中国组织工程研究与临床康复 第15卷 第10期 2011–03–05出版
Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research March 5, 2011 Vol.15, No.10
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
1721Department of Traumatic
Orthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Li Xiao-feng ★, Master, Attending physician, Department of Traumatic
Orthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China xiaofengli74@ https://www.doczj.com/doc/b51153534.html,
Correspondence to: Zhao Jin-m in, Doctor, Professor, Department of Traumatic
Orthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
zhaojinmin@https://www.doczj.com/doc/b51153534.html,
Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30860078*; Key Science and
Technology Program by Health
Department of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 200636*
Received: 2010-12-27 Accepted: 2011-01-26
大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定**★
李晓峰，赵劲民，苏 伟，崔向荣，罗世兴，马爱国
Culture and identification of rat bone marrow mesenchymal stem cells
Li Xiao-feng, Zhao Jin-min, Su Wei, Cui Xiang-rong, Luo Shi-xing, Ma Ai-guo Abstract Li XF, Zhao JM, Su Wei, Cui XR, Luo SX, Ma AG. Culture and identification of rat bone marrow mesenchymal stem cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(10): 1721-1725. [https://www.doczj.com/doc/b51153534.html, https://www.doczj.com/doc/b51153534.html,]
摘要 李晓峰，赵劲民，苏伟，崔向荣，罗世兴，马爱国. 大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(10):1721-1725. [https://www.doczj.com/doc/b51153534.html, https://www.doczj.com/doc/b51153534.html,]
0 引言
骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells ，BMSCs)具有多向分化潜能，能促进间充质组织的再生，如：骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质等组织[1]。在骨髓中，BMSCs 占骨髓有核细胞总数的0.001%~0.1%，含量极低。而同时，由于组织工程需要大量的种子细胞，从啮齿类动物骨髓分离BMSCs 的技
术上的难度限制了许多实验的开展。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的BMSCs 对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关
重要。
本实验通过BMSCs 的黏附特性，应用全骨髓贴壁培养法，建立了一个简便、有效的原代培养、增殖和纯化BMSCs 的方法，观察大鼠BMSCs 的生物学特性及其成骨、成脂分化潜能，为组织工程寻找良好的种子细胞提供实践基础。
李晓峰，等. 大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定
P .O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.doczj.com/doc/b51153534.html,
1722
www.CRTER
.org
广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科，广西壮族自治区南宁市 530021
李晓峰★，男，1974年生，吉林省德惠县人，汉族，2005年福建医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事创伤外科手外科、组织工程方面的研究。 xiaofengli74@ https://www.doczj.com/doc/b51153534.html,
通讯作者:赵劲民，博士，教授，广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科，广西壮族自治区南宁市 530021 zhaojinmin@ https://www.doczj.com/doc/b51153534.html,
中图分类号:R394.2 文献标识码:A
文章编号:1673-8225 (2011)10-01721-05
收稿日期：2010-12-27
修回日期：2011-01-26 (20101227003/D ·Y)
1 材料和方法
设计：细胞形态学与生物学特性实验。 时间及地点：于2009-07/2010-01在广西医科大学基础医学院中心实验室完成。
材料：健康4周龄SD 大鼠20只，SPF 级，由广西医科大学动物实验中心提供，合格证号:SCXK(桂)2009-0002。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准[2]。
主要试剂与仪器：
方法：
BMSCs 的原代分离培养：2%戊巴比妥钠麻醉
大鼠，体积分数75%乙醇全身浸泡消毒10 min 。无菌条件取股骨及胫骨，PBS 清洗3次。剪掉股骨和胫骨的骨骺端，露出骨髓腔，用添加青、链霉素的L-DMEM 培养基冲出骨髓，反复吹打；将冲出的骨髓制成单细胞悬液，1 000 r/min 离心5 min ，弃上清，重悬以1×109 L -1的细胞浓度接种于25 cm 2培养瓶中，置37 ℃、CO 2饱和湿度培养箱中培养。
