基因工程
1、操作水平：DNA分子水平
目的：定向改变遗传物质或获得基因产物。
理论基础：1）物质基础——脱氧核苷酸2）结构基础——规则的双螺旋结构3）中心法则，共用一套遗传密码2、基因工程(genetic engineering)：指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细
胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。(基因操作、遗传工程、重组DNA技术）。1973年诞生的
基本用途：分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源；大规模生产生物活性物质；设计、构建生物的新性状甚至新物种。
3、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。其核心步骤是DNA片段之间的体外连接。
4、基因工程的基本形式：
第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程
第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程第四代基因组或染色体的转移基因组工程
5、基因工程诞生的理论基础：理论上的三大发现
1】证实了DNA是遗传物质；2】揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理；
3】遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定。
6、DNA双螺旋：带负电的糖--磷酸骨架在外侧，碱基在螺旋中间相互堆叠，以5’→3’方向反向平行关系。
第二章用于核酸操作的工具酶
1、寄主的限制和修饰现象：
【１】作用：保护自身ＤＮＡ不受限制；破坏入侵的外源ＤＮＡ，使之降解。
【２】入侵噬菌体的子代便能高频感染同一宿主菌，但却丧失了在其原来宿主细胞中的存活力。因为它们在接受新宿主甲基化酶修饰的同时，也丧失了原宿主菌甲基化修饰的标记。
2、限制性核酸内切酶的命名：如：HindⅠ属名（H）+种名（in）+株名（d）+类型（Ⅰ）
II 型限制性核酸内切酶的基本特性：识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。
**一个单位的限制酶定义为：在合适的温度和缓冲液中，在50μL反应体系中，1h完全降解1μg底物DNA所需的酶量。两种DNA甲基化酶：①DNA腺嘌呤甲基化酶（dam），甲基化酶在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基.
②DNA胞嘧啶甲基化酶（dcm），甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，
受其影响的酶有EcoR II等.
**3、诱发星号活性产生的原因：○1高甘油含量》5%；○2内切酶用量过大；○3低离子强度；○4高pH；
○5含有有机溶剂，如乙醇；○6Mn/Cu/Zn等非Mg二价阳离子存在。
4、DNA聚合酶I的基本性质：5‘→3‘DNA聚合酶活性；5‘→3‘的核酸外切酶活性；3‘→5‘的核酸外切酶活性。切口平移法：目前实验室中最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。
Klenow酶的基本用途：1】补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端；2】DNA片段的同位素末端标记；
3】cDNA第二链的合成；4】双脱氧末端终止法测定DNA序列
Klenow片段：保留5→3’聚合酶活性和3→5‘外切酶活性；丧失了5→3‘的核酸外切酶活性。
T4-DNA聚合酶的基本用途：1】切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端；2】DNA片段的同位素末端标记
T4-DNA酶的基本特性：1】5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性；
2】在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切；3】只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；
4】在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位；5】外切酶活性比Klenow酶高100～1000倍。
反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶
基本特性（用途）：1.以RNA为模板聚合cDNA链；2.双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链
S1核酸酶的基本反应（用途）：（来源于稻谷曲霉菌；催化反应需Zn2+和酸性条件pH4.0—4.5）
1）内切单链DNA或RNA；2）内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA；3）在DNA上定位RNA
Bal31核酸酶：单链内切、双链外切的核酸酶；运用于诱变育种。
末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）基本特性：不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs
碱性磷酸酶：○1来自小牛胸腺的小牛肠碱性磷酸酶（CIP）；○2来自大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶（BAP）。
它们都可以催化核酸分子的脱磷作用，使DNA或RNA的5’磷酸变为5’-OH末端。
第三章基因工程载体
1、载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子。
**2、基因工程对载体的要求（理想质粒载体的必备条件）：
（1）在宿主细胞内能独立复制（2）有选择性标记（3）分子量小，拷贝数多
（4）有一段多克隆位点，外源DNA插入其中不影响载体的复制（5）容易从宿主细胞中分离纯化
载体的基本条件：①能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制；②具有合适的限制性核酸内切酶位点；③具有合适的选择性标记基因，用来筛选重组体DNA。
3. 载体的种类：质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、黏粒载体、病毒载体、人工染色体、（柯斯质粒、动物病毒）特点：◆载体DNA是单个复制单元，在宿主细胞内应具有独立复制能力；◆含有多种限制行内切酶的单一切点；
◆分子量尽可能小，便于细胞中分离纯化，离体条件下操作；◆载体内有不影响其复制，生长的非必要区域；
◆具有多种选择性标记。
*构建基因文库常用的载体：λ载体系列、cosmid（柯斯质粒）载体、YAC（酵母人造染色体）、BAC（细菌人造染色体）、P1源人工载体
第一节质粒载体
质粒：独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中组成部分：复制必需区、、选择标记基因、限制性核酸内切酶位点（克隆位点）
生物学特性：分子小、编码基因少、双链环状闭合。（酵母的?杀伤质粒?是RNA）
空间构型：①共价闭合环状DNA（SC），呈超螺旋②开环DNA（OC），一条链上有一至数个缺口
③线形DNA（L构型），呈负超螺旋
*电泳速率：SC-DNA最快、L-DNA次之、OC-DNA最慢
二、质粒的类型
