第四章SOCS2腺病毒载体的构建 1
腺病毒载体的构建
由第三章结果可知，基础状态下SOCS2在脂肪细胞中的表达水平较低，但是GH 可以诱导SOCS2稳定高表达。SOCS2高表达的同时，GH诱导的脂肪细胞分化因子和脂质代谢基因表达发生了变化。为了研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响，需要通过一种途径实现SOCS2在脂肪细胞中持续高表达。细胞导入外源基因是目前常用的方法，但是保证外源基因的高效表达需要合适的表达系统。目前常用的有质粒、逆转录病毒、蔓病毒、腺病毒等外源基因表达系统。质粒载体可以导入外源基因，但是质粒的转染效率很低，如何把目标基因导入靶细胞转录产物是质粒系统的最主要的问题。逆转录病毒可以把目标基因整合到靶细胞基因组永久表达，但是逆转录病毒只能感染增殖期的细胞。蔓病毒本身对脂肪细胞的感染率又比较低。而腺病毒滴度高，适合外源基因大量表达，并且可插入较大的目的片段，对细胞类型限制较小，可感染非分裂期的细胞(V orburger SA and Hunt KK 2002)。另外腺病毒载体系统中pAdEasy系统操作比较简单(Luo JY et al. 2007)。本章克隆SOCS2基因，采用pAdEasy系统构建pAd-SOCS2载体，为SOCS2在脂肪细胞中高效表达，研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响奠定基础。
4.1材料
4.1.1 样品、菌株、质粒及细胞株
脂肪组织取自6周龄昆白小鼠，小鼠购自第四军医大；E.coli DH5α菌株由本实验室保存；pAdTrack-CMV和pAdEasy-1质粒，E.coli BJ5183菌株由猪脂肪沉积与肌肉发育实验室赠送；人胚肾细胞株HEK293购于中国科学研究院上海细胞资源中心。
4.1.2 主要试剂
限制性内切酶BglⅡ、XhoⅠ和蛋白Marker购自Fermentas公司；内切酶PmeI和PacI购自NEB公司；pMD TM18-T克隆载体、碱性磷酸酶CIPA购自Takara公司；穿梭质粒小提试剂盒购自Omega公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Bioflux公司；λ/Hin dIII Marker购自天根公司；OptiMem优化培养液购自Gibico公司；脂质体Lipofectamine TM 2000购自Invitrogen公司。载体测序和引物合成均由南京金斯瑞生物公司完成，其余材料和试剂来源同3.1。
4.2 试验方法
4.2.1 SOCS2基因克隆
4.2.1.1组织中总RNA提取
根据Takara RNAiso Plus试剂说明提取组织中总RNA：
4.2.1.2 cDNA第一链合成
同3.2.6
提取的总RNA反转录为总cDNA，表3-1为反应体系和操作流程：
表3-1 cDNA第一链合成体系及操作过程
Table 3-1 RevertAid TM First Strand cDNA Sythesis system and operation protocol
反转录合成cDNA第一链
总RNA 1.5 μL
Primer：Oligo（dT）18 primer 1 μL
DEPC处理水9.5 μL
轻微震荡混匀，65℃孵育5min，冰上冷却2min；瞬时离心收集反应液，置于冰上，按顺序加入以下试剂：
5×反应缓冲液 4 μL
RiboLock TM 核糖核酸酶抑制剂（20 u/μL） 1 μL
10 Mm dNTPs混合物 2 μL
RevertAid TM M-MuLV反转录酶（200 u/μL） 1 μL
瞬时离心收集反应液，25℃孵育5min，42℃孵育60min；70℃ 5min终止反应，反应产物直接用于PCR或-20℃存放备用。
4.2.1.3 SOCS2基因编码区（CDS）的扩增
依照扩增CDS全长的引物设计原则，根据Genbank公布的SOCS2基因序列(NM_007706.3)，用Primer Premier5.0软件设计SOCS2扩增引物，表4-1中SOCS2-F和SOCS2-R为SOCS2基因的扩增引物。
表4-1 SOCS2 CDS区扩增引物
Table 4-1 Primers of SOCS2 CDS sequence
Primer names Primer sequence (5'-3')
SOCS2-F：CGTGTTGACTCATCTCCC
SOCS2-R CA TAGCTGCATTCGGAGA
SOCS2-F-BglⅡGCAGATCTATGACCCTGCGGTGCCTGG
SOCS2-R-Flag-XhoⅠGCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCT TGTAATCTACCTGGAA TTTA TATTCTT
4.2.1.4 SOCS2 CDS区的扩增体系和条件
用表4-1中的SOCS2-F和SOCS2-R引物，按照表4-2中的扩增体系和条件扩增SOCS2 CDS区。
第四章SOCS2腺病毒载体的构建 3
表4-2 SOCS2 CDS区的扩增体系和条件
Table4-2 PCR amplification system and
10×PCR 缓冲液 1.25 μL
dNTP Mixture（各2.5 mM） 2 μL
上、下游引物（10μM）各0.5 μL
cDNA 1.3 μL
ddH2O 7.45 μL
