曲张链菌素产生菌壮观链霉菌NRRL 2494
遗传操作体系的建立
宋姣姣1，康前进2，张连茹1，吴莹莹1*，白林泉2（1.厦门大学生命科学学院，天然产物源靶向药物国家地方联合工程实验室，福建厦门361005；2. 上海交通大学生命科学技术学院，微生物代谢国家重点实
验室，上海200040）
摘要：曲张链菌素属于安莎类抗生素，具有显著的生物活性．在从壮观链霉菌NRRL 2494的发酵产物中分离和鉴定了多组分曲张链菌素的基础上，探索和优化了外源DNA通过接合转移进入壮观链霉菌NRRL 2494的操作方法和培养条件．以游离型质粒pJTU1278为载体，在体外构建了一个曲张链菌素酰胺合酶基因svaF敲除的质粒，通过接合转移转入到壮观链霉菌NRRL 2494野生型菌中，所获得的svaF基因缺失突变株失去了产曲张链菌素的能力．该遗传操作体系的成功建立和优化，使得在体内分析和鉴定曲张链菌素生物合成基因的功能成为可能，同时也为建立其他类似放线菌的遗传操作体系提供了参考．
关键词：壮观链霉菌；遗传操作体系；曲张链菌素；生物合成；酰胺合酶
中图分类号：Q 933 文献标志码：A
放线菌所产生的次级代谢产物是天然活性物质的重要来源．曲张链菌素（streptovaricin）属较早发现的安莎类抗生素，其组分A-E由Siminoff[1]和Ravina等[2]于1957年从壮观链霉菌（Streptomyces spectabilis）NRRL 2494的发酵产物中首先分离，其中streptovaricin A和C 的基本化学结构在1968年得到纯化和鉴定[3]．此后，科学家们还从其他壮观链霉菌株中先后分离和鉴定了组分F, G, K, J, U等数个曲张链菌素的同系物[4-5]，发现这些化合物都有共同的芳香核-萘醌环（图1）．对曲张链菌素的生物合成进行初步研究发现，其以3-氨基-5-羟基苯甲酸（3-amino-5-hydroxybenzoic acid，AHBA）为前体，经I型聚酮合酶（polyketide synthase I, PKS I）催化的10步缩合反应延伸完成聚酮脂肪长链，最终形成大环内酰胺结构并释放[6]，这一聚酮链骨架的化学结构和合成过程与著名的抗结核临床药物利福霉素相同．
基金项目：国家自然科学基金项目（31100027）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（20110121120013）．*通信作者：wuyingying@https://www.doczj.com/doc/919023992.html,
图1 曲张链菌素的化学结构式
Fig.1 Chemical structures of streptovaricins
由于曲张链菌素具有抑制RNA聚合酶和反转录酶（DNA聚合酶）的活性[7-9]，目前已发现其对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和非结核分枝杆菌如堪萨斯分支杆菌（Mycobacterium kansasii）、鸟杆菌（Mycobacterium avium）等都有显著的抗菌活性[10-11]，并有抗病毒活性和优于环孢菌素A的免疫抑制功能[4]，但由于毒性较大而较少使用．随着合成生物学的学科发展和技术创新，通过组合生物合成的策略对目标抗生素进行结构优化成为可能[12-14]。基于曲张链菌素良好的药物开发前景，我们试图发掘生物活性更好的新结构类似物并增加其产量，从而适合工业化开发．成功建立抗生素产生菌的遗传操作体系是对抗生素进行生物合成研究和结构改造的前提，但关于壮观链霉菌的遗传操作体系目前还未见报道．本文以曲张链菌素产生菌壮观链霉菌NRRL 2494菌株为对象，在了解其抗生素敏感性和生长速度快等特点的基础上，发现了缩短常规结合转移时间和使用半营养培养基等方法对结合转移的促进作用，成功实现了对曲张链菌素生物合成基因的敲除突变．该遗传操作体系的建立为进一步研究曲张链菌素的生物合成奠定了基础．
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1菌株和质粒
产生曲张链菌素的壮观链霉菌NRRL 2494，用于结合转移的游离型质粒载体pJTU1278[15]，作为阿泊拉霉素抗性基因来源的质粒pJTU472[16]由上海交通大学微生物代谢国家重点实验室构建并保存；构建克隆用载体pBluescript II SK（+）和宿主菌大肠杆菌（Escherichia coli）Top10，结合转移的质粒供体大肠杆菌ET12567/pUZ8002[17]均由本实验室保存．
1.1.2 培养基
LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母抽提物5，NaCl 10，pH 7.0.
TSBY培养基（g/L）：TSB （Trypticase Soy Broth）30，酵母抽提物10，蔗糖103，pH 7.2.
SFM培养基（g/L）：黄豆饼粉20，加入1 L自来水灭菌后用四层纱布过滤，再加入甘露醇20，pH 7.5.
高氏一号培养基（g/L）：可溶性淀粉20，NaCl 0.5，KNO3 1，FeSO4 0.001，K2HPO4 0.1，MgSO4.7H2O 0.5，pH 7.2. Waksman培养基（g/L）：（NH4）2SO40.2，K2HPO3.3H2O 3.0，MgSO4.7H2O 0.5，CaCl2.7H2O 0.126，pH 7.2．
壮观链霉菌NRRL 2494发酵培养基ZM [4]（g/L）：黄豆饼粉10，葡萄糖25，酵母粉2.5，氯化钾4，K2HPO4 0.1，硫酸铵5，牛肉浸膏1，碳酸钙3．
ISP2和ISP3培养基配方见参考文献[18]．以上对应的固体培养基加入20 g琼脂．
1.1.3 酶和主要试剂
酶类和DNA marker购自TaKaRa公司，DNA回收试剂盒购自OMEGA公司，质粒回收试剂盒购自生工生物工程股份有限公司，其他常规试剂均为国产分析纯级产品，各种抗生素购自国内试剂公司，使用浓度为氨苄青霉素（ampicillin）100 mg/mL，氯霉素（chloramphenicol）25 mg/mL，卡那霉素（kanamycin）25 mg/mL，硫链丝菌素（thiostrepton）10 mg/mL，阿泊拉霉素（apramycin）30 mg/mL，萘啶酮酸（nalidixic acid）25 mg/mL，制霉菌素（nystatin）25 mg/mL．PCR引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成，DNA测序由上海立菲公司完成．1.2 方法
1.2.1 壮观链霉菌NRRL 2494的抗生素敏感性检测
采用SFM培养基，配制包括氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、硫链丝菌素、阿泊拉霉素、链霉素和萘啶酮酸在内的7种抗生素系列浓度平板，浓度分别为1，5，20，和50 mg/L．取新鲜的菌丝体划线展开于各个抗生素浓度梯度的固体平板上，置于28 °C培养箱中培养，从
第3天开始至第7天进行生长情况观察．
1.2.2 酰胺合酶基因svaF敲除重组质粒pWY5的构建
壮观链霉菌NRRL 2494的基因组DNA参考文献[19]的方法进行快速提取．根据所获得酰胺合酶基因片段的DNA序列，在基因svaF的左右两侧各1100 bp处分别设计两对引物，分别是左同源臂SvaFLF：5’-AAAGGTACCGGCTCAGGGACGCCACCA-3’（引入Bam HI 酶切位点）和SvaFLR：5’-AAAAAGCTTGTCCGGCGACTGGGCGACA-3’（引入Hin dIII酶切位点）；右同源臂SvaFRF：5’-AAAAAGCTTGTCCTGCGCCGCGCCGTTGT-3’（引入Hin dIII 酶切位点）和SvaFRR：5’- AAAGGATCCGCCAGTCGCAGGGGAGCGG-3’（引入Kpn I酶切位点）．以曲张链菌素野生型产生菌NRRL 2494的基因组DNA为模板，分别以上述两对引物进行PCR，扩增出两侧同源交换臂片段，根据两端带有的限制性内切酶位点分别进行双酶切，将这2个片段与经同样处理后的pBluescript II SK（+）载体连接，构建重组质粒pWY1．测序验证后以KpnI和BamHI酶切pWY1，回收2.2 kb包含双臂序列的片段，与经过相同酶处理的载体pJTU1278连接，构建重组质粒pWY4．用Hin dIII酶切质粒pJTU472，回收1.4 kb左右含有转移原点ori T和阿泊拉霉素抗性基因aac（3）IV的Hin dIII片段，连接至同样经Hin dIII处理过的pWY4上，构建最后用于基因置换的质粒pWY5．将pWY5转化到E. coli ET12567/pUZ8002中，构建E. coli ET12567/pUZ8002/pWY5，作为接合转移的供体菌．
