酶联免疫吸附分析技术及其在食品农药残留
检测中的应用
杜小粉，董 全*
(西南大学食品科学学院，重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400716)
摘 要：农药残留对食品安全的影响越来越明显，这就对食品农药残留的快速检测提出高要求。本文主要介绍酶联免疫分析技术的基本原理以及建立酶联免疫技术的关键技术，并对其在食品农药残留检测中应用进行综述。关键词：酶联免疫吸附技术；农药残留；检测
Application of Enzyme-linked Immunosorbent Assay in Detection of Pesticide Residues in Foods
DU Xiao-fen ，DONG Quan*
(College of Food Science, Southwest University, Chongqing Special Food Engineering and Technology Research Center, Chongqing
400716, China)Abstract ：The negative effects of pesticide residues on food safety have become more and more obvious, so high requirements have been made for the rapid detection of pesticide residues in foods. This article introduces the basic principle of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the key technologies for the establishment of ELISA, and reviews the applications in the detection of pesticide residues in foods.
Key words ：enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)；pesticide residue ；detection
中图分类号：S481.8 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)17-0330-04
收稿日期：2009-07-03
基金项目：重庆市科技攻关项目(2009AC0008)
作者简介：杜小粉(1985－)，女，硕士研究生，研究方向为食品发酵与酶工程。E-mail ：boaiwuzhuang@https://www.doczj.com/doc/9f8491368.html, *通讯作者：董全(1962－)，男，教授，博士，研究方向为农产品加工与贮藏工程。E-mail ：dongquan@https://www.doczj.com/doc/9f8491368.html,
民以食为天，随着经济的发展和人们生活水平的提高，人们对食品的质量安全要求也逐渐提高。随着全球经济一体化发展和贸易国际化，食品安全问题已延伸为全球性公共问题。尤其是近年来，食品安全事件大量发生，如何确保食品的安全性成为食品行业面临的重要课题。
药物和有害化学添加剂的残留是引起食品安全问题的一个重要因素。我国是农业大国，为保证农业的丰产丰收，农药的使用必不可少，从而造成食品尤其是果蔬中农药残留污染。农药残留是农药使用后残存在生物体、食品和环境中农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称[1]。我国常用的农药以杀虫剂最为广泛，毒性也较其它农药大。常用的杀虫剂主要有：有机氯杀虫剂、有机磷杀虫剂、氨基甲酸酯类杀虫剂、拟除虫菊酯类杀虫剂等。农药残留对人体具有明显的急、慢性毒性，会直接危害人们的健康。同时农药残留污染还与进出口贸易、国家声誉，乃至社会安定有密切联系。
目前，常用的农药残留检测手段有气相色谱(g a s c h r o m a t o g r a p h y ，G C )、薄层色谱(t h i n l a y e r chromatography ，TLC)、高效液相色谱(high performance liquid chromatography ，HPLC)等。这些方法大多需要对被分析样品进行前处理，且操作复杂，不能满足现场快速检测样品的要求。开发特异性强、灵敏度高、方便快捷、安全廉价的新分析技术极为迫切。1
酶联免疫分析技术
酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay ，
ELISA)是在免疫荧光和组织化学基础上发展起来的新技术。其主要是利用抗原与抗体的高特异性反应，通过合适的载体，使酶标抗原或抗体与待测样品反应，形成酶标抗原抗体复合物，在相应的酶底物参与下，复合物上的酶催化底物使之水解成有色物质。一定条件下，呈色物质与待测物的含量直接相关，因此可以根据呈色物质颜色的深浅，对待测样品进行定性定量分析[2]。
常用的标记酶有：辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化物酶、碱性磷酸酯酶等，这一类酶通常满足以下条件：具有较高的催化专一性和活性；与抗原抗体偶联后不影响自身酶活性和抗原抗体的免疫活性；催化反应的信号产物易检测；价廉易得，对人体无害[3]。
自20世纪70年代初，Engvall等[3]用碱性磷酸酶标记抗原或抗体，建立酶联免疫吸附实验后，这一技术得到了广泛的应用，尤其在药物残留检测方面。对于农药小分子的酶联免疫分析方法的建立，主要包括待测目标化合物的选择、半抗原的设计和合成、人工抗原的合成、抗体制备、测定方法的建立、样本前处理方法和方法评价等步骤，这其中以半抗原的合成、人工抗原的合成、抗体制备最为关键。
1.1抗原的制备