1、接合型质粒:能自我转移；带有自我复制所必需的遗传信息；带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F 质粒（性质粒、或F因子）严紧型质粒; 不符合基因工程的安全要求
2、非接合型质粒:不能自我转移；带有自我复制所必需的遗传信息；但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因（缺乏转移所需的mob基因），因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。如：R质粒（抗性质粒）、Col质粒（大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒）松弛型质粒; 符合基因工程的安全要求
三、质粒的复制类型---松弛型质粒:拷贝数多，有10—60份拷贝严紧型质粒:拷贝数少，只有1—3份拷贝
四、质粒载体的构建
1. 天然质粒的局限性
1）分子量大，拷贝数低：第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长9.09kb，属严紧型质粒；但只有Tetr 一个选择性标记；分子质量大，拷贝数低
2）筛选标志不理想：ColE1质粒筛选标志是大肠杆菌素E1；colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成?噬菌斑?。
2. 质粒载体必须具备的基本条件
1）具有较小的分子量和较高的拷贝数2）具有若干个限制性内切酶的单一酶切位点
3）具有两种以上的选择标记基因4）具有复制起点（ORI）
5）缺失mob基因6）重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达
3. 质粒的选择标记及其工作原理：（1）选择标记－抗性基因
氨苄青霉素抗性（Ampr）青霉素的衍生物；通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌
氯霉素抗性（Cmlr）通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成，杀死生长的细菌
四环素抗性（Tetr）通过与30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。链霉素抗性（Strr）通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译。杀死细菌。
卡那霉素抗性（Kanr）通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。杀死细菌
4. 人工构建的质粒载体的类型
（1）高拷贝数的质粒载体：如ColE1、pMB1，适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。
（2）低拷贝数的质粒载体：如pSC101，不适合大量扩增DNA用；
（3）失控的质粒载体：属温度敏感型复制控制质粒，如pBEU1、pBEU2
（4）插入失活型质粒载体：载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。
（5）正选择的质粒载体：如pUR2、pTR262；直接选择转化后的细胞；目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体；
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。
（6）表达型质粒载体：主要用来使外源基因表达出蛋白质产物
第四章分子基本操作技术
*1、DNA的提取方法: 最常用的是碱抽提法。
原理：○1闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；○2染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。
步骤：溶菌→→破膜，蛋白质和DNA变性→→中和(用NaAc) →→离心除去沉淀→→纯化DNA（酚-氯仿抽提）→→沉淀DNA
2、三种电泳的区别和适用范围【**电洗脱槽适用于回收大片段DNA】
琼脂糖凝胶电泳：（水平）分离范围广，分辨率低脉冲电场凝胶电泳：适用于超大分子量的DNA电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳：（垂直）分辨力高，用于核酸，蛋白质分离，DNA序列分析
3、核酸的分子杂交：1）Southern blot【用DNA（或RNA）探针检测DNA样品】
2）Northern blot【用DNA（或RNA）探针检测RNA样品】
3）原位杂交【对应的菌斑或噬菌斑位臵不变，可以直接找出阳性菌落】
第六章目的基因的获取和基因文库构建
第一节基因组DNA片断化
1、限制性内切酶法：优点：由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。
缺点：目的基因内部也可能有该内切酶的切点，目的基因也被切成碎片。
2、随机片断化：（1）限制性内切酶局部消化法；（2）机械切割法：超声波、高速搅拌
3、化学合成目的基因方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法。
化学合成DNA片断的组装方法：互补连接法、互补延伸连接法
4、寡聚核苷酸化学合成的优点：
○1直接合成基因；○2合成引物（20mer左右）；○3合成探针序列；○4定点突变合成；○5合成人工接头或衔接物。
5、目的基因的获取方法：核酸杂交法、差示杂交法、PCR筛选法、表达文库的免疫学筛选。
第二节基因文库构建
1基因文库：是用分子克隆方法将某种生物或其组织细胞的所有DNA片段插入适当载体，转化适当宿主菌后进行保存的克隆集合。
2构建步骤：1】染色体DNA大片段的制备：①物理切割法：超声波、机械搅拌；②酶切法：局部消化。
2】载体与基因组DNA大片段的连接：①粘性末端直接连接；②人工接头法；③同聚物加尾。
构建步骤：克隆载体制备----大分子基因组DNA分离----插入片段制备----插入片段与载体连接----连接产物宿主菌转化----基因组DNA文库生成。
3基因组文库的大小：一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。
【p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因
组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）】；【G为基因组大小f：基因组片段平均长度】4、cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，
称cDNA文库。以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA
特点：1）不含内含子序列；2）可以在细菌中直接表达；3）包含了所有编码蛋白质的基因；4）比DNA文库小的多，容易构建。
构建步骤：1）总RNA提取（商业化的试剂盒kit）；（2）mRNA的分离纯化（纤维柱，NaCl洗脱）
3）cDNA的合成：①cDNA第一链合成②降解mRNA模板③cDNA第二链合成④去掉发卡结构
构建步骤：mRNA的提取-----cDNA克隆载体的选择-----cDNA克隆片段的获得----cDNA文库的生成。
cDNA
【p:文库包含了完整mRNA的概率（99%）；1/n低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例；
N：所需的重组载体数（克隆数）】
第七章基因的体外重组与转移
1、粘性末端的连接：两段DNA的连接；DNA片断与载体的连接
2、平头末端的连接：(1) 直接连接；(2)人工加尾形成?粘性末端?
