Advances in Clinical Medicine 临床医学进展, 2018, 8(8), 750-759
Published Online October 2018 in Hans. https://www.doczj.com/doc/949870362.html,/journal/acm
https://https://www.doczj.com/doc/949870362.html,/10.12677/acm.2018.88125
Study of Osteogenesis and Adipogenesis of
Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells by
Diabetic Rats
Jia Chen, Wenlan Yu, Xiaoli Ma, Shumin Xie, Yonglun Liu
Laboratory Animal Center, South China Agricultural University, Guangzhou Guangdong
Received: Oct. 2nd, 2018; accepted: Oct. 17th, 2018; published: Oct. 24th, 2018
Abstract
Objective: To study osteogenesis and adipogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) by diabetic rats during different time periods, and discuss the correlation of diabetic osteoporosis model formation and BMSCs osteogenesis and adipogenesis. Method: Using Streptozotocin (STZ) with higher sugar high fat feedstuff induced diabetic rats model, normal rats as control group.
BMSCs were amplified and purified by whole bone marrow adherent method at 4, 8 and 12 weeks after STZ injection, and the well-grown third-generation cells were selected as the research object of this experiment. Osteogenic induction was used to induce cell differentiation, detecting Alkaline phosphatase (ALP) activity after 7 d; detecting alizarin red staining and ALP and Osteocalcin (Os-teocalcin, OC) mRNA levels after 14 d. Adipogenic induction was used to induce cell differentiation, and after 14 d detecting quantitative analysis of oil red O staining and Lipoprotein lipase (LPL) and peroxisome proliferator activated receptor (PPARγ2) mRNA levels. Results: The ALP activity of di-abetes group significantly decreased, compared with control group, P < 0.05. Calcified nodules of normal control group are significantly higher than the diabetes groups. The OD relative value of ALP
(0.26 ± 0.05) and OC mRNA (0.31 ± 0.09) is lower than the control group (P < 0.01, P < 0.05). After
STZ injection fluid 4, 8, 12 weeks, the adipocyte transformation rate and Oil red O dyeing value of control group is lower than the diabetes group. The OD relative value of LPL (0.89 ± 0.05) and PPARγ2 mRNA (0.38 ± 0.03) is lower than the diabetes group (P < 0.01, P < 0.01). Conclusion: Injec-tion of STZ liquid after 4 weeks, the adipogenesis of diabetic rat BMSCs differentiation capacity in-creased obviously; after 8 weeks, the ossification of diabetic rat BMSCs differentiation capacity de-creased obviously, which may have a certain relationship with the formation of osteoporosis.
Keywords
Diabetes, Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, Osteogenesis, Adipogenesis, Osteoporosis,
The Rat
糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化
陈嘉 等
的研究
陈 嘉，余文兰，马晓莉，谢淑敏，刘永伦
华南农业大学，实验动物中心，广东 广州
收稿日期：2018年10月2日；录用日期：2018年10月17日；发布日期：2018年10月24日
摘 要