1.2.3 大肠杆菌和壮观链霉菌NRRL 2494的接合转移实验
供体菌E. coli ET12567/pUZ8002/pWY5在6 mL含有相应工作浓度的卡那霉素、氯霉素、阿泊拉霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中于37 °C生长至OD600值约0.4~0.6时，离心收集菌体（3220 g，10 min），用LB洗涤菌体2~3次后，重悬于1 mL LB培养基中，作为接合转移的供体菌．受体壮观链霉菌NRRL 2494于SFM固体培养基上生长120 h，将孢子收集到TES buffer中，充分震荡并过滤后以3220 g离心5 min去除上清，将孢子重悬于5 mL TES buffer中，50 °C热激10 min，冷却后加入等体积的预萌发液，37 °C培养萌发2.5 h，3220 g 离心10 min收集菌体，悬浮于10 mL的LB液体培养基中，作为接合转移的受体菌．将上述供体菌和受体菌分别进行显微计数，按大肠杆菌细胞与链霉菌孢子数量相当的比例各取相应体积的悬液混合均匀，涂布于不含任何抗生素的半营养SFM固体培养基上，吹干，置于37 °C培养8 h后用1 mL含有30 μg /mL阿泊拉霉素和25 μg /mL萘啶酮酸的无菌水均匀覆盖整个平板，吹干表面水分后置于28 °C培养，大约3~5 d后可观察到结合子．
1.2.4 壮观链霉菌NRRL 2494双交换突变株的获得
接合转移平板上长出的接合子分别影印到含有硫链丝菌素和阿泊拉霉素的SFM固体培养基上，28 °C培养3-5天后，选取对硫链丝菌素敏感而对阿泊拉霉素不敏感的菌株，提取基因组DNA，以阿泊拉霉素的抗性基因引物Apr-F（5’-GCTCA TCGGTCAGCTTCTCA-3’）和Apr-R（5’-TCGCA TTCTTCGCA TCCC-3’）进行扩增．为进一步验证该突变株，在所敲除基因序列的上下游设计一对检测引物（MTF：5’-ACCACCTCA TGGCGATCCCGTACAAC-3’和MTR：5’-GCTGTGCGGTGAGTTCGTGCGGTT-3’），利用PCR结果来判断接合转移子的基因型（单交换或双交换突变株）．
1.2.5 壮观链霉菌野生型及其突变株的发酵和产物分析
曲张链菌素产生菌壮观链霉菌NRRL 2494或其突变株接种于SFM固体培养基上，28 °C培养6 d后，刮取孢子接种于ZM液体培养基中，28 °C、220 r/min摇床培养68~72 h．按照培养物：培养基比例为1：50的接种量转接于新鲜的ZM液体培养基中，28 °C、220 r/min 继续培养5 d，得到曲张链菌素产生菌及其突变株的液体发酵物．发酵液经离心，调上清pH 到7.0，加等体积的乙酸乙酯提取两次，菌丝体经丙酮浸泡24 h，过滤、减压浓缩至无丙酮水溶液，乙酸乙酯萃取两次．合并乙酸乙酯萃取液，用旋转蒸发仪得到浓缩物样品，溶于500 μL的甲醇中，进行高效液相色谱（HPLC）检测．检测条件为：流动相A相为100%纯水，流动相B为100%甲醇；流速为0.6 mL/min，检测波长为254 nm．梯度洗脱程序：0~6 min，20%~75% B相；6~10 min，75% B相；10~15 min，75%~95% B相；15~20 min，95% B相；20~22 min，95%~20% B相，22~37 min，20% B相．
2 结果和分析
2.1 壮观链霉菌NRRL 2494菌株的抗生素敏感实验
为了确定壮观链霉菌遗传操作系统所需的遗传筛选标记，我们检测了NRRL 2494菌株对多种抗生素的敏感性．结果表明，NRRL 2494菌株对卡那霉素、阿泊拉霉素和硫链丝菌素较为敏感，而对氨苄青霉素、氯霉素、链霉素和萘啶酮酸都表现出不同程度的抗性（表1）．据此结果，我们选择阿泊拉霉素作为NRRL 2494突变株的筛选标记，并将萘啶酮酸作为接合转移实验中大肠杆菌的抑制剂．
表1 壮观链霉菌NRRL 2494菌株对不同抗生素的敏感性Tab. 1 The sensitivity of S. spectabilis NRRL 2494 to various antibiotics
抗生素抗生素使用浓度
氯霉素+ + -/+
卡那霉素-/+ - -
阿泊拉霉素- - -
硫链丝菌素-/+ - -
链霉素+ -/+ -
萘啶酮酸+ + +
注：-，未生长；-/+，弱生长；+，正常生长
2.2 壮观链霉菌与大肠杆菌接合转移实验方法和条件的摸索
大肠杆菌-链霉菌间的接合转移方法由于条件温和、操作方便和菌株稳定，是目前遗传操作中最常用的方法[20]．鉴于NRRL 2494菌株生产的孢子比较丰富，我们选择利用菌株的孢子通过接合转移的方法来探索壮观链霉菌NRRL 2494菌株的遗传操作体系的建立．首先，为收集大量孢子以进行遗传操作，我们采用了SFM、ISP2、ISP3、ISP4和waksman 5种固体培养基对NRRL 2494菌株进行了培养，发现其在SFM平板上的产孢情况最佳，故选用SFM作为NRRL 2494的产孢培养基．其次，链霉菌孢子的质量和数量是影响接合转移成功与否的关键因素，因此，采用插片法观察菌株NRRL 2494在SFM培养基上生长的菌丝和孢子的形态，并应用血球计数板对孢子进行计数，结果显示培养24 h后NRRL 2494开始产生少量孢子，48 h后开始产色素，而96-120 h孢子形态和数量达到最佳状态，168 h后孢子开始呈现老化状态，因此选取120 h作为孢子收集的时间．
鉴于NRRL 24946较其它种属链霉菌更快的生长速度，我们在接合转移实验中设置了一系列供体菌与受体菌的接合时间梯度，由常规链霉菌使用的12~20 h缩短到6~14 h，发现结合时间在8 h左右效果最好．也正是基于生长速度快的特点，我们采用完全SFM和半营养SFM培养基进行接合转移实验并比较结果，发现在抗生素覆盖接合转移平板后，完全培养基表面在48 h内就生长出链霉菌菌苔，而半营养培养基上则在3~5 d后出现分散的链霉菌菌
落．这个结果说明，完全培养基上链霉菌的生长速度过快，抑制了大肠杆菌的生长，导致结合转移过程受阻；而营养成分减半的培养基控制了链霉菌的生长，保证了大肠杆菌的生长速率，使得大肠杆菌中的外源重组质粒能够进入链霉菌，提高了接合效率．因此，我们选择半营养SFM培养基作为NRRL 2494与大肠杆菌间结合转移筛选培养基．
2.3 SvaF基因失活突变株的筛选
根据1.2.2节的方法，我们构建了用于NRRL 2494菌株中酰胺合酶基因svaF敲除的重组质粒pWY5，为验证其正确性，将pWY5以Kpn I和Bam HI双酶切，得到9.2和3.6 kb两个片段；用Hin dIII单酶切，得到12.8 kb的单个片段，结果均符合预期（图2）．
A. svaF基因失活突变株的构建示意图；
B. 重组质粒pWY5的限制性酶切结果：1. 标准DNA分子质量；
2. Kpn I和Bam HI双酶切产物；
3. Hin dIII单酶切产物．
图2 svaF基因失活突变株的构建及pWY5质粒验证
Fig. 2 Construction of svaF inactive mutant and confirmation of plasmid pWY5