①同聚加尾法----原理：DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸
优点：能把任何片段连接起来。缺点：不能把插入片段再切下来。
②衔接物(linker)连接----优点：可以用内切酶把插入片段切下来；能给载体连接上Polylinker。
缺点：如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段。
③DNA接头连接法----优点：连上后就能用。缺点：接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的
连接。防止自我连接：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接
3、DNA体外连接应注意的事项
1】插入片断与载体的酶切位点互补：（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切
2】DNA插入的方向正确:用双酶切
3】插入基因的开放阅读框（ORF）正确:（1）DNA定向插入（2）起始密码
4. 防止载体自身环化连接：
（1）用碱性磷酸酶处理线性载体分子（2）提高插入片断的用量（3）采用同聚物加尾连接技术
（4）CIP处理（5）使用同尾酶产生的黏性末端连接方法
碱性磷酸酶的作用：防止载体自身环化连接，增加重组克隆的数目。
5、载体和外源DNA插入片段的连接结果
1. 载体自身环化连接（能存活）
2. 载体之间互相连接（能存活）
3. 插入片段互相连接（不能存活）
4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活）
5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活）
第二节基因转移
1、感受态细胞：就是受体细胞处于摄入外源DNA的状态。（无特异性，对各种外来DNA都可接收）
感受态大肠杆菌的制备目的：增加受体菌细胞膜的通透性。制备原理：用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性制备过程：培养大肠杆菌→OD600至0.3~0.4→冰浴5-10 min→4℃离心收集菌→用冰冷的60mMCaCl2重悬→4℃离心收集菌→用冰冷的60mMCaCl2重悬→On ice 30 min→4℃离心收集菌→用冰冷的60mMCaCl2重悬→分装、-70 ℃冻存2、外源DNA导入细菌的几种方法
（1）转化大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（2）转染大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。
（3）转导借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。
3. 转化方法：1）化学转化法；2）电转化法（转化效率高，高于109/μgDNA）；3）热休克法（简单，但转化效率不高）
4. 转化率：每μg DNA转化成功的细菌克隆数。
影响转化率的因素：
1）重组质粒（环形质粒数）：1.环形重组质粒2. 质粒自我连接。（线性载体或DNA片断进入细菌会被降解）
2）感受态细胞：①生长状态（使用对数生长期的菌）；②必须在冰冷的条件下制备；③储存感受态菌要在-70℃以下；
④CaCl2处理，使细菌细胞膜失去一些蛋白；⑤使用感受态菌时必须迅速融化（融化后一般不能再次冻存使用）
第八章重组体克隆的筛选和鉴定
一、抗药性标记及其插入失活选择法
1. 原理：pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。
Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
2、pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因：产生β-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（蓝灰色）褪色。（3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
*3、选择过程：
（1）四环素抗性插入失活：如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；
Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
二、β-半乳糖苷酶显色反应选择法
1. 原理：载体上有一段β-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的α片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的β-半乳糖苷酶基因（α片段缺失），可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的β-半乳糖苷酶。
2. 选择过程中，β-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物
假阳性：如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码；（不破坏α肽）。
2、DNA电泳检测法：直接电泳检测法；酶切电泳筛选法；PCR扩增检测法；核酸杂交检测法；免疫化学检测法
核酸杂交检测方法：（1）Southern blotting：用DNA（或RNA）探针检测DNA样品
①原位杂交筛选【对应的菌斑或噬菌斑位臵不变，可以直接找出阳性菌落】；
②R-环检测法【原理为DNA-RNA杂交；用外源基因的mRNA与重组载体杂交；缺点为需要电镜】
（2）Northern blotting：用DNA（或RNA）探针检测RNA样品；主要检测插入片断是否被转录。从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。
3、免疫化学检测法：放射性抗体检测法、免疫沉淀检测法、Western印记分析法。
免疫沉淀检测法：检测分泌型产物；原理是抗原—抗体凝集反应；
TK选择过程：①HAT培养基：次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基②宿主细：Tk-细胞株。
③载体标记：TK基因。只有转入TK基因的细胞才能生存
氯霉素乙酰转移酶（CAT）：CAT是由大肠杆菌转座子Tn9编码的，催化氯霉素发生乙酰化失活。
选择条件：含氯霉素的完全培养基。宿主细胞：真核细胞株均可。载体标记：cat基因
CAT分析方法：①分析乙酰氯霉素；②免疫学检查。
第十章外源基因的表达
1、外源基因：
**最佳启动子必须具备的条件：
①必须是一种强启动子；②应呈现低水平的基础转录，便于表达毒性蛋白；③应是可诱导型的。
2、常用的表达载体：
（1）非融合型表达蛋白载体pKK223-3 具有一个强的tac启动子条件：必须选择一个有lacI的宿主菌。
组成结构：①强启动子: tac（trp-lac）: trp的-35区lacUV5的-10区；②操纵基因：乳糖操纵子系统lac操纵基因
③调节基因宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统，如JM105菌；④终止子：rrnB的强终止子；⑤S-D序列和插入位点区；⑥载体的其余部分：来自pBR322质粒；⑦表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）
（2）分泌型克隆表达载体pINⅢ系统：以pKK223为基础构建的，调节基因不必借助宿主的lacI.；直接分泌到固质中。载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。如：pIN III系列
组成结构：①强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子；②调节基因lac I ；③S-D序列和起始密码ATG；④分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa；⑤插入位点区（多克隆位点）。
pIN III-comA1 以pBR322为基础构建的。
（3）融合蛋白表达载体pGEX系统表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。
（1）优点：便于融合蛋白的分离和纯化
（2）组成结构：①启动子tac ②操纵基因lacP ③调节基因lacI ④S-D序列⑤ori：pBR322 ori
⑥融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）
3、影响外源基因表达效率的因素：
1】启动子的结构对表达效率的影响：
