大鼠体外受精技术研究进展
张春燕1, 2，刘丽均2，徐平2，芮荣1*
1南京农业大学动物医学院，南京210095；
2中国科学院上海实验动物中心，上海201615
摘要：目前，体外受精技术在多种哺乳动物已取得成功并获得广泛应用。大鼠由于其本身的特殊性，体外受精及随后的胚胎培养一直比较困难，国内关于大鼠体外受精方面的研究更是少有报道。文章主要从卵母细胞体外培养、精子获能、受精、受精卵体外培养及胚胎移植等方面着手，对国外大鼠体外受精的研究现状作一简要综述。
关键词：大鼠；体外受精；胚胎培养；胚胎移植
体外受精（IVF）是指在体外环境完成精卵结合的过程。体外受精研究的深入开展，不仅加深了人们对受精机制的认识，也为动物繁育、治疗人类不孕症提供了有力的手段。目前，该项技术在小鼠、兔、山羊、猪和牛等动物及人类已日趋成熟，并得到广泛应用；但在国内少有大鼠体外受精的报道。现将该领域的研究现状作一综述，以供参考。
1. 大鼠体外受精研究简史
事实上，大鼠是较早用于体外受精研究的实验动物之一。早在1968年，Toyoda 和Chang 就开始了大鼠体外受精技术的研究，但只能使去除透明带的卵子和精子在体外受精[1]。1973年，Miyamoto和Chang利用从交配雌鼠子宫内收集的精子进行体外受精时发现，子宫内收集的精子可以使透明带完整的卵子受精[2]。从而用实验证明，以前的体外受精之所以不成功，关键是精子在体外培养时没有获能，不具备穿过透明带使卵子受精的能力。1974年，Toyoda 等研制出适合于大鼠精子体外获能的培养液，由此逐步建立起大鼠体外受精技术[3]。
近年来，研究者在精子获能液、胚胎培养液及提高体外受精胚胎质量方面做了大量研究，目的是尽量模拟体内受精和胚胎发育环境，探索大鼠体外受精的最适条件，以提高其胚胎体外生产效率。
2. 研究方法及进展
完整的体外受精技术包括：卵母细胞的体外成熟（IVM）；精子获能；体外受精；早期胚胎培养和移植。而胚胎移植结果仍是鉴定体外受精胚胎质量的最有效证据。
2.1 卵母细胞的来源与体外成熟
2.1.1收集卵巢未成熟卵母细胞
哺乳动物的卵巢上有大量未成熟、处于不同发育阶段的卵母细胞，这部分卵母细胞需经IVM培养后，方可用于体外受精。获得卵巢卵母细胞的方法主要有两种：（1）机械分离法－利用穿刺针将卵巢表面的卵泡刺破，释放出卵母细胞；或是采用切割法，将整个卵巢切碎后收集卵母细胞。穿刺法采卵数量少，切割法获卵数较多，但切割法会产生更多裸卵或造成卵丘细胞损伤。（2）胶原酶消化法－该方法主要用于腔前卵泡卵母细胞的分离。
大鼠大卵泡（直径>350um）卵母细胞的体外培养，通常使用含15％灭活血清的MEM (Eagle’s Minimum Essential Medium)作为培养液，培养12 h后检查成熟发育情况，以生发泡破裂或第一极体排出作为成熟的判断标准。
*通讯作者，Email：rrui@https://www.doczj.com/doc/9018831386.html,。
在进行腔前卵泡卵母细胞分离培养时，通常取10或11日龄大鼠卵巢，洗净后放入3ml 含4mg/mL胶原酶与10ug/mL脱氧核糖核酸酶的MEM培养液中，置于37℃ CO2培养箱内孵育30-45 min，再用吸管反复吹打，驱散卵巢组织，收集腔前卵泡。基础培养液为添加有1 mM 丙酮酸钠、0.25 M尿苷、3 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）、50 ug/mL庆大霉素、5 ug/mL胰岛素、5 ug/mL转铁蛋白、5 ng/mL硒和2 mM次黄嘌呤的MEM培养液，其渗透压约为300，pH 值为7.3。隔天换液一次，培养20 d后观察卵母细胞生长和成熟分裂情况。
在卵子成熟过程中，卵质、核和膜的同期化“成熟”对于正常受精和发育至关重要。研究表明，卵母细胞的体外培养和发育与其后的受精率和囊胚发育率相关性很大。卵泡液有促进卵质成熟的作用，而卵丘细胞的存在不仅对核成熟有利，并且对体外受精与其后的胚胎发育有利，而且这种作用还可通过向培养液中添加血清或卵泡液得到加强[4]。尽管促卵泡素（FSH）和卵巢类固醇激素对卵母细胞核成熟没有明显的作用，但对卵母细胞成熟后的正常体外受精起着十分重要的作用[5]。胎牛血清（FCS）可以阻止卵母细胞体外培养时的透明带硬化，有利于精子穿透；并可缩短透明带被胰蛋白酶溶解的时间，但对卵母细胞核和胞质影响不大[6]。
2.1.2 体内成熟卵母细胞
即从经超数排卵处理的雌鼠输卵管内采集体内成熟的卵母细胞。超排技术在许多哺乳动物上均有应用，但由于遗传背景的不同和发情周期的差别等原因，对性成熟大鼠的超数排卵收效甚微。Armstrong 和Opavsky（1988）采用连续几天注射FSH的方法，结果获得大量有发育能力的附植前胚胎[7]。近年的研究发现，对65g左右的未成熟大鼠，可间隔48 h腹腔分别注射10 IU孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG），可获得大量有受精能力的成熟卵母细胞。
2.2 精子获能
一般认为，哺乳动物的精子必须在雌性动物生殖道内停留一段时间后，才具备使卵子受精的能力，称之为精子获能。获能是哺乳动物精子受精时独具的特征，一般有两个显著的变化，一是脱去精子表面的某些大分子物质和去能因子，这是一个可逆的生理学变化；二是诱发顶体反应，出现顶体结构的变化。
精子获能的方法有体内获能和体外获能两种。体内获能是早期进行体外受精研究时常用的方法，即从交配后一定时间的雌鼠子宫内获取精子，再用于体外受精。体外获能指在体外培养条件下使精子完成获能的方法，精子获能是体外受精中一个关键性技术环节，是影响体外受精结果的重要因素之一。
影响大鼠精子获能的因素很多，常见的因素包括（1）钙离子（Ca2＋）－Ca2＋在诱发精子顶体反应中起重要的作用，钙离子载体能与Ca2＋形成复合物，携带Ca2＋进入精子，从而诱发顶体反应并激活顶体酶。（2）BSA－BSA对于仓鼠、小鼠和牛的IVF都不是必需的，但对大鼠IVF必不可少[8]。BSA可能改变精子的胆固醇含量，调整精子的脂肪水平，从而改变精子膜的稳定性。精子一旦获能，BSA可促进其迅速穿过卵子。（3）渗透压－当渗透压为310时，有利于大鼠精子获能，低于290时则获能不好[8，9]。需要说明的是，这种渗透压是通过增加NaCl浓度，而不是通过增加山梨醇来实现的。由此可见，精子穿透力的提高可能不仅仅是渗透压的作用，还与高浓度的NaCl有关。（4）pH值－大鼠精子获能的最适pH为7.2－7.4。pH值偏高可致快速获能，但不利于精子生存；而偏低则获能时间会大大延长，不利于体外受精的进行。
长久以来，用于大鼠的体外受精液仅仅局限于mKRB液。2004年， Jiang等首次尝试以IVF20作为受精液对SD和Wistar两品系大鼠进行体外受精。结果发现，Wistar 受精率
