骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记(一)
作者：吴晓林,李冬民,马德茂,张晓田,黄石,宋天保
【关键词】骨髓
【Abstract】AIM:Tostudythedifferentiationcharacteristicsandtheoptimaldosageandtimingforbromodeoxyuridi ne(Brdu)labelingofratbonemarrowderivedmesenchymalstemcells(MSCs)invitro.METHODS:Therat marrowstemcellsisolatedbyusingPercoll(1.073kg/L)wereculturedandproliferated.Thethirdpassage cellswereinducedwithdexamethasome,βglycerophosphate,ascorbicacid2phosphate,IGF1andinsuli n.Onday21,thecellswereanalyzedbyimmunohistochemistryfortypeⅠcollagenandbyhistochemistry foralkalinephosphatase(AKP).ThepurifiedMSCswereincubatedwithBrduatdifferentconcentrations( 5,10and15μmol/L)fordifferenttimeperiods(12，24，48，72and96h),followedbyimmunohistochemistryforBrdutoidentifytheoptimalBrduconcentrationandi ncubationtimeperiod.RESULTS:Afterincubationfor21dforinduceddifferentiationintoosteoblasts,ty peⅠcollagenandAKPwerepositivelyexpressed.Theincubationwith10μmol/LBrdufor72hachievedov er98%ofthelabelingratewithoutproducingobviouscelldamages.CONCLUSION:MSCscanbeinducedt odifferentiateintoosteoblastsundercertainconditionsinvitro.TheoptimalBrdulabelingconcentration andtimeperiodare10μmol/Land72h,respectively.
【Keywords】MSCs;induceddifferentiation;osteoblast;Brdu
【摘要】目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外的诱导分化及5溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记MSCs的可行性.方法：利用密度为1.073kg/L的percoll分离骨髓的单个核细胞，体外培养与扩增MSCs；取生长良好的第3代细胞，用成骨细胞分化培养液培养21d，Ⅰ型胶原免疫组化染色和碱性磷酸酶（AKP）组化染色；分别以浓度为5，10和15μmol/L的Brdu溶液标记MSCs，孵育12，24，48，72和96h后免疫组化检测Brdu，确定最佳标记量和最佳标记时间.结果：诱导分化第21日,AKP染色呈强阳色,Ⅰ型胶原免疫染色呈阳性.10μmol/LBrdu 标记MSCs的效果最好，随着孵育时间的延长，Brdu标记率逐渐增高，标记72h后标记率在90%以上.结论：MSCs在体外一定条件下可定向诱导分化为成骨细胞，用Brdu标记MSCs的最佳浓度为10μmol/L，最佳时间是72h.
【关键词】骨髓间充质干细胞；诱导分化；成骨细胞；5溴脱氧尿嘧啶核苷
0引言
骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞.因MSCs取材方便、对机体的损伤小、具有较强的传代增殖能力和免疫耐受性等特点而受到越来越多的关注.本实验的目的是利用MSCs具有分化潜能的特点，在体外诱导该细胞定向分化为成骨细胞.并用Brdu标记连续传代的MSCs，观察最佳标记时间及标记剂量，从而为追踪Brdu标记的MSCs移植入体内后的存活、生长及分化奠定基础.
1材料和方法
1.1材料健康雄性SD大鼠，体质量55～70g.由西安交通大学医学院实验动物中心提供.
1.2方法
1.2.1大鼠骨髓MSCs的体外分离培养将大鼠引颈处死后置于750mL/L乙醇浸泡约5min，无菌条件下分离出大鼠的股骨和胫骨.用PBS冲洗出骨髓细胞，经5mL针管反复吹打制成单细胞悬液，用200目的不锈钢网过滤，收集滤液.在密度为1.073kg/L的percoll（Phamacia）分离液上缓慢加入收集的滤液，2500r/min离心20min，收集滤液与分离液之间的白膜层细胞，用DMEM（Gibco）洗涤两次，1000r/min离心5min.用加有100mL/L胎牛血清（杭州四季青公司）的DMEM重悬细胞，1×108个/L种于两个直径为6cm的培养皿中培养，2d后更换培养液，加入完全培养基.并将吸出的旧培养液分别移入另两个平皿中继续培养，再过2d更换
成完全培养基.以后每3～4d换液1次，弃去没有贴壁的悬浮细胞.待细胞生长融合到约80%，用0.2g/LEDTA和2.5g/L胰蛋白酶（宝信公司）消化，1∶2传代培养.