（1）一致顺序①-35box--5’-TTGACA-3’RNA聚合酶σ亚基的识别位点；②-10box（Pribnow Box）5’-TATAAT-3’。（2）-35与-10区间的距离：间隔为17bp时，启动子最强；（3）-35和-10区碱基顺序：越接近一致顺序，启动子越强。2】转译起始序列对表达效率的影响
（1）S-D序列：S-D序列后面的4个碱基：如果是A（T）, 翻译效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。（2）起始密码AUG AUG左侧的三个碱基也有影响。β-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左侧如果是UAU或CUU 时，最为有效；如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。
（3）其它多顺反子的mRNA与核糖体的结合位点有一个或几个终止密码。噬菌体外壳蛋白或核糖体蛋白mRNA的核糖体结合位点有多个U。
3】启动子与外源基因之间的距离
4】转录终止区对表达效率的影响转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。5】载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。增加表达效率。
6】外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响
第二节外源基因在真核细胞中的表达
酵母克隆载体：
（1）整合型载体(YIp)由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断（选择标记）构成。如PYeleu10
特点：①转化率低（1-10转化子/微克DNA）。②不能在酵母细胞中自主复制载体上只有细菌的复制区，没有酵母的自主复制区。③整合到酵母的染色体上可与受体细胞的染色体DNA同源重组，随染色体一起复制。④不能从酵母细胞中提取载体。
（2）复制型载体(YRp)由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断(选择标记和酵母DNA自主复制顺序ARS）构成。
特点：①转化率高（102-103转化子/微克DNA) 。②可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。③穿梭载体（shuttle vector）能在大肠杆菌中复制，又能在酵母细胞中自主复制。④不稳定，容易丢失。
（3）着丝粒质粒(YCp) 在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒区。
特点：①行为像染色体，能稳定遗传。②单拷贝存在。③不易从细胞中提取。
（4）附加体型载体(YEp) 由大肠杆菌质粒、2μm质粒及酵母染色体DNA选择标记构成。
如pYF92
特点：①很高的转化活性（103-105转化子/微克DNA）. ②拷贝数多（25-100分子/细胞）。③比YRp稳定。
第十一章植物基因工程
1、Ti 质粒：是根癌农杆菌染色体外/核外的一种闭合环状双链DNA 分子，约200 kb。
类型：章鱼碱型(nos )、胭脂(ocs )、农杆碱型和农杆菌素碱型
结构功能区域：
（1）毒性区（Vir 区）：该区段上的基因能激活T-DNA 转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA 区与Vir 区在质粒DNA 上彼此相邻，合起来约占Ti 质粒DNA 的三分之一。
（2）T-DNA区是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti 质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，故称之为转移DNA。
该DNA 片段上的基因与肿瘤的形成有关。NOC是编码细菌利用胭脂碱的基因
（TL-DNA）为13 kb 的单拷贝序列，是诱发和维持肿瘤所必需的。（TR-DNA）为7 kb 的多拷贝序列。
（3）接合转移区（Con 区）（regions encoding conjugations）：该区段上存在着与细菌间接合转移相关基因（tra），调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti 质粒转移，从而使肿瘤扩散。
（4）复制起始区（Ori 区）：该区段基因调控Ti 质粒的自我复制起始。
2、T-DNA转移至植物细胞的过程可分为：
1. 农杆菌对植物细胞的识别和附着；
2. 农杆菌对植物信号物质的感受；
3. 农杆菌vir基因的活化；
4. T-DNA复合体的产生；
5. T-DNA复合体的转运；
6. T-DNA整合到植物基因组中。
* 植物受伤后能分泌酚类化合物诱导Ti质粒上的毒性基因表达。
3、植物基因工程载体命名规则：
（1）天然存在的质粒第1个字母大写，并用括号括起来，如(ColＥl)。
（2）重组质粒用小写p (Plasmid)后加两个大写字母表示：大写字母指构建质粒的研究人员或完成此项工作的研究机构，如：pSCl0l : SC (Stanley Cohen人名), pMT555:MT (Manchester Technology) 曼彻斯特理工学院。
（3）农杆菌中的质粒一般在命名中要表示出来。如pTiT37，Ti 表示根癌农杆菌，T37 表示质粒编号或分类。
*1、请模仿多利羊的克隆过程，设计克隆大熊猫的方案，并回答相关问题．
（1）从A大熊猫的主要性器官-----卵巢中取出一个卵细胞，去除细胞核．
（2）从B大熊猫的体细胞中取出一个细胞，取出细胞中的细胞核．
（3）将分离出的核注入无核卵细胞细胞内，融合成一个新的细胞．
（4）用细胞培养技术，使融合的新细胞发育成胚胎．
（5）将胚胎植入大熊猫C（填A、B、C）的子宫里．几个月后，该大熊猫可能分娩产下克隆大熊猫．
（6）克隆大熊猫过程中，采用了核移植细胞培养胚胎移植等现代生物技术．
*2、如何提高外源基因表达效率？
答：⑴选择强启动子序列，如tac 等；⑵调整S-D序列与AUG碱的距离，一般为5-9bp；
⑶提高质粒及mRNA的拷贝数和稳定性；⑷高效的转录终止区和高效的翻译起始序列；
⑸减轻宿主细胞的代谢负荷：①诱导表达②表达载体的诱导复制；
⑹提高表达蛋白的稳定性，防止其降解：①克隆一段原核序列，表达融合蛋白（避免被降解的最好措施）②采用某种突变菌株③表达分泌蛋白质。
答:⑴提高启动子强度；⑵缩短启动子与克隆基因间的距离；⑶提高质粒拷贝数及稳定性；
⑷高效的转录终止区；⑸高效的翻译起始序列；⑹减轻细胞的代谢负荷：①诱导表达②表达载体的诱导复制；
⑺提高翻译水平：①调整SD序列与AUG间的距离②用点突变的方法改变某些碱基③增加mRNA的稳定性；。
⑻提高表达蛋白的稳定性，防止其降解：①克隆一段原核序列，表达融合蛋白（避免被降解的最好措施）②采用某
种突变菌株③表达分泌蛋白质
*3、大肠杆菌表达外源基因的优劣势(劣势即为真核基因在原核生物表达需克服的障碍)。
优势：○1基因克隆表达系统成熟完善；○2繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定；○3全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架；○4被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。
劣势：○1缺乏对真核生物蛋白质的复性功能；○2缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统，内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白；○3细胞周质内含有种类繁多的内毒素。
*4、Ti 质粒来自细菌（原核）系统，为何其基因能在真核生物中表达？
证据1：由T-DNA产生mRNA均是典型的植物mRNA 分子，可通过植物RNA 聚合酶II被转录，并具有5` 帽子结构和3`polyA 尾巴。
证据2：nos、ocs 等基因的5’末端具有真核特有的TATA-box和CAAT-box。
结论：T-DNA 的基因序列只能被真核生物识别，不能被原核生物识别。由此说明这些基因可以在真核细胞中表达，且只能在转化到真核细胞后表达。
*5、现代生物技术（基因工程）的研究与发展的利弊。
利：①现代生物技术，特别是人类基因组计划的初步完成，标志着人类历史由认识客体、改造客体的时代转向认识主体、改造主体的新时代；②大规模生产生物分子；③设计构建新物种；④搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内懂得遗传信息资源。
弊：①克隆技术会带来社会伦理方面的问题；②转基因技术的大范围应用会产生基因污染，增加基因遗传病的犯病风险；③宗教界人士、素食主义者及动物保护组织的反对