以E. coli ET12567/pUZ8002/pWY5作为供体菌，壮观链霉菌NRRL 2494的孢子作为受体菌进行接合转移，培养3~5 d后，在每个9 cm平板上都有20个以上的接合转移子出现．挑取单菌落分别影印至含有硫链丝菌素的平板和阿泊拉霉素的平板上培养，并对可能的单交交换接合子在无抗性的固体培养基上进行2轮松弛，筛选出4个突变株SW1-2，SW1-3，SW1-10和SW1-12．以这4株菌的基因组DNA为模板，以阿泊拉霉素抗性基因引物Apr-F/Apr-R和检测引物MTF/MTR分别进行PCR扩增．如果是双交换菌株，可得到0.73 kb的阿泊拉霉素抗性基因片段和1.7 kb的验证引物扩增产物；野生型菌株则只能得到1.0 kb的验证引物扩增产物，不含阿泊拉霉素抗性基因．PCR结果表明所得到的4个突变株均为双交换菌株（图3），
对验证引物扩增产物的测序结果进一步证明了突变株的正确性．
A. 壮观链霉菌NRRL 2494野生型和svaF基因失活突变株中阿泊拉霉素抗性基因的PCR扩增结果：1. 标准DNA分子量；2. NRRL 2494野生型菌株；3. pJTU472；4. SW1-2；5. SW1-3；6. SW1-10；7. SW1-12；
B. 壮观链霉菌NRRL 2494野生型和svaF基因失活突变株中检测引物的PCR扩增结果：1. 标准DNA分子
量；2. NRRL 2494野生型菌株；3. SW1-2；4. SW1-3；5. SW1-10；6. SW1-12．
图3 svaF基因失活突变株的PCR验证
Fig. 3 Gel electrophoresis analyses of PCR products from ΔsvaF mutants
2.4 SvaF基因失活突变株的发酵产物分析
将所获得的双交换突变株进行发酵培养，同时以野生型菌株NRRL 2494作为对照，用高效液相色谱-质谱联用的方法（HPLC-MS）检测发酵产物．结果显示，野生型菌株的发酵产物（图4 A）在保留时间为31.29 和37.6 min时，分别检测到曲张链菌素C组分([M+H]+ (m/z 769.8)，[M+Na]+ (m/z 791.8)；图4 C)和G组分([M+H]+ (m/z 786.4)，[M+Na]+ (m/z 808.3)；图4 D)，而突变株发酵产物（图4 B）未检出相应的质谱数据，即突变株不再产生野生型菌株中的主要曲张链菌素组分streptovaricin C和streptovaricin G. 这说明位于重组质粒pWY5上的外源DNA通过接合转移从大肠杆菌中导入到了壮观链霉菌NRRL 2494中，并发生了预期的同源重组，成功地获得了酰胺合酶基因svaF缺失的双交换突变株．酰胺合酶属于NA T (Arylamine N-Acetyltransferase) 家族，具有保守的Cys-His-Asp三联体活性位点，与聚酮链的释放环化有关[21].由于这些突变株不再产生曲张链菌素的组分，表明酰胺合酶SvaF与曲张链菌素的生物合成相关．
A. 壮观链霉菌NRRL 2494野生型菌株，(●)：曲张链菌素C；(☆)：曲张链菌素G；
B. svaF基因失活突变
株SW1-2；C. 曲张链菌素C的质谱数据；D. 曲张链菌素G的质谱数据.
图4 svaF基因失活突变株发酵产物的高效液相色谱-质谱分析
Fig. 4 Analyses of fermentation products from ΔsvaF mutants by HPLC-MS
3 讨论
链霉菌属于放线菌中的最大类群，是一类具有重要经济价值的革兰氏阳性菌，能够产生多种抗生素和生物活性物质．为实现对其生物合成途径及代谢调控的人工控制，需要稳定的遗传操作系统．通过接合转移的方式，链霉菌遗传操作体系的发展相对成熟，但对壮观链霉菌的遗传操作系统仍未见报道．壮观链霉菌能够产生包括大观霉素、曲张链菌素、硝本吡喃酮、巴弗洛霉素等多种抗生素[22]，其中曲张链菌素是一种极具前景的候选药物．因此，建立壮观链霉菌NRRL 2494的遗传操作体系，利用组合生物合成的方法对其改造，有望获得具有良好活性的新型化合物．
在常规的放线菌基因敲除实验中，接合转移过程中供体菌和受体菌的接合时间一般都在12 h以上，鲜见低于12 h的报道．我们按照该时间多次尝试NRRL 2494的结合转移，都没能成功获得结合子．插片法观察的结果表明壮观链霉菌NRRL 2494生长速度较普通链霉菌快，因此我们尝试缩短接合时间到8 h，同时使用半营养培养基用作接合转移，最成功建立
了外源DNA通过接合转移进入壮观链霉菌NRRL 2494的遗传操作体系，并实现对其所产曲
张链菌素的生物合成基因进行体内敲除的遗传操作，获得了曲张链菌素酰胺合酶基因失活的双交换突变株，导致该突变株不再产生曲张链菌素．此外，生物信息学分析表明，该基因与利福霉素生物合成基因簇中的rifF同源性较高，研究表明RifF是利福霉素生物合成中的关键酶，负责安莎聚酮链的释放[23]．我们的实验结果提示了曲张链菌素中的酰胺合酶SvaF在体内具有与RifF相似的功能．
综上所述，本研究成功建立了壮观链霉菌NRRL 2494的遗传操作体系，为进一步研究曲张链菌素的生物合成和获取曲张链菌素的新结构类似物奠定了基础，同时也为其他生长速度较快的链霉菌属菌种的相关类似研究提供了参考．
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Gene Manipulation System for Streptovaricin Producer Streptomyces
spectabilis NRRL 2494
SONG Jiao-jiao1, KANG Qian-jin2, ZHANG Lian-ru1,
WU Ying-ying1 *, BAI Lin-quan2
(1. State-Province Joint Engineering Laboratory of Targeted Drugs from Natural Products, School
of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, China; 2. State Key Laboratory of
Microbial Metabolism, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong
University, Shanghai 200240, China)
Abstract: In order to enable the streptovaricin biosynthetic study by in vivo gene disruption, it is crucial to develop a genetic modification system for producer Streptomyces spectabilis NRRL 2494. This study aimed to construct the method of conjugation to transfer exotic DNA into Streptomyces spectabilis NRRL 2494. A putative streptovaricin amide synthase gene svaF was disrupted in vivo, and the resulting plasmid was transferred into Streptomyces spectabilis NRRL 2494 by conjugation through a double-crossover recombination event. The svaF gene mutants lost the ability to produce streptovaricin. Based on the above work, we developed a genetic manipulation system for Streptomyces spectabilis NRRL 2494, enabling the functional characterization of streptovaricin biosynthetic genes in vivo, and offered a positive example for other fast-growing Actinobacteria lacking an appropriate genetic manipulation system.
