医疗器械的免疫毒性评价 杨晓芳综述 奚廷斐审校 (中国药品生物制品检定所,北京100050) 摘要 随着对生物材料生物相容性研究工作的不断深入,以及医疗器械在临床使用过程中所出现的一些问题,人们开始认识到医疗器械与人体免疫系统之间相互作用的重要性。单独致敏试验不能全面地评价生物材料类医疗器械免疫学的各个方面,不能为生物材料的临床使用提供安全有效的试验资料,不能为管理机构的决策提供可靠的技术数据。本文着重介绍了医疗器械免疫毒性试验原理和方法。 关键词 医疗器械 生物材料 免疫毒性 评价 Evaluation of Immunological Toxicity of Medical Devices Yang Xiaofang Xi Tingf ei (N ational Institute for the Contr ol of Pharmaceutical and B i olog ical Products,Beijin g 100050,Ch ina) Abstract T here has been increasing a ttentio n ov e r the past few year s o n the po tential fo r the medical dev ices to ca use chang es in the immune sy stems,and it w as necessar y to prov ide g uidance on ho w to address th e adv erse effects of medical devices o n the immune sy stem.Her e we intro duce the principles a nd methods fo r immuno t-ox ico log y testing o f medical devices. Key words M edical dev ices Bioma teria l Im muno tox ico lo gy Ev alua tio n 1 引 言 随着医学和生物材料技术的不断发展,医疗器械在替代人体组织、器官或改善功能方面的作用越来越突出,同时由于自体或异体器官的移植仍面临诸多困难,使得人类越来越依赖医疗器械,尤其是长期植入人体的医疗器械,比如人工心脏瓣膜等人工器官、血管支架等改善功能的医疗器械已经在临床大量应用。生物相容性评价是对这些医疗器械进行风险评估的重要而有效的手段,国际标准化组织(ISO/TC194)颁布的《医疗器械生物学评价》系列标准(ISO10993)明确列出了细胞毒性、遗传毒性、全身毒性、致敏和刺激反应、血液相容性、生物降解等生物学评价试验项目,用于医疗器械的生物安全性评价。 随着对生物材料生物相容性研究工作的不断深入,以及医疗器械在临床使用过程中所出现的一些问题,使得人们开始认识到医疗器械与人体免疫系统之间相互作用的重要性[1～4]。 免疫系统是人体抗击外源性物质的屏障,对植入人体的异体、异种材料或合成材料会产生一系列免疫防御反应,包括非特异的炎症反应,特异的抗体/抗原反应、补体激活、细胞因子和化学因子表达等等。免疫系统包括复杂的器官和细胞,正常情况下处于微妙的平衡状态,与有免疫毒性的物质接触会打破这种微妙的平衡,而对机体产生不利的影响,比如免疫抑制、过敏或自身免疫。免疫系统的改变对于人类健康潜在的不利影响越来越成为科学和公众日益关心的问题。受影响的机体可能没有明显的疾病,但是会表现为越来越不能抵御那些普通的疾病,比如过敏疾病和普通疾病(常见的伤风、感冒或者耳炎等等)[5～13]。 医疗器械或生物材料一次或多次接触机体后能够激发和诱导免疫系统,导致机体产生致敏反应,目前多采用致敏试验(封闭斑贴法和最大剂量法是致敏试验使用率最高的两种方法,也是国际标准ISO 10993-10中列出的两个方法)用于评价医疗器械或生物材料对机体免疫系统的影响。但是,随着科学技术的发展以及人类对自身健康的更多关注,显而易见,致敏试验已经不能满足医疗器械免疫学评价的 生物医学工程学杂志 J Biomed Eng 2007;24(5)∶1191～1195