生物选修3知识点 专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过，赋予生物以，创造出。基因工程是在 上进行设计和施工的，又叫做。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别的核苷酸序列，并且使每一条链中的两个核苷酸之间的断开，因此具有。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式： 和。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：来源于大肠杆菌，来源于T4噬菌体， 只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来； 而能缝合两种末端，但连接的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。 DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 必须需要模板 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②，供外源DNA片段插入。 ③，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是 ,它是一 种 。
（3）其它载体： (二)基因工程的基本操作程序 第一步： 1.目的基因是指：基因。 2.原核基因采取获得，真核基因是。人工合成目的基因的 常用方_ 和_。 3. 从基因文库中获取 基因文库（1）概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 （2）类型：基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库） （1）原理： （2）过程：第一步：加热至90～95℃； 第二步：冷却到55～60℃，； 第三步：加热至70～75℃，。 第二步：（核心步骤）
基因工程 绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
基因工程各章知识点 第一章绪论 1．基因工程的首例操作实验 三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定 三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用 基因工程的诞生： 72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和λDNA,并用T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子 73年，S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R6－5和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性 S.Cohen 和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌 2．基因工程的基本概念 基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA 技术。 供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。 3．基因工程的基本操作过程 a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。 b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。 c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。 d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。 e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。 第二章载体 1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。答案不确定 PBR322作载体的克隆外源基因的原理:PBR322质粒具有12 种限制性内切酶的单一识别位点：Tet r 基因内有7个酶切位点：Bam HⅠ，SalⅠ：Amp r基因内有3 个酶切位点：PstⅠ。Eco RⅠ和HindⅢ不在抗生素基因内，不导致插入失活。 如果在pBR322质粒的Tet r基因内位点插入外源DNA片断，将切断了tet r基因编码序列的连续性，使tet r 失去活性，产生出Amp r Tet s表型的重组pBR322质粒，转化入Amp s Tet s的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Amp r菌落，再将它们影印于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长，这样就找出了含重组质粒的大肠杆菌。如果在pBR322质粒的Amp r基因内位点插入外源DNA片断，则反之。 PUC18作载体的克隆外源基因的原理：
专题一基因工程 一【高考目标定位】 1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作 程序四个步骤；基因工程在农业和医疗等面的应用；蛋白质工程的原理。 2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基 因；利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。 二【课时安排】2课时 三【考纲知识梳理】 第1节DNA重组技术的基本工具 教材梳理： 知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 注意：对本概念应从以下几个面理解： 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸切酶——“分子手术刀” （1）限制性切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。 （2）限制性切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）限制性切酶的切割式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体 （2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸
二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。注意：比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA 解旋。 （3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 （2）运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞对目的基因进行大量复制。 （3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性切酶切点③有一定的标记基因，便于筛选。 思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。 基因进入受体细胞的载体──“分子运 输车”的学习容，不能仅仅着眼于记住这几个 条件，而应该深入思考每一个条件的涵，通过 深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些条件 才能充当载体。 教材拓展： 拓展点一限制酶所识别序列的特点 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱
第一章基因克隆 基因工程的基本技术有哪些？ 答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。 构建基因文库一般使用什么作为载体？ 答：一般使用大肠杆菌作为载体 克隆与亚克隆？ 答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。 PCR对基因克隆有什么作用？ 答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。 第二章分子克隆工具酶 限制与修饰系统？ 答：限制系统可以排除外来DNA。限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。并且能够保证自身的DNA不被降解。 使用最广泛的限制酶？ 答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶 限制性内切酶的命名？ 答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。 如：HindIII 限制与修饰系统分类？ 答：至少可分为3类。II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。其限制反应与甲基化反应是分开的反应。不需要ATP的参与。 限制酶识别的序列长度？结构？