Key words: Streptomyces spectabilis; genetic manipulation system; streptovaricin; amide synthase
酵母菌和霉菌教学设计Teaching design of yeast and mould
酵母菌和霉菌教学设计 前言：小泰温馨提醒，生物学又称生命科学、生物科学，是一门由经验主义出发，广泛的 研究生命的所有面向之自然科学，内容包括生命起源、演化、分布、构造、发育、功能、 行为、与环境的互动关系，以及生物分类学等。本教案根据生物课程标准的要求和针对教 学对象是初中生群体的特点，将教学诸要素有序安排，确定合适的教学方案的设想和计划、并以启迪发展学生智力为根本目的。便于学习和使用，本文下载后内容可随意修改调整及 打印。 1.了解（青霉或曲霉）的形态结构，营养方式和生殖方式及酵母 菌和霉菌对自然界的意义和与人类的关系。 2.通过指导学生观察酵母菌、青霉或曲霉，继续培养学生的 动手实验能力和观察能力。 3.通过了解酵母菌和霉菌与人类的关系，学会用一分为二的 方法分析事物。 重点、难点分析 1.酵母菌和霉菌的形态结构和生活特点，酵母菌和霉菌对自 然界的意义和与人类的关系是本章的重点知识。因为： （1）通过学习酵母菌和霉菌的形态结构，让学生与所学过 的植物细胞结构、细菌细胞结构进行比较分析，归纳总结出它们 在细胞结构上的异同。这样有利于培养学生的分析和综合能力。 （2）通过学习酵母菌和霉菌的生活特点，有利于了解酵母 菌和霉菌对自然界的意义和与人类的关系，使学生懂得研究微生 物的重要任务之一就是用其利，避其害。了解真菌在经济上所蕴
藏的潜在价值是巨大而多样的。 2.酵母菌的营养方式是本章的教学难点： 酵母菌既是异养（腐生）厌氧型真菌，又是异养需氧型真菌，由于初一学生知识水平有限，教师要讲清酵母菌获得能量的方式一定难度。 教学过程设计 一、本课题参考课时为一课时。 二、第一课时： 1.课前准备： 教师首先做好酵母菌的培养。酵母菌的简易培养方法如下： ①提前2～3天用3％～5％的蔗糖或2％葡萄糖溶液放入鲜酵母或一小块发面，恒温22℃培养。 ②将苹果皮切碎或用散发酒味的水果皮，装入瓶内，注意瓶子不要太大，轻轻压实，加入凉开水浸没，不用接种，在较温暖的地方培养2～3天镜检，即能找到酵母菌。 2.教学过程： （1）关于酵母菌形态结构的教学，可以用边讲述边实验的方法进行，有条件的学校最好在实验室上课。课上教师首先指导学生制作含有大量酵母菌的临时装片，并指导学生用显微镜观察酵母菌的形态结构；如果无实验室条件，在教室上课，课前教师可事先做好1～2台观察酵母菌的示范镜。这样学生通过对酵母菌形态结构的观察，对酵母菌建立感性认识。如果不具备以上条件
最新整理七年级初一生物教案第一节酵母菌和霉菌详细介绍：第一节酵母菌和霉菌 教学目标1．了解酵母菌和霉菌（青霉或曲霉）的形态结构，营养方式和生殖方式及酵母菌和霉菌对自然界的意义和与人类的关系。2．通过指导学生观察酵母菌、青霉或曲霉，继续培养学生的动手实验能力和观察能力。3．通过了解酵母菌和霉菌与人类的关系，学会用一分为二的方法分析事物。重点、难点分析1．酵母菌和霉菌的形态结构和生活特点，酵母菌和霉菌对自然界的意义和与人类的关系是本章的重点知识。因为：（1）通过学习酵母菌和霉菌的形态结构，让学生与所学过的植物细胞结构、细菌细胞结构进行比较分析，归纳总结出它们在细胞结构上的异同。这样有利于培养学生的分析和综合能力。（2）通过学习酵母菌和霉菌的生活特点，有利于了解酵母菌和霉菌对自然界的意义和与人类的关系，使学生懂得研究微生物的重要任务之一就是用其利，避其害。了解真菌在经济上所蕴藏的潜在价值是巨大而多样的。2．酵母菌的营养方式是本章的教学难点：酵母菌既是异养（腐生）厌氧型真菌，又是异养需氧型真菌，由于初一学生知识水平有限，教师要讲清酵母菌获得能量的方式一定难度。教学过程设计一、本课题参考课时为一课时。二、第一课时：1．课前准备：教师首先做好酵母菌的培养。酵母菌的简易培养方法如下：①提前2～3天用3％～5％的蔗糖或2％葡萄糖溶液放入鲜酵母或一小块发面，恒温22℃培养。②将苹果皮切碎或用散发酒味的水果皮，装入瓶内，注意瓶子不要太大，轻轻压实，加入凉开水浸没，不用接种，在较温暖的地方培养2～3天镜检，即能找到酵母菌。2．教学过程：（1）关于酵母菌形态结构的教学，可以用边讲述边实验的方法进行，有条件的学校最好在实验室上课。课上教师首先指导学生制作含有大量酵母菌的临时装片，并指导学生用显微镜观察酵母菌的形态结构；如果无实验室条件，在教室上课，课前
酵母菌、霉菌的观察
酵母菌是一类单细胞真菌，一般呈圆形、椭圆形，无性繁殖以芽孢为主，也有少数是裂殖，有些酵母菌能产生囊孢子，有的能形成假菌丝。酵母菌的菌落似细菌菌落，但较大且厚，多呈白色，少数为红色。酵母菌在液体中生长可形成菌膜、菌环、沉淀和浑浊。酵母菌的细菌结构较完善，即有壁、膜、质、核等结构。酵母菌的细胞形态、繁殖方式和培养特征均为菌种鉴定的依据。 酵母活细胞新陈代谢旺盛，活力强，还原力也强，若无毒的染料进入细胞，既被还原脱色，但死细胞及代谢作用缓慢的老弱细胞无此还原力。美兰是无毒染料，且能被活细胞还原成无色，故可用来区别细胞的死活。 霉菌是一些小型丝状真菌、单细胞（根霉、毛霉）或多细胞（曲霉、青霉），其细胞结构与酵母类似，同属真核细胞。 霉菌形态较复杂，个体较大，具有分枝的菌丝体和分化的繁殖器官。其菌丝分为气生菌丝与营养菌丝（菌丝比放线菌粗得多）观察时请注意菌丝是否具有横膈膜、有无假根、无性繁殖时形成何种孢子，孢子着生方式以及孢子头的构造等，以区别各种不同霉菌的形态。 霉菌菌落由分枝状菌丝组成，较疏松，呈毛状、棉絮状、绒毛状或毡状。由于不同霉菌形成的孢子均有不同颜色、构造、性状，故菌落表面呈现出不同的结构和色泽特征。菌丝一般呈白色或灰白色，菌落中心的菌丝较老，先产生孢子，故常形成同心圆。 实验材料和方法： 材料： （1）试剂：美蓝染色液，乳酸苯酚油固定液； （2）菌种：Saccharomyces cerevisiae (酿酒酵母) Candida tropicalis（热带假丝酵母）Penicillium chrysogenum(产黄青霉) Aspergillus niger (黑曲霉) Rhizopus nigricans (黑根霉) Mucor racemosus (总状毛霉) （3）其他：显微镜、载玻片、盖玻片等 1、酵母菌活体观察及死亡率的测定： （1）取洁净载玻片一片，于中央位置处滴加一滴蒸馏水。用经火焰灼烧后的接种环冷却后取少量菌种于蒸馏水中，盖上盖玻片，在显微镜下观察活体状态下的酵母菌； （2）在盖玻片一侧滴加美蓝水染液，在另一侧用吸水纸吸，使美蓝水均匀分布在盖玻片内。在显微镜下观察酵母菌染色情况，并计算死亡数目。 2、子囊孢子观察 从产孢子的培养基上挑取少量菌苔于载玻片的水滴中，经过涂片、干燥和热固定后，加数滴孔雀绿染液，染色1min，水洗去染液；加95%的乙醇脱色30s，水洗去乙醇溶液；最后用0.5%沙黄染液复染30s，水洗去染液，用吸水纸吸去载玻片上的水分，待制片干燥后镜检。 3、假菌丝观察（假丝酵母） 经火焰灼烧后的接种环冷却后取少量菌悬液于载玻片上，用盖玻片盖上并镜检。 4、假根观察、孢子囊的观察（黑根霉） 取洁净载玻片一片，于中央位置处滴加一滴乳酸苯酚固定油，用经火焰灼烧后的镊子取少量菌苔（连带培养基）于固定油中，用盖玻片盖上，并用镊子头部轻压盖玻片制成片，在显微镜下观察黑菌霉的假根、孢囊孢子。 5、孢子头结构（产黄青霉、黑曲霉）、足细胞观察（黑曲霉） 方法步骤同4。
《观察酵母菌和霉菌》教案 封丘县曹岗乡第一初中张立柱一．教学目标 1.让学生利用显微镜和放大镜，观察酵母菌和霉菌 2.让学生掌握酵母菌、霉菌的结构以及显着的区别，让学生熟练的操作酵母菌的染色，看到细胞核及突起物。 3.学生看到霉菌的结构会说出孢子的颜色，菌丝的表现，总结出霉菌的结构特点。 二．教学重点难点 1.教学重点：让学生自己总结出酵母菌、霉菌的结构，霉菌、蘑菇等真菌的细胞里都有细胞核，是真核生物。 2. 教学难点：在显微镜下观察酵母菌和霉菌后写出实验报告以及小组合作的效果。 三．教学过程 1.导语 同学们，我们已经知道了细菌的结构、特点和作用，但是你们知道不知道真菌的结构呢我们都吃过蘑菇，蘑菇的种类很多，最有代表性的蘑菇是黑木耳、白木耳，又叫做银耳、香菇、牛肝菌，还有我们叫不出名字的野蘑菇，我们这里下过雨以后在路边、树林都会发现默默无闻的可爱的蘑菇，他们有的像把雨伞，有的像个蒙古房，它们都是真菌长出来的，它们没有叶绿素，没有根茎叶的分化，他们由菌盖、菌柄、
