基胆蒽(3-Methylcholanthrene，3-MC)或TCDD激活后，使雌激素受体a（estrogen receptor a,ERa）、ERβ、雄激素受体（androgen recep-tor，AR）的蛋白水平剧烈下降，负调控性激素信号通路[8]。
3-MC刺激后，细胞内可形成CUL4B-AhR复合物，该复合物由受损DNA结合蛋白1（damaged-DNA-binding protein1, DDB1），AhR，ARNT，转导素-β样蛋白3(transducin-β-like3, TBL3)，滞蛋白(cullin4B，CUL4B，泛素连接酶的核心成分)和环结构蛋白1(RING-box protein1，Rbx1)组成。活化的AhR作为具有底物特异性的接头蛋白，将ERa、AR等募集到复合物中，起泛素E3连接酶的作用，促进这些性激素受体的泛素化降解[9]。
3AhR通路与其他通路的交叉
3.1AhR通路与E2-ER通路的交叉
ARNT可作为ERα和ERβ依赖的转录辅激活因子。这种辅激活的作用主要是通过ARNT与ER的直接作用介导的，并且依赖于ER配体结合域。通过这种作用，ARNT被募集到ER的靶基因上，起到辅激活的作用。但是只有当E2存在时，ARNT才具有较强的增强转录的作用。
以TCDD与E2共刺激时，ERα促进AhR下游靶基因的转录。这是因为ERα被募集到AhR的复合物中，促进AhR的转录活性。与之相应，ERα与自身靶基因的结合减弱。有研究表明，E2可增强ERα和Sp1的相互作用，引起酰基甲酰磷酸合成酶/天冬氨酸转酰基甲酰转移酶/氨甲酰天冬氨酸脱水酶（carbamyl phosphate synthetase,aspartate transcarbamylase and dihydroorotase,CAD）基因的表达。被TCDD活化的AhR，抑制了ERα-Sp1的相互作用，并将ERα募集到AhR应答基因的启动子上，抑制CAD基因的表达[10]。
3.2AhR通路与与MAPK通路的交叉
丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)通路主要包括胞外信号调节激酶(extracellular sig-nal-regulated kinase1/2,ERK1/2)，p38和c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路。TCDD可同时激活这3个通路。一方面，ERK活性增强AhR配体起始的转录活性，另一方面，ERK对AhR C末端的磷酸化，促进AhR的泛素化降解[11]。
p38参与调节AhR的细胞内定位，如对AhR NES中S68的磷酸化促使蛋白由细胞质转运入核。但p38MAPK信号通路并不参与TCDD对CYP1A1mRNA的诱导。研究表明，往Hepa-1细胞中转入MKK3/6无活性突变体,并不会影响TCDD 对CYP1A1报告基因的诱导作用。转入p38无活性的突变体p38DN与转入p38产生的效果也是一样的。虽然p38的抑制剂，如SB203580、SB202190或SB202474，不论能否抑制p38的活性，均可以阻遏TCDD对小鼠Hepa-1和人Hepa-2细胞的CYP1A1-mRNA以及人MCF-7的CYP1B1-mRNA的诱导作用。但这些抑制剂对于CYP1A1基因转录的阻遏作用不是由于对p38酶活性的抑制引起的，而是因为它们可阻遏一些具有组蛋白乙酰化转移酶活性的辅激活子的募集，而这些因子对CYP1A1-mRNA的转录是必需的[12]。
尽管采用MAPK各成员的抑制剂，都可抑制活化的AhR 对CYP1A1的诱导，但是MAPK通路参与AhR通路的具体机理尚不清楚，因为这些通路的抑制剂，也多少能够抑制配体到AhR的结合，也就无法确定是否是MAPK的酶活性参与到了AhR信号通路中。
4AhR的功能
4.1干扰内分泌
AhR与性激素通路相互交叉，一方面，被TCDD活化的AhR将性激素受体ER和AR募集到CUL4B-AhR复合物中，起泛素E3连接酶的作用，促进这些受体的降解。另一方面，通过相互作用，活化的AhR将激素受体召募至自身的靶基因上，从而使ER和AR对于雌激素和雄激素的应答减弱。在雌性动物中引发卵巢功能障碍、不孕、胎仔减少、流产，在雄性动物中引发精细胞减少、成熟精子退化、雌性化。
4.2阻遏免疫系统
在实验室的啮齿动物模型中，不论是快速或慢性地接触低剂量的TCDD，都会阻遏动物中体液或细胞免疫。另外，TCDD 也能够增加动物对一些感染性疾病的易感性，削弱对移植肿瘤的排斥，并且加快肿瘤的生长及转移，这些作用都是通过对免疫系统的改变造成的。
TCDD的免疫毒性可能通过非淋巴组织诱导，并且这种诱导作用不是直接的。其可能的机制为：1，TCDD通过AhR影响内分泌系统，而该系统能够产生调节免疫系统的激素；2, TCDD的这种免疫阻遏作用的关键的、AhR依赖的目标是由骨髓细胞衍生的淋巴或骨髓细胞。
4.3致癌
苯并芘(Benzo[a]pyrene,B[a]P),是环境中的污染物之一，可结合到AhR上，在多种动物种类中引发皮肤癌等癌症。研究表明，AhR下游的基因产物CYP可以将B[a]P分解成为具有基因毒性的产物，从而诱发癌症。
另外，紫外线UV也与癌症的引发相关，其照射色氨酸所产生的光电子产物，对于AhR具有很高的亲和力，被看作是
AhR的内源性配体。UVB部分(280-315nm)对于皮肤癌的引发具有相当高的效率。在小鼠的皮肤和人角化细胞中发现，UVB 照射后，产生AhR的配体，将AhR活化后，激活CYP1A1的表达，促进EGFR的内在化，随后诱导COX-2的表达[13]。其中，CYP1A1诱导产生具有DNA毒性的致癌物，导致肿瘤细胞的产生。COX-2抑制细胞的凋亡，使肿瘤细胞发展成为可检测的皮肤癌[14]。
4.4调节细胞节律
在小鼠的肝、肺和胸腺细胞中，AhR的表达呈周期性。在无外源刺激的条件下，AhR对周期节律没有影响。
当AhR被TCDD激活后，可打破与小鼠造血前体相关的周期节律，破坏LSK骨髓细胞静息的周期节律，破坏LSK细胞中period基因1/2（period gene1/2,Per1/2）表达的周期性。
反之，Per1/2基因的破坏，会改变AhR的信号通路。在Per1/2基因破坏的小鼠中，TCDD所诱导的CYP1A1和CYP1B1的表达水平也比正常的小鼠更高。
大量的研究表明，TCDD活化的AhR对节律的作用，可能是通过影响经典的昼夜节律运动输出周期故障（Circadian Lo-comotor Output Cycles Kaput,CLOCK）基因而发生的。TCDD 的使用，改变了CLOCK及CLOCK控制的基因的表达水平，导致周期节律的消失，从而无法适应外界环境的改变[15]。
5结语
二恶英是环境中普遍存在的污染物，由于脂溶性的特质，易于在生物体内富集。生物链的传递作用，使二恶英对于人体的危害更为明显。一方面，二恶英干扰机体内的分泌，抑制性激素的作用，使雌性动物卵巢功能障碍、不孕、胎仔减少、流产，使雄性动物精细胞减少、成熟精子退化、雌性化；另一方面，二恶英具有极强的免疫毒性，引起动物胸腺萎缩、免疫功能降低等。并且二恶英对于动物有极强的致癌性，可引发软组织癌等在内的多种肿瘤。因此，二恶英的发病机制，是目前世界上的研究热点之一。