目的：研究糖尿病模型大鼠造模后不同时间段骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)的成骨及成脂分化能力的改变，探讨糖尿病模型骨质疏松形成与BMSCs 成骨及成脂分化能力的相关性。方法：利用链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)加高糖高脂饲料诱导制作大鼠糖尿病模型，正常大鼠作为对照组。分别于注射STZ 液4、8、12周后，利用全骨髓贴壁法来扩增和纯化BMSCs ，取生长良好的第3代细胞作为本实验的研究对象。用成骨诱导液诱导细胞分化，培养7 d 后，检测碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)活力，14 d 后，进行茜素红染色及检测ALP 和骨钙素(Osteocalcin, OC) mRNA 含量。用成脂诱导液诱导细胞分化，诱导14 d 后，进行油红O 染色，计算脂肪细胞转化率；进行油红O 染色定量分析；检测脂蛋白脂酶(Lipoprotein Lipase, LPL)和过氧化物酶增殖活化受体(Peroxisome Proliferator Activated Receptor, PPARγ2) mRNA 含量。结果：注射STZ 液8、12周后，糖尿病组ALP 活力明显下降，与对照组比较，P < 0.01。对照组钙化结节数量明显多于糖尿病组。ALP 基因相对OD 值，糖尿病组(0.26 ± 0.05)低于对照组(0.42 ± 0.09)，P < 0.01。OC 基因相对OD 值，糖尿病组(0.31 ± 0.09)低于对照组(0.41 ± 0.06)，P < 0.05。注射STZ 液4、8、12周后，油红O 染色，对照组、糖尿病组镜下观察可见有红色脂滴，对照组脂肪细胞转化率(25.16 ± 5.03)明显低于糖尿病组(66.85 ± 10.01)，P < 0.01。油红O 染色定量分析结果(OD 值)，对照组(0.016 ± 0.015)油红含量明显低于糖尿病组(0.058 ± 0.016)，P < 0.01。LPL 基因相对OD 值，糖尿病组(0.89 ± 0.05)高于对照组(0.22 ± 0.05)，P < 0.01。PPARγ2基因相对OD 值，糖尿病组(0.38 ± 0.03)高于对照组(0.18 ± 0.01)，P < 0.01。结论：注射STZ 液4周以后，糖尿病大鼠BMSCs 成脂分化能力增强；8周以后，成骨分化能力明显下降，可能与骨质疏松的形成有一定的关系。
关键词
糖尿病，骨髓间充质干细胞，成骨分化，成脂分化，骨质疏松，大鼠
Copyright ? 2018 by authors and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.doczj.com/doc/949870362.html,/licenses/by/4.0/
1. 引言
许多研究表明糖尿病患者发生骨质疏松的风险明显高于非糖尿病患者，流行病学调查资料显示糖尿病患者骨质疏松的发病率为40%~60% [1]，其发病机制尚未完全阐明，且存在许多争议。
骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells ，BMSCs)是目前研究较多的成体干细胞之一，在适宜的诱导下具有向骨、软骨、脂肪、神经等多向分化潜能[2] [3]。BMSCs 是成骨细胞和脂肪细
Open Access
陈嘉等
胞的前体干细胞，其分化去向在骨平衡中扮演了重要角色，其中成骨与成脂分化的调控是当前研究的热点[4]。研究发现BMSCs向成骨分化减少、成脂分化增多是骨质疏松症发病的重要机制[5][6]。抑制BMSCs 成脂分化、促进成骨分化从而纠正骨代谢失衡是治疗骨质疏松症的方向之一[7][8][9]。
本实验通过采用高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素的方法建立2型糖尿病模型，观察不同时间段糖尿病模型大鼠BMSCs成骨和成脂分化情况，旨在研究糖尿病模型大鼠骨质疏松的形成与BMSCs成骨及成脂分化能力的相关性。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
2.1.1. 实验动物
SPF级健康雄性SD大鼠，体质量(180~220) g，20只。由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2013-0002。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。
2.1.2. 主要药品与试剂
DMEM培养基(GIBCO)、胎牛血清(GIBCO)、成骨诱导液、成脂诱导液、油红O (MBCHEM)、碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)、茜素红S (MBCHEM)、cDNA试剂盒(Fermentas公司)、Trizol Reagent (Invitrogen公司)、TaqDNA聚合酶(上海申能博彩生物科技有限公司)、引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)，等。
2.1.
3. 仪器
核酸蛋白测定仪(Eppendorf)、多功能PCR扩增仪(Thermo Hybaid, PXII)、电泳系统(BIO-RAD, Mini-Sub Cell)、凝胶成像及分析系统(BIO-RAD, GelDoc)、UV-7504型单光束紫外可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)。
2.2. 实验方法
2.2.1. 糖尿病大鼠模型的制备
高糖高脂饲料喂养大鼠四周，35 mg/kg腹腔注射链STZ，3 d后剪尾静脉测血糖，以>16.67 mmol/L 视为糖尿病模型成功，腹腔注射后3周复测1次尾静脉血糖和体重，以确保血糖浓度>16.67 mmol/L。
2.2.2. BMSCs分离培养
分别于注射STZ液4、8、12周后，取糖尿病组大鼠及对照组大鼠，10%水合氯醛0.3 mL/l00g体质量腹腔注射麻醉，摘除双侧后肢，浸泡在75%乙醇中5 min，再用无菌生理盐水冲洗至无乙醇，置于无菌培养皿上，剥除股骨、胫骨表面附着的肌肉等组织，无菌PBS反复冲洗。剪断胫、股骨的骨骺端，5 mL 一次性注射器吸取DMEM完全培养液(含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL及链霉素100 μg/mL)充分冲洗骨髓腔，至骨髓腔变白为止。原代BMSCs培养24 h后进行首次换液，PBS清洗3次，以去除未贴壁的细胞。以后每3 d换液1次。当细胞接近80%铺满瓶底后，以2.0 × 105个/mL细胞的密度接种于培养瓶中进行扩增培养。
2.2.
3. BMSCs的成骨分化