BMSCs 的培养、纯化及传代：原代培养过程
中，48 h 后全量更换培养基，以后每3 d 全量更换新鲜培养基。待细胞铺满培养瓶底至细胞融合成单层，密度长至70%~80%融合时，用0.25%胰酶消化，1∶2的比例进行传代培养。
BMSCs 的形态学观察及Giemsa 染色：培养后
每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107 L -1，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75 mL ，以后每3 d 换液。待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS 洗3次，甲醇固定10 min ，Giemsa 染液染2 min ，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。
BMSCs 生长曲线测定：将生长状态良好的SD
大鼠骨髓间充质细胞传至2代并接种于96孔培养板，接种密度5×103/孔，将培养板移入CO 2培养箱中培养。每日取一板进行MTT 检测。选择492 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。
BMSCs 的细胞周期检测：取第3代细胞，调整
细胞浓度为1.0×109 L -1。加100 μL RNase A 37 ℃水浴30 min ，再加入400 μL PI 染色混匀， 4 ℃避光30 min ，流式细胞仪检测细胞周期。
BMSCs 鉴定：
流式细胞仪检测细胞表面标记：收获P3代
生长状态良好细胞，0.25%胰酶消化，4 ℃离心，1 000 r/min ，5 min ，用PBS(含1%BSA)清洗细胞3次，计数细胞，各管依次加入单克隆抗体CD34、CD44、CD45、CD90、CD105。同时每管样品设立同型阴性对照。避光冰上孵育45 min ，用PBS(含1%BSA)洗涤细胞3次，以除去未结合抗体，用500 μL PBS(含1%BSA)重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。
BMSCs 体外定向诱导分化：选择第3代BMSCs ，按1×108 L -1浓度接种于6孔细胞培养板，待细胞贴壁生长至细胞密度达80%时，在各诱导孔的完全培养液中分别加入下列诱导剂：①成脂细胞诱导剂(1 mmol/L 地塞米松、 10 mg/L 胰岛素、50 mmol/L IBMX 、吲哚美辛 0.2 mmol/L)。②成骨细胞诱导剂(1 mmol/L 地塞米松、1 mol/L β-甘油磷酸钠、50 mmol/L 抗坏血酸)。各诱导孔每周换液2次，以未加诱导培养液的细胞培养孔作为对照。成脂细胞诱导剂诱导18 d 后，经40 g/L 多聚甲醛固定，对诱导分化的脂肪细胞进行油红O 染色；成骨细胞诱导剂诱导21 d 后，经40 g/L 多聚甲醛固定，对诱导分化的成骨细胞进行碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa 改良法染色。
主要观察指标：BMSCs 的形态学观察及其向成骨诱导分化的鉴定。
2 结果
2.1 BMSCs 的形态学观察 原代培养：骨髓细胞接种于培养瓶后，细胞呈圆型，大小不一，悬浮于培养液中。24 h 后部分细胞开始贴壁，呈圆形、梭形或多角形。通过换液去除未贴壁的杂质细胞，可见短梭形、星形细胞分散贴壁生长，见图1a 。三四天可见放射状排列的细胞集落，伸出长短不一、粗细不均的突起，梭形细胞
试剂及仪器
来源
L-DMEM 培养基、胎牛血清 胰蛋白酶、青霉素、链霉素、
β-甘油磷酸钠、3-异丁基-1-甲
基黄嘌呤(IBMX) 、地塞米松磷酸钠、L -抗坏血酸、胰岛素 吲哚美辛
CD34、CD44、CD45、CD105
CD90 SW-CJ 型生物洁净工作台 CO 2培养箱 倒置相差显微镜
Gibco
Sigma
百灵威 santa cruz BD 公司
苏净集团安泰公司 Shellab Olympus
李晓峰，等. 大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
1723
www.CRTER
.org
为主，胞浆丰富，胞核大、核仁清晰，见图1b 。六七天细胞呈集落生长，融合80%~90%，呈漩涡状，同向排列，见图1c 。9~10 d 细胞排列紧密，逐渐融合成片，见图1d 。传代培养：消化传代后，传代细胞24 h 完全贴壁生长。细胞形态均一，呈梭形生长，细胞生长旺盛。四五天可传代1次。可稳定连续传代10代以上，细胞形态及生长速度未见明显变化。见图1e 。Giemsa 染色：大鼠BMSCs 多呈梭形，胞浆丰富，染成紫蓝色，细胞核染成深蓝色，有一两个核仁，核仁明显，见图1f 。
2.2 BMSCs 的生长曲线 见图2。
BMSCs 在接种第一二天为细胞潜伏适应期，第3~6天生长曲线基本为线性曲线，表明这段时间
是细胞的对数生长期。第7天后曲线逐渐变得平缓，细胞增殖明显减慢，进入平台期。
2.3 BMSCs 的细胞周期 流式细胞术细胞周期分析结果显示，BMSCs 88.42%处于G 0/G 1期，6.05%处于G 2/M 期，5.53%处于S 期，见图3，表明BMSCs 具有较强的分裂增殖能力。
2.4 BMSCs 表面标记物的表达 见图4。
流式细胞仪检测结果显示，培养的第3代大鼠BMSCs 均一表达CD44，CD90，CD105，阳性率分别为99.34%%，99.34%%，99.35%%；而CD34，CD45，
Figure 1 Morphology of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) at different phases (×100)
图1 不同时期骨髓间充质干细胞的形态学观察(×100)
a: BMSCs at 3 d incubation b: BMSCs at 5 d incubation
c: BMSCs at 7 d incubation
d: BMSCs at 9 d incubation
e: BMSCs at passage 3
f: BMSCs by Giemsa staining
Figure 4 Surface markers expression of rat bone marrow mesenchymal stem cells 图4 大鼠骨髓间充质干细胞表面标志物的表达
李晓峰，等. 大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定
P .O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.doczj.com/doc/b51153534.html,
1724
www.CRTER
.org
呈阴性，阳性率分别为1.47%，1.56%。