二恶英的作用，是由芳香烃受体AhR介导的。作为转录因子，AhR的活性受到多方面的调控，如磷酸化、泛素化等，这些修饰影响AhR在细胞中的定位、转录活性以及稳定性。并且这些作用也与其他通路相互交叉。如AhR的激活，引起ER、AR 等的降解，对性激素受体的抑制，导致二恶英对人体内分泌的干扰。MAPK作为磷酸化激酶，对AhR的磷酸化状态起到重要的调控作用，但是具体的机制还有待于进一步的研究。而AhR 与ARNT形成二聚体后，激活的表达产物，如细胞色素等，可将环境中的一些多环芳烃类化合物降解为对DNA有毒害作用的产物，这可能是引发癌症的重要原因。尽管目前不知道二恶英究竟以何种方式对免疫系统进行削弱，但相信这种免疫毒性可以加快人体病变。另外，AhR也对时钟基因CLOCK、Per1/2等产生影响，最终对细胞的节律产生影响，但是相关的机制也并不是十分的清楚。因此，这些机制的研究，对治疗由二恶英引发的疾病具有重大的意义。
参考文献(References)
[1]Kikuchi Y,Ohsawa S,Mimura J,et al.Heterodimers of bHLH-PAS
protein fragments derived from AhR,AhRR,and Arnt prepared by co-expression in Escherichia coli:characterization of their DNA bind-ing activity and preparation of a DNA complex[J].J Biochem.2003, 134(1):83-90
[2]Berg P,Pongratz I.Differential Usage of Nuclear Export Sequences
Regulates Intracellular Localization of the Dioxin(Aryl Hydrocarbon) Receptor[J].J Biol Chem.2001,276(46):43231-8
[3]Petrulis JR,Perdew GH.The role of chaperone proteins in the aryl hy-
drocarbon receptor core complex[J].Chem Biol Interact.2002,141 (1-2):25-40
[4]Kumar MB,Ramadoss P,Reen RK,et al.The Q-rich subdomain of the
human Ah receptor transactivation domain is required for dioxin-me-diated transcriptional activity[J].J Biol Chem.2001,276(45): 42302-10
[5]Oshima M,Mimura J,Sekine H,et al.SUMO Modification Regulates
the Transcriptional Repressor Function of Aryl Hydrocarbon Receptor Repressor[J],J Biol Chem.2009,284,11017-11026
[6]Ikuta T,Kobayashi Y,Kawajiri K.Phosphorylation of nuclear local-
ization signal inhibits the ligand-dependent nuclear import of aryl hy-drocarbon receptor[J].Biochem Biophys Res Commun.2004,317(2): 545-50
[7]Ma Q,Baldwin KT.2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced
degradation of Aryl hydrocarbon receptor(AhR)by the ubiquitin-pro-teasome pathway[J].J Biol Chem.2000,275,8432-8438
[8]李淑晶,刘文栋,伍会健.二恶英雌激素受体的干扰作用[J].生命科
学,2008,20(5):764-7
Li SJ,Liu WD,Wu HJ.Interference of estrogen receptor by dioxin[J].
Chinese Bulletin of Life Sciences,2008,20(5):764-7(In Chinese) [9]Ohtake F,Baba A,Takada I,et al.Dioxin receptor is a ligand-depen-
dent E3ubiquitin ligase[J].Nature.2007,446(7135):562-6
[10]Khan S,Barhoumi R,Burghardt R,et al.Molecular Mechanism of In-
hibitory Aryl Hydrocarbon Receptor-Estrogen Receptor/Sp1Cross Talk in Breast Cancer Cells[J].Mol Endocrinol.2006,20(9): 2199-214
[11]Chen S,Opera觡a T,Bonzo J,et al.ERK kinase inhibition stabilizes
the Aryl hydrocarbon receptor[J].J Biol Chem.2005,280(6):4350-9.
[12]Shibazaki M,Takeuchi T,Ahmed S,et al.Suppression by p38MAP
Kinase Inhibitors(Pyridinyl Imidazole Compounds)of Ah Receptor Target Gene Activation by2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and the Possible Mechanism[J].J Biol Chem.2004,279(5):3869-76. [13]Nair S,Kekatpure VD,Judson BL,et al.UVR exposure sensitizes
keratinocytes to DNA adduct formation[J].Cancer Prev Res(Phila Pa).2009,2(10):895-902
[14]Park JH,Mangal D,Frey AJ,et al.The aryl-hydrocarbon receptor
(AhR)-facilitates DNA strand breaks and8-oxo-2'-deoxyguanosine formation by the aldo-keto reductase product benzo[a]pyrene-7, 8-dione[J].J Biol Chem.2009,284,29725-29734
[15]Shimba S,Watabe Y.Crosstalk between the AhR signaling pathway
and circadian rhythm[J].Biochem Pharmacol.2009,77(4):560-5