取对数生长期的P3-P6细胞以2 × 105个/mL接种于6孔板内，每孔接种1 mL，72 h后，用成骨细胞诱导液(含10?7 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.05 mmol/L左旋抗坏血酸)添加5%空白血清培养。每周换液2次，培养7 d后，检测ALP活力。14 d后，进行茜素红染色及RT-PCR法检测ALP和
陈嘉等
OC mRNA含量。
2.2.4. ALP活力检测[10]
培养7 d后，用PBS将细胞洗涤3遍，加入细胞裂解液4℃放置，细胞超声破碎仪处理1 min后转至1.5 mL离心管中，于10,000 rpm离心5 min (4℃)。收集上清液，取5 μL加于测定管内，按照ALP试剂盒说明，标准管加入5 μL酚标准应用液，空白管加入双蒸水5 μL，各管加入缓冲液50 μL和基质液50 μL，充分混匀，37℃水浴15 min，加入显色剂150 μL，立即混匀，选择520 nm波长，空白管调零，以紫外分光光度计比色，测各管吸光度值(OD值)。根据下列公式计算ALP活力，计算公式：
ALP活力= (OD测定管÷ OD标准管) × 0.003mg ÷ 取样量中蛋白克数单位定义：每克组织蛋白在37℃与基质作用15 min产生1 mg酚为1单位(U)；0.003 mg为标准管含酚的量。根据分光光度计检测得到样品的OD值(检测波长为520 nm)，利用上述公式计算得出待检样品中ALP的活力(U/gprot)。
2.2.5. 茜素红染色
吸弃培养液，PBS洗3遍。95%酒精固定5 min。加2%茜素红溶液染色5 min，PBS冲洗3遍。倒置相差显微镜下观察，拍照。
2.2.6. RT-PCR 法检测ALP和OC mRNA含量
引物序列和反应条件见表1。PCR产物10 μL，在1.5%琼脂糖凝胶上电泳1 h，电压80 V，BIO-RAD 凝胶成像及分析系统观察并拍照。分别以β-actin为参考基因，行半定量分析。引物设计用primer 6.0软件设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
实验重复3次。
2.2.7. BMSCs的成脂分化
取对数生长期的P3-P6细胞以2 × 105个/mL接种于6孔板内，每孔接种1 mL，72 h后，用成脂细胞诱导液(含1 μmol/L地塞米松、0.01 mg/mL胰岛素、200 μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤)添加5%空白血清培养。每周换液2次。14 d后，进行油红O染色及RT-PCR法检测LPL和PPARγ2 mRNA含量。
2.2.8. 油红O染色
称取0.5 g油红，加异丙醇至100 mL，作为储存液。吸弃诱导液，PBS洗3遍。95%酒精固定5 min。稀释油红储存液，按油红液/去离子水以3:2稀释，针孔滤器过滤，室温放置10 min。每孔加入l mL染液，染色10 min。用PBS洗3遍，去除残留的染色液和残渣。
1) 脂肪细胞转化率
Table 1. Primer sequences of β-actin, ALP and OC
表1.β-actin, ALP, OC引物序列
基因引物序列长度退火温度℃循环
β-actin 5’GTAAAGACCTCTATGCCAACA3’
5’GGACTCATCGTACTCCTGCT3’ 227 bp 54 30
ALP 5’GACGGTGAACGGGAGAAC3’
5’CTCAGAACAGGGTGCGTAG3’ 441 bp 56 30
OC 5’TAAGGTGGTGAATAGACTCCG3’
5’GTGCCGTCCATACTTTCG3’ 150 bp 49 30
陈嘉等
倒置相差显微镜下随机取8个非重叠视野，高倍镜下计数阳性细胞和总细胞数，计算每个视野中脂肪细胞阳性率数值即脂肪细胞转化率。
2) 油红O染色定量分析
彻底移去油红O，用清水洗4次。去除剩余的水，风干。用100%异丙醇冲洗油红O，作用10 min。
用移液枪吹打几次，使油红O充分溶解于异丙醇中。将其移到1.5 mL EP管中，用100%异丙醇作为空白对照。根据分光光度计检测得到样品的OD值(检测波长为450 nm)，采用5 mm的比色杯，以空白管调零。
2.2.9. RT-PCR 检测LPL和PPARγ2 mRNA含量
引物序列和反应条件见表2。PCR 产物10 μL，在1.5%琼脂糖凝胶上电泳1 h，电压80 V，BIO-RAD 凝胶成像及分析系统观察并拍照。分别以β-actin为参考基因，行半定量分析。
实验重复3次。
2.3. 数据处理
实验数据以均数±标准差(x± s)表示，用SPSS 19.0统计软件进行处理。比较使用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P < 0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. 成骨诱导细胞形态的变化
对照组细胞随着诱导时间的增加，细胞聚集成多个散在的细胞结节，逐渐形成多层结构，并产生大量分泌颗粒，将结节包埋，结节中心部逐渐变浓，直至形成不透光致密团状结构，糖尿病组细胞形态变化与对照组相似，但细胞结节明显少。
图1(a)：对照组细胞经诱导后聚集生长，并逐渐形成多个散在的细胞结节，排列紧密，逐渐形成多层结构。
图1(b)：糖尿病组细胞经诱导后，形态变化与对照组相似，但结节明显少于对照组。
3.2. ALP活力检测
成骨诱导后，ALP活力明显增加，对照组ALP活力明显高于糖尿病组，差异有统计学意义(P < 0.01)。
见表3。
3.3. 茜素红染色
成骨诱导第14 d，茜素红染色结果表明，对照组钙化结节数量明显高于糖尿病组，见图2(a)、图2(b)。
图2(a)：对照组成骨诱导液培养14 d后，茜素红染色可见多个散在的红色致密结节。
图2(b)：糖尿病组，茜素红染色阳性，钙化结节数明显少于对照组。
Table 2.Primer sequences of LPL, PPARγ2 and β-actin
表2. LPL, PPARγ2, β-actin引物序列
基因引物序列长度退火温度℃循环
β-actin 5’GTAAAGACCTCTATGCCAACA3’
5’GGACTCATCGTACTCCTGCT3’ 227 bp 54 30
LPL 5’ CGCTCCATCCATCTCTTC3’
5’TTGCTTGTCATTCTCAGTTC3’ 264 bp 52 30
PPARγ25’ TTGAATGACCAAGTGACTCT3’
5’ CGTGCTCTGTGACAATCT3’ 418 bp 54 30
陈嘉 等
(a) (b)
Figure 1. (a) Cells of control group (×100); (b) Cells of diabetes group (×100) 图1. (a) 对照组细胞(×100)；(b) 糖尿病组细胞(×100)