抗原是指能够引起机体特异性免疫应答，并能与相应抗体发生特异性反应的物质，即同时具有免疫原性和抗原性。具有免疫原性的物质也必然具有抗原性，不具有免疫原性只有抗原性的物质称为半抗原。半抗原相当于一个抗原决定簇，即只具有抗原性，能与抗体结合，但不具有免疫原性，不能诱导机体产生免疫应答。抗原分子量一般在10kD以上，主要成分是蛋白质。一般认为，分子量越大，抗原的表面决定簇越多，越有利于免疫应答的产生。抗原的纯度会影响到抗体制备的质量，也会间接影响ELISA的效果。因此，制备稳定且有良好免疫原性的人工抗原是ELISA的关键环节。
农药一般为不含蛋白质的小分子化合物，是只具有抗原性的半抗原，在进行免疫分析之前，还要对其进行结构修饰，使之成为可用的半抗原。典型的半抗原结构中应具备适当末端活性基团，如－N H2、－C O O H、－O H、－S H等，可直接与载体偶联；与载体连接后应保证该特征结构能最大程度地为免疫活性细胞识别和结合，以制备出具有预期选择性和亲合性的抗体；同时还需相应地突出特定农药的结构或者一类农药中共有的结构特征[5]。
半抗原修饰好后，一般要与合适的载体蛋白以共价键偶联，使之具有免疫原性，称之为人工抗原。如果农药分子上不具有所需的活性基团，则需利用化学方法引入制成半抗原，再与载体偶联。常用的载体蛋白有牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、人血纤维蛋白、甲状腺球蛋白、猪血清白蛋白等。常用的偶联方法有：混合酸酐法、碳二亚胺法、重氮化法、戊二醛法等[6-7]。
1.2抗体的制备
抗体是机体受到抗原刺激后，机体体液中产生的能与相应抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体的质量直接影响测定的性能和效率，制备高特异性、高效价的抗体同样也是ELISA中最为关键的环节。目前，较为常见的抗体有多克隆抗体和单克隆抗体。
多克隆抗体是经特定的抗原免疫动物后得到的抗血清抗体，是免疫分析中常用的抗体类型。由单个B细胞增殖形成的群落产生的结构相同、功能均一的抗体称为单克隆抗体。产生抗体的单克隆细胞可在体外无限繁殖，不受动物免疫时间限制。
多克隆抗体的特异性、稳定性以及抗体效价都不及单克隆抗体。苏婧等[8]取免疫小鼠的脾细胞进行细胞融合制备单克隆杂交瘤细胞，产生有机磷农药单克隆抗体。该抗体对于毒死蝉的检出限为0.004μg/ml，对于甲基对硫磷的最低检测限降至0.02μg/ml，而对与半抗原结构差异稍大的辛硫磷和三唑磷的检测限则分别为2.00、3.80μg/ml。
但是单克隆抗体制备涉及细胞培养及细胞融合，对实验条件要求较高，不易制备。多克隆抗体实际也能满足检测的需要，因此，目前ELISA的研究以使用多克隆抗体较多[9-13]。免疫动物一般选用小鼠或新西兰大白兔，免疫途径有腹腔内、淋巴结内、皮下、足底注射等，以皮下或背部多点注射最为常用。
抗体制备好后，需要对抗体进行效价(又称滴度)、亲和力及交叉反应的表征来判断制备的抗体是否有效。效价只可观察到抗原抗体反应时，抗血清的最大稀释倍数；亲和力表示抗原决定簇和抗体结合位点之间的牢固度，亲和常数的范围一般在108～1012L/mol之间；交叉反应是指抗血清对于相应抗原结构相似的抗原的识别能力[1]。
2酶联免疫分析技术类型
EL ISA技术主要有双抗体夹心法、间接法、竞争法、PCR- ELISA法和斑点免疫吸附法等几种类型，其中较为常用的有双抗体夹心法、间接ELISA以及竞争ELISA。
2.1双抗体夹心法
双抗体夹心法主要用于目的抗原的检测。该法要求目的抗原上要具有至少两个抗原决定簇，且这两个抗原决定簇空间上的分布、指向都不相同。通过固定化抗体和酶标抗体分别与抗原上的两个抗原决定簇结合，形成夹心结构，然后加入酶底物显色，从而达到检测目的抗原的目的。该法中固定抗体和酶标抗体与目的抗原均可特异性结合，具有高特异性。
双抗体检测法要求抗原具有多个抗原决定簇，由于农药分子一般都为半抗原，即只有一个抗原决定簇，因此该法不适于农药分子的检测。
2.2间接ELISA法
间接ELISA法常用于检测抗体。先将待测抗体与包被在固定载体上的抗原反应，形成固相免疫复合物，再添加酶标记的抗抗体与免疫复合物中的待测抗体结合，间接给固相免疫复合物引入酶，添加酶底物显色，从而定性定量检测目的抗体。
该法对抗体的要求不高，一般为通用型抗体，因此只需改变包被的抗原即可检测不同的抗体，简单方便。
2.3竞争ELISA法
该法既可检测抗原，也可用于检测抗体。主要通过待测抗原(抗体)与酶标抗原(抗体)竞争性地与固定化抗体(抗原)特异性结合来检测目的抗原(抗体)。由于结合位点一定，待测抗原(抗体)越多，占据的固定化抗体(抗原)上的结合位点就越多，酶标抗原(抗体)与固定化抗体(抗原)的结合就越少。添加酶底物后显色反应颜色就越浅，从而达到定性定量检测待测抗原(抗体)的目的。
3在农药残留检测中的应用
国内外对于农药小分子的免疫分析研究大多集中在针对单个农药小分子进行的半抗原设计和合成及抗体的制备，即一种抗体只对单一目标化合物有特异性识别和检测能力，对于农药多残留的研究还很少。目前，免疫技术在农药检测中的应用研究较多的有：有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类等。
3.1有机磷农药检测
有机磷农药是目前我国使用量最大的农药，常用的有：对硫磷、甲胺磷、敌敌畏、氧乐果、辛硫磷、敌百虫等。有机磷农药多数属于剧毒和高毒类农药，通过抑制生物体内的胆碱酯酶活性，产生迟发性神经毒性，引发运动失调、昏迷、呼吸中枢麻痹，严重可致死亡[14]。农药残留在人体内积蓄后容易引起慢性中毒，出现神经功能紊乱、精神错乱、皮肤刺激等症状，不容小视。