2.5 BMSCs 成脂诱导分化鉴定 BMSCs 加入成脂诱导剂后18 d ，诱导而成的脂肪细胞累积脂质，脂滴变大并合并呈串珠状。经油红O 染色呈鲜红色，见图5。
2.6 BMSCs 成骨诱导分化鉴定 大鼠BMSCs 经成骨诱导培养液培养21 d ，碱性磷酸酶染色可见细胞膜及胞浆内颗粒均呈阳性反应，染色呈蓝黑色颗粒，块状深染颗粒，见图6a 。细胞形态由梭形改变为多角形，细胞呈多层性、重叠性排列，形成间质内含大量矿盐沉积的钙化结节，Von Kossa 改良法染色阳性，见图6b 。茜素红染色矿化结节呈现红色，见图6c 。
3 讨论
BMSCs 是存在骨髓中具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。1966年，Friedenstein 等[3]首次对BMSCs 进行了描述，从大鼠骨髓细胞中分离培养了骨/软骨形成祖细胞。目前，虽然已能在一些组织，
包括肝脏、胚胎血、脐带血和羊水中分离培养，但是细胞的获得和研究主要集中在骨髓组织
[4-6]
。在骨髓中，间
充质干细胞占骨髓有核细胞总数的0.001%~0.1%。它们具有多向分化潜能，包括分化为：脂肪细胞、成骨或软骨细胞及成肌细胞[7]。骨髓衍生的BMSCs 已经从多个物种中分离出来，包括小鼠、大鼠、兔和人[8-10]。
人BMSCs 相对易于收集并培养扩增，而啮齿类动物的相对较难[11-12]。目前，获得BMSCs 的方法主要有全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选法[13-14]。尽管有多种方法从骨髓中分离BMSCs ，但是目前没有一个最佳方案。不同的方法具有不同的优缺点。密度梯度离心法根据骨髓普通细胞较之于BMSCs 的相对密度不同，筛选出纯度较高的BMSCs ，但改变了BMSCs 生长的外界微环境，影响细胞活力。流式细胞术和免疫磁珠法虽可获得纯度较高的BMSCs ，但价格昂贵，造成细胞丢失，而且对细胞活性有较大影响。全骨髓贴壁培养法基于BMSCs 的粘附特性，是获得这种细胞的最简单方法。
本实验中已通过利用全骨髓贴壁培养法这一简单、可靠的方法，分离、纯化和扩增了大鼠BMSCs ，采用含10%FBS 的低糖DMEM 培养基进行的全骨髓贴壁法培养SD 大鼠BMSCs ，经换液和传代等方法去除杂细胞，传至第3代时，可得到高纯度BMSCs ，细胞形态为均一梭形，生长状态良好。大鼠BMSCs 的生长曲线呈S 形，符合正常细胞的生长特性。其倍增时间平均为四五天，时间较短，说明分离培养获得的大鼠BMSCs 在体外生长活跃，有较强的增殖能力，细胞周期检测也证实了BMSCs 处于DNA 合成期的比例较大，细胞生长旺盛。
多项实验研究已经证实大鼠BMSCs 的多项分化潜能和他们可作为细胞治疗的有用来源。例如：Woodbury 等[15]刺激大鼠BMSCs 分化成神经元通过种植密度为 8 000 cells/cm 2的大鼠BMSCs ，并培养至融合。第6代细胞应用于神经元分化。Hofstetter 等[16]将大鼠BMSCs 植入脊髓，培养密度为5 000 cells/cm 2，培养生长至融合，第5代细胞用于植入。Dezawa 等[17]体外诱导大鼠BMSCs 分化为许旺细胞并植入坐骨神经中。细胞在用于实验前，至少要传代扩增4代以上以获得足够量的细胞。有报道称在第2代初始密度为6 000/cm 2培养至第4代共可获得108个细胞[18]。实验中作者开始于第1代细胞100 000/25 cm 2培养瓶并在第3代获得了108个细胞。这些细胞足够用于体外细胞试验或细胞体内移植分析。
BMSCs 可以表达多种细胞表面标记，但是缺乏特异性表面标记。目前，国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出的鉴定人来源BMSCs 的3条最低标准[19]：①对塑料底物的贴附特性。②CD105、CD73及CD90等阳性表达率≥95%，而CD45、CD34、CD14或CD11b 、CD79a 或CD19、HLA-DR 等的阳性表达率
Figure 5 Adipogenic induction of rat bone marrow mesenchymal stem cells at 18 d by oil red O staining (×200)
图5 大鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导18 d 油红O 染色
(×200)
Figure 6 Rat bone marrow mesenchymal stem cells induced
for 21 d (×200)
图6 大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导21d (×200)
a: At 21 d by alkaline phosphatase staining
b: At 21 d by Von Kossa staining
c: At 21 d by alizarin red staining
李晓峰，等. 大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 1725
www.CRTER .org
≤2%。③具有多向分化潜能。实验应用流式细胞仪对培养的大鼠BMSCs 第3代的CD34、CD45、CD44、CD90和CD105等5个表面抗原标志进行了鉴定，结果显示两种方法培养的细胞均显示出间充质干细胞的特性，CD34、CD45等造血干细胞表面标志抗原表达阴性，而CD105、CD44和CD90等间充质干细胞表面标志抗原表达阳性。
杨丽等[20]认为与密度梯度离心法相比，全骨髓贴壁法操作步骤简单，既降低了离心对细胞的损害，又减少了污染机会，节省经费，且分离的BMSCs 贴壁时间短，增殖快，细胞数量多，经传代后能够纯化，提示全骨髓贴壁法是一种更加简单有效的BMSCs 分离方法。蔡鹏 等[21]也应用全骨髓贴壁法获得了高纯度，活性好，形态均一的大鼠BMSCs 。Polisetti 等[22]通过实验研究证实应用简单的粘附方法，可建立一种有效地富集相当纯度的BMSCs ，其表型特征及多分化潜能具有干细胞的特征。
实验利用全骨髓贴壁法，证实了通过简单的体外分离，利用大鼠BMSCs 对塑料底物的贴附特性，建立了一种有效地富集相当纯度的BMSCs 方法，并通过细胞表达一些特异性表面抗原而不表达造血干细胞特异性抗原，其具有向成骨细胞、脂肪细胞诱导分化的潜能等特性，证实了实验分离培养的大鼠骨髓细胞为高纯度的BMSCs 而非其他类型细胞，获得了高纯度、增殖能力强、数量足的BMSCs ，为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。
4 参考文献
[1]
Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999; 284(5411): 143-147.
[2] The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic
of China. Guidance suggestion of caring laboratory animals. 2006-09-30.
中华人民共和国科学技术部.关于善待实验动物的指导性意见. 2006-09-30.
[3] Friedenstein AJ, Piatetzky-Shapiro II, Petrakova KV.
Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. J Embryol Exp Morphol. 1966;16(3):381-390.
[4] Campagnoli C, Roberts IA, Kumar S, et al. Identification of
mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow. Blood. 2001;98(8):2396-2402. [5] Lee OK, Kuo TK, Chen WM, et al. Isolation of multipotent
mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Blood. 2004; 103(5):1669-1675.
[6] Jiang Y , Jahagirdar BN, Reinhardt RL, et al. Pluripotency of
mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 2002; 418(6893):41-49.
[7] Peister A, Mellad JA, Larson BL, et al. Adult stem cells from bone
marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential. Blood. 2004;103(5):1662-1668.
[8] Javazon EH, Colter DC, Schwarz EJ, et al. Rat marrow stromal
cells are more sensitive to plating density and expand more rapidly from single-cell-derived colonies than human marrow stromal cells. Stem Cells. 2001;19(3):219-225.
[9] Gulotta LV, Kovacevic D, Packer JD, et al. Bone Marrow-Derived
Mesenchymal Stem Cells Transduced With Scleraxis Improve
Rotator Cuff Healing in a Rat Model. Am J Sports Med. 2011 Feb 18. [10] Colter DC, Sekiya I, Prockop DJ. Identification of a subpopulation
of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in
colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2001;98(14):7841-7845.
[11] Sekiya I, Larson BL, Smith JR, et al. Expansion of human adult
stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality. Stem Cells. 2002;20(6):530-541. [12] Aubin JE. Osteoprogenitor cell frequency in rat bone marrow
stromal populations: role for heterotypic cell-cell interactions in osteoblast differentiation. J Cell Biochem. 1999;72(3):396-410. [13] Neuhuber B, Swanger SA, Howard L, et al. Effects of plating
density and culture time on bone marrow stromal cell characteristics. Exp Hematol. 2008;36(9):1176-1185.
[14] Chen ZZ, Van Bockstaele DR, Buyssens N, et al. Stromal
populations and fibrosis in human long-term bone marrow cultures. Leukemia. 1991;5(9):772-781.
[15] Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Adult rat and human
bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 2000;61(4):364-370.
[16] Hofstetter CP , Schwarz EJ, Hess D, et al. Marrow stromal cells
form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99(4):2199-2204.
[17] Dezawa M, Takahashi I, Esaki M, et al. Sciatic nerve regeneration
in rats induced by transplantation of in vitro differentiated
bone-marrow stromal cells. Eur J Neurosci. 2001;14(11):1771- 1776.
[18] Yoshimura H, Muneta T, Nimura A, et al. Comparison of rat
mesenchymal stem cells derived from bone marrow, synovium, periosteum, adipose tissue, and muscle. Cell Tissue Res. 2007; 327(3):449-462.
[19] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for
defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006; 8(4):315-317.