Table 3. ALP activity detection (unit: U/gprot, n = 3, x ± s) 表3. 各组ALP 活力检测(单位：U/gprot, n = 3, x ± s)
组别 ALP 活力(U/gprot) 对照组 235.76 ± 20.04 糖尿病组
163.48 ± 18.05**
与对照组比较，**P < 0.01。
(a) (b)
Figure 2. (a) Control group (×40); (b) Diabetes group (×40) 图2. (a) 对照组(×40)；(b) 糖尿病组(×40)
3.4. RT-PCR 法检测ALP 和OC mRNA 含量
对照组、糖尿病组均有表达ALP 、OC 基因。β-actin 的表达则较为一致。以β-actin 为内参，
进行OD
值的比较半定量分析，对照组
ALP 、OC 基因的表达明显增强，与糖尿病组比较，差异有统计学意义(P < 0.01, P < 0.05)。见图3。
陈嘉 等
与对照组比较，*P < 0.05，**
P < 0.01。
Figure 3. Expression of ALP and OC genes 图3. 成骨分化标志物ALP 、OC 基因的表达
3.5. 成脂诱导细胞形态的变化
成脂诱导2 d 后，即有小脂滴出现，脂滴主要集中于细胞核周围，随诱导时间的延长，小脂滴逐渐聚集成大的脂泡，细胞逐渐增大，由原来的梭形变为圆形、椭圆形或多角形，细胞增殖不明显。糖尿病组含脂滴的细胞明显多于对照组，见图4(a)、图4(b)。
图4(a)：诱导7d 后，对照出现大量的脂肪细胞。 图4(b)：糖尿病组脂肪细胞明显多于对照组。
3.6. 脂肪细胞转化率
培养第14 d 后，进行油红O 染色，对照组、糖尿病组镜下观察可见脂滴为红色，脂肪细胞中含大小不等的脂肪滴，细胞核被脂滴挤于细胞一侧(见图5(a)、图5(b))。随机取8个非重叠视野计算细胞总数及脂肪细胞数，脂肪细胞数占细胞总数的百分比即脂肪细胞转化率。对照组脂肪细胞转化率明显低于糖尿病组，差异有统计学意义(P < 0.05)，见表4。
图5(a)：对照组成脂诱导14 d 后油红O 染色，可见大量的红色脂滴。
图5(b)：糖尿病组14 d 后油红O 染色，可见有红色脂滴形成，数量明显多于对照组。
3.7. 油红O 染色定量分析
油红O 染色定量分析结果见表5，对照组与糖尿病组比较，差异有统计学意义(P < 0.01)。
3.8. RT-PCR 检测LPL 和PPARγ2 mRNA 含量
对照组、糖尿病组均有表达LPL 、PPARγ2基因。β-actin 的表达则较为一致。以β-actin 为内参，进行OD 值的比较半定量分析，糖尿病组LPL 、PPARγ2基因的表达明显增强，与对照组比较，差异有统计学意义(P < 0.01, P < 0.01)。见图6。
4. 讨论
虽然骨质疏松症和糖尿病通常被认为是2个独立的疾病，但目前有许多研究表明糖尿病患者发生骨质疏松的风险明显高于非糖尿病患者[11]，糖尿病合并骨质疏松症的发病机制尚不清楚，这给临床治疗带来了极大难题[12]。本实验通过建立糖尿病骨质疏松大鼠模型[13] [14]，观察不同时间段糖尿病模型大鼠
陈嘉 等
(a) (b)
Figure 4. (a) Control group (×100); (b) Diabetes group (×100) 图4. (a) 对照组(×100)；(b) 糖尿病组(×100)
(a) (b)
Figure 5. (a) Control group (×100); (b) Diabetes group (×100) 图5. (a) 对照组(×100)；(b) 糖尿病组(×100)
Table 4. Conversion rate of adipocytes (%, n = 8, x ± s) 表4. 脂肪细胞转化率(%, n = 8, x ± s)
组别 脂肪细胞转化率 对照组 25.16 ± 5.03 糖尿病组
66.85 ± 10.01**
与对照组比较，**P < 0.01。
Table 5. Quantitative analysis of oil red O staining (OD value, n = 8, x ± s) 表5. 油红O 染色定量分析(OD 值, n = 8, x ± s)
组别 OD 值 对照组
0.016 ± 0.015
糖尿病组
0.058 ± 0.016**
与对照组比较，**P < 0.01。
陈嘉 等
与对照组比较，**P < 0.01。
Figure 6. Expression of LPL and PPARγ2 genes 图6. 成脂分化标志物LPL 、PPARγ2基因的表达
BMSCs 成骨和成脂分化情况，旨在研究糖尿病模型大鼠骨质疏松的形成与BMSCs 成骨及成脂分化能力的相关性，为糖尿病骨质疏松发病机制提供依据。
实验结果显示，注射STZ 液4周以后，糖尿病组大鼠BMSCs 成脂分化能力增强，体现为脂肪细胞转化率、油红O 染色定量明显高于对照组。成脂分化标志物LPL 、PPARγ2基因相对OD 值明显高于对照组。8周以后，糖尿病大鼠BMSCs 的成骨分化能力明显下降，体现为糖尿病组大鼠BMSCs ALP 活力明显下降，钙化结节数量明显少于对照组。成骨分化标志物ALP 、OC 基因明显相对低于对照组。
在骨质疏松症患者中，骨髓间充质干细胞向脂肪方向分化增多，向成骨方向分化减少，其分化命运受多条信号通路调控，并涉及转录调控、转录后调控和表观遗传等多种调控机制，是目前研究的热点与焦点。糖尿病性骨质疏松的发生源于糖尿病状态下骨代谢的改变。间充质干细胞作为成骨细胞、脂肪细胞等的来源细胞，其数量、功能活性以及成骨成脂之间的平衡是成骨质量的关键。近年来多项研究表明，糖尿病相关的细胞因子、生长因子、信号通路在间充质干细胞的分化过程中发挥着重要的调控作用，共同导致糖尿病性骨质疏松的发生。多种糖尿病相关因素通过调控间充质干细胞的成骨成脂分化，从而对糖尿病的骨代谢过程产生影响[15]。
然而，目前对糖尿病患者骨髓间充质干细胞的变化及其在骨质疏松发生中的作用研究较少，其具体分子机制尚不清楚，需进一步的研究与探讨。本实验结果显示糖尿病大鼠BMSCs 成脂分化能力增强，成骨分化能力明显下降，可能与糖尿病骨质疏松的形成有一定的关系[16]。
基金项目
广东省科技计划项目(2015A030302068)：链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠骨质疏松发生机制的研究。
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15(2): 103-108.
