酶联免疫吸附测定与酶联免疫印迹技术
酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）和酶联免疫印迹技术（Enzyme-Linked Immunoblotting Assay，Western Blotting）是生物医学研究中常用的两种实验技术。它们能
够高度敏感地检测和定量目标分子，被广泛应用于疾病诊断、药物研
发等领域。
ELISA是一种非常灵敏、特异性强的免疫测定方法，主要用于检测和定量分析抗原或抗体。其原理是将特定的抗原或抗体在微孔板表面
吸附，并通过特异性抗体与样本中的目标分子发生反应。这种方法可
以测定多种生物分子，如蛋白质、肽、荷尔蒙、病毒、细菌等，具有
高灵敏度、高精确度以及自动化程度高的优点。ELISA广泛应用于生物医学研究中，如激素水平的检测、感染病原体的筛查、自身免疫疾病
的诊断等。
而Western Blotting则是一种用于检测和分离蛋白质的方法。首先，通过电泳将复杂的蛋白质混合物分离成单一的蛋白带，然后将其
转移到聚丙烯酰胺凝胶上。接下来，使用特异性抗体与目标蛋白质结合，并通过酶标记的次抗体来检测和定量目标蛋白质。Western
Blotting不仅能够确定蛋白质的相对分子量，还可以检测目标蛋白质
的存在和表达水平。这种方法在肿瘤学、免疫学、分子生物学等领域
具有重要的应用价值。
ELISA和Western Blotting在生物医学研究中有着重要的应用价
值和指导意义。两者都具有高灵敏度和高特异性的优点，可以准确地
检测和定量目标分子。通过ELISA技术，我们可以快速、有效地检测
抗原或抗体的存在和浓度，对疾病的诊断和治疗起到重要的辅助作用。而Western Blotting则提供了一种准确分析蛋白质表达和功能的手段，对深入了解疾病发生机制、药物的作用和效果等方面具有重要的指导
意义。
总之，ELISA和Western Blotting是两种非常重要的生物医学实
验技术。它们的应用能够帮助我们更深入地了解疾病的发生机制、药
物的作用机制，并为疾病的治疗和预防提供有力的支持。随着科学技
术的不断发展，相信ELISA和Western Blotting在生物医学研究中的
应用将会更加广泛和深入。
酶联免疫吸附测定与酶联免疫印迹技术 酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）和酶联免疫印迹技术（Enzyme-Linked Immunoblotting Assay，Western Blotting）是生物医学研究中常用的两种实验技术。它们能 够高度敏感地检测和定量目标分子，被广泛应用于疾病诊断、药物研 发等领域。 ELISA是一种非常灵敏、特异性强的免疫测定方法，主要用于检测和定量分析抗原或抗体。其原理是将特定的抗原或抗体在微孔板表面 吸附，并通过特异性抗体与样本中的目标分子发生反应。这种方法可 以测定多种生物分子，如蛋白质、肽、荷尔蒙、病毒、细菌等，具有 高灵敏度、高精确度以及自动化程度高的优点。ELISA广泛应用于生物医学研究中，如激素水平的检测、感染病原体的筛查、自身免疫疾病 的诊断等。 而Western Blotting则是一种用于检测和分离蛋白质的方法。首先，通过电泳将复杂的蛋白质混合物分离成单一的蛋白带，然后将其 转移到聚丙烯酰胺凝胶上。接下来，使用特异性抗体与目标蛋白质结合，并通过酶标记的次抗体来检测和定量目标蛋白质。Western Blotting不仅能够确定蛋白质的相对分子量，还可以检测目标蛋白质 的存在和表达水平。这种方法在肿瘤学、免疫学、分子生物学等领域 具有重要的应用价值。
ELISA和Western Blotting在生物医学研究中有着重要的应用价 值和指导意义。两者都具有高灵敏度和高特异性的优点，可以准确地 检测和定量目标分子。通过ELISA技术，我们可以快速、有效地检测 抗原或抗体的存在和浓度，对疾病的诊断和治疗起到重要的辅助作用。而Western Blotting则提供了一种准确分析蛋白质表达和功能的手段，对深入了解疾病发生机制、药物的作用和效果等方面具有重要的指导 意义。 总之，ELISA和Western Blotting是两种非常重要的生物医学实 验技术。它们的应用能够帮助我们更深入地了解疾病的发生机制、药 物的作用机制，并为疾病的治疗和预防提供有力的支持。随着科学技 术的不断发展，相信ELISA和Western Blotting在生物医学研究中的 应用将会更加广泛和深入。