[20] Yang L,Xie HJ,Cai Y ,et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu
Linchuang Kangfu. 2009;13(6):1064-1068.
杨丽,张荣华,谢厚杰,等.建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复,2009, 13(6): 1064-1068.
[21] Cai P ,Zhao SX,Su YM, et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu
yu Linchuang Kangfu. 2009;13(36):7073-7077.
蔡鹏,朱绍兴,苏一鸣,等.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(36): 7073-7077.
[22] Polisetti N, Chaitanya VG, Babu PP , et al. Isolation,
characterization and differentiation potential of rat bone marrow stromal cells. Neurol India. 2010;58(2):201-208.
骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast，。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次〔1〕；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4～7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells，AS)，在一
大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。 心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！ ④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。 第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会： ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml 细胞生长液中大约需要4.5ml
脂肪干细胞的提取及鉴定 一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定 1、实验技术及原理: 运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。 2、实验用品: 2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠 2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M 2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗 3、细胞培养的方法与步骤:
万方数据
ＩＳＳＮ１６７３—８２２５ＣＮ２１．１５３９／Ｒ赵凌云，等人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养ｗｗＭ．ｚｇｌｃｋｆ，ｃｏｍｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ０引言 骨髓间充质干细胞是具有形成骨、软骨、脂肪、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群，取材方便，易于体外扩增，可进行自体移植，而不存在组织配型和免疫排斥的问题，被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞。本实验目的在于建立一种可行的骨髓间充质干细胞取材和分离扩增的培养方法。 １材料和方法 设计：开放性实验。 单位：解放军济南军区总医院脊髓修复科。 材料：实验于２００６—０２／１２在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者，对本实验均知情同意。基础培养液由含体积分数为０．１５胎牛血清和低糖仪一ＭＥＭ配置。低糖ｄ－ＭＥＭ培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；淋巴细胞分离液（密度１．０７７ｇ／ｍＬ，上海试剂二厂生产）；胰蛋白酶，胎牛血清（Ｇｉｂｉｃｏ）；Ｃ０２培养箱（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦ９０）；生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦｓａｆｅ一１２００／ｃ）；倒置显微镜（Ｌｅｉｃａ）；离心机（ＪＯＵＡＮＢ４ｉ多功能台式机）。 设计、实施、评估者：设计、实施为第一作者，评估为第二、三作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。 方法： 骨髓间充质干细胞的分离及传代培养：在无菌条件下，以含５ｍＬ肝素钠生理盐水的２０ｍＬ注射器，于患者髂后上棘穿刺抽取骨髓组织６ｍＬ，移入含５ｍＬ肝素钠生理盐水的试管内，混匀，而后沿管壁缓慢加入含１０ｍＬ淋巴细胞分离液的离心管中，２０００ｒ，ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，小心吸取界面层细胞，用Ｄ—Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液洗２次，２０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ，加入基础培养液，血细胞计数板计数，调整细胞的浓度，将细胞悬液按１０９—１０１０Ｌ－１接种于培养瓶，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２饱和湿度孵箱中培养。于培养后的两三天更换培养液，并用Ｄ－Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液冲洗２次，以去除未贴壁的造血细胞，以后每３ｄ换液一次，进一步去除未贴壁的细胞。观察细胞生长情况，待细胞融合成片、长满培养瓶底部后，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶流过所有细胞表面，盖好瓶盖，将培养瓶放在倒置显微镜下观察，发现细胞变圆，部分脱壁，控制消化时间不超过３ｍｉｎ，立即加入２ｍＬ有血清培养液终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞生长区域，吹打过程中不要用力，结束后再用少量培养液漂洗一遍，然后加入适 ５６５０量培养液计数，分别接种在新的培养瓶内。 