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中国组织工程研究与临床康复 第14卷 第14期 2010–04–02出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research April 2, 2010 Vol.14, No.14 P .O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.doczj.com/doc/949870362.html, 2492 1 Biomedicine Research and Development Centre of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 2 Guangzhou (Jinan)-Hong Kong Joint Laboratory of Cell Engineering, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 3 Asia-Pacific Stem Cell Research Centre Co., Ltd., Hong Kong 999077, China; 4 Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 5 Department of Bioengineering, Clemson University, Clemson, SC 29634-0905, USA He Shao-qing ★, Studying for master’s degree, Biomedicine Research and Development Centre of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; Guangzhou (Jinan)-Hong Kong Joint Laboratory of Cell Engineering, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China heshq106@https://www.doczj.com/doc/949870362.html, 人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化**★△○ 何绍清1， 2，罗振宇1， 2，刘秋英1， 2，周向荣△2， 3，邓铭权△2， 3，罗 新4，姚润斯4，高 志5，王一飞○1， 2 Isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells and differentiation into adipocytes and osteblasts He Shao-qing 1, 2, Luo Zhen-yu 1, 2, Liu Qiu-ying 1, 2, Zhou Xiang-rong 2, 3, Deng Ming-quan 2, 3, Luo Xin 4, Yao Run-si 4, Gao Zhi 5, Wang Yi-fei 1, 2 Abstract He SQ, Luo ZY, Liu QY, Zhou XR, Deng MQ, Luo X, Yao RS, Gao Z, Wang YF. Isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells and differentiation into adipocytes and osteblasts. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(14): 2492-2496. [https://www.doczj.com/doc/949870362.html, https://www.doczj.com/doc/949870362.html,] 摘要 何绍清，罗振宇，刘秋英，周向荣，邓铭权，罗新，姚润斯，高志，王一飞.人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(14):2492-2496. [https://www.doczj.com/doc/949870362.html, https://www.doczj.com/doc/949870362.html,] 0 引言 间充质干细胞具有自我更新能力，能分化成为成骨、软骨、肌肉和脂肪细胞等间质组织细胞[1-3]，甚至能分化为心肌、神经胶质和神经细胞[4-6]。近年来因其在组织工程和细胞替代治疗的临床前研究而备受关注。间充质干细胞分布在体内骨髓和其他组织与器官中，如脂肪组织、脐血，甚至外周血也发现有间充质干细胞 [7-10] 。 目前，骨髓间充质干细胞是最常用的种子细胞，但其数量和分化潜能随着年龄的增长显著减少 和降低[11-13]，并且取材时易对供体造成身体伤害。因此，非常有必要寻找新的自体和异体移植的细胞来源。这种新的细胞除了必须具备骨 髓间充质干细胞有更强的增殖力和多向分化潜能的特点外，还必须取材便利，不易造成病毒污染，且不受伦理道德限制等。 脐带由中胚层发育而来，是胎儿时期连接胎儿和母体的索状结构，外由羊膜包被，内有两条动脉和一条静脉及血管周围富含蛋白多糖和黏多糖的组织组成[14]。分娩后的脐带一直都被当废弃物丢弃，近年来因寻求更多来源的成体干细胞而受到关注。自Mitchell 等[15]提出
大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。 心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！ ④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。 第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会： ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml 细胞生长液中大约需要4.5ml
骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast，。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次〔1〕；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4～7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells，AS)，在一