1 PPAR信号通路：过氧化物酶体增殖物激活受体( PPARs) 是与维甲酸、类固醇 和甲状腺激素受体相关的配体激活转录因子超家族核激素受体成员。它们作为脂 肪传感器调节脂肪代谢酶的转录。PPARs由PPARα、PPARβ和PPARγ 3种亚型组成。PPARα主要在脂肪酸代谢水平高的组织，如：肝、棕色脂肪、心、肾和骨骼肌表达。他通过调控靶基因的表达而调节机体许多生理功能包括能量代谢、生 长发育等。另外，他还通过调节脂质代谢的生物感受器而调节细胞生长、分化与 凋亡。PPARa同时也是一种磷酸化蛋白，他受多种磷酸化酶的调节包括丝裂原激活蛋白激酶( ERK-和p38．M APK) ，蛋白激酶A和C( PKA，PKC) ，AM PK和糖原合成酶一3( G SK3) 等调控。调控PPARa生长信号的酶报道有M APK、PKA和G SK3。PPARβ广泛表达于各种组织，而PPAR γ主要局限表达在血和棕色脂肪，其他组织如骨骼肌和心肌有少量表达。PPAR-γ在诸如炎症、动脉粥样硬化、胰岛素抵抗和糖代谢调节，以及肿瘤和肥胖等方面均有着举足轻重的作用， 而其众多生物学效应则是通过启动或参与的复杂信号通路予以实现。鉴于目前人 们对PPAR—γ信号通路尚不甚清，PPARs通常是通过与9-cis维甲酸受体( RXR)结合实现其转录活性的。 2 MAPK信号通路:mapk简介:丝裂原激活蛋白激酶（mitogen—activated protein kinase，MAPK）是广泛存在于动植物细胞中的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。作用主要是将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞的生物化学反应（增殖、分化、凋亡、应激等）。 MAPKs家族的亚族 :ERKs（extracellular signal regulated kinase)：包括ERK1、ERK2。生长因子、细胞因子或激素激活此通路，介导细胞增殖、分化。 JNKs(c-Jun N-terminal kinase)包括JNK1、JNK2、JNK3。此亚族成员能使 Jun转录因子N末端的两个氨基酸磷酸化而失活，因此称为Jun N末端激酶(JNKs)。物理、化学的因素引起的细胞外环境变化以及致炎细胞因子调节此通路。P38 MAPKs：丝氨酸/络氨酸激酶，包括p38 α、p38β、p38γ、p38δ。p38 MAP K参与多种细胞内信息传递过程 ,能对多种细胞外刺激发生反应,可磷酸化其它细胞质蛋白,并能从胞浆移位至细胞核而调节转录因子的活性来改变基因的表达水平 ,从而介导细胞生长、发育、分化及死亡的全过程。 ERK5:是一种非典型的MAPK通路，也叫大MAPK通路，只有一个成员。它可被各种刺激因素激活。不仅可以通过磷酸化作用使底物活化，并且通过C端的物理性结合作用激活底物。 3 ERBB信号途径:ErbB 蛋白属于跨膜酪氨酸激酶的 EGF 受体家族成员。ErbB 的命名来源于在禽红白血病 B( v-Erb-B) 发现的 EGF 受体的突变体,因而 EGF 受体 亦称为“ ErbB1”。人源 ErbB2 称为HER2, 特指人的 EGF 受体。ErbB 家族的
白介素IL-6信号转导及其通路研究概述 细胞因子是一类参与免疫系统的细胞之间通信的蛋白质，除此之外，许多细胞因子在免疫系统之外也具有调节功能。1986年白介素IL-6作为B细胞刺激因子被Kishimoto组分子克隆。IL-6在免疫系统外的活性还有肝细胞刺激因子和骨髓细胞分化诱导蛋白。 白介素IL-6含有184个氨基酸，属于糖基化蛋白质。IL-6可以由多种类型细胞合成和分泌，包括单核细胞、T细胞、成纤维细胞和内皮细胞。IL-6结合受体有两种，一种是特异性受体IL-6R（80kDa I型跨膜蛋白），另一种是gp130，是IL-6家族细胞因子的所有成员的常见受体亚单位。gp130可以在所有细胞表达，但IL-6R的表达受到更多的限制，主要发现于肝细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和CD4+ T细胞。 白介素IL-6受体gp130的二聚化会导致两种细胞内信号通路的启动：经典信号通路和反式信号通路（见下文）。白介素IL-6的受体IL-6R可以在细胞膜经过蛋白质水解，形成可溶性的IL-6R（sIL-6R），在人类中，也可以在翻译阶段进行剪接mRNA，进而产生sIL-6R。在经典信号通路中，IL-6与膜上的IL-6R结合，随后与结合在细胞膜上的gp130结合，启动细胞内信号传导。在IL-6反式信号通路中，IL-6与sIL-6R结合，IL-6和sIL-6R的复合物与细胞膜结合的gp130结合，从而引发细胞内信号。 白介素IL-6是最重要的炎症细胞因子之一。IL-6在通过膜结合和可溶性受体的信号传导中是独特的。有趣的是，这两种途径的生物学后果有很大差异，通过膜结合受体的经典IL-6信号通路主要是再生和保护性的，可溶性IL-6R的IL-6反式信号通路是促炎症的。响应于受体激活的IL-6的细胞内信号传导是通过STA T依赖和STAT独立的信号模块，其由复杂的调节网络调节。IL-6的复杂生物学对该细胞因子的治疗靶向具有影响。 白介素IL-6胞内信号通路可以简单的概述为：IL-6与受体复合物结合后，激活JAK1。JAK1磷酸化gp130细胞质部分内的酪氨酸残基，这些磷酸酪氨酸基序是STAT转录因子，SOCS3反馈抑制剂和衔接蛋白和磷酸酶SHP2的募集位点。SHP2连接到MAPK级联，使Gab1磷酸化，磷酸化的Gab1转移到质膜上，协调正在进行的MAPK和PI3K活化。Src家族激酶独立于受体磷酸化并激活Y AP。 白介素IL-6信号转导第一步：激活JAK。 大多数细胞因子受体缺乏胞内激酶活性，生长因子的受体例外。白介素IL-6胞内信号转导首先激活Janus激酶（JAK），开启酶促反应。通过JAK N末端的同源结构域内（JH）
总字数：19,361 图：5 表：0 第七章细胞信号转导异常与疾病 第一节细胞信号转导系统概述 一、受体介导的细胞信号转导通路 二、细胞信号转导通路调节靶蛋白活性的主要方式 第二节信号转导异常发生的环节和机制 一、细胞外信号发放异常 二、受体或受体后信号转导异常 第三节与信号转导异常有关的疾病举例 一、胰岛素抵抗性糖尿病 二、肿瘤 三、心肌肥厚和心衰
第七章细胞信号转导异常与疾病 细胞信号转导系统(signal transduction system或cell signaling system)由能接收信号的特定受体、受体后的信号转导通路以及其作用的靶蛋白所组成。细胞信号转导系统具有调节细胞增殖、分化、代谢、适应、防御和凋亡等作用，它们的异常与疾病，如肿瘤、心血管病、糖尿病、某些神经精神性疾病以及多种遗传病的发生发展密切相关。受体和细胞信号转导分子异常既可以作为疾病的直接原因，引起特定疾病的发生；亦可在疾病的过程中发挥作用，促进疾病的发展。细胞信号转导异常可以局限于单一成分（如特定受体）或某一环节，亦可同时或先后累及多个环节甚至多条信号转导途径，造成调节信号转导的网络失衡。对信号转导系统与疾病关系的研究不仅有助于阐明疾病的发生发展机制，还能为新药设计和发展新的治疗方法提供思路和作用靶点。 第一节细胞信号转导系统概述 信号转导过程包括细胞对信号的接受，细胞内信号转导通路的激活和信号在细胞内的传递。激活的信号转导通路对其靶蛋白的表达或活性/功能的调节，如导致如离子通道的开闭、蛋白质可逆磷酸化反应以及基因表达改变等，导致一系列生物效应。 一、受体介导的细胞信号转导通路 细胞的信号包括化学信号和物理信号，物理信号包括射线、紫外线、光信号、电信号、机械信号(摩擦力、压力、牵张力以及血液在血管中流动所产生的切应力等)以及细胞的冷热刺激等。已证明物理信号能激活细胞内的信号转导通路，但是与化学信号相比，目前多数物理信号是如何被细胞接受和启动细胞内信号转导的尚不清楚。 化学信号又被称为配体(ligand)，它们包括：①可溶性的化学分子如激素、神经递质和神经肽、细胞生长因子和细胞因子、局部化学介质如前列腺素、细胞