实验三酶联免疫吸附试验（ELISA） 一、实验目的 了解ELISA的基本原理，掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。 二、实验原理 将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检血清（抗体），然后加入与其相对应的既有酶活性又有免疫活性的酶标抗体或抗原，它们之间反应后，通过洗涤去掉未结合的标记物。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，酶的降解底物和呈现的色泽在一定条件下是呈正比的，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析，因此可用分光光度计进行测定，计算出参加反应的抗原或抗体的含量，从而达到测定抗原或抗体的目的。 常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色 辣根过氧化物酶（HRP） RZ>3.1 碱性磷酸酶（AP） 邻苯二胺（OPD） 四甲基联苯胺（TMB） 对硝基苯磷酸酯（p-NPP） 橙黄色 蓝色 黄色 棕黄色 黄色 黄色 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。常用的三种类型： 1、间接法测抗体（间接ELISA）
间接法用于测定抗体。它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。 2、双抗体夹心法（双抗夹心ELISA） 双抗体夹心法用于检测抗原。它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。操作：将抗体吸附于固相表面；加抗原，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。底物的降解量＝抗原量。 3、竞争ELISA 竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。 三、主要仪器及试材 以伪狂犬全病毒（PRV）间接酶联免疫吸附试验（PRV－ELISA）为例。 使用猪伪狂犬抗体检测试剂盒。本试剂盒含: 1、包被抗原的微孔板； 2、阴、阳性对照血清； 3、抗猪IgG-HRP结合物； 4、洗涤液； 5、底物A液、B液； 6、终止液； 7、样品稀释液 本实验所需仪器和试剂： 1、酶联免疫测定仪 2、已包被抗原（Ag）的酶标板（PRV蛋白） 3、血清：PRV阳性血清、PRV阴性血清、待检样品血清 4、酶标抗体（E-Ab）：兔抗猪IgG-HRP 5、包被液（0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液）： 1.59g NaCO 3，2.93g NaHCO 3 ，加 ddH 2 O至1000mL 6、洗涤液（0.05% Tween-20的PBS（pH7.4））： 8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na 2HPO 4 ·12H 2 O，0.2g KH 2 PO 4 ，0.5mL吐温-20（Tween-20），加ddH 2 O至1000mL。 7、保温液（含0.1% BSA 的洗涤液）：0.1g 牛血清白蛋白（BSA），洗涤液100mL
几种常用的抗体检测方法 常用的抗体检测方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光法、免疫组化法、免疫印迹法（Western blotting）、流式细胞术等。下面将对这些方法进行详细介绍。 1.酶联免疫吸附试验（ELISA）： ELISA是一种常用的抗体检测方法。它利用酶标记二抗与被测物中特异性抗体结合，通过酶的底物反应来检测被测抗体的存在。ELISA有直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、夹心ELISA等多种变种。这些变种根据目标抗体、需求灵敏度、特异性等因素选择适当的方法。 2.免疫荧光法： 免疫荧光法利用荧光染料标记的抗体与特定抗原结合，利用荧光显微镜观察样本中的荧光信号。它分为直接免疫荧光法和间接免疫荧光法。直接免疫荧光法直接将荧光素标记于抗体上，观察样本中的荧光信号。间接免疫荧光法则是先用一抗结合目标抗原，再用荧光素标记的二抗来检测一抗的位置。 3.免疫组化法： 免疫组化法是一种用于检测细胞或组织样本中特定抗原的方法。它利用抗原与抗体的特异性结合来检测目标蛋白的分布。在免疫组化中，一般使用免疫荧光或酶标记的二抗来观察抗原的位置。通过对显微镜观察或图像分析，可以得出目标蛋白的表达情况。 4. 免疫印迹法（Western blotting）：