小鼠间充质干细胞 一、细胞复苏和接种 1. 37℃预热小鼠间充质干细胞培养液和基础培养液。 2. 从液氮中取出细胞产品管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。 3. 在生物安全柜中，用75%的酒精擦拭产品管外壁。 4. 将产品管中的细胞移至15ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃基础培养液4－5 ml混匀，边滴加边摇匀。 5. 用1ml基础培养液冲洗产品管，并将其转移到15 ml离心管中，边滴加边摇匀。 6. 轻轻混匀细胞后，取10 μl细胞悬液和10 μl台盼蓝混匀，从中取10 μl计数。 7. 细胞悬液在1 000 rpm，室温条件下，离心5分钟，去除上清。 8. 加完全培养液4－5 ml，调整细胞量，轻轻混匀细胞，备用。 9. 按10 000-15 000个细胞/cm2接种细胞。 10. 每个T25培养瓶中加完全培养液3-5 ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。 二、细胞换液和培养 注意：复苏或传代后的细胞，请于24小时后，第一次更换培养液。 1. 复苏后的细胞经37℃、5%CO2培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后，请继续在37℃，5％CO2培养箱内培养。 2. 之后，每2-3天更换培养液1次，至细胞长到培养瓶表面的80% 可进行传代或冻存。 3. 换液前，请将培养液从4℃中取出，使其恢复到室温。 三、消化细胞 1．消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分别配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液，
用前按1：1混合。 将PBS或D-Hank's液, 消化液，含10% FBS的基础培养液恢复到室温。 2．具体操作如下： （1）吸去培养液，加入3 ml PBS或D-Hank's液，使PBS或D-Hank's液均匀的分布在培养瓶细胞表面。1分钟之后，吸去PBS或D-Hank's液。 （2）每个T25培养瓶加入消化液2 ml，使消化液均匀的分布在培养瓶细胞面。 （3）25℃消化2分钟，在显微镜下看细胞回缩成圆形后，轻轻震动使绝大部分细胞脱落。（4）向每个培养瓶中加3-5 ml 含10% FBS的基础培养液中和胰酶的消化作用。 （5）用移液管轻轻吹打培养瓶表面使细胞完全脱落后，吸至15 ml无菌离心管内。 （6）20℃，1 500 rpm 离心5分钟，弃上清。 （7）加入一定量的完全培养液，调整细胞数量后，抽样加入胎盘蓝计数，得到细胞数和活性后，按细胞数传代或冻存。 四、细胞传代 1．消化细胞（详见第三步）。 2．按10000-15000个细胞/cm2接种细胞于T25的培养瓶中。 3．每个培养瓶中加完全培养液3-5ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。 五、小鼠骨髓MSCs的体外分离、培养及扩增 断颈处死小鼠，超净台上取胫骨和股骨，切开两端松质骨，并在骨干中部剪断，无血清DMEM-LG培养基冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，经Percoll密度梯度离心法，分离和收集有核细胞，用含15％FBS的DMEM-LG培养基重悬离心管中的MSCs，镜下细胞计数，使细胞密度达到1X106个/ml，CO2培养箱培养，换液，将MSCs不断纯化。当细胞生长融合达80%-90% 时，用1:1 的0.25% 胰蛋白酶和0.02%EDTA消化分散细胞，在显微镜
小鼠骨髓间充质干细胞培养 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。 实验准备： 1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。 2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器 操作步骤 1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养 取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5?2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每两天换液1次，并观察细胞形态。待细胞长至80%-85%时传代（1传2） 2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速。 采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。 分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs 获得或失去这些表面标记物的表达。
骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记(一) 作者：吴晓林,李冬民,马德茂,张晓田,黄石,宋天保 【关键词】骨髓 【Abstract】AIM:Tostudythedifferentiationcharacteristicsandtheoptimaldosageandtimingforbromodeoxyuridi ne(Brdu)labelingofratbonemarrowderivedmesenchymalstemcells(MSCs)invitro.METHODS:Therat marrowstemcellsisolatedbyusingPercoll(1.073kg/L)wereculturedandproliferated.Thethirdpassage cellswereinducedwithdexamethasome,βglycerophosphate,ascorbicacid2phosphate,IGF1andinsuli n.Onday21,thecellswereanalyzedbyimmunohistochemistryfortypeⅠcollagenandbyhistochemistry foralkalinephosphatase(AKP).ThepurifiedMSCswereincubatedwithBrduatdifferentconcentrations( 5,10and15μmol/L)fordifferenttimeperiods(12，24，48，72and96h),followedbyimmunohistochemistryforBrdutoidentifytheoptimalBrduconcentrationandi ncubationtimeperiod.RESULTS:Afterincubationfor21dforinduceddifferentiationintoosteoblasts,ty peⅠcollagenandAKPwerepositivelyexpressed.Theincubationwith10μmol/LBrdufor72hachievedov er98%ofthelabelingratewithoutproducingobviouscelldamages.CONCLUSION:MSCscanbeinducedt odifferentiateintoosteoblastsundercertainconditionsinvitro.TheoptimalBrdulabelingconcentration andtimeperiodare10μmol/Land72h,respectively. 