实验一发光细菌的急性毒性评价试验 一、实验器材 1.菌株 明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum） 2.培养基 酵母膏0.5%，胰蛋白胨或多聚蛋白胨（Polypetone）0.5%，甘油0.3%，NaCl 3%，Na2HPO4 0.5%, KH2PO4 0.1%，pH6.5。固体培养基再加琼脂2%。 3.溶液、试剂及待测物质 酵母粉，蛋白胨，NaCl（AR），Na2HPO4（AR），KH2PO4（AR），甘油（AR），二甲基亚砜（AR），乙酸乙酯（AR），HCl（1M），去离子水。 4.仪器及其他用品 生物毒性测试仪；电热恒温鼓风干燥箱；振荡培养箱；DELTA 320pH计；氮吹仪；镊子，移液枪，三角锥形瓶等。 二、目的要求 1.学习了解发光细菌的急性毒性评价试验的基本原理。 2.掌握发光细菌的急性毒性评价试验的操作要领和评价方法。 三、基本原理 发光细菌是指在正常的生理条件下能够发射肉眼可见的蓝绿色荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490 nm之间，在黑暗处肉眼可见。不同种类发光细菌的发光机理是相同的，都是由特异性的荧光酶(LE)，还原性的黄素(FMNH2)，八碳以上长链脂肪醛(RCHO)，氧分子(O2)所参与的复杂反应，大致历程如下： FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCH→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE+FMN+ H2O+RCOOH+光 具体来说，生物发光反应由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为 407-409 nm处的蓝绿光。 发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。当细胞活性升高，处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增强。发光细菌在毒物作用下，细胞活性下降，ATP含量水平下降，导致发光细菌发光强度的降低。实验显示，毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系，因而，可以根据发光细菌发光强度判断毒物毒性大小，用发光度表征毒物所在环境的急性毒性。
免疫毒性试验得指导原则(草案) 本指导原则就是为了有助于药品安全性得正确评价,对申报药品审评时所做免疫毒性试验提供得标准实施方法。但就是、对于所有得药品进行完全一样得免疫毒性试验,有时也不尽合理,重要得就是:应根据对象药品得特性采用最适宜得试验方法。 [背景］ 在清除细菌与病毒等外来病原体以及体内产生得癌细胞等,并维持生体正常得过程中,免疫系统起着重要得作用。免疫功能低下容易导致机会感染与产生肿瘤,这在免疫功能缺乏症与获得性免疫功能缺乏综合征(AＩDS)得病例中就是人们所熟知得。对免疫系统得有害作用(免疫毒性)与其她毒性不同,与其说就是其直接对患者得生存带来威胁,不如说由外来病原体得侵袭与内在性癌细胞得发生时产生得免疫毒性更有害。 关于药品审评申报得非临床免疫毒性试验,虽然指出了其重要性,但就是,构成免疫系统得细胞组织及其相互作用就是复杂得,免疫功能得评价项目很多,除小鼠之外得试验动物,特别就是毒性试验中通常使用得大鼠,其免疫功能试验方法得评价尚未充分进行,这些都就是实情,而且免疫功能试验方法得设定较迟。然而,近十年间,包括国际性得共同研究,免疫毒性试验方法得评价取得了较大得进步,即便就是使用大鼠进行得免疫毒性试验,也进入了堪称充分而实用得阶段。 在本指导原则中,利用具有免疫毒性得诸多化学物质在反复给药毒性试验时与免疫毒性有关得检查项目中出现异常得现象,其原则就是,根据反复给药毒性试验得结果,在怀疑存在免疫毒性得场合下,进而再做免疫毒性试验、免疫毒性包括抑制免疫功能、变态反应、自体免疫以及其她得免疫功能异常亢进等,但本指导原则并未将试验药物特异性得免疫反应(药物变态反应与药物特异性得自体免疫)作为研究对象。(注１) 根据本指导原则,在符合表1得某一项时,必须进行免疫毒性试验。生物制品及应用生物技术得药品不列入本指导原则得对象。 ［指导原则得目得］ 为了有效地进行药物免疫毒性得检查及其性质得研究,必须根据预测得免疫毒性选择最适宜得试验方法与拟定实验方案。本指导原则得目得就是提供进行非