综述与进展 p38M APK信号转导通路与细胞凋亡研究进展 王誉霖1,张励才2 作者单位：1.安徽省宣城市人民医院麻醉科242000;2江苏徐州医学院作者简介： 王誉霖（1978，女,吉林市人，住院医师，硕士。研究方向：疼痛信号转导及调控。 主题词p38丝裂原活化蛋白激酶类；细胞凋亡;综述 中图分类号R345文献标识码A文章编号1674 8166（201012 1665 03 丝裂原活化蛋白激酶（mitog en2activated pr otein kinase,MA PK级联是细胞内广泛存在的丝/苏氨酸蛋白激酶超家族，是将细胞质的信号传递至细胞核并引起细胞核发生变化的重要物质。目前在人类已鉴定了4条MAPK途径:细胞外信号调节蛋白 激酶（ex tra cellular sig nal regulated protein kinase,ERK途径,C Jun 基末端激酶（c Jun N term inal kinase,JN K/应激活化蛋白（stress activated protein kinase,SAPK途 径,ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶1（big MAP MAP kinase,BM K1途径和p38M APK（p38mitogen activated protein kinases,p38MA PK 传导途径［1］。p38 信号途径是 MAPK家族中的重要组成部分，多种炎症因子和生长因子及应激反应可使p38MAPK的酪氨酸和苏氨酸双磷酸化，从而激活p38M APK,使它在炎症、细胞应激、凋亡、细胞周期和生长等多种生理和病理过程中起重要作用。因此,p38MAPK 通路参与了多种刺激引起的信号级联反应，表明它在引起多种细胞反应中起重要作用，并且,p38在细胞凋亡中也有着重要的调节效应。1 p38M APK信号转导通路 丝裂原活化蛋白激酶（m ito gen activated pr otein kinase,MA PK级联是细胞内重 要的信号转导系统之一。在哺乳动物细胞M APK通路主要有:细胞外信号调节激酶（extracellular signal r eg ulated kinase,ERK ffi路、p38MA PK 通路、c jun 氨基末端激酶（c jun N term inal kinase,JNK通路和ERK5 通路［1］。其中,p38MAPK 是M APK 家族中的重要成员。
免疫与炎症相关信号通路 一、Jak/Stat Signaling:IL-6 Receptor Family Jak和Stat是许多调节细胞生长、分化、存活和病原体抵抗信号通路中的关 键部分。就有这样一个通路涉及到IL-6（gp130）受体家族，它帮助调节B 细胞的分化，浆细胞生成和急性期反应。细胞因子结合引起受体的二聚化同 时激活受体结合的Jak蛋白，活化的Jak蛋白对受体和自身进行磷酸化。这些磷酸化的位点成为带有SH2结构的Stat蛋白和接头蛋白的结合位臵，接头蛋白将受体和MAP激酶，PI3激酶/Akt还有其他的通路联系在一起。受体结合的Stat蛋白被Jak磷酸化后形成二聚体，转移进入细胞核调节目的基因的 表达。细胞因子信号传导抑制分子（SOCS）家族的成员通过同源或异源的 反馈减弱受体传递的信号。Jak或Stat参与其他受体蛋白的信号传导，在下 面Jak/Stat使用表格中有这方面的列举。研究人员已经发现Stat3和Stat5在一些实体肿瘤中被酪氨酸激酶而不是Jaks组成性激活。 JAK/STAT途径介导细胞因子的效应，如促红细胞生成素，血小板生成素， G-CSF，这些细胞因子分别是用于治疗贫血，血小板减少症和中性粒细胞减 少症的蛋白质类药物。该途径也通过干扰素介导信号通路，干扰素可以用来 作为抗病毒和抗增殖剂。研究人员发现，失调的细胞因子信号有助于癌症的 发生。异常的IL-6的信号或导致自身免疫性疾病，炎症，癌症，如前列腺癌 和多发性骨髓瘤的发生。Jak抑制剂目前正在多发性骨髓瘤模型中进行测试。Stat3具有潜在促癌性（原癌基因）,在许多癌症中持续的表达。在一些癌细 胞中，细胞因子信号传导和表皮生长因子受体（EGFR）家族成员之间存在交流。 Jak激活突变是恶性血液病中主要的分子机制。研究人员已经在Jak2假激酶域中发现一个特有的体细胞突变（V617F），这个突变常常发生于真性红细 胞增多症，原发性血小板增多症和骨髓纤维化症患者。这个突变导致Jak2的病理激活，同时激活控制红细胞，巨核细胞和粒细胞增殖分化的促红细胞 生成素（EPO），血小板生成素（TPO）和G-CSF等的受体。而Jak1的功能获得性体细胞突变已发现存在于成人急性淋巴细胞性白血病当中。体细胞激活突变已经证明存在于小儿急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中。此外，
细胞信号转导途径研究方法 一、蛋白质表达水平和细胞内定位研究 1、信号蛋白分子表达水平及分子量检测: Western blot analysis. 蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后,分离为不同条带，其中含有能与特异性抗体(或McAb)相应的待检测的蛋白质(抗原蛋白)，将PAGE胶上的蛋白条带转移到NC膜上此过程称为blotting，以利于随后的检测能够的进行，随后,将NC膜与抗血清一起孵育，使第一抗体与待检的抗原决定簇结合(特异大蛋白条带)，再与酶标的第二抗体反应,即检测样品的待测抗原并可对其定量。 基本流程： 检测示意图：
2、免疫荧光技术 Immunofluorescence （IF） 免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 采用流式细胞免疫荧光技术（FCM）可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的蛋白质分子，用两种不同的荧光素分别标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内同时检测两种不同的分子（Double IF），也可用多参数流式细胞术对胞内多种分子进行检测。 二、蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术 1、免疫共沉淀（Co- Immunoprecipitation, Co-IP）
Co-IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A”能特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象而开发出来的方法。目前多用精制的protein A预先结合固化在agarose的beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。进一步进行Western Blot 和质谱分析。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用。 2、GST pull-down assay GST pull-down assay是将谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白（标记蛋白或者饵蛋白，GST, His6, Flag, biotin …）作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白(test protein或者prey被扑获蛋白)结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。