Kolosova等利用单克隆抗体对甲基对硫磷分别进行直接、间接竞争酶联免疫测定，IC-ELISA(indirect com-petitive- ELISA，间接竞争性ELISA )对甲基对硫磷的检出限为0.08ng/ml，所需时间3.5h；DC-ELISA(direct competitive-ELISA，直接竞争ELISA)法的检出限0.5ng/ml，其所需时间仅为1.5h[15]。有人以氯磷酸二乙酯为半抗原与牛血清蛋白偶联生产多克隆抗体，建立有机磷农药的间接竞争酶联免疫吸附试验(IC-ELISA)，对硫磷的检出限降至0.0125μg/ml，嘧啶磷和敌敌畏的检出限分别为0.0116μg/ml和0.048μg/ml，对硫磷、嘧啶磷和敌敌畏样品的回收率都高于90%[16]。王华等[17]研制的用于检测蔬菜中甲胺磷残留的竞争酶联免疫测定试剂盒，检测甲胺磷的最低检测限为0.01μg/ml，线性检测范围为0.01～100μg/ml，与其他有机磷农药交叉反应较小，具有较高的特异性；回收率在93.12%～102%之间，试剂盒在4℃下可保存6个月以上；用碳二亚胺法制备免疫原免疫兔子得到多克隆抗体进行竞争ELISA，检测了三种有机磷农药的残留。甲胺磷和甲基对硫磷的最低检出限都为0.01μg/ml，对硫磷的最低检出限为0.001mg/ml；ELISA 检测添加的农药样品的平均回收率均达到94.74%[18]。3.2氨基甲酸酯类农药检测
氨基甲酸酯类农药是我国当前广泛使用的农药种类之一，其对人体的危害同有机磷农药类似。
吴慧明等[19]研制了一种用于检测土壤中克百威残留量的直接竞争ELISA试剂盒。该试剂盒的最低检测限为0.01mg/L，线性检测范围为0.01～10mg/L。张齐等[20]制备了氨基甲酸酯类杀虫剂速灭威的兔抗血清，建立了定量定性检测速灭威的间接竞争ELISA法。该方法对速灭威的检出限为0.08～0.10μg/L，检测线性范围为1～10000μg/L，可有效的用于农产品中速灭威残留的检测。
3.3拟除虫菊酯类农药检测
拟除虫菊酯类杀虫剂是根据天然除虫菊素结构仿生合成的杀虫剂，目前，使用量仅次于有机磷类杀虫剂。拟除虫菊酯具有神经毒性，人类长期食用含有拟除虫菊酯类农药的食物易造成慢性中毒，对人体具有潜在威胁[21]。
利用碳二亚胺法将半抗原与牛血清偶联制成免疫原，建立联苯菊酯的竞争间接酶联免疫检测，在最佳条件下，联苯菊酯类农药的检出限降至(0.016±0.002)mg/L，与其他菊酯农药无交叉反应[22]。余向阳等[23]以辣根过氧化物酶对兔抗拟除虫菊酯类农药抗体进行标记，建立了可同时检测蔬菜中多种拟除虫菊酯类农药的直接竞争抑制ELISA法。用该方法对南京市场抽取的107个样品进行检测，并与气相色谱法进行比较，直接竞争ELISA阳性检出率为8.46%，而气相色谱法阳性检出率为3.74%。
4结 语
药物残留分析是复杂混合物中痕量组分的分析技术，既需要精细的微量操作手段，又需要高灵敏度的痕量检测技术，难度大、仪器化程度和分析成本高，为药物残留分析带来一定难度。高敏感性的快速检测方法和试剂盒则成为保障无残留的最重要的手段。因此，在生产中趋向于研究更为灵敏、准确、简便、快速的检测方法。
ELISA技术在农药检测方面已得到了初步应用和发展。免疫分析化学技术具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大，多个样品可同时检测、分析费用低、仪器化程度要求不高等特点，在对复杂样品中超微量农药残留分析和现场快速检测方面，检测方法的
不断完善，尤其是亲和力高、特异性强的抗体生产技术也日臻完善，具有广阔的应用前景和开发潜力。目前国外已研制的酶联免疫试剂盒，包括有机磷类、氨基甲酸酯类、硫代氨基甲酸酯类、有机氯类、拟除虫菊酯类等。我国关于农药残留检测试剂盒的研发起步较晚，目前试剂盒的市场多被国外的公司占领，致使样本检测成本较高，极大地限制了试剂盒的应用与推广。
此外，ELISA是建立在抗原抗体反应的特异性基础上，该特异性识别对结构类似的化合物有一定的交叉反应，从而影响检测的有效性，同时，由于其特异性不能同时用于多种成分的检测。在面对未知农药样品的检测时，仍然无能为力，具有盲目性。另外，目前最为常用的为多克隆抗体，其制备虽然便宜、简单，但其特异性和检测效果都不及单克隆抗体，而产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备比较困难，需要大量的人力和费用，仍需进一步研究。
参考文献：
[1]王大宁, 董益阳, 邹明强. 农药残留检测与监控技术[M]. 北京: 化学
工业出版社, 2006: 401.
[2]商博东, 王栩冬, 张维, 等. 酶联免疫吸附法在食品安全分析中的应
用[J]. 中国卫生检验杂志, 2005, 15(11): 1406-1408.
[3]张伟, 袁耀武. 现代食品微生物检测技术[M]. 北京: 化学工业出版
社, 2007: 22-23.
[4]ENGVALL E, PERLMANN P. Enxyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G[J]. Immunochemistry,
1971, 8(9): 871-874.
[5]桂文君. 农药残留ELISA速测试剂盒产业化技术研究: 三唑磷、克
百威ELISA试剂盒研制[D]. 杭州: 浙江大学, 2007: 21-23.
[6]刘冰, 魏松红, 尹晓东, 等. 农药残留酶联免疫吸附分析技术研究进
展[J]. 安徽农业科学, 2007, 35(21): 6484; 6515.
[7]俎晶晶, 屈凌波, 孙武勇. 甲硝唑人工抗原的制备及其ELISA检测
[J]. 动物医学进展, 2007, 28(1): 11-13.
[8]苏婧, 薛小平, 唐蕊华, 等. 一种有机磷农药单克隆抗体的制备及其
特性研究[J]. 环境污染与防治, 2008, 30(4): 24-26.
[9]梁颖, 刘媛, 祝金凤, 等. 甲氧基有机磷杀虫剂广谱特异性抗体的制
备[J]. 分析化学, 2008, 36(5): 647-652.
[10]WANG S T, GUI W J, GUO Y R, et al. Preparation of a multi-hapten
antigen and broad specificity polyclonal antibodies for a multiple pesti-cide immunoassay[J]. Analytical Chimica Acta, 2007, 587(2): 287-292.