免疫印迹法是一种用于检测特定蛋白质的方法。通过将细胞或组织溶解后的蛋白质样品进行SDS-电泳分离，然后将分离的蛋白转移到膜上，并使用特异性抗体与目标蛋白结合，再用酶标记的二抗或放射性同位素进行信号检测。通过观察带有目标蛋白的免疫印迹图谱，可以确定特定蛋白的存在及其表达量。 5.流式细胞术： 流式细胞术是一种可以通过检测细胞表面或细胞内特定抗原的方法。它结合了免疫磁珠的标记和激光生物学。通过将样本中的细胞和抗体共孵育，利用流式细胞仪来检测细胞检测物的存在以及细胞表型特征。流式细胞术可以用于单细胞检测、免疫细胞表型分析、测定细胞凋亡等方面。 总结起来，常用的抗体检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光法、免疫组化法、免疫印迹法（Western blotting）、流式细胞术等。每种方法都有其特点和适用范围，在科学研究、临床诊断和生物制药领域得到广泛应用。这些方法的发展与改进，对于抗体检测的敏感性、特异性和高通量化带来了更好的效果，为科学研究和临床诊断提供了可靠的检测手段。
临床医学检验新技术
酶联免疫分析技术 酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)技术自20 世纪70年代初问世以来，发展非常迅速，目前被广泛应用于免疫学、医学、生物学等许多领域。ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。 技术原理：酶联免疫吸附试验是一种固相免疫测定技术，其先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，后加入酶标抗体与免疫复合物结合，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。 根据检测目的和操作步骤不同，有双抗体夹心法、间接法、竞争法三种类型的常用方法。 临床应用：ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。 1、病原体及其抗体的检测病毒感染如肝炎病毒，巨细胞病毒，风疹病毒，疱疹病毒，轮状病毒，艾滋病病毒（HIV）等。细菌感染如链球菌，布氏杆菌等。寄生虫感染如阿米巴、弓形虫、锥虫等。 2、蛋白质如各种免疫球蛋白，肿瘤标志物如甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺碱性磷酸酶，激素如hCG, FSH, TSH, hGH, 酶如肌酸激酶-MB，其他蛋白质如铁蛋白等。 3、非肽类激素如T3, T4，雌二醇，皮质醇等。 4、药物治疗心脏病药物如地高辛，抗哮喘药物如茶碱，抗生素如庆大霉素等。
项目十二酶免疫技术 一、酶联免疫吸附试验 (Enzyme linked immunosorbent assay) 【实验原理】 酶联免疫吸附试验(ELISA)为一固相酶免疫测定技术，先将已知抗原或抗体包被于固相载体表面，与待检样品中的相应抗体或抗原发生反应，再加入酶标抗体与免疫复合物结合，最后加入酶反应底物，根据产物颜色深钱或测定吸光度(A)值，可进行定性或定量分析。实验的方法类型有双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。本试验只介绍间接法和双抗体夹心法。 (一)间接法 【试剂和器材】 1．PBS (pH7.4，0.01mol/L) 取81.0 ml 0.2 mol/L Na2HPO4，加入19.0 ml 0.2mol/L NaH2PO4和17g NaCl，再加入蒸馏水1900 ml混匀即可。 2．包被缓冲液pH 7.4 0.01 mol/L PBS，其中加入终浓度为0.1g/L的柳硫汞。 3．洗涤液pH 7.4 0.01 mol/L PBS，加入终浓度为0.05%的Tween-20 。 4．封闭液含1%牛血清白蛋白(BSA)的洗涤液。 5．稀释液含0.25% BSA的洗涤液。 6．底物缓冲液(pH5.0) 取0.2mol/L Na2HPO4 25.75 ml，加入0.1mol/L柠檬酸24.25 ml。 7．底物溶液取40mg邻苯二胺(OPD)溶于100ml 底物缓冲液中, 加入40μl 30% H2O2。临用时配制，该底物对光敏感，须避光保存。 8．终止液0.5 mol/L H2SO4。 9．混合正常人血清、兔抗人全血清、正常兔血清、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG抗体。 10．聚氯乙烯酶标板、微量移液器、试管、湿盒、酶标仪、微量震荡器。 【步骤和方法】 1．