干货细胞信号通路图解之MAPK通路【值得珍藏】 科研小助手原创，转载请注明来源。公众号内回复“Cell Signaling Pathway”获取全套信号通路图本文由百度贴吧nosce吧吧主黄杰投稿一、MAPK信号通路： （1）有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)是一族在真核生物中非常保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，在许多细胞活动中起作用，如生长增殖，细胞分化，细胞运动或死亡。MAPK级联信号传导由3 个不同层次的分子所组成。MAPK被MAPK的激 酶( MAPKK)磷酸化后激活，MAPKK被MAPKK的激酶(MAPKKK )磷酸化而激活。而MAPKKK通过与小GTPase 和/或其他蛋白酶相互作用而被激活，从而将MAPK和细胞 表面的受体以及胞外的信号联系在一起。 （2）许多参与生长和分化的受体都能够激活MAPK/ERK信号通路，比如说受体酪氨酸激酶(RTK)，整合素，和离子通道。响应特定信号所涉及到的具体分子会相差很大，但通路的结构是一致的，那就是接头分子(adaptor，如Shc, GRB2, Crk等)将鸟苷酸交换因子(SOS, C3G 等)和受体连接在一起，然后把信号向小GTP 结合蛋白(Ras, Rap1)传递，后者又激活核心的级联反应，这是由一个MAPKKK( Raf) ，一个MAPKK( MEK1/2)和MAPK( Erk)所构成的。活化的ERK 二聚体能调节胞浆中的目标分子，也可以转移到细胞核中，然
后对一系列转录因子进行磷酸化以调节基因表达。SciRes（3）很多外部的刺激都能够激活G蛋白偶联受体(GPCR)。在受体活化以后，G 蛋白将GDP 转换成GTP ，然后结合了GTP的α和β/γ亚基从受体脱离开，启动信号向胞内的传导。与不同亚型的异质三聚体G 蛋白结合的受体可以采取不同 的手段激活小G 蛋白/MAPK级联反应，至少有三个不同家族的酪氨酸激酶参与其中。Src家族激酶响应活化的PI3Kγ，而后者被β/γ亚基激活。它们还能够响应受体的内化，受体酪氨酸激酶的交叉活化，以及有Pyk2 和/或FAK参与的整 合素途径信号。GPCRs同样可以通过PLCβ去激活PKC 和CaMKII ，对下游的MAPK通路可以有激活或抑制的影响。SciRes（4）压力激活的蛋白激酶(Stress-activated protein kinase, SAPK)或称Jun氨基端激酶(Jun amino-terminal kinase, JNK) 是MAPK的家族成员，能被一系列的环境压力，炎症细胞因子，生长因子和GPCR激动剂所激活。压力信号通过Rho家族的小GTP 酶(small GTPase)向这条级联通路传导，这些小GTP酶包括(Rac, Rho, cdc42) 。和其他的MAPK情况一样，靠近膜的激酶是一个MAPKKK，一般 是MEKK1-4 ，或者是一个混合激酶去磷酸化并激活 MKK4(SEK)或MKK7，它们是SAPK/JNK的激酶。另外，MKK4/7也可以被生发中心激酶(germinal center kinase, GCK)以一种GTPase 依赖的方式激活。活化后的
生物技术通讯 ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．２Ｍａｒ．，２００７ 综述 文章编号：１００９－０００２（２００７）０２－０３３６－０３ 蛋白质组学方法在细胞内信号转导研究中的应用 李敏，周慧，崔银秋 吉林大学生命科学学院生物大分子实验室，吉林长春１３００２１ ［摘要］蛋白质组学的新技术为我们研究细胞内的信号转导过程提供了更广泛和崭新的思路，它克服了传统技术的局限 性，实现了对蛋白的高通量分析。简要综述了蛋白质组学技术在信号转导过程中信号分子的确定、定量，磷酸化等翻译后修 饰的识别，以及蛋白质之间相互作用研究等方面的应用。 ［关键词］蛋白质组学；信号转导 ［中图分类号］Ｑ２５FＱ５０３［文献标识码］Ａ ＡｐｐｌｙｉｎｇＰｒｏｔｅｏｍｉｃＭｅｔｈｏｄｓｔｏＣｅｌｌｕｌａｒＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ ＬＩＭｉｎ，ＺＨＯＵＨｕｉ，ＣＵＩＹｉｎ－ｑｉｕ ＢｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅＬａｂ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｉｍｐｒｏｖｅｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｔｈａｔｈａｖｅｅｍｅｒｇｅｄｉｎｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｐｒｏｖｉｄｅｕｓｍｕｃｈｍｏｒｅｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅａｎｄｎｅｗｉｎ－ ｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｔｈａｓｏｖｅｒｃｏｍｅｔｈｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｒｅａｌｉｚｅｄｔｈｅ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｐｒｏｔｅｉｎａｎａｌｙｓｉｓｍｏｄｅ．Ｉｎｔｈｉｓｌｅｔｔｅｒ，ｔｈｅａｐｐｌｙｉｎｇｏｆｐｒｏｔｅｏｍｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｉｎｄｅｆｉｎｉｎｇａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｓｕｃｈａｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｒｅ－ ｓｅａｒｃｈｄｕｒｉｎｇｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ． ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓFｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ２０世纪９０年代以来，对细胞内信号转导途径的研究逐渐成为国内外生物学界广泛关注的热点。由于信号的传递在细胞的增殖、分化和生存等过程中都起着十分关键的作用，因而逐渐成为解决许多重要理论及实践问题的基本思路和有力武器。近年来有关细胞信号转导研究的方法层出不穷。传统地，人们主要利用ＲＮＡ干扰技术、抗体免疫沉淀、３２Ｐ标记结合蛋白质印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）等方法来检测和鉴定信号传递过程中差异表达的信号分子及关键蛋白的磷酸化。这些方法和技术能够做小量的分析，但无法进行大规模的研究。