骨髓间充质干细胞的生长曲线的绘制：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养。以细胞数为纵坐标，时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。 骨髓间充质干细胞贴壁率的测定：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养，每隔２ｈ进行细胞贴壁率检测。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的形态学观察。②骨髓间充质干细胞的生长曲线。③骨髓间充质干细胞的贴壁率。 统计学分析：由第一作者采用ＥＳＡ４．０软件进行统计处理，数据以娃ｓ表示。 ２结果 ２．１骨髓间充质干细胞的形态学观察倒置显微镜下，骨髓间充质干细胞接种１ｄ即贴壁，２ｄ时贴壁细胞较多。经冲洗和换液去除悬浮细胞后，贴壁细胞继续培养３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（图１）。至１４ｄ细胞密集在集落中心，基本铺满瓶底，第３～５代细胞呈均匀一致的长梭型，排列成旋涡状或放射状（图２）。 图１原代培养的骨髓间充质干细胞贴壁后３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（倒置显微镜，ｘ２０） ２．２骨髓间充质干细胞的生长曲线骨髓间充质干细胞传代后３ｄ内处于潜伏期，３ｄ后进入生长期，７ｄ后进入平台期。第３代骨髓间充质干细胞生长曲线见图３。 Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１２００。Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ 万方数据
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定 【摘要】目的分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞，接种含10%胎牛血清的DMEM培养基中。单个核细胞行贴壁培养后，进行细胞形态学观察，绘制细胞生长曲线，分析细胞周期，检测细胞表面抗原。结果采用Percoll(1.073 g/mL)分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀，梭形或星形的成纤维细胞样细胞。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期，至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50%～70%细胞为CD29和CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定，可作为组织工程的种子细胞。 【关键词】脐血;间充质干细胞;细胞周期;免疫细胞化学 Abstract: Objective Isolation and cultivation of mesenchymal stem cells (MSCs) in human umbilical cord in vitro, and determine their biological properties. Methods The mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation from human umbilical cord blood in sterile condition, and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. After the adherent mononuclear cells were obtained, the shape of cells were observed by microscope, then the cell growth curve, the cell cycle and the cell surface antigens were obtained by immunocytochemistry and flow cytometry methods. Results MSCs obtained by Percoll (1.073 g/mL) were similar in size, spindle-shaped or star-shaped fibroblasts-liked cells. Cell growth curve analysis indicated that MSCs were in the exponential stage after 5d and in the stationary stages after 9d. Flow cytometry analysis showed that the CD29 and CD44 positive cells were about 50%～70%. Conclusions The human umbilical cord derived mesenchymal stem cells were grown stably in vitro and can be used as the seed-cells in tissue engineering. Key words:human umbilical cord blood; mesenchymal stem cells; cell cycle; immunocytochemistry 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在一定条件下具有多向分化的潜能，是组织工程研究中重要的种子细胞来源。寻找来源丰富并不受伦理学制约的间充质干细胞成为近年来的研究热点[1]。脐血(umbilical cord blood, UCB)在胚胎娩出后，与胎盘一起存在的医疗废物。与骨髓相比，UCB来源更丰富，取材方便，具有肿瘤和微生物污染机会少等优点。有人认为脐血中也存在间充质干细胞(Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs)。如果从脐血中培养出MSCs，与胚胎干细胞相比，应用和研究则不受伦理的制约，蕴藏着巨大的临床应用价值[2,3]。本研究将探讨人UCB-MSCs体外培养的方法、细胞的生长曲线、增殖周期和细胞表面标志等方面，分析UCB-MSCs 作为间充质干细胞来源的可行性。