菌丝，菌褶构成，菌褶处存在有孢子，孢子是蘑菇的后代，靠风传播。有的蘑菇能吃，有的有毒，但能提取兴奋剂，真菌种类多，但不外乎几大类，正如人一样，有黑人、白人、黄种人。有人从霉菌培养皿中提取一种药物，他把它叫做青霉素，并获得了诺贝尔奖，青霉素的药效是抑制病菌的生长和发育，可以治疗咳嗽、发热，还可以治疗淋病。真菌也有坏处，如让人手长手癣、脚气。 真菌又小又可爱，我们用肉眼直接看不到它们，今天我们上实验课，借助显微镜来观察，我为大家配置好的酵母菌、霉菌，大家分小组一起观察，最后写出实验报告 2.目的要求 认识酵母菌和霉菌的结构，并且知道它们属真菌。 3.材料用具 酵母菌的培养液，橘子皮上的霉菌，吸管，镊子，显微镜，解剖针，载玻片，盖玻片，放大镜，碘液，吸水纸。4.实验步骤 （1）观察酵母菌 a.取一滴酵母菌的培养液，滴在载玻片上，盖上盖玻片，用显微镜观察。 b.在盖玻片一侧滴上一滴碘液，以防碘液过多从另一侧流出，可以用吸水纸吸引，千万不要把碘液滴在实验台上，在显微镜下观察。
2020 九年级生物教案第二章第一节酵母菌和霉菌教学设计_0780文档 EDUCATION WORD
九年级生物教案第二章第一节酵母菌和霉菌教学设计_0780文档 前言语料：温馨提醒，教育，就是实现上述社会功能的最重要的一个独立出来的过程。其目的，就是把之前无数个人有价值的观察、体验、思考中的精华，以浓缩、系统化、易于理解记忆掌握的方式，传递给当下的无数个人，让个人从中获益，丰富自己的人生体验，也支撑整个社会的运作和发展。 本文内容如下：【下载该文档后使用Word打开】 教学目的： 1．知识方面 （l）通过学习使学生识记酵母菌和霉菌的形态结构、营养方式和生殖方式的特点，知道这些知识在生产、生活中的应用。 （2）学会观察酵母菌、青霉或曲霉（认识酵母菌的形态结构和出芽生殖，认识霉菌的形态结构和孢子）。 2．能力方面 通过观察酵母菌、霉菌，培养学生善于观察生命现象的能力和实验操作技能。 3．思想情感方面 （1）通过观察酵母菌、霉菌，培养学生热爱生命、乐于探索生命奥秘的探索精神。
（2）通过学习本节知识，使学生初步形成生物学的基本观点，能用科学的态度去认识生命世界。 重点难点 1．酵母菌在生活中的应用为本节教学的重点之一，因为它密切联系生活实际，初中学生很容易产生兴趣，有利于培养学生热爱生命的情感。 2．观察酵母菌和霉菌是本节教学的另一个重点，因为通过本实验过程可以充分培养学生的观察能力、操作能力，可以培养学生热爱生命、探索生命奥秘的思想情感，还可以给学生创造互相学习、协作共进的机会。 3．酵母菌获得能量的方式是本节课的难点，因为酵母菌分解葡萄糖的过程是化学变化过程，由于学生缺乏这方面的知识，所以理解起来有难度。 教具准备 酵母菌培养液，培养好的青霉和曲霉，显微镜，解剖针，载玻片，盖玻片，吸管，镊子，稀释的碘液，吸水纸，放大镜，纱布。 课时安排2课时。 教学过程 1．教学过程设计思路 利用实物激发兴趣导出主题→学生实验、观察实物、培养能力，强化知识→利用实验，使学生识记酵母菌、霉菌的形态结构和生活特点→分组讨论、代表发言、理解总结
目的：本程序依据《霉菌培养箱使用说明书》规定了霉菌培养箱操作程序。 范围：恒温恒湿霉菌培养箱 职责：质量管理部、QC 内容： 1面板示意参照图 2按键操作说明 2.1杀菌键：按一下该键杀菌灯亮，再按一下该键杀菌灯熄灭。若灯亮后一直不关，则约2分钟后，照明灯将自动熄灭。 2.2左移、右移键。在设定状态下，按一下该键，待设定的参数（闪烁）往前或往后移一位。 2.3加、减键。在设定的状态下，按该键可分别对当前的设定值进行加1、减1操作。如连续按住2秒钟不放，则进行连续加、减。在运行状态下，按加、减键，可以加减当前运行时间。 2.4确认/查询键：在设定状态下，按该键对当前选择进行的确认。在运行状态
下，按该键则显示当前段设定值，再安一下该键，返回运行状态。否则，30秒后自动返回。 2.5功能键：上电后，箱体即进入运行状态下，液晶窗口显示： 2.5.1此时按一下功能键，进入功能选择状态，窗口显示： 且有一项选择闪烁，按左右键，做好选择，再按一下确认键，则进入相应的功能操作，若不想进行设定，则可按一下功能键退出选择状态，回到运行状态。 2.5.2若用户选择1.参数设定，按一下确认键，则进入参数设定状态， 且待设定的参数闪烁，用户可通过左右键选择本段待设定的参数，通过按上下键可修改参数值：若用户选择NEXT,按一下确认键，则进入下一段设定。若用户选择EXIT,按一下确认键，则推出参数设定状态，回到功能选择状态。若用户需用N段参数运行，则将第N+1段的时间参数设置成00即可，再选择NEXT，再按一下确认键，设置结束，回到运行状态，培养箱即按设定的参数自动运行。 若用户选择2系统参数设定，按一下确认键，则进入系统参数设定状态，显示：且待设定的参数闪烁，用户通过左右键，可选择待设定的参数，通过按上下键可修改参数值（其中：通讯地址是指与上位机通讯是的该箱体的序号;温度修正值可修正当前测量温度，湿度修正值可修正当前测量湿度；打印间隔是可设定每隔几分
第二章第一节酵母菌和霉菌习题精选 1．前面学习的细菌，是单细胞的原核生物，而下面由一个细胞构成的真核生物是( ) Ａ．黄曲霉 Ｂ．香菇 Ｃ．酵母菌 Ｄ．平菇 2．有的人特别喜欢吃馒头，那么发面蒸馒头利用的微生物是( ) Ａ．乳酸菌 Ｂ．酵母菌 Ｃ．曲霉菌 Ｄ．毛霉菌 3．细菌用分裂方式繁殖后代，而酵母菌的繁殖方式为( ) Ａ．出芽生殖和孢子生殖 Ｂ．出芽生殖和分裂生殖 Ｃ．分裂生殖和有性生殖 Ｄ．分裂生殖和孢子生殖 4．馒头、面包上生长的是曲霉，腐烂的水果上生长的是青霉。青霉、曲霉的生殖方式是( ) Ａ．孢子生殖 Ｂ．分裂生殖 Ｃ．出芽生殖 Ｄ．结合生殖 5．酵母菌在有氧和无氧的条件下，都能把葡萄糖分解，其中酵母菌在无氧的条件下能把葡萄糖分解成( ) Ａ．二氧化碳和水 Ｂ．二氧化碳、水，同时释放较多能量 Ｃ．二氧化碳和能量 Ｄ．酒精、二氧化碳，同时释放较少能量 6判断题(正确的打“√”，错误的打“×”，用横线表明错处并改正)。
(1)酵母菌是单细胞的个体，属于细菌。( ) (2)乳酸菌、酵母菌都能用于制作食品，属于真菌。( ) (3)青霉只生长在腐烂的水果上，曲霉只生长在馒头、面包上。( ) (4)馒头暄软多孔是由于酵母菌发酵产生的二氧化碳造成的。( ) (5)青霉都可以生产医药用的青霉素。( ) (6)细菌、真菌体内都没有叶绿体，大多进行腐生生活，于是容易使食品腐烂。（） (7)真菌与腐生细菌一样在自然界的物质循环中起重要作用。( ) 6．夏天我们以常发现，存放在壁橱里的衣物和鞋常常发霉，其原因是( ) Ａ．低温、干燥 Ｂ．低温、潮湿 Ｃ．高温、风干 Ｄ．温暖、潮湿 7．生活中为了抑制细菌和真菌的生活，防止食品腐败采取的措施（） ①低温②风干③高温灭菌后密封④添加防腐剂⑤温暖⑥潮湿 Ａ．①②③④ Ｂ．①②⑤⑥ Ｃ．①②③⑤ Ｄ．②③④⑤ 8．英国的生物学家弗莱明是世界上第一个发现抗生素的人，第一种抗生素是从 _____________微生物中提炼出来的。 Ａ．黄曲霉菌 Ｂ．青霉菌 Ｃ．酵母菌 Ｄ．乳酸菌 9．可以用来酿酒和制作酱、酱油、腐乳的霉菌是( ) Ａ．曲霉 Ｂ．青霉 Ｃ．酵母菌 Ｄ．黄曲霉 10．小明学完本节知识后，告诉奶奶不要吃霉变的花生，因为霉变的花生可致癌，其致
篇一：活性炭过滤器蒸汽杀菌作业指导书 编号：w/0138-03-6-06-03-003 版次：1/1 发布日期：2011.07.20活性炭过滤器蒸汽杀菌标准作业指导书 一、目的 利用高温蒸汽对活性炭进行杀菌。二、术语 活性炭：用于吸附水中氯离子、细小有机物，改善水的色度。三、流程图 第 1 页共 4 页编号：w/0138-03-6-06-03-003 版次：1/1发布日期：2011.07.20活性炭过滤器蒸汽杀菌标准作业指导书 五、设备示意图及部件编号 第 2 页共 4 页 六、操作前准备 2、相关记录： 《水处理热力站运行记录》、《活性炭过滤器蒸汽杀菌记录》 3、安全措施： 穿戴好防护用品，检查设备阀门管路畅通，设备及压力容器安全附件完好无错。七、操作步骤 第 3 页共 4 页 八、异常及紧急情况的处理九、相关文件 《活性炭吸附工艺原则》 第 4 页共 4 页篇二：实验室仪器作业指导书立式压力蒸汽灭菌器 篇三：疾病预防控制中心作业指导书 疾病预防控制公司作业指导书 目录 1.艾科纯水处理系统操作规程作业指导书 2. wfx-130原子吸收仪操作规程作业指导书 3. ls-c35l型蒸汽灭菌器操作规程作业指导书 4. 1501普通显微镜操作规程作业指导书 5. cs21fs1型普通显微镜操作规程作业指导书 6. dhg9123a型电热鼓风干燥箱操作规程作业指导书 7. hh.w21-600型操作规程作业指导书 8. bcd-207ak型普通电冰箱操作规程作业指导书 9. bcd-1992m2型普通电冰箱操作规程作业指导书 10. 7a2003电子天平操作规程作业指导书 11. au-w120型电子天平操作规程作业指导书 12. kxh202-1a电热恒温干燥箱操作规程作业指导书 13. dzkw-4电子恒温水浴锅操作规程作业指导书 14. bcd-1992m2普通电冰箱操作规程作业指导书 15. dh2500电热恒温培养箱操作规程作业指导书 16. bcd-46e/b型海尔电冰箱操作规程作业指导书 17. hh.w21-cu600型电热恒温水浴锅操作规程作业指导书 18. kj-202型振荡器操作规程作业指导书 19. wh-76a型微混合器操作规程作业指导书 20. 80-2型台式低速离心机操作规程作业指导书 21. 80-2型台式低速离心机操作规程作业指导书