包被将混合正常人血清用包被缓冲液1:400稀释，加于酶标板中，每孔100μl，置4℃16~18h。 2．封闭弃去包被液，每孔加入封闭液200μl，置湿盒，37℃2~3h。用洗涤液洗涤3次，每次2~3min。 3．加样用稀释液将兔抗人全血清做1:50~1:12800系列倍比稀释，将正常兔血清做1:100稀释，分别加入板孔中，并同时设立空白对照孔(加入稀释液)，每孔100μl，震荡混匀30s，置37℃30~60 min。同上用洗涤液洗3次。 4．加酶标抗体将酶标抗体用稀释液适当稀释，每孔加100μl，震荡混匀，置37℃30~60min，用洗涤液洗3次。 5．显色每孔加入底物溶液100μl，室温避光反应10~30min，每孔加入终止液50μl。 【结果判定】 1．肉眼观察样本孔颜色较明显深于阴性对照孔为阳性。 2．用酶标仪测各孔A492值，测定孔与阴性孔A比值≥2.1为阳性。 3．以终点滴度报告结果。 【注意事项】 1．必须注意固相载体的选择，要求板孔之间在同样反应条件下颜色反应的吸光度值的偏差在平均吸光度的±10%以内，阳性和阴性标本的颜色反应要相差明显，吸光度值相差应
酶联免疫吸附测定法（ELISA） 1.定义 (3) 2.原理 (3) 2.1抗原抗体反应 (3) 2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5) 3.ELISA的类型 (5) 3.1双抗体夹心法测抗原： (6) 3.2双抗原夹心法测抗体 (6) 3.3间接法测抗体 (6) 3.4竞争法测抗体 (7) 3.5竞争性测抗原 (7) 3.6捕获包被法测抗体 (7) 3.7ABS-ELISA法 (8) 4.ELISA试剂的组成 (9) 4.1固相载体： (9) 4.2包被的方式 (9) 4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。 (10) 4.4包被的条件： (10) 4.5洗涤液： (10) 4.7酶的催化性； (11) 4.8结合物的制备 (11) 4.9结合物的保存 (12) 4.10酶的底物 (12) 4.11酶反应终止液 (12) 4.12参考标准品 (13) 4.13加样： (13) 4.14保温 (13)
4.15保温方式： (13) 4.16室温温育的反应 (13) 4.17洗涤 (14) 4.18显色 (14) 4.19比色 (14) 4.20酶标比色仪 (15) 4.21结果判定 (15) 4.22定量测定 (16) 4.23ELISA的操作要点 (16)
1.定义 酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。 2.原理 采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。 2.1抗原抗体反应 2.1.1可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab 的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原和抗体均能保持原有的结构和活性。 2.1.2特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。因此，在很多时候，测定某一特定的物质不需分离待测物。 2.1.3最适比例 只有当抗原抗体的浓度比例是当时，才出现可见反应。 以沉淀反应为例（Ab量固定，Ag量递增）
生物医学中的免疫检测技术及其应用 免疫检测技术是生物医学领域中不可或缺的一部分，可以用于检测生物体内的抗体、药物、蛋白质等。其在许多领域中都有应用，例如医学、生态学以及食品安全等。本文将介绍免疫检测技术的分类、原理及其在医疗领域中的应用。 一、免疫检测技术分类 免疫检测技术可以分为四种类型: 免疫荧光法、酶联免疫检测法、放射性免疫分析法以及免疫印迹分析法。 1、免疫荧光法 免疫荧光法是一种利用特殊的抗体与待检测物相互作用并用荧光显色的技术。这种技术可用于检测单倍体、基因、蛋白质甚至肿瘤等。它的原理是将特定荧光染料标记到抗体上，将该标记抗体与待测物相互作用后，未结合荧光抗体是用荧光显色检测出来开。本方法具有高度的敏感性和特异性，是检测细胞内某些成分的重要方法。 2、酶联免疫检测法 酶联免疫检测法是一种利用抗体与待检测物相互作用，并用酶的反应作为检测结果的技术，这种技术被广泛地应用于医学、生产以及食品安全等领域。该方法的优点在于稳定、成本低、灵敏度和特异度高。 3、放射性免疫分析法 放射性免疫分析法是利用放射性同位素标记化合物来对待测物进行标记，用射线比较测量出样品中同位素标记量的方法。这种方法具有分子水平的敏感度，但缺点在于具有放射性污染的风险。因此，尽管具有高灵敏度，但不被广泛使用。 4、免疫印迹分析法