可达78％；在IVF20中添加30 mM NaCl后，SD品系的体外受精率可达73％；体外受精后的胚胎都能以较高比例发育到囊胚（47％），并在移植后能完成全程发育 [9]。
2.3大鼠体外受精
体外受精不仅依赖于卵母细胞的成熟培养和精子获能，而且精子浓度、精卵相互作用的时间，培养液和培养温度、CO2含量等也是重要的影响因素。
2.3.1 精子的获取和培养
取3 mon以上有繁育能力的雄鼠，颈椎脱臼处死，腹部75％酒精消毒，打开腹腔，取附睾尾。用眼科剪小心将附睾尾周围的脂肪剥离，在灭菌滤纸上去除血迹和脂肪，用眼科剪在附睾尾上剪个小口，可见有乳白色精子团涌出，用穿刺针挑入预先平衡过夜的受精液滴中。温箱孵育5 min后，取10-30uL精子悬液，移入另一新鲜液滴，使精子浓度达1.0ⅹ106个/mL，培养条件为5％CO2、95％空气、饱和湿度和37℃，5-7 h后完成获能。
2.3.2 卵子的获取和受精
对雌鼠进行超数排卵，于hCG注射后14 h颈椎脱臼处死雌鼠，剪离输卵管，撕破膨大部，将卵团引入获能好的精子悬液中，每400 uL液滴中含10-40个卵母细胞，温箱孵育12 h 后即可完成受精。
2.4 胚胎培养
受精后的大鼠胚胎要在体外培养到槡椹胚或囊胚后再移植给受体，才会获得较高的妊娠率。目前，哺乳动物胚胎在体外培养中普遍存在早期发育阻滞现象。如牛胚胎的发育阻滞常发生在8-16细胞，猪为4-细胞，仓鼠为2-4细胞，小鼠为2-细胞。研究早期，大鼠胚胎体外培养时经常阻滞在2-4细胞期。Kishi等尝试用培养仓鼠胚胎的HECM-1培养液培养大鼠原核期胚胎，48 h后57.9％的胚胎发育到了4-细胞；随后的8-细胞、桑椹胚和囊胚形成率分别为32.2％，17.4％和9.9％[10]。Kishi等首次报道体外培养大鼠胚胎成功发育至囊胚[11]。后经改良，把HECM-1中的NaCl浓度从98.0 mM降至78.8 mM，再添加7.5 mM葡萄糖和20种必需氨基酸，发展成现在通用的mR1ECM培养液，囊胚发育率可达80％以上[12]。2000年，Goh等经实验改良又发明出R2ECM培养液，适用于大鼠2-细胞胚胎至囊胚的发育[13]，囊胚发育率可达80％以上。此外，通过兔输卵管上皮共培养亦可克服大鼠胚胎的体外发育阻滞，采用该培养体系，59％的受精卵可发育到槡椹胚或囊胚[14]。
2.4.1影响大鼠胚胎体外培养的因素
常见的影响因素有：（1）磷酸盐－它的存在对大鼠早期胚胎的发育有阻滞作用；但有研究表明，大鼠1-细胞胚胎在体外培养80 h后，添加磷酸盐可提高囊胚形成率。当培养110 h 后，添加磷酸盐的囊胚形成率可达94％，不作添加仅为67％[15]。(2)葡萄糖－葡萄糖对早期胚胎发育影响不大，不具有明显的抑制或促进作用；但桑椹胚期后添加葡萄糖可提高囊胚发育率[16]。(3)渗透压和BSA－大鼠受精卵若在原核形成前转入mR1ECM培养液中，则发育能力降低；而经mKRB预培养后则发育率较髙。后来的研究发现，渗透压和BSA在精子穿透卵子后的预培养中起着重要作用，是受精后卵母细胞发育到囊胚的必需因子[17]。然而，支持最大发育率的最适BSA浓度与渗透压尚需进一步研究。
3. 存在问题
经体外受精得到的胚胎在移植后能成功完成全程发育，但窝仔数下降，并且超过一半的母鼠在怀孕13－20 d时终止妊娠。体内与体外受精后，经mR1ECM培养至桑椹胚或囊胚再
移植，也得到类似的结果。表明目前所用的培养条件仍与体内生长环境存有差距，有待于进一步完善。
不同品系的大鼠在相同IVF条件下，尤其是使用冷冻精子做IVF时，其受精率的差异很大。不同品系来源的精子对溶液渗透压的敏感性不同，这一点已经在小鼠、牛、猪和人类得以证实。因此，遗传背景不同可能会导致精子特性的差别及对渗透压耐受性的不同，在大鼠上仍需证明这一点。
4. 前景展望
大鼠是仅次于小鼠的重要实验动物，在过去一个世纪中它一直是首选的啮齿类实验动物，被广泛地用于生物医学研究。直到上个世纪80年代，由于小鼠胚胎干细胞技术的成熟，可以方便地通过基因敲除和敲入来改造小鼠基因，并获得研究用克隆小鼠，大鼠在医学实验动物中的地位才逐渐被小鼠所取代。然而，对于许多人类疾病，用大鼠建立动物模型更为理想。以乳腺癌为例，大鼠显然是更理想的动物模型，大鼠体内肿瘤的激素反应与人类更为接近。另外，实验大鼠比小鼠要聪明，体积也比小鼠大，因而成为从事大脑和循环系统研究的理想动物。
随着生命科学的快速发展，实验动物事业蒸蒸日上，各种动物模型相继问世。模型动物一般饲养困难，饲养成本高，且繁殖困难，长时间传代后易发生变异或基因突变，导致宝贵的资源丢失。因此，大鼠的资源保存技术研究非常必要。目前资源保存的常用手段除传统的活体保种外，就是利用生殖工程技术和现代低温生物学技术对动物的配子或胚胎进行冷冻保存。啮齿类动物的配子保存比较困难，较常用的是对胚胎进行冷冻保存，这就需要有大量的胚胎资源，而体外受精正是获得大量胚胎的有效途径。
虽然大鼠的体外受精尚不够完善，还存在受精率低、胚胎培养困难、移植后胚胎发育能力低等一系列问题。但我们相信，随着研究的不断深入，这些问题终究会得到更好的解决，以期为人类实验医学的发展做出更大的贡献。
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Advance of in vitro fertilization technique in rats
Zhang Chunyan1,2，Liu Lijun2，Xu Ping2，Rui Rong1
（1College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;
2Shanghai Laboratory Animal Center, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201615）
Abstract
In vitro fertilization technique has made great progress in many mammalian species and has been put into use widely. The in vitro fertilization and embryo culture in rats are still difficult due to their specificity. To our knowledge, there isn’t any report on the in vitro fertilization of rats in China. This article made a simple review about the in vitro fertilization of rats overseas, including the maturation of oocytes, sperm capacitation, fertilization, embryo culture and embryo transfer.