指导原则编号： 【Z】G P T 5-1 中药、天然药物免疫毒性（过敏性、光过敏反应） 研究的技术指导原则 二○○五年三月
目录 一、概述 (1) 二、基本内容 (2) （一）基本原则 (2) （二）过敏反应试验 (3) 1、试验中应考虑的问题 (3) 2、I型过敏反应试验 (4) 3、II、Ⅲ型过敏反应试验 (6) 4、Ⅳ型过敏反应试验 (6) （三）光过敏反应试验 (6) （四）结果分析及评价 (7) （五）常见问题及处理 (8) （六）不同剂型的中药、天然药物试验项目的选择 (10) 三、参考文献 (10) 四、附录 (11) （一）主动皮肤过敏试验 (11) （二）主动全身过敏试验 (13) （三）被动全身过敏试验 (15) （四）豚鼠最大化试验和Buehler试验 (16) （五）皮肤光过敏反应试验 (18) 五、著者 (20)
中药、天然药物免疫毒性（过敏性、光过敏反应） 研究的技术指导原则 一、概述 免疫毒理学是毒理学中一门重要的分支学科，其目的是探讨外源性化合物对机体（人和实验动物）免疫系统产生的不良影响及机理。免疫毒性是指外源性化合物对机体免疫系统的损伤作用，包括两类，一是免疫抑制，即免疫系统的广泛抑制，可致机体对感染的易感性增加及肿瘤发生率增高；另一是免疫增强，即免疫系统反应性过度增强，可能包括免疫性产生，过敏反应（超敏反应或变态反应）、自身免疫反应以及不良免疫刺激等。 过敏反应指变态反应，又称超敏反应，是指机体受同一抗原再次刺激后产生的一种异常或病理性免疫反应。按抗原与抗体或细胞反应的方式和补体是否参加等，将过敏反应分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四型。其中Ⅰ型过敏反应是了解得最多的一种过敏反应，目前采用的过敏试验方法多数是根据Ⅰ型过敏反应发病机制的不同环节而设计建立的。 光过敏反应为IV型过敏反应的特殊类型，是局部给药和全身给药后，分布在皮肤的药物中所含的感光物质与光线产生复合作用使得用药后皮肤对光线产生的不良反应。 中药、天然药物为一种外源性物质，也可能作为过敏原引发机体产生过敏反应。 由于免疫系统是增生活跃的系统，因此对外源性物质非常敏感，但每一种化学物质都有其特定的靶器官，因此不必盲目地对所有受试物进行免疫毒性监测，而是选择性地对某些受试物特别是以免疫系统为靶器官的毒
S8 人用药品注册技术要求国际协调会 ICH三方协调指导原则 人用药物免疫毒性研究 现行ICH进程第四阶段 2005年9月15日 本指导原则由相应的ICH专家小组，根据ICH程序制定，并经各国管理部门协商，已进入第四阶段，被推荐给欧盟、日本和美国管理部门采用。
ICH三方协调指导原则 本指导原则在2005.9.15举行的ICH指导委员会会议上已进入ICH原则制定的第四阶段，被 推荐给ICH三方管理部门采用。 目录 1. 前言 (3) 1.1 指导原则的目的 (3) 1.2 背景 (3) 1.3 指导原则的适用范围 (4) 1.4 概述 (4) 2. 指导原则 (5) 2.1 评价潜在免疫毒性时应考虑的因素 (5) 2.1.1 常规毒性研究 (5) 2.1.2 药理性质 (6) 2.1.3 目标用药人群 (6) 2.1.4 结构相似性 (6) 2.1.5 药物处置 (6) 2.1.6 在临床试验或临床使用中观察到的征象 (6) 2.2 循证分析 (7) 3. 附加免疫毒性研究的选择和设计 (7) 3.1 目的 (7) 3.2 试验的选择 (7) 3.3 研究设计 (8) 3.4 附加免疫毒性研究的评价和进一步的研究 (8) 4. 与临床研究有关的免疫毒性试验的时间安排 (8) 5. 参考文献 (9) 图1：推荐的免疫毒性评价的流程图 (10) 附录：免疫毒性评价方法 (11)