随着双向电泳（ｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２－ＤＥ）和质谱技术的不断完善与发展，蛋白质组学方法越来越多地被用于研究胞内信号转导过程。它弥补了传统方法的不足之处，实现了高通量大规模的研究模式。近年来，蛋白质组学方法应用于信号转导的研究，主要在对蛋白表达谱的检测和定量、翻译后修饰的识别，以及蛋白质之间相互作用图谱的绘制等方面。蛋白质组学方法为我们完整地绘制细胞内信号转导网络图提供了更为可靠的依据。以下就近年来该领域的一些新技术及应用做一简要综述。 １信号蛋白的寻找和确定 细胞受到外界的刺激后，首先吸引许多锚定蛋白、衔接蛋白的结合，引起蛋白的相互作用，并随之引发胞内的一系列信号蛋白的改变（如级联磷酸化事件的发生），最终信号传递到核基因，表达或阻抑表达一些特征蛋白，或者作用于某些特定的细胞器，引发其他生物学效应。由此可见，要了解一种信号途径的具体过程，首先要对该过程的特征信号分子及下游所表达的蛋白进行确定。目前，二维电泳结合质谱技术（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ或ＥＳＩ－ＭＳ）已经成为蛋白质组学的首选工具，来获得不同状态下的细胞全蛋白质组。许多研究通过选择性抑制或激活信号通路并筛选２－ＤＥ的效应分子成功地鉴定了信号转导过程中的靶标。本文作者所在研究室［１］利用２－ＤＥ结合ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ，对处于不同生理条件下的ＮＩＨ３Ｔ３细胞的全细胞裂解液进行双向电泳分离及软件分析。在我们筛选的ａＦＧＦ拮抗剂小肽存在的条件下，鉴定出３种表达量下调、１种表达量上升的蛋白，其中鸟苷酸结合蛋白α－１１亚单位和１Ｃ型核因子分别参与胞内ａＦＧＦ信号传导以及转录调控。近来人们又开发出许多以２－ＤＥ为基础的改进方法，包括从样本制备、分离到染色等各方面，来对蛋白进行更好的分离分析，如亚细胞分离、差异凝胶电泳（ＤＩＧＥ）技术等［２］。 ２－ＤＥ的优势是能够更直观地提供信号蛋白的相对分子质量、等电点、相对表达丰度等信息，但它在分离一些ｐＩ过大或过小、疏水性强的低丰度蛋白时有很大的困难。最近研究较多的多维蛋白质鉴定技术（ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈ－ｎｉｑｕｅ，ＭｕｄＰＩＴ）［３］弥补了上述缺陷。ＭｕｄＰＩＴ能够更有效地检测疏水蛋白，且在分析来自胞内细胞器的蛋白时具有更高的效率。最常用的是二维液相色谱（２Ｄ－ＬＣ），它首先对蛋白复合物进行酶 ［收稿日期］２００６－０８－３０ ［基金项目］吉林省科技发展计划项目（２００４０４１１－３） ［作者简介］李敏（１９８２－），女，硕士研究生 ［通讯作者］崔银秋，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｃｕｉｙｑ＠ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ３３６
T C R细胞通路研究进展标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]
T C R信号通路研究新进展 T细胞相关免疫疗法在近期的癌症研究中大放异彩，“主力部队”是CAR-T和TCR-T这两种技术。相对于CAR-T细胞疗法，TCR-T疗法的关注度相对低些，但是这两种细胞疗法都属于利用患者自身的T淋巴细胞治疗癌症的前沿基因疗法。研究发现，在实体瘤治疗方面，TCR疗法可能比CAR疗法更有优势。 T细胞在免疫系统中具有重要作用，可以攻击病原体和肿瘤细胞。T细胞受体（TCR）能识别不同的广泛亲和力的配体，参与激活多种生理过程。TCR细胞疗法定制功能性TCR，具有最佳的抗原识别特性，利用人体免疫系统来对抗癌症。那么，这种疗法的分子机制是什么呢？与之相关的TCR信号通路的分子调控机制有怎样的研究进展呢？本文将对这些问题进行综合性讲述。 TCR蛋白结构 图一TCR复合物结构 T细胞作为适应性免疫应答的主要组成部分，其抗原识别受体结构以被证实，克隆获得的TCR由α-链和β-链构成异源二聚体。TCR异源二聚体主要与CD3的多个信号转导亚基结合，如图所示，CD3γ、CD3δ和CD3ε异源二聚体以及CD3ζ同源二聚体。在CD3的不同亚基含有免疫受体酪氨酸的活化基序-ITAM，但是每个亚基的数量不同，CD3γ、CD3δ和CD3ε分别含有一个，而CD3ζ含有三个串联的ITAM，这样就使的每个T细胞受体可以产生10个ITAM。酪氨酸磷酸化的ITAM可以使TCR与胞内信号转导通路发生偶联，向TCR募集含有SH2结构域的蛋白质，如酪氨酸激酶ZAP70。但是现在还没有解决为什么TCR复合物包含这么多的信号转导亚基和ITAM的问题，主要有两种假说，一种是CD3分子或单独的ITAM可能通过募集独特的效应分子，执行不同的信号转导功能；另一种是多个ITAM的主要功能是放大TCR信号。 TCR识别与抗原递呈细胞（APC）呈递的可以结合MHC分子（pMHC）的肽。单独的TCR能够识别具有广泛亲和力的不同配体（自身肽和外来肽）。TCR参与触发不同的功能输出。在胸腺中，pMHC与TCR信号结合强度决定了细胞发育与分化过程。当结合力在最小值到最大值之间时，促进胸腺细胞的存活，并转化成CD4+CD8-或CD4-CD8+的成熟阶段；如果TCR与pMHC太低或太高，细胞会发生凋亡。在外围，自体pMHC对TCR的低亲和力结合提供了维持初始T细胞所必需的强直性存活信号，并且还可以促进其与外来抗原高亲和力遭遇时的完全激活。 图二TCR结合强度对胸腺细胞的影响 TCR信号强度对于产生合适的应答T细胞至关重要。TCR信号传导应答指导 CD4+T细胞分化成功能不同的T辅助细胞亚群，对特定T细胞亚群（如调节性T 细胞）也起着关键作用。TCR细胞的强度和持续时间与记忆T细胞分化相关，也是诱导T细胞无能或耗竭的基本决定因素。TCR信号受到生化及分子机制的调控，导致信号放大或衰减。调控TCR的机制复杂多样，不过可以分为三个基本层面：早期信号转导效应分子（如关键激酶和磷酸酶的调节）；信号分子发育阶段（特异性表达调控）；以及TCR信号强度的动态调控。 TCR信号通路概述 图三：TCR信号通路概述
1PPAR信号通路：过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是与维甲酸、类固醇和甲状腺激素受 体相关的配体激活转录因子超家族核激素受体成员。它们作 为脂肪传感器调节脂肪代谢酶的转录。PPARs由PPARα、PPARβ和PPARγ3种亚型组成。PPARα主要在脂肪酸代谢水平高的组织，如：肝、棕色脂肪、心、肾和骨骼肌表达。他通过 调控靶基因的表达而调节机体许多生理功能包括能量 代谢、生长发育等。另外，他还通过调节脂质代谢的生物感受器而调节细胞生长、分化与凋亡。PPARa同时也是一种磷酸化蛋白，他受多种磷酸化酶的调节包括丝裂原激活蛋白激酶(ERK-和 p38．MAPK)，蛋白激酶A和C(PKA，PKC)，AMPK和糖原合成酶一3(GSK3)等调控。调控PPARa 生长信号的酶报道有MAPK、PKA和GSK3。PPARβ广泛表达于各种组织，而PPARγ主 要局限表达在血和棕色脂肪，其他组织如骨骼肌和心肌有少量表达。PPAR-γ在诸如炎症、动 脉粥样硬化、胰岛素抵抗和糖代谢调节，以及肿瘤和肥胖等方面 均有着举足轻重的作用，而其众多生物学效应则是通过启动或参与的复杂信号 通路予以实现。鉴于目前人们对PPAR—γ信号通路尚不甚清，PPARs通常是通过与9-cis维 甲酸受体(RXR)结合实现其转录活性的。 