Keywords: Rats; Vitro fertilization; Embryo culture, Embryo transfer
1、分子生物学检验技术：是以核酸或蛋白质为分析材料，通过分析基因的结构、表达的变化和由此而导致的基因功能的改变，为疾病的研究和诊断提供更准确、更科学的信息和依据的一门学科。 2、请说明分子生物学检验技术在临床试验诊断中的应用。（1）感染性微生物的检测。如：用PCR技术进行甲型肝炎病毒的检测、乙型肝炎病毒的检测和解脲脲原体的检测等。（2）基因突变的检测。如：用PCR一限制性片段长度多态性（RFLP)技术检测地中海贫血基因突变。 （3）法医学检测。如：用PCR微卫星检测技术进行亲子关系的鉴定和个体识别。 （4）基因异常表达的检测。如：用cDNA表达的芯片技术进行基因异常表达的检测。 （5）基因定位。如：用原位杂交技术进行组织与细胞中基因表达的定位。 3、基因组：是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质。 4、基因：是基因组中一个功能单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链信息或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。 5、原核生物：是细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌和蓝绿藻等原始生物的总称，是最简单的细胞生物体。
6、操纵子结构：是原核生物基因组的功能单位。 7、质粒：是指细菌细胞染色体外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子。 8、转座因子：又称为转座元件，是一类在细菌染色体、质粒和噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立的DNA序列。 9、原核生物基因组的结构特征： （1）原核生物基因组通常仅由一个DNA分子构成，基因组中只有一个复制起点，具有类核结构。 （2）具有操纵子结构，模板mRNA为多顺反子mRNA。编码区远远大于真核生物基因组，但又远远小于病毒基因组。在基因组中存在多功能的识别区域，如复制起始区、转录启动区和终止区等，这些区域常常含有反向重复序列。 （3）结构基因通常为单拷贝基因，编码顺序一般不重叠。（4）具有编码同工酶的基因。 （5)含有可移动的DNA序列。 10、病毒基因组的结构特点： （1）与细菌和真核生物基因组相比，病毒基因组结构简单，基因数少，所含信息量也少。 （2）病毒基因组的核酸类型较多，有双链DNA、单链DNA、双链RNA和单链RNA；有环状分子，也有线性分子。但无论是哪种核酸类型，一种病毒颗粒中核酸成分只能为一种，或
°实验五：小鼠解剖实验 吴雪薇121140059 一、实验目的 1、通过实验学习给小鼠注射、灌胃等技术操作 2、了解戊巴比妥对哺乳动物的影响 3、复习解剖的基本操作 4、通过实验了解小鼠唾液腺的结构 5、通过实验了解小鼠体内器官、系统构造 二、实验原理 1、小鼠唾液腺 唾液腺由颌下腺、腮腺、舌下腺组成，颌下腺最明显，颌下腺两边弥散的是腮腺，舌下腺连于颌下腺上，容易与颌下腺上连的淋巴结搞混。 2、会厌软骨 会厌软骨即构成会厌的软骨，形状扁平，像树叶，下部附着在喉结的内壁上。会厌是喉头上前部的树叶状结构，由会厌软骨和黏膜构成。呼吸或说话时，会厌向上，使喉腔开放；咽东西时，会厌向下，盖住气管，使东西不至进入气管内。 3、小鼠体内结构 （1）胸腔：胸腔内的结构主要有食道、心、肺。 （2）腹腔：主要有胃、肝、胆、胰、脾、肠、肾（包括肾上腺）、输尿管、膀胱和生殖器官：卵巢、输卵管、子宫（雌），睾丸、附睾、精囊腺、输精管（雄）。 （3）胸腔与腹腔由膈膜隔开。 三、实验器材 注射器、烧杯、灌胃针、解剖盘、解剖剪刀、镊子、解剖针、钉子 四、实验材料 小鼠1只、戊巴比妥溶液 五、实验操作 1、抓取一只小鼠，拎住尾巴根部，使其前肢抓在抹布上，后肢提起，用注射器 向其腹腔注射0.5ml戊巴比妥溶液。 2、将小鼠放在烧杯中，观察它的反应。 3、待小鼠不再动时，用注射器向其腹腔再注射0.5ml戊巴比妥溶液，使其死亡。 4、将小鼠放在解剖盘上，用大头针将四肢固定在解剖盘上。 5、用解剖剪刀，从靠近肛门处剪开表皮直至口腔，观察唾液腺。 6、剪开口腔，观察会厌软骨。 7、剪开腹腔和胸腔，观察小鼠体内结构。 8、处理小鼠，清洗、整理实验器材。 六、实验结果 1、观察注射戊巴比妥溶液后的小鼠 本次实验第一次注射，注射了0.4ml的戊巴比妥溶液，第二次注射了0.6ml。
第二章临床分子生物学检验标志物 1. 分子生物标志物：指可以反映机体生理，病理状态的核酸、蛋白质、代谢产物等生物分子，是生物标志物的一种类型。 2. 中心法则：指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒中的RNA自我复制(如烟草花叶病毒等)和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程(某些致癌病毒)是对中心法则的补充。 3. 基因组：是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质，包括基因和非编码DNA。 4. 原核生物基因组特征： 1）原核生物基因组较小：大小一般在106—107碱基对之间； 2）原核生物的类核结构：原核生物基因组DNA位于细胞中央的核区，没有核膜将其与细胞质隔开在蛋白质的协助下，以一定的形式盘曲，折叠包装起来，形成类核； 3）原核生物的操纵子结构：原核生物的结构基因大多数按功能相关性成簇地串联排列于染色体上。结构基因同其上游的调控区以及下游的转录终止信号，共同组成了一个基因表达单位，即操纵子结构； 4）原核生物的结构基因：原核生物的结构基因中无内含子成分，多数是单拷贝基因，基因与基因之间有重复序列存在； 5）具有编码同工酶的基因：这类基因表达产物的功能相同，但基因结构不完全相同；6）含有可移动DNA序列：可移动的DNA序列通过不同的转移方式发生基因重组，改变生物体的遗传性状，使生物体更适应环境的变化； 5. 质粒：指细菌细胞染色体以外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子； 6. 人类基因组包括细胞核内的核基因组（3X109bp）和细胞质内的线粒体基因组（16569bp），人类基因组中存在大量的非编码序列和重复序列； 7. 小卫星DNA：由10—100bp组成的重复单位重复几十到几百甚至几千次，形成的1—5bp 的短DNA，又称可变数目串联重复； 8. 微卫星DNA：核心序列为1—6bp，可以重复上百次，又称短串联重复； 9. 多基因家族：指由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因，在多基因家族中，某些成员并不产生有功能的基因产物，这些基因称为假基因； 10. 多态性：当某种变异相对常见，在群体中的频率高于1%时，则称为多态性，频率低于