【Keywords】MSCs;induceddifferentiation;osteoblast;Brdu 【摘要】目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外的诱导分化及5溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记MSCs的可行性.方法：利用密度为1.073kg/L的percoll分离骨髓的单个核细胞，体外培养与扩增MSCs；取生长良好的第3代细胞，用成骨细胞分化培养液培养21d，Ⅰ型胶原免疫组化染色和碱性磷酸酶（AKP）组化染色；分别以浓度为5，10和15μmol/L的Brdu溶液标记MSCs，孵育12，24，48，72和96h后免疫组化检测Brdu，确定最佳标记量和最佳标记时间.结果：诱导分化第21日,AKP染色呈强阳色,Ⅰ型胶原免疫染色呈阳性.10μmol/LBrdu 标记MSCs的效果最好，随着孵育时间的延长，Brdu标记率逐渐增高，标记72h后标记率在90%以上.结论：MSCs在体外一定条件下可定向诱导分化为成骨细胞，用Brdu标记MSCs的最佳浓度为10μmol/L，最佳时间是72h. 【关键词】骨髓间充质干细胞；诱导分化；成骨细胞；5溴脱氧尿嘧啶核苷 0引言 骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞.因MSCs取材方便、对机体的损伤小、具有较强的传代增殖能力和免疫耐受性等特点而受到越来越多的关注.本实验的目的是利用MSCs具有分化潜能的特点，在体外诱导该细胞定向分化为成骨细胞.并用Brdu标记连续传代的MSCs，观察最佳标记时间及标记剂量，从而为追踪Brdu标记的MSCs移植入体内后的存活、生长及分化奠定基础. 1材料和方法 1.1材料健康雄性SD大鼠，体质量55～70g.由西安交通大学医学院实验动物中心提供. 1.2方法 1.2.1大鼠骨髓MSCs的体外分离培养将大鼠引颈处死后置于750mL/L乙醇浸泡约5min，无菌条件下分离出大鼠的股骨和胫骨.用PBS冲洗出骨髓细胞，经5mL针管反复吹打制成单细胞悬液，用200目的不锈钢网过滤，收集滤液.在密度为1.073kg/L的percoll（Phamacia）分离液上缓慢加入收集的滤液，2500r/min离心20min，收集滤液与分离液之间的白膜层细胞，用DMEM（Gibco）洗涤两次，1000r/min离心5min.用加有100mL/L胎牛血清（杭州四季青公司）的DMEM重悬细胞，1×108个/L种于两个直径为6cm的培养皿中培养，2d后更换培养液，加入完全培养基.并将吸出的旧培养液分别移入另两个平皿中继续培养，再过2d更换
第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述 doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011） 2 南方医科大学在读博士（南宁530011） *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
３７８陕西中医２０１０年第３１卷第３期 药杂志，２００４，３２（３）：１８０—１８２， ［７３金静愉，郁仁存．乳腺癌中西医结合诊治方案口］．中国肿瘤，１９９５，４（５）：７－１０。 ［８］刘胜，吴雪卿，陈前军．４０７乳腺癌术后患者辨证分型规律探析口］．辽宁中医杂志，１９９９，２６（９）：３８７—３８８．［９］唐汉钧，高尚璞，郑勇．中医药治疗乳腺癌术后２８８例临床观察口］．上海中医药大学报，２００２，１６（３）：２３．［１０］刘燕珠，王泳，吴丹红，等．中西医结合治疗乳腺癌６８例［Ｊ］．福建中医药，２０００。３１（３）：３０—３１． ［ｎｌ万华，吴雪卿，陆德铭．扶正祛邪在治疗乳腺癌中的运用［Ｊ］．上海中医药大学学报，２００２，１６（１）：３０—３１．［１２］朱华宇，司徒红林．林毅辨治乳腺癌经验撷菁［Ｊ］．辽宁中医杂志，２００７，３４（４）：３９５—３９６． ［１３３武自力．金静愉治疗乳腺癌经验［Ｊ］．四川中医，２００７，２５（８）５—６． ［１４］刘胜，赵倩，刘佳，等．乳腺癌术后方对乳腺癌术后５年复发转移率的影响［Ｊ１．中西医结合学报，２００８，６（１０）：１０００—１００４． ［１５］刘胜，花勇强，孙平，等．乳移平抗乳腺癌术后复发转移的临床研究［Ｊ］．中西医结合学报，２００７，５（２）：１４７—１４９． ［１６］卓斌．乳康汤治疗３６例乳腺癌术后或放、化疗后的临床观察口］．湖南中医学院学报，１９９５，１５（２）：２３． ［１７］陈英．益气养血、清热解毒治疗乳癌术后４１例［Ｊ］．浙江中医学院学报，１９９９，２３（６）：３０１． ［１８］李增战，陈捷，苗文红，等．鹿仙散结汤治疗晚期乳腺癌３０例［Ｊ］．陕西中医，２００７，２８（５）：５２６—５２７． ［１９］喻伟国，程进明．抗癌汤结合化疗治疗肿瘤术后４８例总结口］．湖南中医杂志，２００３，１９（１）：１１—１３． ［２０］李景鹏，贾英杰．贾英杰治疗乳腺癌术后的经验［Ｊ］．湖北中医杂志，２００７，２９（７）：２３． ［２１］黄智芬，刘俊波，陈强松，等．健脾消积汤联合化疗对晚期乳腺癌患者生活质量及免疫功能的影响［Ｊ］．新中医，２００７，３９（５）：８８—８９． ［２２］樊淳理．中药治疗乳腺癌术后化疗患者４１例［Ｊ］．中医杂志，２００６，４７（３）：２２６． ［２３］张卫红．卞卫和教授治疗乳腺癌经验举隅［Ｊ］．南京中医药大学学报，２００７，２３（２）：１２６－１２８． ［２４１黄梅，杨海燕．益气活血汤改善脾虚挟瘀型乳腺癌患者化疗毒副作用的临床研究口］．湖北中医杂志，２００５，２７（７）：９－１０。 ［２５］周明，吴勇华，刘永达．中西医结合治疗晚期乳腺癌１４例分析口］．中国中西医结合杂志，１９９５，１５（４）：２３７．［２６］罗雪冰．益气祛邪汤治疗乳腺癌术后７６例疗效观察［Ｊ］．华夏医学，２００７，（２）：２４７—２４８． ［２７］沈哗华，宋明志，黄雯霰．中西医结合治疗７１例乳腺癌术后患者的疗效分析［Ｊ］．中西医结合学报，２００３，１（１）：３０－３１． ［２８１向丽萍，欧阳恒，肖毅良．