2MAPK信号通路:mapk简介:丝裂原激活蛋白激酶（mitogen—activatedproteinkinase，MAPK）是广泛存在于动植物细胞中的一类丝氨酸/苏氨酸蛋 白激酶。作用主要是将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞的生物化学反 应（增殖、分化、凋亡、应激等）。 MAPKs家族的亚族:ERKs（extracellularsignalregulatedkinase) ：包括 ERK1、ERK2。生长因子、细胞因子或激素激活此通路，介导细胞增殖、分化。 JNKs(c-JunN-terminalkinase)包括JNK1、JNK2、JNK3。此亚族成员能使Jun转录因子N末 端的两个氨基酸磷酸化而失活，因此称为JunN末端激酶(JNKs)。物理、化学的因素引起的 细胞外环境变化以及致炎细胞因子调节此通 路。 P38MAPKs：丝氨酸/络氨酸激酶，包括p38α、p38β、p38γ、p38δ。p38MAPK参与多种细胞内信息传递过程,能对多种细胞外刺激发生反应,可磷酸化 其它细胞质蛋白,并能从胞浆移位至细胞核而调节转录因子的活性来改变基因的表达水平,从而 介导细胞生长、发育、分化及死亡的全过程。 ERK5:是一种非典型的MAPK通路，也叫大MAPK通路，只有一个成员。它可 被各种刺激因素激活。不仅可以通过磷酸化作用使底物活化，并且通过C端的物理性结合作用 激活底物。 3ERBB信号途径:ErbB蛋白属于跨膜酪氨酸激酶的EGF受体家族成员。ErbB的命名来源于在禽 红白血病B(v-Erb-B)发现的EGF受体的突变体,因而EGF
信号通路研究思路
证明一个药物能通过抑制P38表达而发挥保护细胞的作用，需要做的是： 要证明你的药物是通过抑制P38表达而发挥保护作用，首先要证明P38表达增加会导致损伤。 其次，要证明你的药物存在保护作用。 再次，证明你的药物可以抑制P38表达。 最后，证明你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。 首先证明P38表达增加会导致损伤。 这里需要建立一个损伤模型。正如你提到的，钙离子导致P38mapk的增高，如果某种损伤可以通过钙离子导致P38mapk的增高，那么你就建立起了一个损伤模型。这时，对P38做个RNA干扰，使其表达下降，再来损伤刺激，如果这时损伤刺激不会导致损伤，那么可以说P38mapk的增高会导致损伤。 这里最好不要用P38的抑制剂SB来处理，因为这个抑制剂是针对P38活性的抑制剂，抑制的是P38的磷酸化，而不是表达量。 如果说明的问题是p38磷酸化水平增加而导致损伤，那么我建议用抑制剂。这时还可以用Dominant-negative。抑制剂的实验证实该药物不影响P38表达，而影响其活化。（应该首先考虑选用抑制剂，因为目前一些药物的作用机制不是抑制靶点的表达，而是抑制靶点的激活。如果在此应用RNAi的话，很可能会漏掉这个机制或增加实验步骤。） 其次，要证明你的药物存在保护作用。
当然就是用你的药物先处理一下，再来损伤刺激，如果这时损伤刺激不会导致损伤，那么可以说你的药物存在保护作用。 再次，证明你的药物可以抑制P38表达。 用你的药物先处理一下，再来损伤刺激，再检测P38表达，如果用药组相对于没有用药组P38表达下降，那么可以说你的药物可以抑制P38表达。 最后，证明你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。 这一步看似不必要，其实是最重要的步骤，而国内的文章往往忽略了这一关键环节。 这里建议还是用RNA干扰P38表达，再用你的药物处理，再进行损伤刺激，如果用药组与没有用药组的损伤程度一致，那么才可以说你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。 抑制剂也有其局限性，有时是“致命”的，主要原因是抑制剂缺乏特异性。虽然我们在文章里看到用抑制剂的时候都说是什么什么的特异性抑制剂，但真的那么特异吗？其实往往是作者为了写文章发文章的需要而夸大了抑制剂的特异性。细胞里无数的信号通路，谁也不能保证抑制剂在作用于靶分子时不会影响其他信号通路。其实无论什么抑制剂，对剂量的要求都相对比较苛刻，为什么？就是因为一旦浓度高了，就不知道会干扰到其他哪些信号通路，从而产生很多说不清道不明的现象。 PI3K的抑制剂---LY294002和wortmannin,它们都能抑制PI3K和相关的激酶，但LY294002的浓度达到200μM常用来抑制DNA依赖的蛋白激酶（DNA-PK）；wortmannin在浓度超过3μM常用来抑制运动失调性毛细血管扩张基因
参与细胞信号转导通路的蛋白简写及全拼 4E-BP eIF4E binding protein Abl Ableson protein tyrosine kinase ACTR A histone acetyltransferase AIF Programmed cell death protein 8 ANT Adenine nucleotide translocation channel Apaf-1 Apoptotic protease activating factor 1 APP beta-Amyloid precursor protein APPs Acute phase proteins ASIP Agouti switch protein ASK Apoptosis signal-regulating kinase (e.g., ASK1) ATF-2 Activating transcription factor 2 ATM Ataxia telangiectasia?mutated protein kinase ATR ATM and Rad3?related protein kinase Bam32 B-cell adaptor molecule 32 kDa BCAP B-cell adaptor for PI3K Bcl-10 B-cell leukemia 10 protein Bfl-1 Bcl-2-related protein A1 Bid A BH3 domain?only death agonist protein Bimp1 B-lymphocyte-induced maturation protein 1 BLNK B-cell linker protein BRCA Breast cancer growth suppressor protein Btk Brutonís tyrosine kinase C3G Guanine nucleotide?releasing factor 2 CAD Caspase-activated deoxyribonuclease Cam Calmodulin CaMK Calcium/calmodulin-dependent kinase CAP c-Cbl-associated protein Cas p130CAS, Crk-associated substrate Caspase Cysteine proteases with aspartate specificity CBL Cellular homologue of the v-Cbl oncogene CBP CREB binding protein CD19 B-lymphocyte antigen CD19 CD22 B-cell receptor CD22 CD40 B-cell surface antigen CD40 CD45 Leukocyte common antigen, a phospho-tyrosine phosphatase CD5 Lymphocyte antigen CD5 cdc2 Cell division cycle protein 2, CDK1 cdc34 Cell division cycle protein 34, a ubiquitin conjugating (E2) enzyme cdc42 Cell division cycle protein 42, a G-protein CDK Cyclin-dependent kinase Chk Checkpoint kinase CHOP C/EBP homologous protein 10