[11]ANAND C, PASHA A, SWETHA M D, et al. Development of polyclonal
ELISA for the N-methylcarbamate insecticide bendiocarb[J]. Food and Agricultural Immunology, 2007, 18(1): 39-51.
[12]ZHANG Q, WANG L B, AHN K C, et al. Hapten heterology for a
specific and sensitive indirect enzyme-linked immunosorbent assay for organophosphorus insecticide fenthion[J]. Analytica Chimica Acta, 2007, 596(2): 303-311.
[13]KIM Y J, KIM Y A, LEE Y T, et al. Enzyme-linked immunosorbent
assays for the insecticide fenitrothion-Influence of hapten conformation and sample matrix on assay performance[J]. Analytica Chimica Acta, 2007, 591(2): 183-190.
[14]田园. 快速检测有机磷及氨基甲酸酯类农药的酶生物传感器研究[D].
西安: 陕西师范大学, 2007: 11.
[15]KOLOSOV A Y, PARKA J H, EREMIN S A, et al. Comparative study
of three immunoassays based on monoclonal antibodies for detection of the pesticide parathion-methyl in real samples[J]. Analytica Chimica Acta, 2004, 511(2): 323-331.
[16]TANG J S, ZHANG M, CHENG G H, et al. Development of IC-ELISA
for detection of organophosphorus pesticides in water[J]. Journal of En-vironmental Science and Health Part B: Pesticides Food Contaminants and Agricultural Wastes, 2008, 43(8): 707-712.
[17]王华, 熊汉国, 张丁联, 等. 甲胺磷残留检测直接竞争ELISA试剂盒
的研制[J]. 食品研究与开发, 2007(4): 122-126.
[18]王华. 有机磷农药残留酶联免疫直接竞争检测技术的研究[D]. 武汉:
华中农业大学, 2007: 45-48.
[19]吴慧明, 杨挺, 朱国念. 土壤中克百威残留检测直接竞争ELISA试
剂盒的研制[J]. 浙江大学学报: 农业与生命科学, 2003, 29(6): 634-638.
[20]张奇, 李铁军, 朱晓霞, 等. 氨基甲酸酯类杀虫剂速灭威酶联免疫吸
附分析方法研究[J]. 分析化学, 2006, 34(2): 178-182.
[21]王春梅, 程敬丽, 刘毅华, 等. 拟除虫菊酯类农药免疫分析方法研究
进展[J]. 农药学学报, 2008, 10(1): 15-22.
[22]LI B, SHI H Y, WANG M H. An enzyme-linked immunosorbent assay
for the detection of bifenthrin[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2008, 36(1): 34-38.
[23]余向阳, 骆爱兰, 刘媛, 等. 拟除虫菊酯类农药多残留直接竞争ELISA
建立以初步应用[J]. 分析测试学报, 2008, 27(3): 249-252.
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时问，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量成正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固医学教丨育网整理相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再医学教丨育网整理形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
酶联免疫检测技术的应用 真菌毒素的检测：黄曲霉毒素 B 1 、M 1 以及T-2 毒素，脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素DON )，二乙酰草镰刀菌烯醇(DAS )，玉米赤霉烯酮，赫曲霉毒素A ( OA )。 农药的检测：主要有除草剂与杀虫剂两大类，例如杀暝松( FN )、甲氟磷酸异已酶( SOMAN )、草不绿( Alachor)、西维因( Carbaryl )、多菌灵及克菌丹( Captan )等。 其他类的检测：盐酸克伦特罗，河豚毒素，植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素，苯并( a)芘，抗生素，激素类以及一些营养物质和食品添加剂如麸蛋白( Gliaclin )，酱油蛋白( Soy protein )，花生蛋白(Peanut protein )，牛乳清蛋白( Borine Whey Protein )等。 随着食品工业的发展，对分析检测的要求越来越高，从而也使ELISA 方法将更趋完善。一方面为提高ELISA方法的灵敏度和特异性，制备单克隆抗体的技术的发展，将和ELISA 法互相结合，从而使食品卫生分析达到DNA分子结构水平，促使食品工业的健康发展。 1 放射免疫分析(RIA) 放射免疫法(Radioimmunoassay,RIA)优点是特异性强、灵敏度高、精确、简便易行。它包括以标记抗原(Antigen,Ag)为特点的放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)和以标记抗体(Antibody,Ab)为特点的免疫放射分析(Immunoradiometric assay,IRMA)。前者以液相竞争结合法居多，既测大分子抗原又测小分子抗原；后者以固相法测大分子抗原为主。 最早建立的农药免疫法中，RIA占了很大比重，建立了狄氏剂、艾氏剂、2,4-D 和2,4，5-T、对硫磷和百草枯等农药的放射免疫法。但由于进行RIA需使用昂贵的计数器，存在放射性防护和废物处理等问题，其应用受到较大限制。1982年后发表的农药免疫分析文章，主要是酶免疫分析法。 2 酶免疫法(EIA) 酶免疫法(Enzyme Immunoassay,EIA)是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方法。酶免疫法的检测原理与放射免疫法类似，通过测定结合于固相的酶的活力来测定被测定物的量。用作标记物的酶有辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)和碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase)。酶标试剂制备容易、稳定、价廉。酶免疫分析的灵敏度接近放射免疫技术，而可借助于简单的仪器作定量测定，是目前农药监测中应用最广泛的免疫分析技术。 EIA法包括酶联免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent
酶联免疫吸附测定蛋白浓度 作者姓名 （北京科技大学化学与生物工程学院生物科学与技术系，北京，100083） [摘要]酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ElISA）是目前常用的免疫学检测方法之一，它不仅可以检测抗体，还可以检测抗原。具有敏感性高、特异性强、方法简便、容易观察结果、便于大规模检测的特点，应用范围和程度可与放射免疫分析法相比拟。本实验研究酶联免疫吸附的测量准确度及线性，实验过程中应注意的问题及ELISA技术的应用实例及研究进展。 [关键词]酶联免疫吸附；HRP；分光光度法 酶联免疫吸附测定指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。基本原理是首先使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。然后使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。最后利用酶促反应产生的荧光产物测定吸光度值。利用洗涤的方法，固相载体上形成的抗原抗体复合物与初始加入的包被物浓度或者抗原抗体特异性有关，故最后结合在固相载体上的酶量与样品浓度成一定的比例。故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/mL。常见的ELISA方法有直接法，间接法，双抗夹心法，竞争法等，分别用于不同应用情形及检测需要。 80年代后，随着生物素-亲合素系统（BAS）作用被发现，这一亲和作用被结合应用到ELISA技术上，大大提高了后者反应的灵敏性与专一性。 同时，ELISA技术的研究进展还包括对灵敏度的提高。碱性礴酸酶(AP)一双底物系统并不直接催化有色物质生成，而是使NADP 脱磷酸，生成NAD，NAD进入由醇脱氢酶和黄递酶催化的氧化还原循环，导致深色物质生成。辣根过氧化物酶(HRP)一增强发光显示系统也在原先的方法上有所改进，用纳米金作为底物可使方法灵敏度高上百倍。 ELISA技术在医学中有广泛的应用，如肿瘤学，细菌学，病毒学的检测，在机理研究方面，免疫病理学，内分泌学，血液学的研究中都会用到ELISA技术检测特定分子的存在及含量差别。 1材料和方法 1.1 材料 鼠抗氯霉素（CAP）单克隆抗体。氯霉素-牛血清交联蛋白。牛奶样品。HRP-羊抗鼠Ig。 包被液：0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液（Na2CO3 0.159 克，NaHCO3 0.294克，蒸馏水稀释至100 mL）。 洗涤及稀释液：0.01mol/L pH7.4 PBST 溶液（NaCl8g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，1mL吐温20，0.5mL。蒸馏水加至1000mL）。
实验三酶联免疫吸附试验（ELISA） 一、实验目的 了解ELISA的基本原理，掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。 二、实验原理 将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检血清（抗体），然后加入与其相对应的既有酶活性又有免疫活性的酶标抗体或抗原，它们之间反应后，通过洗涤去掉未结合的标记物。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，酶的降解底物和呈现的色泽在一定条件下是呈正比的，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析，因此可用分光光度计进行测定，计算出参加反应的抗原或抗体的含量，从而达到测定抗原或抗体的目的。 常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色 辣根过氧化物酶（HRP） RZ>3.1 碱性磷酸酶（AP） 邻苯二胺（OPD） 四甲基联苯胺（TMB） 对硝基苯磷酸酯（p-NPP） 橙黄色 蓝色 黄色 棕黄色 黄色 黄色 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。常用的三种类型： 1、间接法测抗体（间接ELISA）
间接法用于测定抗体。它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。 2、双抗体夹心法（双抗夹心ELISA） 双抗体夹心法用于检测抗原。它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。操作：将抗体吸附于固相表面；加抗原，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。底物的降解量＝抗原量。 3、竞争ELISA 竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。 三、主要仪器及试材 以伪狂犬全病毒（PRV）间接酶联免疫吸附试验（PRV－ELISA）为例。 使用猪伪狂犬抗体检测试剂盒。本试剂盒含: 1、包被抗原的微孔板； 2、阴、阳性对照血清； 3、抗猪IgG-HRP结合物； 4、洗涤液； 5、底物A液、B液； 6、终止液； 7、样品稀释液 本实验所需仪器和试剂： 1、酶联免疫测定仪 2、已包被抗原（Ag）的酶标板（PRV蛋白） 3、血清：PRV阳性血清、PRV阴性血清、待检样品血清 4、酶标抗体（E-Ab）：兔抗猪IgG-HRP 5、包被液（0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液）： 1.59g NaCO 3，2.93g NaHCO 3 ，加 ddH 2 O至1000mL 6、洗涤液（0.05% Tween-20的PBS（pH7.4））： 8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na 2HPO 4 ·12H 2 O，0.2g KH 2 PO 4 ，0.5mL吐温-20（Tween-20），加ddH 2 O至1000mL。 7、保温液（含0.1% BSA 的洗涤液）：0.1g 牛血清白蛋白（BSA），洗涤液100mL
影响酶联免疫吸附试验检测结果的原因分析及应对措施 酶联免疫（EliSA）是检验科目前常用的免疫学检测方法之一，其操作方便、简单，不须要特殊设备，使其在各级医院都可应用。但如果忽视了影响其结果的因素，难免会造成假阴性或假阳性的结果。因此了解影响结果的因素，是减少差错事故发生很必要的。 1实验室操作人员的基本素质因素 实验室人员的素质主要包括五个方面：思想素质、文化素质、技术素质、心理素质、身体素质。因为我们是为人服务的，所以我们的职业道德水平直接关系到人们的生命健康和生命安全。如果在工作中出现了张冠李戴，就有可能造成严重后果。其次文化素质和技术素质很重要，我们必须熟练掌握本专业的基本理论和操作技术。还要不断努力学习新的理论知识，努力提高业务水平。有良好的心理素质勇于面对工作中的挫折，在繁忙工作中有条不紊。所以人员素质问题对检验结果有重要的影响因素。 2标本处理因素 实验室人员收到标本后应：“三查七对”，对不符合要求的标本和申请单拒收，合格标本及时分离血清，避免溶血。提取血清时不能混有大量纤维蛋白或细胞成分，对不能及时检测的标本要妥善保存于4℃冰箱，做好原始记录。从冰箱取出的标本要预温至室温，对冰冻的样品要融化好，充分混匀再用。 3操作过程的影响因素 3.1 操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度（保持在18～25℃），反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等，各种条件必须符合要求。 3.2 正确使用加样器，加样器应垂直加入标本或试剂，避免摩擦包被板底部。加样过程中避免液体外溅，血清残留在反应孔壁上，加样器吸头要一次性使用，加样次序要与说明书一致，否则易发生错误，造成实验重复性差。 3.3 手工洗板加洗液时冲击力不能太大，洗涤次数不超过说明推荐的次数，洗涤液在反应孔内滞留的时间不宜太长。不要让洗液造成孔间污染，导致假阴性和假阳性。 3.4 要保证加液量一致，我们在使用时感觉加样器比滴瓶加样准确，滴瓶加液量不准造成显色不一，造成判断错误。 3.5 显色液的量不可过多，加样的工作环境不能阳光直射，加显色液后避光反应，显色液量要合适。 4试剂的影响因素 应选用有国家批准文号，质量保证的产品。试剂要妥善保存于4℃冰箱内，在使用时先恢复至室温，不同批号的试剂组分不宜交叉使用。试剂打开后要在一周内用完，剩余试剂下次用时先检查是否变质，显色剂如被污染变化将造成全部显色，导致错误结果。过期试剂不宜，应做好双份质控品的监测，确保结果的可靠性。 5采取措施，避免差错事故的发生 创造一个良好的工作环境，实验室工作人员应团结友爱，互相关心，互相学习自然心情舒畅，工作情绪高涨。再就是建立完善的质量保证体系，以书面的形式发给每位成员以及临床科室，做到人人熟悉，人人重视影响实验结果的因素，并在操作过程中时刻注意，将质控贯穿到整个实验过程中。制定一系列的制度，用制度管人，明确责任，这样才能提高质量，避免错误结果的发生。