答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列 限制酶产生的末端？ 答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端 什么是同裂酶？分类？ 答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。但他们的切割位点有可能不同。分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他 限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？ 答： 什么是同尾酶？ 答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。 酶切的缓冲液中一般含有什么？作用是？ 答：调控pH的缓冲剂：稳定溶液的pH M g2+：稳定酶的作用，提高酶的活性，提高酶的特异性 DDT（二硫苏糖醇）：防止DNA二聚化，影响酶切结果 BSA（小牛血清蛋白）：防止了酶的贴壁效应（可使酶变形），同时减少非特异性吸附，对酶有稳定和促进的作用。 酶切的反应温度？反应时间？中止酶切的方法? 答：反应温度大多为37℃，时间一般为2-3h。中止的方法是在65℃下反应20min。 什么星星活性？抑制其发生的办法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特性称为星星活性。抑制星星活性的措施有很多，如减少酶的用量（可避免过分酶切）、减少甘油浓度、保证反应体系中唔有机溶剂或乙醇、提高离子强度到100-150mmol/L（如果不会抑制酶活性的话）和降低反应pH至pH7.0以及保证使用M g2+作为2价阳离子。 影响酶活性的因素有？ 答：可分为内因和外因 外因是可预见的，可控的：反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应提及的选择以及反应时间的长短等。 内因有：星星活性、底物甲基化和底物构象（线性还是超螺旋） 原核细胞有几种DNA聚合酶？其特点是什么？ 答：DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或者双链DNA的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。
基因工程核心知识点 一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶（E?coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E?coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形 成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 *比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋。（3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。 （4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA 连接酶的异同点。 3.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 （3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒 【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。(4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因，目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。 2.获得目的基因的方法
专题1 基因工程 ※基因工程的概念： 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 ﹡原理：基因重组 ﹡目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 ﹡意义：能够打破生物种属的界限（即打破生殖隔离，克服远源杂交不亲和的障碍），在分子水平上定向改变生物的遗传特性。 ﹡操作水平：DNA分子水平 【思考】： （1）基因工程的物质基础是：所有生物的DNA均由四种脱氧核苷酸组成。 （2）基因工程的结构基础是：所有生物的DNA均为双螺旋结构。 （3）一种生物的DNA上的基因之所以能在其他生物体内得以进行相同的表达，是因为它们共用一套遗传密码子。 一、基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端（回文结构特点）。 ①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。 ②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶
（1）分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类 （2）功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 ★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键 ②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接； T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。 (3)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 （4）与DNA分子相关的酶
2019-2019高考生物基因工程专项知识点基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力 的手段，下文是查字典生物网为考生准备的生物基因工程专项知识点的内容。 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 (一)基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶) (1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 (2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯 键断开，因此具有专一性。 (3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶(E?coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E?coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而
T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是??质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 3.PCR技术扩增目的基因 (1)原理：DNA双链复制 (2)过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至
-高考生物基因工程专项知识点 基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力 的手段，下文是为考生准备的生物基因工程专项知识点的内容。 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 (一)基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶) (1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 (2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯 键断开，因此具有专一性。 (3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶(E?coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E?coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而