植物Ca2+信号的研究进展 摘要 为了适应环境,调节自身代谢和生长, 在植物的生长发育过程中,需要对各种外界环境刺激以及植物内部生理信息做出反应,因此,植物产生了自己的信号系统。Ca2+作为一种信号分子，它几乎参与了生命体所有的生理生化活动，在植物细胞的信号系统中也起着举足轻重的作用。钙是植物生长发育必需的大量元素之一，在细胞水平上, 钙在细胞分裂、极性形成、生长、分化、凋亡等过程中均有重要的调节功能, 能维持细胞壁, 细胞膜及膜结合蛋白的稳定性并参与调节和控制植物的许多生理生化反应, 是植物代谢的重要调节者。针对国内外对植物Ca2+信号的研究情况,综述了Ca2+信号的产生、Ca2+信号参与的各种植物生理过程、Ca2+信号的检测以及其研究的最新进展。 关键词：植物; Ca2+信号; 检测; 研究进展
钙元素广泛存在于自然界和各种生物体内, 而游离态的Ca2+更是在生命活动中扮演着举足轻重的角色, 它几乎参与了生命体所有的生理生化活动。作为一种信号分子, Ca2+在受精、胚胎发育、基因表达、细胞分化、组织形成、代谢调控等过程中都有参与, 可以说, Ca2+信号无处不在[1]。1967年, Ridg-wang和Ashley通过向藤壶肌纤维中微注射水母发光蛋白, 第一次测定静息态胞内钙离子浓度[Ca2+]以来, 对于Ca2+信号的研究即风生水起。虽然植物Ca2+信号的研究起步较动物细胞晚, 但依然取得了一些成果。对植物Ca2+信号的研究, 不但能揭示生命的奥秘, 同时能帮助我们更加清楚地了解各种生命活动。为此, 针对国内外对植物Ca2+信号的研究情况, 笔者对Ca2+信号的生理功能、信号的产生、Ca2+信号参与的各种植物生理过程、以及其研究的最新进展进行了综述。 1.Ca2+的功能 Heilbrunn在1937～1952年发表的著作中, 提出了Ca2+在生物系统中复杂和多功能性的观点。认为利用Ca2+是所有活细胞的基本特征。在他提出的“细胞刺激理论”中认为:当细胞受到各种刺激时, 细胞内原来浓度很低的Ca2+水平明显增高。Heilbrunn提出Ca2+的一些细胞效应有:(1)促进细胞黏合和胞间通讯;(2)影响酶活性, 如ATP酶酯酶等;(3)调节细胞分裂;(4)控制细胞的代谢活动;(5)调节细胞溶质中溶胶-凝胶状态转变;(6)高浓度Ca2+可能造成细胞死亡, 溶质中Ca2+浓度如果太高, 会与细胞内的磷酸根产生沉淀, 而磷酸根是细胞能量及物质代谢所必须的;(7)调节细胞膜的透性。钙在维持细胞膜方面有着重要作用, 电镜观察表明, 缺钙导致细胞膜解体, 加钙又恢复常态。可见钙有稳定细胞膜结构, 防止细胞膜损伤的作用。有机酸是植物代谢的中间产物, 钙能和有机酸结合成为可溶性的钙盐结晶, 其中最为普遍的就是草酸钙。据报道, 在外源Ca2+诱导下, 细胞内可形成草酸钙结晶移去外源Ca2+, 结晶会消失。草酸钙的形成有以下生理作用:(1)消除有机酸在植物体内的过多积累。(2)草酸钙的形成过程是可逆的,植物体内钙离子过多形成草酸钙, 消除过量钙对植物的伤害, 当钙离子浓度不能满足植物需要时,草酸钙释放出Ca2+以满足植物的需要。 2.植物Ca2+信号的产生和终止 高度区域化的植物细胞内结构中, 在质膜液泡膜内质网膜上都存在着跨膜的钙离子电化学梯度, 细胞质和细胞核内游离钙离子也呈现不均匀分布, 这些梯度分布在静止状态是相对稳定的, 在受到刺激时会发生变化。钙离子梯度是钙信号产生的基础，即植物细胞Ca2+空间分布的不均衡性是产生Ca2+信号的生物基础。植物细胞中, 静息态的胞内Ca2+浓度([Ca2+] i)为100～200nM, 而细胞外(细胞壁)和细胞内(内质网、液泡、线粒体、高尔基体、细胞核)钙离子库中钙离子浓度却是胞内的数十倍, 达到了1～10mM[2,3]。当细胞受到信号刺激时, Ca2+从钙离子库中释放, 使胞内Ca2+浓度瞬间升高,激活Ca2+依赖蛋白和激酶CPKs引起细胞代谢以及基因表达的改变。当Ca2+重新进入细胞内钙离子库或流出细胞进入胞外钙离子库时, 信号得以终止。钙离子浓度的调节是通过各种钙离子通道, 钙离子泵和钙离子转运来实现的[4]。 3.植物Ca2+信号的多样性 Ca2+信号几乎参与了各种植物生理过程, 包括花粉管生长、细胞分裂、受精等;同时, Ca2+信号还参与植物的抗逆反应和对光线的感知。由此可见, Ca2+
细胞信号传导通路 1. 信息传导通路的基本组成 人体细胞之间的信息转导可通过相邻细胞的直接接触来实现，但更重要的也是更为普遍的则是通过细胞分泌各种化学物质来调节自身和其他细胞的代谢和功能，因此在人体中，信息传导通路通常是由分泌释放信息物质的特定细胞、信息物质（包含细胞间与细胞内的信息物质和运载体、运输路径等）以及靶细胞 （包含特异受体等）等构成。 信号转导通常包括以下步骤： 释放信息物质→信息物质经扩散或血循 环到达靶细胞→与靶细胞的受体特异性 结合→受体对信号进行转换并启动细胞 内信使系统→靶细胞产生生物学效应 【1】。通过这一系列的过程，生物体对外界刺激作出反应。 3. 信息物质及其分类 信息物质可分为细胞间信息物质与细胞内信息分子。 凡由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质统称为细胞间信息物质，即第一信使，按照细胞分泌信息物质的方式又可将细胞间信息物质分为神经递质、内分泌激素、局部化学介质和气体信号分子。在细胞内传递细胞调控信号的化学物质称为细胞内信息物质，其组成多样化。通常将Ca2+、cAMP、cGMP、DAG、IP3、Cer、花生四烯酸及其代谢物等这类在细胞内传递信息的小分子化合物称为第二信使。责细胞核内外信息传递的物质称为第三信使，能与靶基因特异序列结合，发挥着转录因子或转录调节因子的作用。 研究发现一些信息物质能与位于分泌细胞自身的受体结合而起调节作用，称为自分泌信号。如肝癌细胞能分泌多种血管生成因子，其中VEGF是目前发现的刺激肿瘤血管形成最重要的促进因子，研究表示，肿瘤细胞分泌的VEGF除选择性作用于肿瘤血管内皮细胞上的特异性VEGF受体（Flt-1和KDR），通过酪氨酸激酶介导的信号转导，调控内皮细胞分化和血管形成外，肿瘤细胞自身也有VEGF受体的表达，而且针对VEGF及其受体的干预措施可以改变这些肿瘤细胞的体外增殖活性和其他生物学特征，这些研究表示肿瘤中存在VEGF的自分泌机制【2】。自分泌所产生的信息物质也具有其独特而重要的生理功能。4. 受体分类及与受体相关的信息转导途径 受体是细胞膜上或细胞内能识别生物活性分子并与之结合的成分，他能把识别和接受的信号正确无误地放大并传递到细胞内部，进而引起生物学效应。存在于细胞质膜上的受体称为膜受体，化学本质绝大部分是糖镶嵌蛋白；位于胞液和细胞核中的受体称为胞内受体，它们