1.2.2传代后大鼠MSCs向成骨细胞的分化胰酶消化生长良好的第3代（P3）细胞，以1×107个/L密度种于6cm培养皿中，平皿中预先加入0.5cm×1.0cm无菌盖玻片.待细胞长到约80%融合后，加入含200mL/L胎牛血清的DMEM诱导24h，弃去.加入诱导液，其中含0.1μmol/L 地塞米松、50μmmol/L维生素C,10μmmol/Lβ甘油磷酸钠、IGF1（Chemikon）,胰岛素和100mL/L 胎牛血清.同时，设立正常对照组，只加入含100mL/L胎牛血清的培养基，其余均不加.分别诱导7，14和21d.取出盖玻片，PBS冲洗，40g/L多聚甲醛固定15min.然后应用抗Ⅰ型胶原mAb（Sigma）和ABC法（ABC试剂盒购于北京中杉公司）进行Ⅰ型胶原免疫组织化学染色.加入诱导液组，以PBS和正常鼠血清分别替代一抗作为阴性对照；应用组织化学钙钴法显示碱性磷酸酶（AKP），以不加底物β甘油磷酸钠的孵育液作为阴性对照.
1.2.3Brdu标记MSCs消化P3细胞，以0.5×108个/L将MSCs接种于12孔培养皿，在将要加入Brdu的培养皿中预先放入无菌盖玻片.当细胞铺满皿底40%时加入Brdu（Sigma）溶液，使其终浓度分别为5，10和15μmol/L.孵育12，24，48，72和96h后取出盖玻片，用PBS 冲洗，40g/L多聚甲醛固定15min，应用抗BrdumAb（Sigma）和ABC法进行免疫组织化学染色显示Brdu，除在正常血清封闭前以2mol/L盐酸变性30min外，其余均按试剂盒说明书进行操作.以PBS和正常鼠血清分别替代一抗作为阴性对照.另外，将用10μmol/LBrdu标记的MSCs进行传代培养，观察细胞传代后的标记效果.
胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源 李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1 胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。 胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2 胚胎干细胞为基础的分化模型 胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1 神经细胞 体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化 化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。 参考文献 1 Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147. 2 Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731. 3 Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486. 4 裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)
中国组织工程研究与临床康复 第14卷 第14期 2010–04–02出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research April 2, 2010 Vol.14, No.14 P .O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.doczj.com/doc/964093530.html, 2492 1 Biomedicine Research and Development Centre of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 2 Guangzhou (Jinan)-Hong Kong Joint Laboratory of Cell Engineering, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 3 Asia-Pacific Stem Cell Research Centre Co., Ltd., Hong Kong 999077, China; 4 Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 5 Department of Bioengineering, Clemson University, Clemson, SC 29634-0905, USA He Shao-qing ★, Studying for master’s degree, Biomedicine Research and Development Centre of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; Guangzhou (Jinan)-Hong Kong Joint Laboratory of Cell Engineering, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China heshq106@https://www.doczj.com/doc/964093530.html, 人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化**★△○ 何绍清1， 2，罗振宇1， 2，刘秋英1， 2，周向荣△2， 3，邓铭权△2， 3，罗 新4，姚润斯4，高 志5，王一飞○1， 2 Isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells and differentiation into adipocytes and osteblasts He Shao-qing 1, 2, Luo Zhen-yu 1, 2, Liu Qiu-ying 1, 2, Zhou Xiang-rong 2, 3, Deng Ming-quan 2, 3, Luo Xin 4, Yao Run-si 4, Gao Zhi 5, Wang Yi-fei 1, 2 Abstract He SQ, Luo ZY, Liu QY, Zhou XR, Deng MQ, Luo X, Yao RS, Gao Z, Wang YF. Isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells and differentiation into adipocytes and osteblasts. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(14): 2492-2496. [https://www.doczj.com/doc/964093530.html, https://www.doczj.com/doc/964093530.html,] 摘要 何绍清，罗振宇，刘秋英，周向荣，邓铭权，罗新，姚润斯，高志，王一飞.人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(14):2492-2496. [https://www.doczj.com/doc/964093530.html, https://www.doczj.com/doc/964093530.html,] 0 引言 间充质干细胞具有自我更新能力，能分化成为成骨、软骨、肌肉和脂肪细胞等间质组织细胞[1-3]，甚至能分化为心肌、神经胶质和神经细胞[4-6]。近年来因其在组织工程和细胞替代治疗的临床前研究而备受关注。间充质干细胞分布在体内骨髓和其他组织与器官中，如脂肪组织、脐血，甚至外周血也发现有间充质干细胞 [7-10] 。 目前，骨髓间充质干细胞是最常用的种子细胞，但其数量和分化潜能随着年龄的增长显著减少 和降低[11-13]，并且取材时易对供体造成身体伤害。因此，非常有必要寻找新的自体和异体移植的细胞来源。这种新的细胞除了必须具备骨 髓间充质干细胞有更强的增殖力和多向分化潜能的特点外，还必须取材便利，不易造成病毒污染，且不受伦理道德限制等。 脐带由中胚层发育而来，是胎儿时期连接胎儿和母体的索状结构，外由羊膜包被，内有两条动脉和一条静脉及血管周围富含蛋白多糖和黏多糖的组织组成[14]。分娩后的脐带一直都被当废弃物丢弃，近年来因寻求更多来源的成体干细胞而受到关注。自Mitchell 等[15]提出
骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast，。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次〔1〕；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4～7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells，AS)，在一
胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞
细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养
骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记(一) 作者：吴晓林,李冬民,马德茂,张晓田,黄石,宋天保 【关键词】骨髓 【Abstract】AIM:Tostudythedifferentiationcharacteristicsandtheoptimaldosageandtimingforbromodeoxyuridi ne(Brdu)labelingofratbonemarrowderivedmesenchymalstemcells(MSCs)invitro.METHODS:Therat marrowstemcellsisolatedbyusingPercoll(1.073kg/L)wereculturedandproliferated.Thethirdpassage cellswereinducedwithdexamethasome,βglycerophosphate,ascorbicacid2phosphate,IGF1andinsuli n.Onday21,thecellswereanalyzedbyimmunohistochemistryfortypeⅠcollagenandbyhistochemistry foralkalinephosphatase(AKP).ThepurifiedMSCswereincubatedwithBrduatdifferentconcentrations( 5,10and15μmol/L)fordifferenttimeperiods(12，24，48，72and96h),followedbyimmunohistochemistryforBrdutoidentifytheoptimalBrduconcentrationandi ncubationtimeperiod.RESULTS:Afterincubationfor21dforinduceddifferentiationintoosteoblasts,ty peⅠcollagenandAKPwerepositivelyexpressed.Theincubationwith10μmol/LBrdufor72hachievedov er98%ofthelabelingratewithoutproducingobviouscelldamages.CONCLUSION:MSCscanbeinducedt odifferentiateintoosteoblastsundercertainconditionsinvitro.TheoptimalBrdulabelingconcentration andtimeperiodare10μmol/Land72h,respectively. 【Keywords】MSCs;induceddifferentiation;osteoblast;Brdu 【摘要】目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外的诱导分化及5溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记MSCs的可行性.方法：利用密度为1.073kg/L的percoll分离骨髓的单个核细胞，体外培养与扩增MSCs；取生长良好的第3代细胞，用成骨细胞分化培养液培养21d，Ⅰ型胶原免疫组化染色和碱性磷酸酶（AKP）组化染色；分别以浓度为5，10和15μmol/L的Brdu溶液标记MSCs，孵育12，24，48，72和96h后免疫组化检测Brdu，确定最佳标记量和最佳标记时间.结果：诱导分化第21日,AKP染色呈强阳色,Ⅰ型胶原免疫染色呈阳性.10μmol/LBrdu 标记MSCs的效果最好，随着孵育时间的延长，Brdu标记率逐渐增高，标记72h后标记率在90%以上.结论：MSCs在体外一定条件下可定向诱导分化为成骨细胞，用Brdu标记MSCs的最佳浓度为10μmol/L，最佳时间是72h. 【关键词】骨髓间充质干细胞；诱导分化；成骨细胞；5溴脱氧尿嘧啶核苷 0引言 骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞.因MSCs取材方便、对机体的损伤小、具有较强的传代增殖能力和免疫耐受性等特点而受到越来越多的关注.本实验的目的是利用MSCs具有分化潜能的特点，在体外诱导该细胞定向分化为成骨细胞.并用Brdu标记连续传代的MSCs，观察最佳标记时间及标记剂量，从而为追踪Brdu标记的MSCs移植入体内后的存活、生长及分化奠定基础. 1材料和方法 1.1材料健康雄性SD大鼠，体质量55～70g.由西安交通大学医学院实验动物中心提供. 1.2方法 1.2.1大鼠骨髓MSCs的体外分离培养将大鼠引颈处死后置于750mL/L乙醇浸泡约5min，无菌条件下分离出大鼠的股骨和胫骨.用PBS冲洗出骨髓细胞，经5mL针管反复吹打制成单细胞悬液，用200目的不锈钢网过滤，收集滤液.在密度为1.073kg/L的percoll（Phamacia）分离液上缓慢加入收集的滤液，2500r/min离心20min，收集滤液与分离液之间的白膜层细胞，用DMEM（Gibco）洗涤两次，1000r/min离心5min.用加有100mL/L胎牛血清（杭州四季青公司）的DMEM重悬细胞，1×108个/L种于两个直径为6cm的培养皿中培养，2d后更换培养液，加入完全培养基.并将吸出的旧培养液分别移入另两个平皿中继续培养，再过2d更换
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述 doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011） 2 南方医科大学在读博士（南宁530011） *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸
胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs
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