霉菌和酵母菌检测 1 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 1.1 冰箱：2℃～5℃。 1.2 恒温培养箱：28℃±1℃。 1.3 均质器。 1.4 恒温振荡器。 1.5 显微镜：10×～100×。 1.6 电子天平：感量0.1g。 1.7 无菌锥形瓶:容量500ml、250ml。 1.8 无菌广口瓶：500ml。 1.9 无菌吸管：1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)。 1.10 无菌平皿：直径90mm。 1.11 无菌试管：10mm×75mm。 1.12 无菌牛皮纸袋、塑料袋。 2 培养基和试剂 2.1 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基：见附录A中A.1。 2.2 孟加拉红培养基：见附录A中A.2。 3 操作方法 3.1 试验前准备 3.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管（1ml、10ml）、稀释剂等移至操作室内。准备好足够用量，避免操作中出入操作间。 3.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min。 3.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。 3.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手、工作台面，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。 3.2 样品稀释液的制备
根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备样品稀释液。样品稀释液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。样品稀释液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。 3.2.1 固体和半固体样品 称取25g样品至盛有225ml灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。或放入盛有225ml无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10的样品匀液。 3.2.2 液体样品 以无菌吸管吸取25ml样品至盛有225ml无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。 3.3 霉菌和酵母菌计数 3.3.1 用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注于盛有9ml 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。 3.3.2 按3.3.1操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1ml 无菌吸管或吸头。 3.3.3 根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。 3.3.4 及时将15ml～20ml冷却至46℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基或孟加拉红培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 3.4 培养 待琼脂凝固后，将平板翻转，28℃±1℃培养5d，观察并记录。 3.5 菌落计数 肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（colony forming units，CFU）表示。选取菌落数在10CFU～150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。 3.6 结果与报告
霉菌和酵母菌介绍及检测方法 一、霉菌和酵母菌介绍： 霉菌和酵母菌及其检验酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。 霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。长期以来，人们利用某些霉菌和酵母加工一些食品，如用霉菌加工干酪和肉，使其味道鲜美；还可利用霉菌和酵母酿酒、制酱；食品、化学、医药等工业都少不了霉菌和酵母。但在某些情况下，霉菌和酵母也可造成中腐败变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。 二、检验方法： 霉菌和酵母的计数方法，与菌落总数的测定方法基本相似。主要步骤为：将样品制作成10倍梯度的稀释液，选择3个合适的稀释度，吸取1mL于平皿，倾注培养基后，培养观察，计数。对霉菌的计数，还可以采用显微镜直接镜检计数的方法。 具体检测标准参见： GB4789.15-94，《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物检验霉菌和酵母计数》三、说明： 1．样品的处理。为了准确测定霉菌和酵母数，真实反映被检食品的卫生质量，首先应注意样品的代表性。对大的固体食品样品，要用灭菌刀或镊子从不同部位采取试验材料，再混合磨碎。如样品不太大，最好把全部样品放到灭菌均质器杯内搅拌2min。液体或半固体样品可用迅速颠倒容器25次来混匀。 2．样品的稀释：为了减少榈稀释倍数的误差，在连续递增稀释时，每一稀释度应更换一根吸管。在稀释过程中，为了使霉菌的孢子充分散开，需用灭菌吸管反复吹吸50次。 3．培养基的选择：在霉菌和酵母计数中，主要使用以下几种选择性培养基。 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA）：霉菌和酵母在PDA培养基上生长良好。用PDA作平板计数时，必项加入抗菌素以抑制细菌。 孟加拉红（虎红）培养基：该培养基中的孟加拉红和抗菌素具有抑制细菌的作用。孟加拉红还可抑制霉菌菌落的蔓延生长。在菌落背面由孟加拉红产生的红色有助于霉菌和酵母菌落的计数。 高盐察氏培养基：粮食和食品中常见的曲霉和青霉在该培养基上分离效果良好，它具有抑制细菌和减缓生长速度快的毛霉科菌种的作用。 4．倾注培养。每个样品应选择3个适宜的稀释度，每个稀释度倾注2个平皿。培养基熔化后冷却至45℃，立即倾注并旋转混匀，先向一个方向旋转，再转向相反方向，充分混合均匀。培养基凝固后，把平皿翻过来放温箱培养。大多数霉菌和酵母在25－30℃的情况下生长良好，因此培养温度25~28℃。培养3d后开始观察菌落生长情况，共培养5d观察记录结果。 5．菌落计数及报告：选取菌落数10~150之间的平板进行计数。一个稀释度使用两个平
MHP-250霉菌培养箱使用操作规程 1 目的：规范MHP-250霉菌培养箱的操作，保证培养效果。 2 范围：MHP-250霉菌培养箱 3 职责：化验员负责对仪器的使用，化验室主任负责对仪器使用情况的监督。 4 内容 4.1概述：MHP-250霉菌培养箱（以下简称培养箱）是具有冷热控制的高精度恒温设备，是细菌、霉菌、微生物培养及育种试验的恒温培养装置，特别适用于生物遗传工程，医学研究卫生防疫、药检、环境保护、农村科学、水产、畜牧等领域从事科研和生产使用的理想设备。 4.2技术参数 电源电压：220V±10% 50Hz。 功率： 650W 制冷剂：任选 控温测温范围：0～60℃。 显示分辨率：0.1℃。 温度波动：±0.5℃ 4.3使用方法： 点击设定键，进入到温度设定状态，通过增加、简少键修改所需的值；再按下设定键，进入到时间设定状态，时间小时区闪烁，再按下设定键，时间分钟区闪烁，可通过增加、减少键修改所需的值，再按下设定键，保存并退出设定状态。当时间设置“0”时，表示没有定时功能；当设定时间不为“0”时，则等测量温度达到设定温度，定时器开始计时，时间到，运行结束，“停止”字符点