酶联免疫吸附实验ELISA －－操作规则（新手适用） 一、实验目的 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。 二、实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A(1cm 403nm 1%)＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/9f8491368.html, 酶联免疫吸附试验（ELISA）注意事项 作者：任小龑 来源：《新校园·上旬刊》2015年第07期 摘要：本文主要探讨了酶联免疫吸附试验（ELISA）中常见的影响因素，对学生实验中常出现的问题进行原因分析，并总结解决办法。ELISA试验操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，有可能导致显色不全、假阴性或假阳性结果。 关键词：酶联免疫;吸附试验;满版 实验室常用固相酶免疫测定方法在1971年最初建立，称为酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunsorbent assay），简称ELISA。原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体的酶标记，以酶催化底物显色来判断结果。 影响酶联免疫测定的因素较多，如标本的采集保存、试剂的准备、加样的技术、温度的 控制、洗涤反应板的方式、显色反应时间的控制等，均可能对试验结果产生很大影响。只有避免这些因素，才能保证试验结果的准确性和可靠性。 一、移液枪的使用 我院免疫实验室常用手动单道移液器。注意事项：（1）吸样前要保证枪头和液体处于相同温度;（2）若容量瓶中的液体太少，可倒入ep管中，方便吸取;（3）严格精确调节方法;（4）安装枪头要垂直插入，左右轻微转动上紧，上下敲击会引起内部的零部件因瞬间强烈撞击而松散;（5）垂直吸液，枪头吸嘴尖端需浸入液面2～4mm以下，一般液体，正向吸液1～2档，粘稠液可反向吸液2～1档，缓慢吸取，控制好弹簧的伸缩速度，太快会产生反冲和气泡，吸取后将移液枪提离液面，停顿1秒钟，观察是否有液滴流出，若有流出，说明有漏气现象;（6）放液时将吸嘴贴到容器内壁并保持10～400倾斜，平稳把按钮压到1档，停约一秒钟到2档，排出剩余液体。 吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，不能突然松开，以防溶液吸入过快而冲入枪体 内腐蚀柱塞造成漏气。 移液枪应轻拿轻放，不能将已吸有液体的移液枪平放或倒置。 不要将按钮旋转出量程，否则会卡住内部机修装置而损坏;长时间不用时建议将刻度调至最大量程，让弹簧恢复原形，可延长使用寿命;定期对移液枪校准。 二、加样
ELISA实验报告 -森贝伽生物实验技术中心前言 酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。该法适于测定细胞培养上清、血清、血浆及组织液中的样本，干扰小可以测到每毫升纳克水平的细胞因子（或受体）的水平。 材料与方法 1材料 1.1主要试剂 ELISA检测试剂盒(From：森贝伽生物/SenBeiJia) 1.2主要仪器及耗材 酶标仪：芬兰（Labsystems Multiskan MS）公司产品 洗板机：芬兰（Thermo Labsystems）公司产品 离心机：微量高速离心机（国产） 移液器：吉尔森P型移液器(Pipetman)产品 培养箱：隔水式恒温培养箱（国产）产品
其他所需耗材均为国产。 2方法 2.1实验过程 （1）标准品的稀释与加样：标准品按照说明书稀释好五个梯度，各个梯度每孔加样量都为50μL； （2）加样：分别设空白孔、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀； （3）温育：用封板膜封板后置37℃温育30min； （4）配液洗涤：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30sec 后弃去，如此重复5次，拍干； （5）加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外； （6）温育：用封板膜封板后置37℃温育30min； （7）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30sec 后弃去，如此重复5次，拍干； （8）显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min； （9）终止：每孔加终止液50μL，终止反应； （10）测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15min以内进行。 2.2计算 以标准物的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，计算出标准曲线的多项式二次回归方程，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 实验结果举例（相关技术问题可咨询我们） 编号OD值浓度（ng/L） 空白0.0320
ELISA Lin Chengyu Bio 04 2010030007 Experiment Date: 2012-03-12 Submitting Date: 2012-03-21 1Introduction 1.1Background information ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) is a solid-phase assay for antibodies employing ligands labeled with enzymes which is widely used for immunological assays. This technique can be applied to detect antigens or antibodies for qualitative or quantitative purpose. Since enzyme reactions are very well known amplification processes, the signal is generated by enzymes which are linked to the detection reagents in fixed proportions to allow accurate quantification.1 1.2Major principles Figure 1 Schematic diagram of ELISA2 Figure 2 Procedure of indirect ELISA3
ELISA酶联免疫吸附试验在动物生产过程中的 应用 简介 随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，大大提高了ELISA的特异性，由于电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。 基本原理 ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