食品微生物学检测技术思考题 1、试述微生物与食品安全的关系。 2、对食品进行微生物检验有何意义？ 3、食品微生物检验的范围包括哪些？ 4、食品卫生标准中的微生物指标有哪些？ 5、描述食品微生物检验的一般程序。 6、列表比较低倍镜、高倍镜及油镜在数值孔径、工作距离及镜头大小等方面的差别。 7、要使视野明亮，除光源外，还可采取哪些措施？ 8、与普通光学显微镜比较暗视野显微镜和相差显微镜在结构和功能上有何特点？ 9、简述监测高压蒸汽灭菌效果的方法及其特点。 10、大肠菌群的含义是什么？食品中检测大肠菌群有何卫生学意义？ 11、光学显微标本中的非染色标本有何特点？分几种？ 12、阐述格蓝氏染色（原理、方法、作用）。 13、何谓菌落总数？食品中检测菌落总数有何卫生学意义？ 14、简述计数器计数法的原理及方法步骤。比较血球计数板和细菌计数板的差别。 15、什么叫无菌操作？ 16、描述测微技术的原理及方法。 17、何谓微生物接种？指出常用接种工具及接种方法。 18、简述氯化镁孔雀绿增菌液(MM)和四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)对沙门氏菌的增菌原理。 19、何谓增菌培养、前增菌培养（非选择性增菌培养）及选择性增菌培养？ 20、何谓生理生化试验？解释靛基质（Indole）试验和甲基红（Methyl Red）试验。 21、阐述三糖铁（TSI）琼脂试验的原理。如何利用三糖铁（TSI）琼脂试验区别志贺氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌？为什么？ 22、描述沙门氏菌抗原结构的种类及其特点。 23、简述螺旋接种法及其特点。 24、什么叫血清学试验？对食品中沙门氏菌进行血清学分型鉴定时通常采用什么方法？简述该方法的试验步骤。 25、GB 4789.2—2010中制定的菌落总数的测定方法分为几个步骤，简述每一步骤的操作要点。 26、GB 4789.3—2010中制定的大肠菌群的测定方法有几种？简要描述其特点。第一法分为几个步骤，简述每一步骤的操作要点及目的。 27、GB 4789.10—2010中制定的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的检验方法有几种？请简要描述各种特点。第一法检验金黄色葡萄球菌分为几个步骤？简述每一步骤的操作要点及目的。 28、对冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品进行沙门氏菌检验时需经过哪五个基本步骤？各步骤的主要目的是什么？
实验小鼠（laboratory mouse)学名(Mus muscculus)，实验小鼠来自于野生小鼠，经人们长期选择培育而成。18世纪就被用做动物试验，是目前应用最广泛、被研究的最清楚、最深入的实验动物。已育成的小鼠品种品系有500多种。 一、生物学特性 （一）、动物学分类位置 小鼠属于脊椎动物门，哺乳纲、啮齿目、鼠科、鼷鼠属、小家鼠种。 （二）、一般特性 1、外观：小鼠面部尖突，头呈锥体形，嘴脸前部两侧有19根触须，耳耸立呈半圆形，眼睛大。尾长约与身长相等，尾部覆有短毛和环状角质鳞片。健康小鼠皮毛光滑紧贴皮肤，四肢匀称，眼睛亮而有神。小鼠有多种毛色。 2、体形小，生命周期短，易于饲养管理。出生体重仅1.5克左右，一月龄体重约18--22克。成年小鼠每日食量5--8克，饮水4--7毫升，排粪1.4--2.8克/天，排尿1--3毫升/天。 3、性情温顺，胆小怕惊。 4、成熟早，繁殖力强。雌35--50日龄，雄45-60日龄就可性成熟，雌65--75日龄，雄70--80日龄可达体成熟。性周期4--5天，妊娠期19--21天，哺乳期20--21天，年产6--9胎。属全年多发情动物，产后即发情。 5、反应敏感，适应性差。对多种病原体、毒素及致癌物都很敏感，外界环境光照、噪音、营养、温度、空气质量等多种因素均可对小鼠造成影响。 6、昼伏夜动，喜欢啃咬。喜光线较暗的安静环境，进食、分娩都常发生在夜间，傍晚和黎明前是小鼠活动的两个高峰。 7、喜群居。 8、小鼠有20对染色体，推测有3万多个结构基因，已查明的已有648个。 9、寿命为2--3年。 （三）、解剖生理特点： 1、小鼠上、下颌各有两个门齿，六个臼齿，门齿终生不断生长，需经常磨损来维持齿端的长短，保持恒定。 2、小鼠下颌骨形态有品系特征，可用下颌骨形态分析技术进行近交系小鼠遗传监测。 3、内部脏器：食道细长约2cm，胃分前胃和腺胃，胃容量小（1--1.5ml),胃功能较差，不耐饥饿；有胆囊；胰腺分散在十二指肠、胃底及脾门处；无汗腺；淋巴系统发达；脾脏有明显造血功能；无腭或咽部扁桃体；左肺单叶，右肺四叶；骨髓为红骨髓而无黄骨髓，终生造血；雌鼠为双子宫型，呈Y字型，卵巢有系膜包绕，不与腹腔相通；乳腺发达，共有五对乳头，胸部3对，鼠蹊部2对；雄鼠睾丸大，幼鼠时藏于腹腔内，性成熟后下降到阴囊；前列腺分背、腹两叶。 二、在生物医学中的应用 （一）、药物研究 1、药物安全性评价 小鼠常用于药物的急性、亚急性、慢性毒性试验以及最大耐药量的测定等，“三致”试验也常用小鼠进行。 2、生物制品的检定 3、药物筛选 4、药效学评价试验
第二章临床分子生物学检验标志物 1、分子生物标志物:指可以反映机体生理,病理状态的核酸、蛋白质、代谢产物等生物分子,就是生物标志物的一种类型。 2、中心法则:指遗传信息从DNA传递给RNA,再从RNA传递给蛋白质,即完成遗传信息的转录与翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA,即完成DNA的复制过程。这就是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒中的RNA自我复制(如烟草花叶病毒等)与在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程(某些致癌病毒)就是对中心法则的补充。 3、基因组:就是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质,包括基因与非编码DNA。 4、原核生物基因组特征: 1)原核生物基因组较小:大小一般在106—107碱基对之间; 2)原核生物的类核结构:原核生物基因组DNA位于细胞中央的核区,没有核膜将其与细胞质隔开在蛋白质的协助下,以一定的形式盘曲,折叠包装起来,形成类核; 3)原核生物的操纵子结构:原核生物的结构基因大多数按功能相关性成簇地串联排列于染色体上。结构基因同其上游的调控区以及下游的转录终止信号,共同组成了一个基因表达单位,即操纵子结构; 4)原核生物的结构基因:原核生物的结构基因中无内含子成分,多数就是单拷贝基因,基因与基因之间有重复序列存在; 5)具有编码同工酶的基因:这类基因表达产物的功能相同,但基因结构不完全相同; 6)含有可移动DNA序列:可移动的DNA序列通过不同的转移方式发生基因重组,改变生物体的遗传性状,使生物体更适应环境的变化; 5、质粒:指细菌细胞染色体以外,能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子; 6、人类基因组包括细胞核内的核基因组(3X109bp)与细胞质内的线粒体基因组(16569bp),人类基因组中存在大量的非编码序列与重复序列; 7、小卫星DNA:由10—100bp组成的重复单位重复几十到几百甚至几千次,形成的1—5bp 的短DNA,又称可变数目串联重复; 8、微卫星DNA:核心序列为1—6bp,可以重复上百次,又称短串联重复; 9、多基因家族:指由某一祖先基因经过重复与变异所产生的一组基因,在多基因家族中,某些成员并不产生有功能的基因产物,这些基因称为假基因; 10、多态性:当某种变异相对常见,在群体中的频率高于1%时,则称为多态性,频率低于1%的
《动物胚胎工程实验教程》 王子玉自编 南京农业大学动科院 2005年8月