T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是??质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 3.PCR技术扩增目的基因 (1)原理：DNA双链复制 (2)过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链;第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链;第三步：加热至70～
专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外和 ，赋予生物以新的，创造出更符合人们需要的新的和 。基因工程是在上进行设计和施工的，又叫做。 基因工程育种的原理：；优点：、 （一）基因工程的基本工具（工具酶：、） 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种的核苷酸序列，并且使每一条链中部位的两个核苷酸之间的断开，因此具有性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：末端和末端。（4）限制酶自身DNA，原因是原核生物中或识别序列已经被。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于，只能将双链DNA片段互补的之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合，但连接平末端的之间的效率较。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端， 形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②。 ③。 （2）最常用的载体是 ,它是一种裸露的、结构简单的、独立于之外，并具有的 DNA分子。 （3）其它载体：、 . (二)基因工程的基本操作程序 第一步： 1.目的基因是指：。
2.获取目的基因的方法有、 和。 3.基因文库是指：将含有某种生物的许多DNA片段，导入 中储存，各个受体菌分别含有这种生物的，称为基因文库。包含了一种生物所有的基因，这种基因文库称为；包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库称为，如。 获取目的基因的依据有哪些？如、、 、、。 4.PCR技术扩增目的基因 （1）原理： （2）特点： （3）条件：（）、、（）、（）。 （4）仪器：。 5.人工合成目的基因的方法有：、。第二步： ----也是基因工程的 1.目的：。 2.组成：＋＋＋ （1）启动子含义及作用： 。 （2）终止子含义及作用：。 注意与终止密码子的区别 （3）标记基因的作用：。 常用的标记基因是、。 第三步： 1.转化的概念：是进入受体细胞内，并且在受体细胞内的过程。 2.常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是，其次还有和 等。其中单子叶常有的方法是。
基因工程 一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 二、基因工程的基本工具 1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀” 2、DNA连接酶-----“分子缝合针” 3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车” 1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）存在：主要存在于原核生物中。 （2）特性：特异性，一种限制酶只能 识别一种特定的核苷酸序列，并且能在 特定的切点上切割DNA分子。 （3）切割部位：磷酸二酯键 （4）作用：能够识别双链DNA分子的 某种特定核苷酸序列，并且使每一条链 中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸 二酯键断开。
（5）识别序列的特点： （6）切割后末端的种类：DNA 分子经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA 的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。
2．“分子缝合针”——DNA连接酶 （1）作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。 （2）类型 相同点：都连接磷酸二酯键 3．“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 (4)载体的作用: ①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的
基因工程期末考试重点知识整理
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg 及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)
第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ
基因工程细胞工程知识点汇总 一、基因工程 （一）基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点，
供外源DNA片段插入。③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是 质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 （3）其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理：DNA双链复制 （2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。第二步：基因表达载体的构建 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
高中生物基因工程核心知识点 专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶（E?coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E?coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
第一章基因工程概述 1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？ 基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多 种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内， 使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大 要素。 1.分离目的基因 2.限制酶切目的基因与载体 3.目的基因和载体DNA在体外连接 4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养 5.选择、筛选含目的基因的克隆 6.培养、观察目的基因的表达 第二章基因工程的载体和工具酶 1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？ ?具有对受体细胞的可转移性或亲和性。 ?具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 ?具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。 ?具有合适的筛选标记。 ?分子量小，拷贝数多。 ?具有安全性。 2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？ 1、自主复制性 2、可扩增性 3、可转移性 4、不相容性 主要类型有 1.克隆质粒 2.测序质粒 3.整合质粒 4.穿梭质粒 5.探针质粒 6.表达质粒3. 质粒的构建 （1）删除不必要的 DNA 区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源 DNA 片段的装载量。