特性 用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。如今应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。 辣根过氧化物酶 过氧化物酶（HRP）广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40 000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH 值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm。 酶的纯度以RZ表示：RZ=OD403/OD275 纯酶的RZ多在3.0以上，最高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占 75%，不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：⑴邻苯二胺（OPD），产物为橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓硫酸终止反应，颜色可在数小时内不改变,是目前国内ELISA中最常用的一种；⑵联大茴香胺（OD），产物为橘黄色，最大吸收值在400nm，颜色较稳定；⑶5－氨基水杨酸(5－AS）：产物为深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性较差；⑷邻联甲苯胺（OT）产物为蓝色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，
elisa酶联免疫吸附实验报告 一．实验目的 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。 二．实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。 ELISA的基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为
酶联免疫吸附试验及其应用 作者：鲍行豪 一、前言 近二十几年来，免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法（Enzyme—Linked Immunosorbent Assay，ELISA），本法自70年代初期由VAN WEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相继分别报道后，现已引起广泛重视。 ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA 法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。 二、方法的基本原理和种类 ELISA的基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正 比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 由于ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有特异性。
大学实验报告酶联免疫吸附试验 学院： 专业： 姓名： 学号：
一．实验原理 酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种用酶标记抗原或抗体的方法，此法是将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的技术，可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体。基本原理如下：①先使用抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或酶标抗体即保留了其免疫活性，又保留了酶活性；③试验时，把受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原或酶标抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤法去除固相载体上的游离物质，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的多少有关。当加入酶反应的底物后，底物被酶催化而产生有色物质。颜色反应深浅与受检抗原或抗体的量成正比。因此，可借助颜色反应的深浅来定性、定量抗体或抗原。本技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。 图1 ELISA实验原理示意图 二．实验材料 BSA抗原、兔抗BSA抗体（一抗，分别用PBS稀释成1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256七个浓度）、酶标羊抗兔IgG（二抗）、0.05M PH9.6碳酸盐包被缓 冲液、洗涤液（PBS）、底物溶液、2mol/L H 2SO 4 。
三．实验方法 1.包被板的处理：加BSA（包被缓冲液稀释为10μg/ml）至酶标板中，每孔100μl，置湿盒中4℃过夜。第二天取出，用PBS洗涤3-4次。 2.取包被好的酶标板，在第一孔中加入100μl PBS作阴性对照，在第2-8孔加入上述稀释的一抗各100μl，置37℃保温1h。 3.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入二抗各100μl，置37℃保温30min。 4.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入底物溶液各100μl，在暗处37℃避光显 色20min，最后加入50μl、2M H 2SO 4 终止反应。 5.在波长490nm处，测定各孔的光密度吸收值。 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在检测仪上，于490nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 四．实验结果 表1 酶联免疫吸附OD值检测表 目测各孔颜色较浅;检测其OD值结果如上表所示，各孔OD值与阴性对照之比都小于2.1，全部为阴性。
酶联免疫吸附实验 一、实验目的 1、用间接竞争酶联免疫吸附实验（ELISA法）测定多抗血清(pAb)敏感性，从而 筛选出融合备用鼠融合前3～5d腹腔注射OTA的计量。 2、采用间接ELISA 法测定pAb效价，采用阻断ELISA法鉴定pAb敏感性，从 而筛选出效价高且IC50（赭曲霉毒素A（OTA）多抗血清对OTA的50%抑制浓度）低的小鼠做细胞融合备用鼠。 3、用间接ELISA 和间接竞争ELISA 筛选出效价高、敏感性好、细胞生长旺盛 的杂交瘤细胞株。 4、采用间接ELISA 法测定单克隆抗体效价，采用阻断ELISA法测定单克隆抗 体敏感性，采用间接ELISA 检测方法进行单克隆抗体同种型及亚类鉴定。 二、实验原理 ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 ELISA法根据种类和变化可分为以下几类：双抗体夹心法、间接法、竞争法、阻断法双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。 在本实验中应用了间接法、阻断法和竞争法，利用酶分子与小鼠血液中的抗体共价结合，在底物的作用下，产生颜色反应，通过颜色的深浅筛选出融合备用鼠融合前腹腔注射OTA的计量和效价高且IC50低的小鼠做细胞融合备用鼠。 三、实验试剂与器材 1、实验试剂 在本测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂） 在此实验中所采用的免疫吸附剂是1μg/mL OTA-OV A；标记物是1:1000 倍用含5% 猪血清的PBST 稀释的50μL/ 孔的GAM-IgG-HRP；显色剂是50μL/ 孔的T M B OTA、牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OV A)、小鼠单抗同种型检测试剂盒美国Sigma公司； 碳化二亚胺(EDC)英国Thermo Scientific 公司； 弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、基础培养基1640、选择培养基HAT、HT、PEG21500美国Invitrogen公司； 羊抗鼠酶标二抗(GAM-IgG-HRP)华美生物工程有限公司； 实验用水为重蒸去离子水