亮，蜂鸣器鸣叫30秒钟，长按减小键4秒钟，程序重新开始运行，蜂鸣器鸣叫时，可用增加键消音。 照明（或灭菌）可按使用客户的需要，选择打开或者关闭，并有对应指示灯亮或灭。 在非设定状态下，点击“减小∕在运行∕背光”键可开关液晶屏的背光灯。 4.4注意事项 本产品搬运中，禁止倒置与大于45度平放。 在使用中不要频繁设定温度，以免压缩机频繁启动造成过载影响寿命。 箱内不需要照明时，应按一下照明键即关闭照明，以免影响上层温度，同时延长灯管使用时间。 箱内培养物品不宜存放太多，摆放应留有间隙，以利箱内空气循环。 切忌触摸、碰撞箱内感温探头，以免损坏造成失控。 请勿用酸、碱及其它腐蚀性溶液擦拭表面，可用干布擦净。当设备不用时，应保持箱内干燥，并切断电源开关置于“0”位置。 该产品必须有专业人员负责操作和维护，非电器人员不得检修该设备，严禁带电检修。 使用本设备前请认真阅读产品使用说明书，再进行各项操作。
第二章真菌 第一节酵母菌和霉菌 教学目标 1．了解酵母菌和霉菌（青霉或曲霉）的形态结构，营养方式和生殖方式及酵母菌和霉菌对自然界的意义和与人类的关系。 2．通过指导学生观察酵母菌、青霉或曲霉，继续培养学生的动手实验能力和观察能力。 3．通过了解酵母菌和霉菌与人类的关系，学会用一分为二的方法分析事物。 重点、难点分析 1．酵母菌和霉菌的形态结构和生活特点，酵母菌和霉菌对自然界的意义和与人类的关系是本章的重点知识。因为： （1）通过学习酵母菌和霉菌的形态结构，让学生与所学过的植物细胞结构、细菌细胞结构进行比较分析，归纳总结出它们在细胞结构上的异同。这样有利于培养学生的分析和综合能力。 （2）通过学习酵母菌和霉菌的生活特点，有利于了解酵母菌和霉菌对自然界的意义和与人类的关系，使学生懂得研究微生物的重要任务之一就是用其利，避其害。了解真菌在经济上所蕴藏的潜在价值是巨大而多样的。 2．酵母菌的营养方式是本章的教学难点： 酵母菌既是异养（腐生）厌氧型真菌，又是异养需氧型真菌，由于初一学生知识水平有限，教师要讲清酵母菌获得能量的方式一定难度。 教学过程设计 一、本课题参考课时为二课时。 二、第一课时： 1．课前准备： 教师首先做好酵母菌的培养。酵母菌的简易培养方法如下： ①提前2～3天用3％～5％的蔗糖或2％葡萄糖溶液放入鲜酵母或一小块发面，恒温22℃培养。 ②将苹果皮切碎或用散发酒味的水果皮，装入瓶内，注意瓶子不要太大，轻轻压实，加入凉开水浸没，不用接种，在较温暖的地方培养2～3天镜检，即能找到酵母菌。
2．教学过程： （1）关于酵母菌形态结构的教学，可以用边讲述边实验的方法进行，有条件的学校最好在实验室上课。课上教师首先指导学生制作含有大量酵母菌的临时装片，并指导学生用显微镜观察酵母菌的形态结构；如果无实验室条件，在教室上课，课前教师可事先做好1～2台观察酵母菌的示范镜。这样学生通过对酵母菌形态结构的观察，对酵母菌建立感性认识。如果不具备以上条件的学校，教师可以课前画好酵母菌结构的投影片，也可以利用挂图及书中的插图，有录像设备的学校可以在课上放一段酵母菌形态结构的录像片段。讲述酵母菌结构时应注意指导学生与植物细胞结构和细菌细胞结构进行比较。让学生指出它们的异同。这样能够使学生明确认识到酵母菌的结构中有成形的细胞核。另外通过观察还可以看到母菌是单细胞个体，所以属于个体微小的真菌。 （2）酵母菌营养方式的教学，首先要强调指出酵母菌不含叶绿素，不能进行光合作用，因此不属于自养生物。在讲述酵母菌在有氧的条件下生活，能把葡萄糖分解成二氧化碳和水；而在在无氧条件下，又可把葡萄分解成二氧化碳和酒精的内容时，教师可以做演示实验，在课前1～2天用两个试管分别倒入含酵母菌的培养液，把其中一个试管用塞子堵上，一个敞着口，课上请学生分别闻一闻，让学生说出哪个有明显的酒味。并问为什么？同时让学生观察分析培养酵母的糖液中为什么会有气泡？ （3）在酵母菌与人类的关系的教学过程中，教师可用谈话法。利用学生已经掌握的知识设问，如馒头、面包为什么是松软多孔的？你们知道酵母菌有哪些利用价值等等。最后教师归纳总结。要指出酵母菌是我国古代劳动人民应用较早的一类微生物，自然界中几乎到处都有酵母菌，已发现的酵母菌达数百种之多，绝大多数都是人类的好朋友，特另提在酒类酿造方面已经有四千多年的历史。另外酵母菌中含有丰富的蛋白质、维生素等营养物质，因此可利用酵母菌的菌体捉取辅酶A、细胞色素C、凝血质、卵磷脂和多种氨基酸等。近几年，酵母菌在石油脱蜡、酶制齐和发酵饲料等方面的应用也有了新的进展。 （4）关于酵母菌生殖方式的教学： 在讲述酵母菌的出芽生殖方式时，可指导学生，制作临时装片，在显微镜下观察正在进行出芽生殖的酵母菌，有条件的学校可放一段酵母芽出芽生殖的录像片，或在黑板上画简图示意，还可制作投影片。要强调酵母菌出芽生殖的芽与绿色开花植物的芽不是一个概念。酵母菌细胞上长出的突起，比母细胞小得多，是母细胞上的一个芽体，脱离母体后，即成为个新的酵母菌，属于无性生殖。酵终菌还有另一种生殖方式为抱子生殖，在条件恶劣时，产生抱子，由抱子发育成新个体。
“观察酵母菌和霉菌”实验报告单 名称 姓名实验“观察酵母菌和霉菌” 组员 实验内容 材料用具 目的要求酵母菌培养液、橘子皮上的青霉、吸管、镊子、显微镜、解剖针、载玻片、盖玻片、放大镜、稀释的碘液、吸水纸 认识酵母菌、霉菌的形态结构年级八上生物实验类型提交时间分组实验指导老师 方法步骤 酵母菌电镜照片xx霉菌电镜照片 (1)观察酵母菌 1.取一滴酵母菌培养液，滴在载玻片上、盖上盖玻片、用显微镜观察，就能看到一个个椭圆形的细胞，细胞中有明显的液泡，这就是酵母菌。 2.在盖玻片的一侧滴一滴碘液、用吸水纸从另一侧吸引，对酵母菌进行染色、在显微镜下能看到酵母菌细胞中染上颜色的细胞核和淀粉粒。有的细胞上长出大小不一的突起，这是酵母菌在进行出芽生殖。 （2）观察青霉 1.从培养皿中取一块长有青霉的橘子皮，垫上白纸，用放大镜观察，可以看到一条条直立生长的白色绒毛，这就是青霉的直立菌丝，菌丝的顶端长有成串的青绿色的孢子。
2.用解剖针挑取少许长有袍子的菌丝，制成临时装片，置于显微镜下观察。注意观察菌丝有没有颜色，直立菌丝的顶端有没有扫帚状的结构，以及孢子的着生状态和颜色。 讨论 1.酵母菌的细胞结构有什么特点？ 2.青霉孢子的颜色和着生状态有什么特点？ 1.制备酵母菌培养液时，应将装置放在25-30℃的环境中培养，以使酵母菌快速繁殖。 2.酵母菌培养液应含有一定浓度的糖，但是糖的浓度不宜过高。 3.培养青霉时，可以在培养皿里垫一层吸水纸，加适量的水，并盖上盖，放在阴暗温暖的环境中。 每天往里面加适量的温水，以保持一定的温度。 4.青霉分生孢子梗上成串的孢子容易碰落，盖盖玻片时要特别小心，动作须轻缓，盖好后不能移动位置。 注意事项 AA
霉菌培养箱操作规程 一、使用说明 1．设备到位后，锁紧前脚轮，使箱体安置平稳。 2．接通220V/50Hz电源，且电源插座应有可靠接地。 3．控制器操作说明。(配用仪表，PC-2002-PT100) 1)面板示意图参照图： 面板上左窗口3位数码管，可显示测量温度或设定温度，右窗口4个数码管可 显示设定时间或计时值（倒计时），同时对应的指示灯亮。 2)面板右下部为一组按键，功能分别如下： ①温度／时间键在上电状态下，按一下该键，仪表进入温度设定状态，仪表左窗口显示原先设定的温度值，且末位数码管闪烁，同时温度设定指示灯亮，用户可根据需要修改参数。再按一下，仪表进入时间设定状态，仪表右窗口显示原先设定的时间值，同时时间设定指示灯亮，用户可根据需要修改参数。（若工作时间设定为000，则表示定时器不工作，在此状态下运行时，右窗口显示设定温度）再按一下该键，则又回到温度设定状态，如此循环。 按住该键不松开，约5秒后，仪表进入其他参数设定状态，左、右窗口分别显示： sc **.*表示温度修正值（一～+℃）(出厂值0) dEL ***表示压缩机延时时间(60～300秒)(出厂值180) AL ***表示超温报警温度～10．Ot)（出厂值）
设定完毕，按设定写入键退出设定状态。 若上电后，无任何键按下，约10秒后，仪表进入运行状态，计时指示灯亮，仪表根据设定的温度控制值，对系统进行温度控制，并根据设定的定时值，开始倒计时，当计时值为零后，仪表结束运行，仪表显示End，并有蜂鸣器输出，呜叫约30秒钟。用户若需再次运行，可按一下温度／时间键，10秒后，仪表自动进入运行状态。 ②▲键该键为加数键。在设定参数时，数字中有一个闪烁。若按该键，则设定数值末位数加1。若按住该键不松开，约2秒后，设定值连续加（时间连续加10）；按住该键不松开约5秒后，时间设定值连续加100。 ⑧▼键该键为减数键。在设定参数时，若按该键，则设定数值减l，若按住该键不松开，经3秒后，设定值连续减（时间连续减10）；按住该键不松开约5秒后，时间设定值连续减100。 ④设定写入键在设定完成后，按一下该键退出设定状态。 ⑤照明开/关键在任何时候，按一下该键，则照明控制继电器接通，再按一下，则继电器断开。 说明： ①仪表加热时，加热指示灯亮。 ②压缩机延时时间为所设定的dEL值。压缩机工作时，制冷指示灯亮；若此时压缩机延时保护时间未到，则压缩机继续等待，且制冷指示灯闪烁。 ⑧如果测量温度>设定温度+AL时，则有蜂鸣器报警，报警指示灯亮，