小鼠间充质干细胞 一、细胞复苏和接种 1. 37℃预热小鼠间充质干细胞培养液和基础培养液。 2. 从液氮中取出细胞产品管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。 3. 在生物安全柜中，用75%的酒精擦拭产品管外壁。 4. 将产品管中的细胞移至15ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃基础培养液4－5 ml混匀，边滴加边摇匀。 5. 用1ml基础培养液冲洗产品管，并将其转移到15 ml离心管中，边滴加边摇匀。 6. 轻轻混匀细胞后，取10 μl细胞悬液和10 μl台盼蓝混匀，从中取10 μl计数。 7. 细胞悬液在1 000 rpm，室温条件下，离心5分钟，去除上清。 8. 加完全培养液4－5 ml，调整细胞量，轻轻混匀细胞，备用。 9. 按10 000-15 000个细胞/cm2接种细胞。 10. 每个T25培养瓶中加完全培养液3-5 ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。 二、细胞换液和培养 注意：复苏或传代后的细胞，请于24小时后，第一次更换培养液。 1. 复苏后的细胞经37℃、5%CO2培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后，请继续在37℃，5％CO2培养箱内培养。 2. 之后，每2-3天更换培养液1次，至细胞长到培养瓶表面的80% 可进行传代或冻存。 3. 换液前，请将培养液从4℃中取出，使其恢复到室温。 三、消化细胞 1．消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分别配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液，
用前按1：1混合。 将PBS或D-Hank's液, 消化液，含10% FBS的基础培养液恢复到室温。 2．具体操作如下： （1）吸去培养液，加入3 ml PBS或D-Hank's液，使PBS或D-Hank's液均匀的分布在培养瓶细胞表面。1分钟之后，吸去PBS或D-Hank's液。 （2）每个T25培养瓶加入消化液2 ml，使消化液均匀的分布在培养瓶细胞面。 （3）25℃消化2分钟，在显微镜下看细胞回缩成圆形后，轻轻震动使绝大部分细胞脱落。（4）向每个培养瓶中加3-5 ml 含10% FBS的基础培养液中和胰酶的消化作用。 （5）用移液管轻轻吹打培养瓶表面使细胞完全脱落后，吸至15 ml无菌离心管内。 （6）20℃，1 500 rpm 离心5分钟，弃上清。 （7）加入一定量的完全培养液，调整细胞数量后，抽样加入胎盘蓝计数，得到细胞数和活性后，按细胞数传代或冻存。 四、细胞传代 1．消化细胞（详见第三步）。 2．按10000-15000个细胞/cm2接种细胞于T25的培养瓶中。 3．每个培养瓶中加完全培养液3-5ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。 五、小鼠骨髓MSCs的体外分离、培养及扩增 断颈处死小鼠，超净台上取胫骨和股骨，切开两端松质骨，并在骨干中部剪断，无血清DMEM-LG培养基冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，经Percoll密度梯度离心法，分离和收集有核细胞，用含15％FBS的DMEM-LG培养基重悬离心管中的MSCs，镜下细胞计数，使细胞密度达到1X106个/ml，CO2培养箱培养，换液，将MSCs不断纯化。当细胞生长融合达80%-90% 时，用1:1 的0.25% 胰蛋白酶和0.02%EDTA消化分散细胞，在显微镜
人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定 何黎顾华 昆明医学院第一附属医院皮肤性病科云南 [摘要] 目的：探索实验条件下人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定。 方法：利用细胞工程方法进行组织分离及细胞培养：通过免疫组化方法，利用角蛋白单克隆抗体对培养的角质形成细胞进行鉴定，并利用表皮干细胞的相对特异标识分子——CK19对其进行检测分析。 结果：表皮自真皮较完整分离，电镜及免疫组化证实培养细胞为角质形成细胞，免疫组化结果显示：CK反应阳性，部分细胞CK19阳性，表明有表皮干细胞存在。 结论：体外分离、培养角质形成细胞成功，且分离得到的角质形成细胞中有表皮干细胞存在。 [关键词]：角质形成细胞表皮干细胞细胞培养角蛋白——19 对于烧伤、急性创伤、某些疾病导致的皮肤缺损，尤其是大面积烧伤一直以自体皮移植作为首选方案，而自体皮肤不足是临床遇到的主要问题。随着细胞培养技术和组织工程的出现，使许多脏器或组织体外重建成为可能。人工皮肤的研制就是一个典型例子。在这一技术中，种子细胞——角质形成细胞的体外培养，以及体外分离到的角质形成细胞中是否有在体外能大量增殖的表皮干细胞决定了能否成功构建人工皮肤。为此本课题采用组织分离方法及细胞培养方法进行角质形成细胞体外分离及培养；通过免疫组化方法，利用人广谱单克隆抗体对培养细胞进行鉴定；并利用CK19对体外培养细胞中是否有表皮干细胞进行检测。 材料和方法 一、材料 1、取材 选择6-26岁健康男性，行包皮环切术切除的包皮。 2、主要培养基及试剂 (1)磷酸盐缓冲溶液（PBS和D-Hank’s液）：（2）培养基：K-SFM（Gibco公司），编号：37010，内含2.5ug表皮细胞生长因子（EGF）和25mg小牛垂体(BPE)：（3）分离酶：dispase（4）胰蛋白酶；（5）抗人广谱角蛋白单克隆抗体；（6）CK19单克隆抗体；（7）SP 超敏免疫组化试剂盒。 二、方法 1、取材
小鼠骨髓间充质干细胞培养 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。 实验准备： 1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。 2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器 操作步骤 1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养 取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5?2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每两天换液1次，并观察细胞形态。待细胞长至80%-85%时传代（1传2） 2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速。 采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。 分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs 获得或失去这些表面标记物的表达。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定 1、实验技术及原理： 运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型 （CD29/CD44）的鉴定。 2、实验用品： 2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠 2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM 2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗 3、细胞培养的方法与步骤： 3.1无菌操作的要领和要求。 