酶联免疫吸附试验（ELISA） 基本原理与结果解释 基本原理： 一、包被 1、固相载体的要求 （1）、结合抗体或抗原的容量大 （2）、抗体或抗原牢固地固定在其表面 （3）、不影响免疫反应性 （4）、利于反应充分进行 （5）、固相方法简便易行，快速经济 2、固相载体的材料：聚笨乙烯 3、包被coating 将抗原或抗体结合于固相载体。 4、封闭blocking 用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附。 二、反应 加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体。 标记酶的要求： (1)、活性高 (2)、性质稳定 (3)、专一性强 (4)、酶催化底物的显色信号易于判断和测量 (5)、方法敏感，重复性好，简单易行 (6)、酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 常用酶 辣根过氧化物酶HRP（ELISA中应用最为广泛的标记用酶） 三、洗涤
使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离。 四、底物显色 HRP DH2+H2O2—————→D+2H2O H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高。供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种。 常用底物：四甲基联苯胺TMB 四甲基联苯胺TMB是ELISA中应用最广泛的底物。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性。 常用方法与原理 一、双抗体夹心法 方法： 用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等 二、双抗原夹心法 原理：类似双抗体夹心法 操作步骤：类似双抗体夹心法 应用：乙型肝炎表面抗体
实验六酶联免疫吸附测定法 摘要：酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术 (immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，具有操作简便、灵敏性高等优点，是生物化学等领域检验的常规测定方法。本实验采用ELISA间接竞争法对牛奶中鼠抗氯霉素（CAP）进行了检测和分析。 关键词：酶联免疫吸附测定鼠抗氯霉素检测 60 年代初期，Averameas 及Ram 等在不破坏酶的催化活性及免疫球蛋白的免疫活性或 蛋白质结构的前提下，利用特殊的交联剂将辣根过氧化物酶（HRP）与人血清白蛋白（HSA）连接在一起，后来又用酸性磷酸酯酶（AP）与抗体（Ab）结合，这些结合物统称为酶标记 物或酶结合物，被用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定，从此建立了免疫酶技术。1971 年瑞典的Engvall 和荷兰的Van Weeman 等人使抗体与溴化氰激活的纤维素结合或使抗体吸附于聚苯乙烯试管上制成固相免疫吸附剂（固相载体），再与免疫酶技术结合，建立了酶联免疫吸附测定法，用于检测抗体或抗原。1974 年Voller 等用聚苯乙烯微量反应板作为吸附载体吸附抗体（抗原），再与相应的酶标记物结合，使ELIS A 操作更方便，易重复，灵敏度可高达ng （10-9g）至pg（10-12g），并且所需仪器设备简单，因而成为生物化学，临床医学检验的常规测定方法之一，原则上ELISA 可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。在实际应用方面可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断鉴定等。因此，它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行病学及传染病学等方面密切相关。ELISA 过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。ELISA 常用的测定方法主要有直接法和间接法两种：直接法是酶标记抗体与待检测样本中固相抗原直接作用，加入底物后，显色(其颜色深浅与样本中抗原量成正比)；间接法是使已知抗原吸附在固相载体上，与待检测样本中的抗体作用，再加入酶标记抗同种动物抗体的免疫球蛋白(二抗)，使与特异抗原抗体复合物中的抗体作用，加入酶底物，显色(颜色深浅与样本中抗体量成正比)。ELISA 有许多改良方法, 如夹心法( sandwich ELISA) 、双抗体夹心法( double-antibody sandwich technique) 、竞争法、酶- 抗酶法和均质法(homogeneousELISA) 、生物素- 亲和素放大系统(biotina-vidin system, BAS) ELISA 及斑点- ELISA ( dot-ELISA)等。常用方法大致可分为三类：(a) 测定抗体的间接法；(b)测定抗原的双抗体夹心法；(c) 测定抗原的竞争法。前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原，适用于临床诊断上，而竞争法是测定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食品分析。竞争酶联免疫吸附分析法又可分为直接竞争法和间接竞争法。直接竞争法主要有三步：抗体吸附于固相载体，温育后清洗→加入含有抗原的待测液及酶标记的抗原，温育后清洗→加入酶底物温育后显色，判断结果。间接竞争法主要有四步：抗原吸附于固体载体，温育后清洗→加入含有抗原的待测液和抗体，温育后清洗→加入酶标记抗体，温育后清洗→加入酶底物温育后显色，判断结果。 影响ELISA 测定结果的因素主要包括以下几点： (1) 抗原：在ELISA 中，包被于固相载体表面的抗原或抗体的来源和制备方法对试验结
酶联免疫吸附测定法（ELISA） 1.定义 (3) 2.原理 (3) 2.1抗原抗体反应 (3) 2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5) 3.ELISA的类型 (5) 3.1双抗体夹心法测抗原： (6) 3.2双抗原夹心法测抗体 (6) 3.3间接法测抗体 (6) 3.4竞争法测抗体 (7) 3.5竞争性测抗原 (7) 3.6捕获包被法测抗体 (7) 3.7ABS-ELISA法 (8) 4.ELISA试剂的组成 (9) 4.1固相载体： (9) 4.2包被的方式 (9) 4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。 (10) 4.4包被的条件： (10) 4.5洗涤液： (10) 4.7酶的催化性； (11) 4.8结合物的制备 (11) 4.9结合物的保存 (12) 4.10酶的底物 (12) 4.11酶反应终止液 (12) 4.12参考标准品 (13) 4.13加样： (13) 4.14保温 (13)
4.15保温方式： (13) 4.16室温温育的反应 (13) 4.17洗涤 (14) 4.18显色 (14) 4.19比色 (14) 4.20酶标比色仪 (15) 4.21结果判定 (15) 4.22定量测定 (16) 4.23ELISA的操作要点 (16)
1.定义 酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。 2.原理 采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。 2.1抗原抗体反应 2.1.1可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原和抗体均能保持原有的结构和活性。 2.1.2特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。因此，在很多时候，测定某一特定的物质不需分离待测物。2.1.3最适比例 只有当抗原抗体的浓度比例是当时，才出现可见反应。 以沉淀反应为例（Ab量固定，Ag量递增）