霉菌与酵母菌计数方法 1试验菌液得制备与使用(以白色念珠菌为示例) 白色念珠菌(0)代 ↓ 传代培养 ↓ 实验菌液得制备:沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养 基,培养温度20～２5℃,培养时间2~3天 ↓ 计数培养基适用性检查:胰酪大豆胨琼脂培养基,培养温度３0～3５℃, 培养时间不超过5天,接种量不大于10０cｆu ↓ 计数方法适用性试验:胰酪大豆胨琼脂培养基(ＭPＮ法不适用),培养温 度３０～３5℃,培养时间不超过５天,接种量不大于10０cfu 注:当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌与酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查,检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基 1.１菌种 试验用菌株得传代次数不得超过５代(从菌种保藏中心获得得干燥菌种为第0代),并采用适宜得菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株得生物学特性。 1。2菌液制备(按表1规定程序培养各试验菌株) 取白色念珠菌得新鲜培养物 ↓ 用pH7、0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得菌悬液 取黑曲霉得新鲜培养物 ↓ 加入3～５ｍｌ含0.０５%聚山梨酯80得pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无 菌氯化钠溶液,将孢子洗脱 ↓ 采用适宜得方法吸出孢子悬液至无菌试管内 ↓ 用含0。05％聚山梨酯80得pＨ7.０无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0。９%无菌氯 化钠溶液制成适宜浓度得黑曲霉孢子悬液 菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在２~8℃,可在24小时内使用、稳定得黑曲霉孢子悬液可保存在2~８℃,在验证过得贮存期内使用、
1。３阴性对照 为确认试验条件就是否符合要求,应进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长,应进行偏差调查、 2、培养基适用性检查 按表1规定,接种不大于100cｆu得菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板 ↓ 置表１规定条件下培养 ↓ 每一试验菌株平行制备2管或2个平皿 ↓ 同时,用相应得对照培养基替代被检培养基进行上述试验 ↓ 被检固体培养基上得菌落平均数与对照培养基上得菌落平均数得比值应在0。5-2范围内,且菌落形态大小应与对照培养基上得菌落一致;被检液体培养基管与对照培养基管比较,试验 菌应生长良好 3计数方法适用性试验 供试液制备:水不溶性非油脂类供试品 ↓ 取供试品,用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液,或pH7。2磷酸盐缓冲液,或胰酪大豆胨 液体培养基 ↓ 制备成１:10供试液。 ↓ 若需要,调节供试液ｐH值至6~8。必要时,用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释、 ⒉接种与稀释 所加菌液得体积应不超过供试液体积得1％、为确认供试品中得微生物能被充分检出,首先应选择最低稀释级得供试液进行计数方法适用性试验。
霉菌与酵母菌计数方法 1试验菌液的制备和使用（以白色念珠菌为示例） 白色念珠菌（0）代 ↓ 传代培养 ↓ 实验菌液的制备：沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养 基，培养温度20～25℃，培养时间2～3天 ↓ 计数培养基适用性检查：胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃， 培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu ↓ 计数方法适用性试验：胰酪大豆胨琼脂培养基（MPN法不适用），培养温 度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu 注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基 1.1菌种 试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 1.2菌液制备（按表1规定程序培养各试验菌株） 取白色念珠菌的新鲜培养物 ↓ 用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液取黑 曲霉的新鲜培养物 ↓ 加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化 钠溶液，将孢子洗脱 ↓ 采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内 ↓ 用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯 化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。 1.3阴性对照 为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如阴 性对照有菌生长，应进行偏差调查。 2.培养基适用性检查 按表1规定，接种不大于100cfu的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板 ↓ 置表1规定条件下培养 ↓ 每一试验菌株平行制备2管或2个平皿 ↓ 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验 ↓ 被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试 验菌应生长良好 3计数方法适用性试验 供试液制备：水不溶性非油脂类供试品 ↓ 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨 液体培养基 ↓ 制备成1:10供试液。 ↓ 若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀 释。
第五部队第五部分第二掌柜第一节酵母菌和霉菌题1 酵母菌的主要生殖方式是。 A．分裂生殖 D．孢子生殖 C．出芽生殖 D．接合生殖 解成熟的酵母菌细胞能向外突起形成芽体，芽体逐渐长大，最后与母体脱离，成为一个新的酵母菌。这种生殖方式叫出芽生殖，是酵母菌最主要的生殖方式。选项C正确。 题2 下列生物中，有成形细胞核的是（） A．结核杆菌 B．酵母菌 C．醋酸杆菌 D．肺炎双球菌 解结核杆菌、醋酸杆菌和肺炎双球菌都是细菌，属原核生物，没有成形的细胞核，酵母菌是单细胞的真菌，属真核生物，具有成形的细胞核。选项B正确。 题3 下列各组生物中，主要营孢子生殖的是。 A . 酵母菌 B. 球菌和杆菌 C．青霉和曲霉 D．螺旋菌 解球菌、杆菌和螺旋菌都是细菌，主要以分裂方式繁殖；酵母菌主要营出芽生殖；青霉和曲霉都是霉菌，主要营孢子生殖。选项C正确。 题4 下列生物中，可产生抗生素的是。 A．青霉 B．酵母菌 C. 曲霉 D. 肺炎双球菌 解青霉能为人类提供医疗使用的抗生素一—青霉素，酵母菌和曲霉则不会产生抗生素，而肺炎双球菌则能使人致病。选项A正确。 题5 酵母菌的营养方式是（） Ａ．寄生 D．自养 C ．腐生 D．光合作用 解酵母菌细胞内没有叶绿体，不能进行光合作用，制造有机物，其营养方式应为异养,它能分解有机物、释放能量，供生命活动利用，营养方式属于异养中的腐生。选项C 正确。 题6 酵母菌在有氧和无氧的情况下都能分解葡萄糖，释放能量，两种情况下，共有的产物是。 A．水 B．酒精Ｃ．二氧化碳 D．氧 解酵母菌既能进行有氧呼吸，又能进行无氧呼吸，属兼气性真菌。在有氧存在时，葡萄糖被彻底分解成二氧化碳和水，释放出大量能量；没有氧气存在时，葡萄糖的分解不