免疫印迹法是一种常用的生物学实验技术，可以用于鉴定和检测蛋白质和其他 大分子化合物的存在和特性。该方法的操作流程简单，样品处理方便，但灵敏度不如放射性免疫分析法。 二、免疫检测技术原理 免疫检测技术利用特异性的免疫反应检测特定物质。这种技术的原理是抗体与 待检测物质之间的结合反应。抗体可与蛋白质、生物毒素、药物等特定分子作用，形成具有特异性的抗原-抗体复合物。当标记物和待测抗原/抗体发生特异性结合后，通过分析检测标记物、抗原或抗体的指标（如荧光、酶、放射性同位素）以确定待测物质的存在。 三、免疫检测技术在医学领域中的应用 免疫检测技术在医学领域中有着广泛的应用，例如如下: 1. 诊断疾病 免疫检测技术可以用于检测疾病，如癌症、糖尿病、肝炎病毒等。在诊断中， 血清学检测是一种常规的免疫学检测方法，可用于诊断感染和自身免疫疾病。 2. 检测药物 免疫检测技术可以用于检测药物，如肿瘤治疗时，关键是确定何时停用治疗并 从治疗正常化到康复医疗。该方法可检测药物的代谢产物，以判断药物的治疗效果和剂量。 3. 运动员药检和血清测试 免疫检测技术可以用于检测运动员药检和血清测试。对于运动员的药检，需要 快速，灵敏的荧光面板。在血清测试中，ELISA (酶联免疫吸附试验)是目前常用的 血清学检测方法。 4. 疫苗开发和生产
elisa的基本原理方法类型及应用 酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种免疫学的诊断技术，属于发光免疫分析（ FIA） 的一种，它能判断待测物质是否含有某种抗原或抗体。ELISA 是由分子生物学家Peter Perlman在 1969 年发明的，它是由免疫学家和检验室专业人士经过不断改进和发展形成 的一种常见的检测工具。 ELISA 试验有三个主要步骤：配制板（Prepare Plate）、抗体配体结合 （Antibody-Antigen Binding）和检测（Dectection）。首先在特定医学实验室中将待测 抗原或抗体与其他分子结合在反应基片或其他特定容器上。随后，将特异性的抗体结合该 特定的抗原或其抗体，以形成特异性的蛋白质复合物；最后，将一种特定的发光抗体，经 过特定的化学或物理反应，与试剂相结合，从而检测到这种抗原和其抗体。 ELISA 有两种基本类型：一种是检测抗原的ELISA，也被称为酶免疫吸附法（EIA）；另一种是检测抗体的ELISA，也被称为免疫印迹分析（IIA）。酶免疫吸附法（EIA）的主 要特点是反应的时间比较短，因此可以快速地检测特定抗原。它的原理是将适当浓度的待 测抗原与抗原试剂相结合，然后将相互作用的悬液加到对应的孔板上，再将对应的特异性 抗体悬液加到孔板中，当抗体与抗原发生作用时，会形成一个抗体复合物，并产生一个抗 原复合物；最后，将作用到抗原复合物上的特异性发光强度肽或其他发光物质，最终显示 出抗原浓度水平，以便进行分析。而免疫印迹法（IIA）的主要特点是可以对相对浓度较 低的抗体进行检测，可以精确地评估特定的抗体水平。原理是将含有特定酶质的试剂加到 孔板上，然后将抗原悬液加入酶质中，将含有特定抗体的悬液加入酶质中，当与特定抗原 结合时，形成抗体复合物，将特定发光抗体结合到抗原复合物上，从而检测特定抗体水平。 ELISA 应用非常广泛，在生物学、药物学、流行病学等一些领域中都有应用，并且能 够检测出抗原和抗体的小量组分，能够准确的检测出抗原和抗体，从而更有效的同时体现 出检测的准确性。ELISA 艾滋病毒抗体试验用于检测艾滋病毒的感染，也可以用于检测癌 症抗原指数；另外，ELISA 也可用于检测某些微生物抗原指数，如耳部病原体检测等。除 此之外，ELISA 在食品学中也有一定应用，如蛋白质检测、甲反应检测等。 ELISA 技术具有灵敏度高，普遍可行性好以及重复性高，只需短时间就可完成试验， 是目前科学界用来研究和诊断免疫性疾病的主要手段，也是科学研究中最常用的技术和应 用最为广泛的技术之一。ELISA 受到了科学界的广泛关注，已被广泛应用，在临床诊断方 面也发挥了重要作用。