实验一小鼠卵母细胞的体外成熟实验 一、实验目的 熟悉雌鼠的生殖器官的结构特点；掌握小鼠的超数排卵方案；掌握从卵巢上扎取未成熟卵母细胞的方法、卵母细胞的分类方法、体外成熟培养方法及核成熟情况和卵丘扩展程度的观察。 二、实验器材和材料 1. 器材及药品 体视显微镜，手术器械（眼科剪，眼科镊），1mL注射器，胶头滴管，口吸管，CO2培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑料培养皿，记号笔。 操作液（M2），成熟培养液（M－199），激素（PMSG和HCG），石蜡油。 2．实验动物： 3-4周龄昆明系雌性小白鼠，自由采食饮水。 三、实验内容 1.小鼠的超数排卵 注射剂量皮下或腹腔注射PMSG 10 IU/只小鼠。 注射方法 皮下注射：用手指捏住小鼠的头及尾部固定（图1-1），以酒精棉球消毒其背部，提起皮肤，将注射针头平插刺入皮下，将针头微向上挑起不露出针尖时，再注入药物。随着药物的推入，在皮下可看到鼓起一个小泡，即证实药物确已注入皮下部位。皮下注射时防止药液从针孔处逸出。 腹腔注射：针头刚进入腹腔后向上挑，防止损伤小鼠腹腔内器官。注射针头宜选用小号细针头。注射药物后的小鼠自由饮水、采饲，自然光照。 2.卵巢的采集方法 在注射PMSG后46h利用颈椎脱臼法处死小鼠（将供体鼠置于饲养笼上，鼠爪自然抓紧笼上铁支架，此时一只手拉紧鼠尾，另一只手食指与拇指压紧鼠颈部，或用镊子压紧颈部即可致死，此为引颈法。用75%酒精喷湿鼠全身以消毒并防止毛发飞扬）。将小鼠头部固定，用力牵拉鼠尾，可感到颈椎部位脱臼的振动；也可用食指和拇指直接掐断颈椎致死。然后用图钉将小鼠呈仰卧姿势固定于小木板上或鼠解剖台上。
1病原生物基因组在医学上有何应用？详见书P3 a菌种鉴定b确定病毒感染和病毒载量c病毒分析d细菌耐药监测和分子流行病学调查 2什么是原癌基因，原癌基因有什么特性，原癌基因可以分为哪些种类以及原癌基因常见的激活机制有哪些？ 原癌基因是指人类或其他动物细胞（以及致癌病毒）固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的 基因总称。 特性：进化上高度保守，负责调控正常细胞生命活动，可以转化为癌基因。 功能分类：生长因子，生长因子受体，信号转导蛋白，核调节蛋白，细胞周期调节蛋白，抑制凋亡蛋白 激活机制：插入激活，基因重排，基因点突变，基因扩增，基因转录改变 3试述Down综合征（21三体综合征）的主要临床特征及核型。 临床特征：生长发育障碍，智力低。呆滞面容，又称伸舌样痴呆。40%患者有先天性心脏畸形。肌张力低，50%患者有贯通手，男患者无生育能力，女患者少数有生育能力，遗传风险高。 核型：92.5%患者游离型：核型为47，XX（XY）,+21 2.5%患者为嵌合型：46, XX（XY）/47 ，XX（XY）,+21 5%患者为易位型：46，XX（XY）,-14 ，+t（14q21q） 4简述淋球菌感染的主要传统实验室诊断方法及其主要特点，对比分析分子生物学方法的优势1直接涂片染镜检：敏感度和特异性差，不能用于确诊。 2分离培养法：诊断NG感染的金标准，但是其对标本和培养及营养要求高，培养周期长，出报告慢，难以满足临床要求。 3免疫学法：分泌物标本中的非特异性反应严重以及抗体法间的稳定性和条件限制，推广受限。 分子生物学的优点：敏感，特异，可直接从了临床标本中检出含量很低的病原菌，适应于快速检测 5、在单基因遗传病的分子生物学检验中，点突变检测常用方法有哪些？ 1异源双链分析法（HA）2突变体富集PCR法3变性梯度凝胶电泳法4化学切割错配法5等位基因特异性寡核苷酸分析法 6DNA芯片技术7连接酶链反应8等位基因特异性扩增法9RNA酶A切割法10染色体原位杂交11荧光原位杂交技术 6、简述白假丝酵母菌的分子生物学检验方法 白假丝酵母菌分子生物学检验主要包括白假丝酵母菌特异性核酸（DNA RNA）的检测、基因分型和耐药基因分析 等。 1PCR技术：选择高度特异性的天冬氨酸蛋白酶基因设计引物 PCR—斑点杂交技术：正向杂交和反向杂交，后者可一次检测多种真菌 DNA指纹技术：RFLPRAPD电泳核型分析 AP —PCR技术：定义方法简便，快速，特别适合临床应用 DNA序列分析：可测定rDNA序列也适用于基因突变引起的耐药 基因芯片技术：适用于病原体的耐药研究 7、 F VIII基因倒位导致血友病A，DMD基因外显子缺失导致与杜氏肌营养不良，珠蛋白基因突变导致与珠蛋白合成障碍性贫血。 （第11章，P197，P203，P207。窝觉得大家把题目读三遍就可以了） 答：F VIII基因倒位是导致的血友病A的主要原因（占50%）其它基因突变，如点突变，缺失，插入也会导致血友病A。 同理DMD基因外显子缺失是迪谢内肌营养不良（杜氏肌营养不良）发生的主要原因（60%-70%）。 珠蛋白合成障碍性贫血有六种，主要的两种是a珠蛋白生成障碍性贫血和B珠蛋白生成障碍性贫血，基因突变是主要发病原因。&基因多态性有哪些的临床应用？（P4）
食蟹猴人工授精及體外受精實驗初步程序 KHI Bioservices(Hong Kong)Limited 袁濤 D.V.M 1人工授精及體外受精實驗初步程序 : 1人工授精 (artificial insemination) 1.1母猴準備 利用獨立籠檢視母猴月經, 選擇有正常及規律性月經之猴子進行 利用腹腔鏡(Laparoscopy)或超聲波(Ultrasound)檢查卵巢及卵泡發育情況, 自月經後第5天每隔一天檢查, 接近排卵期時每天進行檢查, 直至確定排卵. [ 另有學者進行荷爾蒙測試 (estrogen, progesterone, LH) 確定排卵 (estrogen ,↓ ↑↑腹腔鏡(Laparoscopy)或超聲波(Ultrasound)較能直接檢視卵泡發育狀progesterone , LH ), 況 ] 1.2公猴取樣 -電激棒取樣 一般分有penile stimulation 及 rectal probe stimulation 電激棒之規格 -精子處理 方法 1取樣後, 凝固精液放於37C 30分鍾 5% CO2 培育箱液化 2液態精液以Tyrode albumin lactate pyruate-HEPES (TALP-HEPES)稀釋1:5 3抽取小許檢視精子活力, 形態及數量 4稀釋至2.0 – 4.0 x 108精子/ml [另有日本研究用2.5 – 5.0 x 107精子/ml 濃度進行 授精] 5培育於30 – 32 , 2-3小時 [另有加入1mM Caffeine使精子活能化(capacitation) ] 1.3授精程序 有文獻提及, 日本獼猴人工授精實驗中, 授精於陰道內之猴不能授精,而只有授精於子官內方可成功. 於食蟹猴陰道及子官均可. 1當母猴証實排卵時, 每天進行0.2ml輸精, 一般由11-14天
临床分子生物学检验试题 一填空题 1. 核酸的最大紫外吸收波长在，蛋白质的最大吸收波长在。 2. 双链DNA 中的碱基对有，。 3. 根据分子和结构不同，RNA 可以分为，，，。 4. 核酸变性过程中,紫外光吸收达到最大值50%时温度称为,其主要与核酸 的最终含量有关. 5. DNA 水解后主要产物是, , 。 6. 核酸（DNA 和RNA ）分子除含 有，，，四种元素外，还含有大量的元素。 7. PCR 技术是当今分子生物学使用最多的技术之一，它一般都有，，三 个基本反应步骤构成。 8. 核酸水解后首先得到核苷酸，核苷酸可以继续水解得到和。 9. 通用遗传密码中代表终止密码的三种密码 是UAA 、和。 10. P CR 方法扩增DNA 片段是，在反应中除了用该DNA 片段作为模板外，尚需加入、 和。 11. 在DNA 分子中还有大量的磷（P），P 的含量大约为。 二．判断题 1. 核酸变性时,碱基对之间的氢键断开,堆积力也受到破坏,共价键断裂. （） 2. 核酸杂交原理就是根据核酸分子间互补.（） 3. 在中性或碱性溶液中,核酸主要带正电 荷.（） 4. 核酸分子质量很大,因此核酸溶液具有很大粘性.（） 5. 分子杂交可以发生在任何只有互补核苷酸顺序两条单股核酸单链之间,如DNA/DNA 、DNA/RNA 、RNA/RNA 等.（） 6. 核酸水解后首先得到核苷酸，核苷酸可以继续水解得到核苷和磷酸（） 7. 在高分子溶液中一般球形分子比线形分子的具有较大的粘度。（） 8?核酸的最大吸收波长在280nm，而蛋白质的最大吸收波长在260nm。