菊藻丸抗乳腺癌术后复发转移的临床观察［Ｊ］．中国临床药理学与治疗学，２００２，７（１）：６３—６４． ［２９］王义程，丁凌，鲁志诚．三苯氧胺加中成药治疗绝经后晚期乳腺癌［Ｊ］．肿瘤研究与临床，１９９６，８（４）：２６５．［３０］ＣｏｈｅｎＩ，ＴａｇｌｉａｆｅｒｒｉＭ，ＴｒｉｐａｔｈｙＤ．ＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ口］．ＳｅｍｉｎＯｎｃ０１．２００２，２９（６）：５６３—５６４． ［３１］ＣｕｉＹ，ＳｈｕＸＯ，ＧａｏＹ，ｅｔａｌ．ＵｓｅｏｆｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙａｎｄａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｍｅｄｉｃｉｎｅｂｙＣｈｉｎｅｓｅｗｏｍｅｎｗｉｔｈｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ口］，ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓＴｒｅａｔ．２００４，８５（３）：２６３—２７０． ［３２］刘叙仪，孟松娘．杨敬贤，等．中药Ｒ３对耐阿霉素人乳腺癌细胞ＭＣＦＴａｄｒ多药耐药的逆转ｉ－Ｊ］．中国肿瘤临床，１９９７，２４（５）：３２５—３３０ ［３３１姜晓峰，甄永苏．大黄素逆转肿瘤细胞多药抗药性的作用［Ｊ］．药学学报，１９９９，３４（３）：１６４—１６７． ［３４］ＷａｎｇＬ．ＹａｎｇＣＨ，ＨｏｒｗｉｔｚＳＢ，ｅｔａｌ．Ｒｅｖｅｒｓａｌｏｆｔｈｅｂｕｍａｎｍｕｒｉｎｅｍｕｌｔｉｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔａｐｃｅｐｈｅｎｏｔｙｐｅｗｉｔｈｍｅｇｅｓｔｒｏｌａｃｅｔａｔｅ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ．ＣｈｅｍｏｔｈｅｒｐｈａｒｍＡｃｏｌ，１９９４，３４：９６． ［３５３李忠．临床中医肿瘤学［Ｍ］．辽宁科学技术出版社，２００２，１２４—１２５． （收稿２００９—１２—１０；修回２０１０－０１—２４） 骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究进展’秦安清刘黎青△于娜◇周盛年△▲山东中医药大学基础医学院（济南２５０３５５） 【中图分类号】Ｑ２５【文献标识码】Ａ【文章编号】ｌＯＯＯ一７３６９（２０１０）０３～０３７８—０３ ＊山东省科技攻关课题（ＮＯ：２００７ＧＧｌ０００２０１７）；山东省中医药管理局资助课题（ＮＯ：２００７—００６） △通讯作者：刘黎青周盛年 ▲山东大学齐鲁医院神经内科（济南２０００１２） ◇山东省昌乐县中医院（昌乐２６２４００） 骨髓问充质干细胞（ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）又称骨髓基质干细胞，是骨髓细胞中除去造血干细胞（非粘附细胞）之外的细胞部分，作为成体干细胞之一，具有多项分化潜能，能向骨、软骨、肌肉、神经、角膜上皮细胞等中胚层或外胚层组织细胞分化，是组织工程中重要的种子细胞之一，并且具有取材方便，扩增迅速，可自体移植等特点，因 万方数据
间充质干细胞分化为心肌细胞的研究进展 【摘要】心肌梗死等缺血性心脏病严重威胁人类生存和生活质量,组织工程技术为根治心肌梗死等心脏病提供了一种新的方法,近年来,心肌组织工程有了较大的进展,但在种子细胞等方面的难题还远没有解决。本文对关于间充质干细胞分化为心肌细胞的研究作了一下综述,为细胞替代治疗的研究提供一定的参考。 【Abstract】Ischemic heart disease such as myocardial infarction endanger human health and life,cardiac tissue engineering is one of the new radical therapy for myocardial infarction.In recent years,researchers have made great progress in cardiac tissue engineering,but the problems of seed cells and scaffold materials are far from resolved.This paper reviews research advances of mesenchymal stem cells induced into cardiomyocyets so that it may contribute to Cell therapy. 【Key words】 Mesenchymal Stem Cells;Cardiomyocyets;Cell therapy 在成人肌肉组织中,心肌细胞(Cardiomyocytes,CMs)属于终末分化期永久性细胞,不具有再生能力[1],其对有丝分裂信号作出的反应是细胞肥大[2]而不是再生,致使损伤后心肌再生和修复严重受限,由于心肌损伤后无法通过自身的增殖、分化进行修复,坏死的心肌则由纤维疤痕组织取代[3,4]。研究发现心肌中也含有干细胞[5-7],在心肌梗死(Myocardial infarction,MI)后这些细胞会发生分裂增生,但数量极少,增殖能力太小,不能完整地修复心肌组织,更不能满足心肌组织再生的需求,致使具有收缩功能的CMs减少,最终发展成充血性心力衰竭、死亡,严重影响患者的生活质量。临床上缺乏对病变冠状动脉的再造和梗死心肌的再生、重建的根本治疗方法,而细胞替代治疗通过移植功能细胞,替代、修复或加强受损的组织或器官的细胞的生物学功能已成为治疗多种组织坏死性疾病的新策略。 1 心肌细胞和间充质干细胞的特点 心肌细胞在出生后就进入了有丝分裂的后期,基本丧失了增生和再生的能力,不再进入细胞周期,而目前尚无证据支持心肌中含有干细胞[1]。成人骨髓中含有造血细胞和非造血细胞,非造血细胞与细胞外基质一起形成了支持造血的骨髓微环境(Bone marrow microenvironment,BMME)[8]。骨髓微环境中的细胞成分包括网状内皮细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、成纤维样细胞[9],这些细胞通过分泌各种细胞因子、生长因子、以及自身细胞表面受体的表达,对造血细胞的附着、分化、自我更新起到了重要作用[10]。目前,普遍认为,在骨髓中至少存在两种干细胞群即造血干细胞(Haematopoietic stem cells,HSCs)和MSCs,前者是所有造血细胞的祖细胞[11,12],后者则是中胚层发育的早期细胞,这类细胞可以通过体外贴壁培养加以分离,不仅能分化为造血实质和基质细胞等,还分化为多种造血以外的组织,