酶联免疫吸附测定与酶联免疫印迹技术 1. 引言 酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）和酶联免疫印迹技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称Western blot）是两种常用的免疫学实验技术。它们在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。本文将对这两种技术进行详细介绍，并比较它们的优势和局限性。 2. 酶联免疫吸附测定（ELISA） 2.1 原理 ELISA是一种通过酶标记的抗体与待测物相互作用来检测目标分子的方法。它主要包括固相吸附、特异性抗体结合、酶标记抗体结合和底物反应四个步骤。 首先，将待测物固定在微孔板上，形成固相吸附。然后，加入特异性抗体与待测物结合。接着，加入酶标记的二抗与特异性抗体结合，形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物。最后，加入底物反应，酶催化底物反应产生可测量的信号。根据信号的强度可以定量测定待测物的浓度。 2.2 应用 ELISA技术在生物医学研究和临床诊断中有广泛的应用。它可以用于检测病原微生物、肿瘤标志物、激素、抗体等多种生物分子。在临床诊断中，ELISA可以用于早期筛查、疾病诊断和疫苗效果评估等方面。在研究中，ELISA可以用于分析蛋白质相互作用、药物筛选和基因表达分析等。 2.3 优势和局限性 ELISA的优势在于其灵敏度高、特异性强、操作简单、结果可定量等特点。它可以同时处理多个样本，适用于大规模实验。此外，ELISA的结果可以通过光学密度或荧光强度来定量，结果可靠。 然而，ELISA也存在一些局限性。首先，ELISA只能检测已知的目标分子，无法发现新的生物标志物。其次，ELISA的结果受到固相吸附和抗体选择的影响，可能存在交叉反应和误差。此外，ELISA对样本的处理和保存要求严格，操作不当容易导致误差。
免疫吸附技术 免疫吸附技术是一种重要的生物技术，广泛应用于生物学、医学、环境科学等领域。本文将从以下几个方面对免疫吸附技术进行介绍。 一、免疫吸附技术的基本原理 免疫吸附技术是利用抗体与抗原之间的特异性结合来实现检测、纯化、定量等目的的技术。抗体是一种特异性识别和结合抗原的蛋白质，而抗原则是引起抗体产生的物质。在免疫吸附技术中，通常使用抗体作为固定相，将其固定在固体表面上，例如微孔板、磁珠等。样品中的抗原与固定在表面上的抗体结合，形成抗原-抗体复合物。通 过检测抗原-抗体复合物的信号，可以实现对目标物质的检测、纯化、定量等目的。 二、免疫吸附技术的种类 1. 酶联免疫吸附法（ELISA） 酶联免疫吸附法是目前应用最广泛的免疫吸附技术之一。其基本原理是将待测物与特异性抗体结合，再加入与抗体结合的酶标记物质，通过酶标记物质的催化作用，将显色底物转化为可见的产物，从而实现对待测物的检测。酶联免疫吸附法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，可应用于医学、生物学等领域的检测。 2. 免疫印迹法（Western blot） 免疫印迹法是一种常用的蛋白质检测技术。其基本原理是将待测蛋白质与特异性抗体结合，再将抗体标记物质与抗原-抗体复合物结合，形成可见的带状图案。免疫印迹法可用于鉴定蛋白质的存在和表
达量，具有灵敏度高、特异性强等优点。 3. 免疫磁珠分离法 免疫磁珠分离法是利用磁珠作为固定相，将抗体固定在磁珠表面上，实现对目标物质的纯化和分离的技术。该技术具有操作简便、纯化效果好、适用于大规模分离等优点。 三、免疫吸附技术的应用 1. 医学领域 免疫吸附技术在医学领域中应用广泛，主要用于检测和诊断疾病。例如，酶联免疫吸附法可用于检测病毒感染、肿瘤标志物等；免疫印迹法可用于检测蛋白质表达及变异等；免疫磁珠分离法可用于纯化蛋白质、细胞等。 2. 生物技术领域 免疫吸附技术在生物技术领域中也得到了广泛的应用。例如，酶联免疫吸附法可用于检测基因表达水平、蛋白质相互作用等；免疫印迹法可用于鉴定蛋白质结构、功能等；免疫磁珠分离法可用于纯化重组蛋白等。 3. 环境科学领域 免疫吸附技术在环境科学领域中也有一定的应用。例如，酶联免疫吸附法可用于检测环境中的污染物，如重金属、农药等；免疫印迹法可用于鉴定环境中的微生物等；免疫磁珠分离法可用于纯化环境中的微生物等。 四、免疫吸附技术的发展趋势
简述酶联免疫吸附试验的原理及基本步骤酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测体内特定抗原或抗体的存在和数量。其原理基于抗原-抗体的特异性结合作用以及酶的催化作用。 酶联免疫吸附试验的原理： 酶联免疫吸附试验主要利用酶作为标记物，将待检测的抗原或抗体与其特异性抗体或抗原结合，再用酶标记抗体或抗原与待检测物结合，形成酶-抗原-抗体或酶-抗体-抗原复合物。最后通过酶反应产生的色素变化或发光信号，来间接或直接定量分析待检测物的含量。 酶联免疫吸附试验的基本步骤： 1.固相抗原或抗体的吸附：在反应板的孔中吸附抗原或抗体。一般采用多孔吸附板作为载体，将抗原或抗体溶液加入孔中，经过一段时间的孵育后，以使抗原或抗体与孔板表面结合。 2.无特异性位点的封闭：将未被吸附的非特异性蛋白质如牛血清蛋白（BSA）添加到孔中，对未被特异性抗原或抗体吸附的区域进行封闭，防止非特异性结合的发生。 3.加入标记物：加入被标记的抗体或抗原，使其与孔中的特异性抗原或抗体发生特异性结合。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。 4.洗涤：用缓冲液洗涤孔中多余的未结合抗体或抗原，降低非特异性背景。