1. 前言 1.1 指导原则的目的 本指导原则的目的在于提供（1）关于鉴别化合物潜在免疫毒性的非临床试验方法的建议和（2）关于免疫毒性试验循证决策方法的指导原则。本指导原则中免疫毒性特指非预期的免疫抑制或免疫增强，不包括药物引起的超敏反应和自身免疫。 1.2 背景 对于人用药物对免疫系统潜在不良反应的评价应结合于规范的药物开发过程中。免疫系统毒性包括多种不良反应，这些不良反应主要包括免疫应答的抑制或增强。免疫应答抑制能够导致机体对感染因子或肿瘤细胞的抵抗力下降。免疫应答增强能够放大自身免疫性疾病或超敏反应。药物或药物-蛋白结合物也可能被机体识别为异物从而诱发抗药反应，其后的药物暴露能够导致超敏反应（变态反应）。过去，大量技术、方法的建立和确证工作致力于评价候选化合物潜在的免疫抑制和接触致敏作用。目前还没有标准的试验方法可以评价药物的呼吸或全身变态反应原性（抗原性），或药物特异性的自身免疫。目前没有任何地区要求检测上述指标。对于皮肤致敏试验方法也不存在区域性分歧。 免疫抑制或增强可能与以下两类药物相关： 1）对于以调节免疫功能（如抑制器官移植排斥反应）为治疗目的的药物，免疫抑制作用可能是其药效学作用的放大。 2）对于不以影响免疫功能为治疗目的的药物，其免疫毒性可能是因为引起免疫细胞的坏死或凋亡，或药物与靶组织和非靶免疫细胞共有的细胞受体反应。 抑制细胞增生的抗癌药物是一类可以引起非预期免疫抑制的药物。非临床研究中发现的毒性反应可以相当程度地预测此类药物的人体免疫毒性。也就是说，在此类药物的风险评价中可能并不需要通过特定的试验来确定免疫毒性，因为此
免疫毒性试验的指导原则（草案） 本指导原则是为了有助于药品安全性的正确评价，对申报药品审评时所做免疫毒性试验提供的标准实施方法。但是。对于所有的药品进行完全一样的免疫毒性试验，有时也不尽合理，重要的是：应根据对象药品的特性采用最适宜的试验方法。 [背景] 在清除细菌和病毒等外来病原体以及体内产生的癌细胞等，并维持生体正常的过程中，免疫系统起着重要的作用。免疫功能低下容易导致机会感染和产生肿瘤，这在免疫功能缺乏症和获得性免疫功能缺乏综合征（AIDS）的病例中是人们所熟知的。对免疫系统的有害作用（免疫毒性）与其他毒性不同，与其说是其直接对患者的生存带来威胁，不如说由外来病原体的侵袭和内在性癌细胞的发生时产生的免疫毒性更有害。 关于药品审评申报的非临床免疫毒性试验，虽然指出了其重要性，但是，构成免疫系统的细胞组织及其相互作用是复杂的，免疫功能的评价项目很多，除小鼠之外的试验动物，特别是毒性试验中通常使用的大鼠，其免疫功能试验方法的评价尚未充分进行，这些都是实情，而且免疫功能试验方法的设定较迟。然而，近十年间，包括国际性的共同研究，免疫毒性试验方法的评价取得了较大的进步，即便是使用大鼠进行的免疫毒性试验，也进入了堪称充分而实用的阶段。 在本指导原则中，利用具有免疫毒性的诸多化学物质在反复给药毒性试验时与免疫毒性有关的检查项目中出现异常的现象，其原则是，根据反复给药毒性试验的结果，在怀疑存在免疫毒性的场合下，进而再做免疫毒性试验。 免疫毒性包括抑制免疫功能、变态反应、自体免疫以及其他的免疫功能异常亢进等，但本指导原则并未将试验药物特异性的免疫反应（药物变态反应和药物特异性的自体免疫）作为研究对象。（注1）
第二节免疫毒理试验中常用的方法 为鉴定外来化合物对免疫系统的毒性，必须建立一系列灵敏、特异、简便、快速的检测方法，大多数免疫毒理学家认为，要建立一组实验方法来评价免疫毒性。 一、病理学常规检查 病理学检查对于评价外来化合物对免疫功能的影响十分有用。外来化合物接触实验动物后，对免疫系统的毒性作用可表现为淋巴器官重量或组织学的变化、淋巴组织及骨髓的细胞量或质的变化和外周血淋巴细胞数改变。因此为了观察化学物质对免疫功能的影响，首先可对免疫器官进行大体解剖观察，如果发现胸腺重量下降和胸腺发生萎缩，就应着重检查细胞免疫功能；有人观察到动物接触已烯雌酚、TCDD或环磷酰胺，胸腺重量与细胞免疫功能状况呈很好的正相关。 