（） 9?酚一氯仿提取法是我们在提取DNA时所用的经典方法，现在仍然被许多实验室所采用。（）10. 组成RNA的四种碱基是腺嘌呤（A ）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）。（） 11. PCR技术是以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增技术。（） 12. PCR技术是现在常用的一种扩增技术，它的基本步骤的顺序是退火、变性、延伸。 （） 13. 免疫印漬技术及Southern Blotting是一种印漬技术和抗原抗体反应结合的技术（） 14. 在临床基因扩增检验诊断实验室工作的实验操作人员必须经过业务培训并取得上岗证书（） 15. 无论是DNA还是RNA，在多核苷酸链 内既有酸性的磷酸基又有碱性的含氮杂环碱，因此核酸是两性电解质。（） 16. 在PCR 实验中，退火是指在极端的PH 和受热条件下，核酸分子中的氢键断裂， DNA 双螺旋解开的一个过程。（） 17. 临床基因扩增诊断实验室的设置必须遵 循一定的原则，而这些基本原则制定的主要依据就是使建立的基因扩增诊断实验室结果的准确性能够得到保证，能忠实的反映被检的临床样本的真实情况。（ ） 二选择题 1. 核酸在波长为260nm 光吸收强度大小排列正确的是（） A. G>A>T>C B.A>T>G>C C.C>G>T>A D.G>C>A>T 2．鉴别RNA 靶分子的杂交是（） A Southern Blot B Northern Blot C Western Blot D 斑点杂交 3. 在做RNA 检测时，我们对全血抗凝最好用下列哪种抗凝剂（） A. 肝素 B. EDTA-K2 C. EDTA-Na2 D. 草酸钾
临床微生物学检验技术试题及答案A1题型 1、人类ABO血型抗原包括 A、A抗原 B、B抗原 C、O抗原 D、AB抗原 E、A抗原和B抗原 答案：E 2、ABO血型物质在人体中可引起哪几种Ab产生 A、抗B抗体 B、抗AB抗体 C、抗A抗体 D、抗O抗体 E、抗A和抗B抗体 答案：E 3、免疫耐受就是 A、非特异性无反应性 B、特异性无反应性 C、机体无反应性 D、免疫抑制性 E、对任何抗原都不反应 答案：B 4、迟发型皮肤过敏反应与下列哪种物质有关 A、IgE B、IgA C、活化B细胞 D、活化T细胞 E、活化NK细胞
答案：D 5、佐剂作用是 A、将Ag送入机体各部位 B、将Ag固定在局部 C、增强Ag免疫原性 D、赋予Ag免疫原性 E、增强机体对Ag的免疫应答 答案：E 6、下列哪种物质既有非特异性免疫也参与特异性免疫反应 A、IgG B、干扰素 C、IgA D、前列腺素 E、补体 答案：E 7、TDH 细胞是 A、产生Ab细胞 B、天然杀伤细胞 C、细胞毒细胞 D、迟发变态反应T细胞 E、依Ab杀伤T细胞 答案：D 8、关于霍乱弧菌是否侵入上皮细胞，下列说法正确的是 A、不侵入 B、侵入 C、在特定条件下侵入 D、具有侵袭基因的霍乱弧菌侵入 E、侵入后局限于上皮细胞内 答案：A 9、葡萄球菌能产生多种溶血素，其中最主要的是
A、α、β溶血素 B、α、γ溶血素 C、β、γ溶血素 D、δ、ε溶血素 E、α、γ溶血素 答案：A 10、与其他肺部感染病原菌相比较，铜绿假单胞菌的毒力特点是 A、产生外毒素 B、具有内毒素 C、产生溶血素 D、产生绿脓素 E、具有菌毛 答案：D 11、有荚膜的流感嗜血杆菌含有荚膜多糖抗原称作： A、V抗原 B、M抗原 C、A抗原 D、X抗原 E、S抗原 答案：B 12、下列关于铜绿假单胞菌叙述中，正确的是 A、革兰氏阳性球菌 B、革兰氏阳性杆菌 C、无芽孢 D、具有荚膜 E、无鞭毛 答案：C 13、下列何种微生物具有荚膜结构 A、军团菌 B、支原体
姓名：薛桂凤学号： 实验报告（一） 一、实验目的： 1.掌握小鼠的抓取和固定。 2.掌握小鼠的编号与标记方法。 3.掌握小鼠的常用实验方法。 4.掌握小鼠的常用麻醉方法。 5.掌握小鼠的安死术。 6.掌握小鼠的釆血方法。 7.了解小鼠的采尿、粪的方法。 8.了解小鼠各种脏器标本的采集方法。 二、实验器材：ICR小鼠、电子称、手套、实验托盘、固定板、固定器、烧杯、注射器 （2支）、剪刀、镊子、灌胃针头、毛细管、酒精棉球、5%水合氯醛、生理盐水 三、实验内容 1.抓取：单手固定、双手固定、固定器、固定板。 2.称重：小鼠放在烧杯中称重（去除烧杯重量），记录小鼠体重20g。 3.编号：包括染色法及穿耳孔法。 4.给药：包括尾静脉给药（小鼠放入固定器，露出尾巴、准备好注射器；左手食指托 住尾巴，拇指配合，右手持注射器针尖轻轻抬起与血管平行刺入，轻推给药；血管由红变白后拔针、棉球按压）、皮下注射（俯卧固定，左手拇指和食指捏住皮肤提起，右手持针沿纵轴方向刺入皮肤，阻力消失后回抽无血注入药物，拔针）、皮内注射（俯卧固定，与皮肤平行刺入捏起的皮肤，阻力大，注射药物局部有皮丘后停留片刻后拔针）、腹腔注射（仰面固定，在腹正中线两侧腹股沟平行的位置30-45°进针，挑起皮肤和肌肉，回抽无血，注药）、灌胃（小鼠固定身体呈一条直线，灌胃枕头顺着上颚插入咽部，先少量注药证明未入气管后继续给药）、肌肉注射（）注射针刺入肌肉回抽无血给药。 5.釆血：尾尖釆血法、眼眶静脉丛釆血法、心脏釆血法。 6.麻醉：根据小鼠体重计算麻醉药物用量，水合氯醛，通过腹腔注射给药途径麻醉小 鼠，观察小鼠麻醉期。 7.安死术：颈椎脱臼法、过量麻醉法、空气栓塞法 8.解剖：观察小鼠的脏器解剖结构 四、总结 1.小鼠性情比较温顺，个体小，比较容易抓取固定。但是小鼠尾静脉血管较细，尾静 脉注射有一点难度，可以先酒精擦拭使血管扩张，遵循先远后近的原则会提高尾静脉注射的成功率。 2.通过此次试验，学习了关于实验动物小鼠的一些基本操作技术，对以后的科研实验 做了基本的准备。但还需克服心理的恐惧，多加练习，增加熟练程度。
微生物学检验技术（副高、高级）病例分析题 一个23岁男子因尿痛、尿频，尿道有黄绿色脓性排出物或分泌物而入院。脓性分泌物涂片镜检显示有大量多形核白细胞，其内有革兰染色阴性双球菌。 1.病人最可能感染的病原体是： A.脑膜炎球菌 B.杜克嗜血杆菌 C.溶脲脲原体 D.淋病奈瑟菌 E.性病淋巴肉芽肿衣原体 2.治疗首选药物是： A.青霉素 B.头孢曲松与强力霉素联用 C.强力霉素 D.磺胺增效剂-磺胺甲基异噁唑 E.万古霉素 3.该病原体在缺乏特异性抗体的情况下具有抗吞噬作用，这主要是由哪种抗原所致： A.荚膜 B.菌毛 C.外膜蛋白蛋白酶 E.脂多糖 4.如果在患者脓性分泌物中查不到病原菌，你人认为尿道炎最常是由哪种病原体引起的： A.溶脲脲原体 B.梅毒螺旋体 C.单纯疱疹病毒 D.沙眼衣原体血清型D～K E.沙眼衣原体血清型L1、L2或L3
一个1岁女孩因阵发性严重咳嗽而入院。发作时，连续咳嗽5～20次，呼吸困难，口鼻流出大量粘液性带泡分泌物。患者咳嗽终止前，随着空气最后涌入肺部，发出喘鸣音。其它临床症状有：鼻和眼结膜出血，眶膜水肿，淋巴细胞性白细胞增多。病人无发热，咽喉部无假膜。该女孩尚未接受常规计划免疫。 5.引起患者疾病的最可能的病原体是： A.百日咳杆菌 B.流感嗜血杆菌 C.呼吸道合胞病毒 D.流感病毒 E.白喉杆菌 6.已与病孩密切接触的未受免疫儿童和成人，应采取哪种药物进行预防性治疗： A.白喉抗毒素 B.氨苄青霉素＋克拉维酸 C.红霉素 D.头孢曲松 D.金刚烷胺 7.病人发病过程中所见的过度分泌是由于： A.灭活延长因子2的毒素 B.激活膜结合Gi蛋白而提高胞内cAMP水平的毒素 C.降解SIgA抗体的IgA蛋白酶 D.切断上皮细胞表面糖蛋白末端神经氨酸与相邻糖基的联结链的一种表面酶 E.病理免疫损伤 8.分离培养该病原体应采用： 巧克力培养基B. 金培养基-鲍A. C.鸡胚接种 D.吕氏血清培养基 E.罗氏培养基 一个患镰状细胞性贫血的5岁男童入院治疗。他母亲诉说儿子发病3天，发热、