5.底物反应：加入适当的酶底物，酶底物与酶结合发生催化反应，使底物产生颜色或发光等可检测的反应产物。 6.反应终止：加入终止剂，停止底物的反应，防止颜色或发光信号进一步变化。 7.读取结果：使用酶标仪或光度计测定标记物的颜色或发光强度，根据标准曲线计算出待检测物的浓度。 总体来说，酶联免疫吸附试验通过特异性抗原-抗体结合和酶催化反应，可以间接或直接测定体内特定抗原或抗体的含量，具有灵敏度高、特异性强和操作简便等优点，因此在医学诊断、病毒学研究和生物学实验等领域得到广泛应用。
酶联免疫法
酶联免疫吸附实验ELISA 一．实验目的 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。 二．实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表
示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。 ELISA的基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动
线性免疫印迹法和酶联免疫吸附法检测抗核抗体的比较分析研究目的：比较分析使用免疫印迹法检测抗核抗体谱（LIA-ANAs）和酶联免疫 吸附法（ELISA）检测患者血清中抗核抗体水平的特点，以评价两种方法用于辅助诊断自身免疫性疾病（AID）的临床价值。方法：同时使用免疫印迹法和酶联免疫吸附法检测血清抗核抗体的病例3014例，记录每个病例的检测结果及患者的临床诊断。比较两种方法检测抗核抗体的结果，分析其一致性。3014例中选取AID患者123例，健康对照组80例，比较两种方法检测的敏感度和特异度。结果：LIA法与ELISA法检测抗核抗体结果总一致率为92.20%，经Kappa检验，两者具有较好的一致性（Kappa=0.69）。LIA法和ELISA法检测抗核抗体的敏感度分别为82.1%和78.9%，特异性分别为92.5%和90.0%。两种方法检测自生免疫性疾病患者的ANA敏感度和特异度，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：两种方法都具有较高的敏感度和特异度，均可应用于临床检测。两种方法相结合即ELISA法作为初筛试验、LIA法作为确诊试验联合应用更具临床意义。 [Abstract] Objective：To compare LIA and ELISA of detecting antinuclear antibody level in serum in patients，evaluate clinical value for the diagnosis of the two methods in autoimmune diseases（AID）.Method：At the same time，the use of line immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antinuclear antibodies were 3014 cases，clinical diagnosis and detection results recorded for eachcase and patients. Comparison of two methods for thedetection of anti nuclear antibodies，analysis of itsconsistency. In 123 AID patients of 3014 cases were selected，80 healthy controls were detected between the two methods，the sensitivity and specificity.Result：Detection of LIA method and ELISA method of anti nuclear antibodies results the total consistent rate was 