一般来说，大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。 （2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证 DNA 重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因， 提高质粒的拷贝数 （3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受 体细胞。 （4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列，即多克隆接头（Polylinker），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一 化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。 （5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。 4. 什么是人工染色体载体？ 将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起， 即可构成染色体载体 5. 什么是穿梭载体？ 人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体。 6.入-噬菌体载体及构建 -DNA为线状双链DNA分子，长度为48.5kb，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。 ?1缩短长度提高外源 DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点 ?引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性 ?灭活某些与裂解周期有关基因。 ?使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的污染
一、绪论 1、简述基因工程的概念。 答：基因工程是指按照人们的设计，用生物技术直接操作生物的基因组。通过分离和拷贝目的基因或人工合成外源基因，在体外将外源基因插入到载体分子中，成为重组DNA，再导入宿主细胞内，进行扩增和表达。此过程所涉及的方法学称为重组DNA技术，也称分子克隆或基因操作。 2、列举基因工程中常用的一些技术。 答：（1）基因敲入：以ES细胞培养技术和同源重组为基础，通过转基因将外源基因整合到特定的靶位点，利用靶位点全套的表达调控元件以实现特异性的异位表达。 （2）基因敲除：将一个特地设计的DNA片段导入生物体中，通过同源重组使靶基因被置换出而失活的实验技术。 （3）基因敲落：是用反义技术，RNAi等降低或抑制靶基因的表达活性。 （4）基因打靶：是用同源重组来瞄准希望改变的特定内源基因。 （5）基因组编辑：用基因组编辑核酸酶，如锌指核酸酶（ZFN）、归巢核酸内切酶、转录激活子样效应物（TALE）和成簇间隔短回文重复（CRISPR）进行剪切。 二、基因工程的分子遗传学基础 （一）名词解释 1、基因表达：指DNA分子经转录产生互补的RNA分子。 2、半保留复制：亲代DNA双链分离后的两条单链均可作为新链合成的模板，复制完成后的子代DNA分子的核苷酸序列均与亲代DNA分子相同，但子代DNA分子的双链一条来自亲代，另一条为新合成的链，故称为半保留复制。 3、半不连续复制：是指DNA复制时，前导链上DNA的合成是连续的，后随链上是不连续的，故称为半不连续复制。半不连续模型是DNA复制的基本过程。 4、DNA的变性：指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链，从而使核酸的天然构象和性质发生改变。变性DNA常发生一些理化及生物学性质的改变：溶液粘度降低、溶液旋光性发生改变、增色效应。 5、DNA的复性：指变性DNA在适当条件下，两条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。 6、增色效应：指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。DNA分子中碱基间电子的相
基因工程知识点全 第一章基因工程概述 1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？ 基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人 们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。 1.分离目的基因 2.限制酶切目的基因与载体 3.目的基因和载体DNA在体外连接 4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养 5.选择、筛选含目的基因的克隆 6.培养、观察目的基因的表达 第二章基因工程的载体和工具酶 1.基因工程载体必须满足哪些基本条件？ 具有对受体细胞的可转移性或亲和性。 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。 具有合适的筛选标记。 分子量小，拷贝数多。 具有安全性。
2.质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？ 1、自主复制性 2、可扩增性 3、可转移性 4、不相容性 主要类型有 1.克隆质粒 2.测序质粒 3.整合质粒 4.穿梭质粒 5.探针质粒 6.表达质粒 3.质粒的构建 （1）删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。一般来说，大于20Kb的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。 （2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的 mob基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证DNA重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数 （3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记， 便于检测含有重组质粒的受体细胞。 （4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切 割位点的DNA序列，即多克隆接头（Polylinker），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。 （5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达
高三生物知识点归纳：基因工程及其应用 1.概念：按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。 高考生物知识点归纳 2.原理基因重组 3.工具： A.基因的”剪刀”：限制性内切酶 ①分布：主要在微生物中。 ②作用特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。 ③结果：产生黏性未端(碱基互补配对)。 B.基因的”针线”：DNA连接酶 ①连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。 ②结果：两个相同的黏性未端的连接。 C.基因的”运载工具”：运载体 ①作用：将外源基因送入受体细胞。 ②具备的条件：a、能在宿主细胞内复制并稳定地保存。b、具有多个限制酶切点。 c、有某些标记基因。 ③种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。 ④质粒的特点：质粒是基因工程中最常用的运载体。 4.基因操作的基本步骤： ①提取目的基因：人们所需要的特定基因，如人的胰岛素基因、抗虫基因、抗病基因、干扰素基因等 ②目的基因与运载体结合(以质粒为运载体)：用同一种限制酶分别切割目的基
因和质粒DNA(运载体)，使其产生相同的黏性末端，将切割下的目的基因与切割后的质粒混合，并加入适量的DNA连接酶，使之形成重组DNA分子(重组质粒) ③将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞 ④目的基因检测与表达 检测方法如：质粒中有抗菌素抗性基因的大肠杆菌细胞放入到相应的抗菌素中，如果正常生长，说明细胞中含有重组质粒。 表达：受体细胞表现出特定性状，说明目的基因完成了表达过程。如：抗虫棉基因导入棉细胞后，棉铃虫食用棉的叶片时被杀死;胰岛素基因导入大肠杆菌后能合成出胰岛素等。