小鼠实验操作 （一）、实验动物的选择原则 1、尽量选择与人体结构、机能、代谢及疾病特征相似的动物； 2、选用的实验动物的解剖、生理特点应符合实验目的； 3、根据人与实验动物对同一刺激的反应差异，选用具有明显反应的动物； 4、根据生物医学研究必须达到的精确度，选用结构功能简单又能反映研究指标的动物； 5、选用患有人类类似疾病的近交系或突变系动物； 6、选用与实验设计、技术条件、实验方法等相适应的标准化动物； 7、在不影响实验目的与结果的前提下，选择最易获得、最经济、便于操作管理的动物； 8、供实验用的动物应具备质量合格证。 （二）、常用实验动物的特点 1、小白鼠 是实验室最常用的一种动物。易于大量繁殖，且价廉，适用需要大量动物的实验，如药物筛选、半数致死量测定、药物效价比较、抗感染、抗肿瘤药物及避孕药物的研究等。 2、大白鼠 与小白鼠相似。一些在小白鼠身上不便进行的实验可选用大白鼠，如药物抗炎作用的实验常选用大白鼠踝关节制备关节炎的模型。此外，也可用大白鼠直接记录血压、作胆管插管，或用大白鼠观察药物的亚急性或慢性毒性。大白鼠的血压和人相近，且稳定，现常用于抗高血压药物实验。 3、豚鼠 是实验室常用动物之一。对组织胺很敏感，容易致敏，常用于平喘药和抗组胺药的实验。对结核菌亦敏感，故也用于抗结核药的研究。此外还用于离体心脏及平滑肌实验，其乳头肌和心房常用于电生理特性及心肌细胞动作电位实验，研究抗心律失常药物的机理。 （三）、实验动物选择的注意事项 由于动物对外界刺激的反应存在个体差异，在选择实验动物时，还应注意动物的年龄、体重、性别、生理状态、健康状况及其品系、等级等因素对实验的影响。 二、实验动物的性别鉴别与编号 （一）、实验动物的性别鉴别 药理学实验常用的动物中，较大的动物（如家兔、猫、犬等）可以从生殖器分辨其性别，而较小的动物（如小白鼠、大白鼠、豚鼠等）的性别鉴别，通常以肛门与生殖孔之间的距离来判断，距离近者为雌性，距离远者为雄性。 （二八实验动物的编号 药理实验中常用多只动物同时进行实验，为避免混乱应将动物进行编号。实验动物编号的目的在于将观察范围内的同种动物进行区别，以便于观察。常用的方法有染色法、耳缘剪孔法、烙印法和号牌法等，可根据实验目的、动物种类和具备的条件选用，一般编号应具有清晰易辨、简便耐久的特点。猫、犬、兔等较大的动物可用特别的号码牌固定于身上。小白鼠、大白鼠及白色家兔等用黄色苦味酸涂于动物不同部位进行染色标记而编号。例如在小白鼠，右前肢皮肤外侧涂色标记为1号，腹部右外侧皮肤涂色标记为2号，右后肢皮肤外侧涂色标记为3号，头部皮 肤涂色标记为4号，背部正中皮肤标记为5号，尾巴根部标记为6号，7、8、9号在左侧同1、2、3号，第10号不涂黄色。大白鼠的编号与小白鼠相同。 第二节实验动物的捉拿、给药和处死方法 （一）、小白鼠、大白鼠 1、捉拿法：小白鼠可采取双手法和单手法两种形式。 双手法：右手提起鼠尾，放在鼠笼盖或其他粗糙面上，向后方轻拉，小白鼠则将前肢固定于粗糙面上。此时迅速用左手拇指和食指捏住小白鼠颈背部皮肤（图1），并以小指与手掌尺侧夹持其尾根部，固定于手中。
分子生物学检测技术简介 分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶，是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。近年来，分子生物学诊断技术的方法学研究取得了很大进展，先后建立了限制性内切酶酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析等方法。1985年由美国Cetus公司人类遗传学研究室Mullis等创立并随后迅速发展起来的DNA 体外扩增技术（Polymerase Chain Reaction, PCR），以及90年代发展起来的DNA芯片技术（DNA Chip），又将分子生物学诊断技术提高到一个崭新的阶段。 一、核酸分子杂交 （一）概述：具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程叫核酸分子杂交。应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。到目前为止，分子杂交技术在基因诊断中仍占重要地位，它按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种，前者应用较广，有Southern印迹杂交、点杂交、夹心杂交（三明治杂交）、原位杂交和寡核苷酸探针技术等。核酸分子杂交主要涉及两个方面：待测的DNA 或RNA，以及用于检测的DNA或RNA探针。探针标记的好坏决定检测的敏感性。 1、Southern印迹杂交是最经典和应用最广泛的杂交方法。根据基因探针与待测DNA限制酶酶解片段杂交的带谱，可以直接确定宿主基因的缺陷所在或病原体的存在状态。 2、Northern 印迹杂交基本原理与Southern印迹杂交相同，不同的是它检测mRNA而不是DNA，因此可分析和了解基因的表达状态。由于mRNA比DNA更易受到各种因素的降解，所以整个操作过程须特别小心。 3、斑点杂交将待测DNA或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上（无需限制酶酶解），与探针进行杂交反应。该技术对于基因拷贝数多的样品很适合，具有简捷快速的特点，一次可做大批量样品的筛查，适于流行病学调查和感染性疾病外源性致病基因的检测。目前斑点杂交技术在各实验室中得到较普及的应用。该技术可用来分析待测核酸片段中是否存在与探针同源的序列，同时还可半定量反映样品中的模板含量。其原理包括将提取的核酸片段变性后转移并固定于支持膜上，通过预杂交以除去非特异位点，然后以标记探针进行杂交。标记物有多种，以同位素标记的探针杂交后，可通过放射自显影分析结果，而以非同位素(如生物素、地高辛等)标记的探针杂交后，需加入对应的酶标记物(如亲和素、地高辛抗体)，再经过显色反应后，利用光密度扫描仪进行量化检测。本方法特异性可靠，但灵敏度偏低，而且操作复杂，因此大大限制了该技术的普及应用。 4、分支链DNA(bDNA)技术近几年，bDNA作为核酸直接量化检测技术已广泛应用于HBV、HCV和
《微生物检测技术》教学大纲 一、基本信息 二、教学目标及任务 教学目标：通过36个学时的教学，努力使学生了解微生物检验检测中的基本技术体系，了解微生物检测技术在研究工作中的用途和新技术的发展动态，使学生在微生物检验检测方面能够提高认识，并对技术体系有一定的了解，以适应就业后在动植物检验检疫、食品品质检测等方面的微生物检验检测业务的需要，也能适应学生今后在进一步的研究和开发过程中所需要用到的研究性检测业务。 三、学时分配 四、教学内容及教学要求 绪论我国粮食生产、我国农业的发展趋势及其和微生物的关系。 重点介绍我国粮食生产的趋势和供需关系，使学生理解微生物检验检测的重要性 无难点 了解微生物检验技术的重要性