二、淋巴细胞增殖反应试验 淋巴细胞增殖反应试验是测定T细胞和B细胞功能活性的简便方法，重复性也较好。 检测方法有形态学方法、同位素掺入法和颜色反应法。颜色反应法测定活细胞及增殖细胞转化程度简单、快速，在对一定数量细胞测定时，具有与同位素掺入法同样的灵敏度，是一种常用的方法。 三、体液免疫功能检测 有许多方法可用来检测体液免疫功能，包括抗体滴度、抗体形成细胞（PFC）及B细胞受体试验等。 抗体形成细胞试验是一种敏感而且常用的方法。通常用的抗原有绵羊红细胞（SRBC）、牛血清白蛋白（BSA）、卵白蛋白（0valbumin）、脂多糖（LPS）等。 用琼脂单向扩散法测定人血清免疫球蛋白的含量，虽不很敏感，但却是很常用的方法。 四、细胞免疫功能检测 细胞免疫功能主要由T细胞完成，细胞免疫担负着迟发型变态反应、移植排斥、肿瘤免疫等。 用来测定细胞免疫功能的方法有体内法（迟发型变态反应、移植物抗宿主反应、皮肤移植排斥反应）和体外法（淋巴细胞增殖、T细胞毒性及淋巴因子的产生）。
指导原则编号： 【Z】G P T5-1 中药、天然药物免疫毒性（过敏性、光变态反应） 研究的技术指导原则 （第二稿） 二00四年三月十八日
目 录 [概述] (4) 一、 定义 (4) 二、 背景 (5) 三、 适应范围 (6) 四、 重点内容 (6) [基本内容] (6) 一、基本原则 (6) 二、过敏反应 (7) （一）试验中应考虑的问题 (7) （二）I型过敏反应 (7) 1．定义 (7) 2．主动皮肤过敏试验 (8) 3．主动全身过敏试验 (8) 4．被动皮肤过敏试验 (8) 5．抗体滴度检测 (9) （三）II、Ⅲ型过敏反应 (9) （四）Ⅳ型过敏反应 (10) 三、光变态反应 (10) （一）皮肤光变态反应试验 (11) （三）光变态反应试验中应考虑的问题 (11) 四、数据分析及评价 (12) 五、常见问题及处理 (13) 六、不同剂型的中药、天然药物的一般要求 (15) [参考文献] (16)
[附录] (17) 一、主动皮肤过敏试验 (17) 二、主动全身过敏试验 (19) 三、被动全身过敏试验 (20) 四、Ⅲ型过敏试验 (22) 五、Ⅳ型过敏试验 (22) （一） B uehler分析和豚鼠最大值法 (22) （二） 啮齿类局部淋巴结试验 (23) 六、皮肤光变态反应试验 (25) [起草说明] (26) [著者] (29)
中药、天然药物免疫毒性（过敏性、光变态反应） 研究的技术指导原则 [概述] 一、定义 免疫毒理学是毒理学中一门重要的分支学科，其目的是探讨外源性化合物对机体（人和实验动物）免疫系统产生的不良影响及机理。外源性化合物对机体免疫系统的损伤作用包括两类，一是免疫抑制，即免疫系统的广泛抑制，可致机体对感染的易感性增加及肿瘤发生率增高；另一是免疫增强，即免疫系统反应性过度增强，可能包括免疫性产生，超敏反应（变态反应）、自身免疫反应以及不良免疫刺激等。 过敏反应指变态反应，又称超敏反应，是指机体受同一抗原再次刺激后产生的一种异常或病理性免疫反应。按抗原与抗体或细胞反应的方式和补体是否参加等，将过敏反应分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四型。其中Ⅰ型过敏反应是了解得最多的一种过敏反应，目前采用的过敏试验方法多数是根据Ⅰ型过敏反应发病机制的不同环节而设计建立的。 光过敏反应为IV型过敏反应的特殊类型，是局部给药和全身给药后，分布在皮肤中的药物中所含的感光物质与光线产生复合作用使得用药后皮肤对光线产生的不良反应。 中药、天然药物为一种外源性物质，也可能作为过敏原引发机体产生过敏反应。 由于免疫系统是增生活跃的系统，因此对外源性物质非常敏感，但每一种化学物质都有其特定的靶器官，因此不必盲目地对所有受试物进行免疫毒性监测，而是选择性地对某些受试物特别是以免疫系统为靶器官的毒物进行研究。用于某些适应症的药物，因其作用机制的特殊性，对人体免疫系统可能产生影响；另外，当受试物是已知的免疫调节剂的情况，或在安全性评价过程中初步发现对免疫系统有明显