3.2细胞原代培养： 3.2.1操作步骤 a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。 b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。 c. 消化：将漂洗后的组织至于平皿中,加入胶原酶（0.075%II型胶原酶, PH），用量（0.1-0.3ug/ml或200U/ml），再用移液管移至烧瓶中，置于37℃水浴或恒温箱中30分钟），每隔5-10min振荡一次。30min后，生理盐水终止胶原酶的消化。 d. 离心和计数：将离心管做好标记，平衡后以（1200g,1200r/min 10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，1200r/min 离心10分钟（先后顺序），得到单个核细胞。加入培养液吹打混匀后取样计数。根据计数结果调整细胞浓度为10⒋个细胞/ml。
第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述 doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011） 2 南方医科大学在读博士（南宁530011） *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸
．1神经干细胞的原代培养 1)在无菌工作台上取24小时新生SD大鼠4只，乙醚气体麻醉后(也 可无需麻醉)，用酒精消毒皮肤。 2)无菌工作台中，用带有无菌手套的左手拿握住消毒后的新生大鼠， 充分暴露头部，右手使用已灭菌后的眼科剪打开新生大鼠脑部，按无菌操 作规则断头取脑，PBS漂洗3次后，用D．Hanks液漂洗1次，在解剖显 微镜下切取前脑侧脑室周围脑组织(含海马)，仔细剔除脑膜和血管等结缔 组织后，放入D．Hanks液中冲洗。 ．3)在无菌工作台上，用眼科剪将脑组织剪碎至大约0．5mm2的小块， 用吸管反复轻柔吹打成细胞悬液。收集细胞悬液后先后在100目和200 目铜网上过滤，从而获得单细胞悬液。 4)细胞计数：用O．4％台盼蓝与细胞悬液按比例均匀混合，血球计数 板在显微镜下计数台盼蓝呈阴性的活细胞，小细胞团按单个细胞计数。 5)细胞计数后，放入50ml一次性培养瓶中培养(4～5)x105个活离的细胞(已经凋亡或者其它细胞)无需胰蛋白酶消化液消化剥离，培养期间密切观察细胞生长情况。(无血清条件培养液有能刺激NSC分裂增殖的细胞因子，所以只有NSC能存活) ．2神经干细胞的传代 大鼠脑NSC在培养2．-一3d成云雾状，不规则的球形细胞团，4---，6d 后成为悬浮生长的神经球。将悬浮细胞液吸出，采用1000r／min离心 5min，弃上清，加入无血清条件培养基，仍用细口径直吸管吹打为单细胞 悬液，将细胞重悬，调整细胞浓度为(4～5)×105／ml，依照原条件继续培养。 同时取出部分细胞用于NSC的鉴定。 Nestin免疫组化检测步骤： 1)将分离出的部分NSC浓悬液，1000 r／min离心5 min，弃上清； 2)加入2ml配制好的4％多聚甲醛，室温固定15---，20分钟； 3)PBS浸洗3min 2次，去上清； 4)Triton液破膜10 min； 5)PBS浸洗3min洗3次，离心去上清，用残留的一滴PBS重悬细 胞，将细胞滴在涂有O．1％多聚赖氨酸处理过载玻片上。自然干燥，让细 胞贴在载玻片上； 6)3％I-1202浸润细胞10 min灭活内源性过氧化物酶； 7)滴入正常5％胎牛血清室温封闭20min。甩去多余液体，不洗； 8)滴加1：300稀释后的兔抗鼠单克隆nestin抗体4。C过夜。PBS 洗2 min 3次； 9)将抗体轻轻甩去，用PBS缓冲液加满洗涤3次，每次5min； 10)滴加第二抗体，37℃孵育40min后轻轻甩去二抗后用PBS洗涤3 次，每次5min； 11)滴加DAB显色剂后镜下控制显色1 5min，用清水终止显色； 研究论文 12)滴加苏木素复染2min后用自来水终止DAB显色，用O．5％盐酸 酒精分化5s后立刻用自来水轻柔冲洗至玻片变蓝。13、)分别在80％、90％、无水乙醇染色缸中各蘸一下，滴加少量二甲
脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序 一、试剂准备 （一）成脂分化诱导液（Adipogenic Medium, AM）配方【1】： 试剂名称浓度商品信息 1.极限必须培养基 (Dulbecco’S Modified Eagle Medium ，DMEM) 1.0 L (SH30021.01B, Hyclone) 2.胎牛血清 （Fetal Bovine Serum，FBS）10% (ES-009-B, Millipore) 3.青霉素/链霉素 （Penicillin/Streptomycin）1% （TMS-AB2C, CHEMICON） 4.地塞米松 (Dexamethasone,DM) 1μmo／L 分子量：392.46 (D4902-25MG, Sigma) 5.胰岛素 (Insulin, IS) 10 μmol／L 分子量：5808 (91077C—1g, Sigma) 6.3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (Isobutylmethylxanthine,IBMX) 0.5 mmol／L 分子量：222.24 ( I5879-100MG, Sigma) 7.吲哚美辛 (Indomethacin,ID) 200 μmol／L 分子量：357.79 (I7378—5G, Sigma) （二）成脂分化诱导液浓储液配制 试剂名称质量浓缩倍数配制方法 1.Stock A 胎牛血清1ml/管1X( liquid）分装1ml/管X100 保存：-20℃ 2.Stock B 青霉素/链霉素0.1ml/管100X( liquid）分装0.1ml/管X100 保存：-20℃ 3.Stock C 地塞米松0.0117738 g 1000X 溶于30ml 无水乙醇(0.1%) 分装0.1ml/管X300 保存：-20℃ 4.Stock D 胰岛素0.05808 g100X 溶于10ml Hcl(0.1 mol/L，PH2.0) 分装0.1ml/管X100 保存：4℃ 5.Stock E 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.05556 g 200X 溶于2.5ml DMSO(0. 5%) 分装0.05ml/EP管X50 保存：-20℃ 6.Stock F 吲哚美辛0.07155 g 500X 溶于2ml 无水乙醇(0.2%) 分装0.02ml/管X100 保存：-20℃ （三）成脂分化诱导液工作液配制（10ml） 1.取DMEM(L)8.72ml加入15ml离心管（BD）; 2.加1管Stock A（1ml）； 3.加1管Stock B（0.1ml）； 4.取1管Stock C（0.1ml）溶解，加入0.01ml； 5.加1管Stock E（0.05ml）；