第一章微生物在自然界的分布、作用和特征 第一节微生物在自然界的分布 第二节微生物在自然界的作用 第三节微生物在自然界的特征 本章重点介绍微生物的多样性、微生物分布的普遍性和检测特定的微生物的难点 无难点 了解技术对微生物检验的重要性 第二章微生物检验技术和社会 第一节微生物检验技术和植物检疫 第二节微生物检验技术和食品安全 第三节微生物检验技术和研究 本章重点介绍微生物检验检测技术在植物检疫、食品安全、资源开发以及研究活动中的作用和意义 无难点 理解微生物检验技术对国民经济和国民生活安全的重要性，了解微生物检验技术作用范围 第三章微生物检测技术概述 第一节可培养微生物的检测 第二节VBNC的检测技术 第三节其它的微生物检测技术 针对本课程以各项技术为中心展开，缺乏系统性的特点，本章首先给各种微生物检测技术进行概述，尽量给学生提供一个整体观和一些关键技术的信息。 难点在于理解VBNC的检测 理解各种常用的微生物检验技术和方法 第四章样品的采集和处理 第一节气体的采样和处理 第二节液体的采样和处理 第三节固体的采样和处理 从实际出发，本课程设置了采样技术，对用于微生物检验检测的样品的采集进行细致的介绍。 难点在于理解各种采样设备和工具（缺乏实物） 使学生注意到采样行为对微生物的检测结果带来的误差，并培养学生在自己今后的工作中尽量减少采样造成的误差的意识。 第五章微生物检测技术 第一节可培养微生物的检测 以国标为蓝本，介绍可培养微生物的检测方法 学生实验中有一定的基础，应无难点 使学生了解微生物检测的国家标准在实际工作中的应用，使学生学会如何利用国标。 第二节VBNC的检测技术 以最新的研究或最经典的研究例子为蓝本，介绍VBNC检测的各种方法 难点在于理解检测的理论原理和实际操作之间的差距 使学生了解VBNC的检测的方法及其特征，在必要的时候能选择使用。 第六章微生物分离和培养技术 第一节微生物的分离 介绍可培养以及难培养的微生物的分离方法，着重介绍菌根菌的分离 难点在于对于微生物的分离效果的理解 希望学生能掌握基本的微生物分离方法 第二节可培养微生物的培养 1 病原物的培养 2 非病原物的培养 介绍可培养微生物的培养方法，着重介绍病原菌培养时的注意事项 难点在于对于如何传达培养病原微生物时的临场感
分子生物学检测技术 分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶，是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。近年来，分子生物学诊断技术的方法学研究取得了很大进展，先后建立了限制性内切酶酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析等方法。1985年由美国Cetus公司人类遗传学研究室Mullis等创立并随后迅速发展起来的DNA 体外扩增技术（Polymerase Chain Reaction, PCR），以及90年代发展起来的DNA芯片技术（DNA Chip），又将分子生物学诊断技术提高到一个崭新的阶段。 一、核酸分子杂交 （一）概述： 具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程叫核酸分子杂交。应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。到目前为止，分子杂交技术在基因诊断中仍占重要地位，它按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种，前者应用较广，有Southern印迹杂交、点杂交、夹心杂交（三明治杂交）、原位杂交和寡核苷酸探针技术等。核酸分子杂交主要涉及两个方面：待测的DNA 或RNA，以及用于检测的DNA或RNA 探针。探针标记的好坏决定检测的敏感性。 1、Southern印迹杂交 是最经典和应用最广泛的杂交方法。根据基因探针与待测DNA限制酶酶解片段杂交的带谱，可以直接确定宿主基因的缺陷所在或病原体的存在状态。
2、Northern 印迹杂交 基本原理与Southern印迹杂交相同，不同的是它检测mRNA而不是DNA，因此可分析和了解基因的表达状态。由于mRNA比DNA更易受到各种因素的降解，所以整个操作过程须特别小心。 3、斑点杂交 将待测DNA或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上（无需限制酶酶解），与探针进行杂交反应。该技术对于基因拷贝数多的样品很适合，具有简捷快速的特点，一次可做大批量样品的筛查，适于流行病学调查和感染性疾病外源性致病基因的检测。目前斑点杂交技术在各实验室中得到较普及的应用。该技术可用来分析待测核酸片段中是否存在与探针同源的序列，同时还可半定量反映样品中的模板含量。其原理包括将提取的核酸片段变性后转移并固定于支持膜上，通过预杂交以除去非特异位点，然后以标记探针进行杂交。标记物有多种，以同位素标记的探针杂交后，可通过放射自显影分析结果，而以非同位素(如生物素、地高辛等)标记的探针杂交后，需加入对应的酶标记物(如亲和素、地高辛抗体)，再经过显色反应后，利用光密度扫描仪进行量化检测。本方法特异性可靠，但灵敏度偏低，而且操作复杂，因此大大限制了该技术的普及应用。 4、分支链DNA(bDNA)技术 近几年，bDNA作为核酸直接量化检测技术已广泛应用于HBV、HCV和HIV等的研究。该方法主要是通过将磷酸化的捕获探针以共价键的形式结合在固相载体上，然后依次加入待测核酸和悬挂有多个支链的信号探针进行杂交，每个支链DNA都结合有放大信号的分子(如碱性磷酸酶)，最后通过利用化学发光检测核酸的含量。bDNA技术是目前核酸直接量化检测技术中灵敏度最高的方法之
小鼠体外受精标准化程序 雌鼠（8－10周龄）体外促排卵: 1.4点左右腹腔注射尿促性素针剂(10U/只),； 2.48hr后腹腔注射绒促性素针剂(10U/只); 培养液预平衡: 雌鼠注射绒促的当天，准备如下液体 1.Quinn’s 1023（HEPES-HTF培养基）：使用时添加10％SPS，共 5ml； 2.Quinn’s 1020：使用时添加10％SPS，共5ml； 3.Quinn’s 1026：使用时添加10％SPS，共2ml； 以上液体配置后，HEPES-HTF培养基需要拧紧离心管口，Quinn’s 1020与Quinn’s 1026则半旋口，均放置于CO2培养箱内，孵育过夜。 卵子的获得： 1. 前准备：用昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1020做四个微滴的三个培养皿，盖油，置于CO2培养箱内，孵育备用； 2. 于超净台中，取昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1023液2-3ml与35mm的平皿中； 3. 用颈椎脱臼法处死促排卵雌鼠，取其卵巢及输卵管于上述平皿中； 4. 在解剖显微镜下，用1ml空针剖开小鼠输卵管的壶腹部，即见粘附有大量颗粒细胞的卵子粘液团流出，用拉过的巴斯德吸管吸取置于预先孵育的10％SPS Quinn’s 1020微滴中； 5. 反复冲洗2-3次后，将卵子转入新鲜的10％SPS Quinn’s 1020微
滴中孵育。 精子的获得： 1.于超净台中，取昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1023液2-3ml与 35mm的平皿中； 2.用颈椎脱臼法处死雄鼠，取其附睾上体尾部，除去脂肪与血迹后， 置于上述平皿中； 3.在解剖显微镜下，用1ml空针剖开附睾上体尾部，稍加震荡后即 见成团精子游出； 4.用拉过的巴斯德吸管吸取后轻轻加入到含2ml 10％SPS Quinn’s 1020液的离心管底部，放入CO2培养箱内使精子上游15-25min； 5.吸取上游液于另一离心管中，室温3000rpm离心15min； 6.小心吸取沉淀，加入到另一含1ml 10％SPS Quinn’s 1020液的圆 底管中，混匀，置于CO2培养箱内备用。 体外受精： 1. 用处理过的精液做几个50μl左右的微滴，盖油，吸取各卵子粘液团分别放置于各微滴中，置于CO2培养箱内受精5－6hr； 胚胎培养： 1. 前准备：用昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1026做10－15个微滴，盖油，置于CO2培养箱内，孵育备用； 2. 用拉过的巴斯德吸管分别吸取受精卵，于新鲜的10％SPS Quinn’s 1020微滴中反复吹打数次后，转入预平衡的10％SPS Quinn’s 1026微滴中，培养并观察分裂情况；