92.20%，the Kappa test，two of them have good agreement （Kappa=0.69）. Detection of LIA method and ELISA method，the sensitivity of anti nuclear antibody were 82.1% and 78.9%，specificity of 92.5% and 90.0%. Two methods for detection of spontaneousimmune disease sensitivity and specificity of ANA，no significant difference （P>0.05）.Conclusion：Both the two methods have high sensitivity and specificity and can be applied to clinical testing. Combining two methods that ELISA as a screening test and LIA as a confirmatory test has more clinical significance for AID diagnosis [Key words] Antinuclear antibody；Line immunoassay；Enzyme linked immunosorbent 抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）又称抗核酸抗原抗体，是一组机体针对自身真核细胞的各种成分包括脱氧核糖核蛋白（DNP）、DNA、可提取的核抗原（ENA）和RNA等为靶抗原产生的自身抗体的总称，主要存在与血清中，也可存在于胸水、关节腔液和尿液中[1]。抗核抗体检测主要用于自身免疫性疾病（autoimmune diseases，AID）即一类机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害疾病的辅助诊断，包括有系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿性关节炎（RA）、结缔组织病、干燥综合症、全身性硬皮症和狼疮性肝炎等[2]。抗核抗体
酶免疫测定技术的分类 一、非均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物作为抗体（抗原）的载体，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。 （一）酶联联免疫吸附试验（ELISA） 1.原理 酶联免疫吸附试验（ELISA）是固相酶免疫测定技术中的一种，其基本原理是将待测抗原或抗体先固定于固相载体表面，再用酶标记的抗原或抗体与已被固定的相应抗体或抗原发生特异性反应，加入酶底物和色原后呈色，呈色程度（用A值表示）与待测抗体或抗原的水平呈相关关系。此法常用多孔聚苯乙烯反应板作为固相载体，读取结果需用酶联检测仪。 ELISA试验的结果判定分定性和定量两种。定性是参比阴、阳性对照根据有无呈色报告阴性或阳性，或根据呈色程度作出半定量（1+～4+）报告。这种方法常受操作者的主观因素影响，只适合于大批量体检标本的初筛。目前规定，临床标本的检测，均应用仪器测定后报告。用于定性和定量结果判定的方法主要有： （1）P/N比值： 即待测样本吸光度（A）值-空白对照A/阴性对照A-空白对照A。一般以P/N≥2.1为阳性。
（2）S/CO比值： S为待测样本吸光度（A）值，CO为Cutoff值，常以阴性对照平均A 值×2.1代表CO值。一般以S/ CO≥1.0为阳性，竞争法以S/CO ≤1.0为阳性。 （3）标准曲线单位： 将已知浓度或活性单位的标准抗原或抗体在试验系统中进行反应，分别测定A值，以A值为纵坐标，抗原或抗体水平为横坐标，绘制标准曲线，根据检样的A值由标准曲线获得定量单位。 2.方法 ELISA依据方法和步骤不同可分为以下几种基本反应模式。 （1）间接法： 用于检测样本中特异性抗体。将已知特异性抗原包被于聚苯乙烯板微孔，形成固相抗原；洗弃未交联的抗原（洗板，下同）；加稀释的待检样本，若其中含特异性抗体则与固相抗原结合形成抗原-抗体复合物；洗弃未反应的成分，加酶标记抗抗体（一般为酶标记抗人IgG、抗人IgM或葡萄球菌A蛋白），使在固相载体上形成抗原-待检抗体-酶标记抗体复合物；洗弃未反应的成分，加酶底物-色原呈色，在一定波长下测A值判定待测抗体的有无和水平。该法主要用于抗体的检测，其优点是酶标抗体具有通用性，具体实验步骤如下。