瞬时离心收集反应液，按一下条件进行反应：
预变性（95℃）5min
反应一：（20个循环）
变性（95℃）40s
退货（62℃，每个循环降0.5℃，共20循环）40s
延伸（72℃）50s
反应二：（20个循环）
变性（95℃）40s
退火（57℃）40s
延伸（72℃）50s
反应三：
延伸（72℃）8min
反应结束后，样品直接用于电泳检测，或暂时存放于4℃，-20℃可存放一周
4.2.1.6 SOCS2 CDS区的T载体克隆及鉴定
依照Takara pMD TM18-T 克隆载体操作说明，将胶回收的SOCS2CDS全长克隆至pMD TM18-T；
A. 克隆反应体系和操作步骤如下表，样品添加及试剂融解均在冰上操作；
pMD18-T（50 ng/μL） 1 μL
插入的目的片段（0.1-0.3 pmol） 3.5 μL
dH2O 0.5 μL
SolutionⅠ 5 μL
B. 瞬时离心，收集反应液。16℃孵育过夜(>12 h)；将连接产物10 μL加入到100 μL DH5α感态中，冰浴30 min；
C. 42℃热击45s，迅速冰浴1 min，此过程不可激烈晃动PCR管，否则影响转化效率；
D. 加入1 mL LB无抗性培养液，37℃、200 rpm震荡培养1 h；
E. 室温、4000 rpm离心5 min，收集菌体；吸弃900 μL培养液上清，用枪头吹打100 μL 余液，重悬菌体；
F. 无菌条件下，将100 μL菌液均匀的涂于含Amp的LB固体平板，37℃倒置培养；E. 培养约12 h，无菌条件下，挑取单菌落于含Amp的LB液体培养液中，37℃、250 rpm 震荡培养过夜，提取穿梭质粒进行PCR检测；阳性克隆送至金斯瑞公司测序。
4.2.2 DH5α感受态的制备(CaCl2)
无菌条件下，将冻存的DH5α划线接种于无抗性的LB固体平板上，37℃倒置、过夜培养，选取生长良好的单克隆接种于100 mL无抗性的LB液体培养液中，于37℃、250 rpm，震荡培养过夜(约16 h)；
A.从中吸取1 mL菌液接种于100 mL无抗性的新鲜培养液，37℃、250～300 rpm培养2～
3 h，从2 h开始不断对菌液测ODλ=600值，直至0.4≤ODλ=600≤0.6(0.45为最适OD值)；
B.以下步骤必须均需无菌冰上操作，0.1M CaCl2和含15～20%甘油的0.1M CaCl2需要预冷处理；
C.取30 mL菌液于50 mL离心管，冰上冷却10 min；
D.4℃ 4500 rpm离心5 min收集菌体；加3 mL 0.1M CaCl2溶液，枪头轻轻吹打，使菌体悬浮，冰上放置20 min；
E. 4℃ 4500 rpm离心5 min，收集菌体；加3 mL含15～20%甘油的0.1M CaCl2，枪头吹打混匀菌体；每100 μL分装一管，-80 ℃冻存。
4.2.3 质粒转化
A. -80℃冻存的感受态，冰上融化或室温融化后立即置于冰上；
B. 向100 μL感受态中加入连接产物(含量≤50 ng，体积≤10 μL)，摇匀，冰上静止30 min；
C. 42 ℃水浴热激90 s，或37℃水浴5 min，热击后迅速置于冰上，静止5 min；操作过程
不要有激烈摇动；
C.向离心管中加1 mL 无抗性LB培养基，混匀后，37℃ 250 rpm振荡培养1 h，细菌恢
复正常生长，抗性基因开始表达；
D.将上述菌液4000 rpm离心5 min，弃去1 mL上清，重悬菌体，菌液均匀涂于含相应
抗性的LB固体平板，放置30 min后，37℃倒置培养过夜。
4.2.4 质粒的小量提取
挑取最新筛选的含有穿梭质粒的单克隆于含有相应抗性的LB培养基中，37℃300 rpm激烈振荡培养12~16 h，获得的新鲜菌液依照Omega E.Z.N.A.质粒小量提取试剂盒的操作说明提取穿梭质粒，所有步骤均在室温下操作。
第四章SOCS2腺病毒载体的构建 5 4.2.5 重组穿梭穿梭质粒的构建
4.2.
5.1 SOCS2 CDS区的PCR扩增和回收
以pMDTM18-SOCS2穿梭质粒为模板，表4-1中SOCS2-F-BglⅡ和SOCS2-R-Flag-XhoⅠ分别为上游和下游引物，按表4-2中的反应体系和操作步骤扩增SOCS2，所用引物带有所需要的酶切位点(下划线部分)和Flag标签(斜体部分)。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行检测，切取含目的片段的胶块，按4.2.5步骤回收PCR产物，微量定量仪测定浓度待用。
4.2.
5.2 SOCS2基因和pAdTrack-CMV穿梭质粒的的双酶切及回收
以微量定量仪测定的浓度为参照，按下列体系对目的DNA进行BglⅡ和XhoⅠ的双酶切，穿梭质粒酶切体系：
10×Buffer 2 μL
pAdTrack-CMV(0.5～1 μg/μL) 6 μL
BglⅡ0.6 μL
XhoⅠ0.6 μL
dH2O 10.8 μL
SOCS2 PCR产物酶切体系：
10×Buffer 2 μL
SOCS211 μL
BglⅡ 1 μL
XhoⅠ 1 μL
dH2O 15 μL
瞬时离心收集反应液，37℃孵育5 h，产物进行1%琼脂糖电泳，将酶切的获得的目的条带切下，按4.2.5步骤回收双酶切的DNA，测定浓度备用。
4.2.
5.3 SOCS2基因与pAdTrack-CMV穿梭质粒片段的连接
将双酶切后回收产物的质量浓度计算转化为摩尔浓度，目的DNA和穿梭穿梭质粒DNA以10:1的摩尔比混合，T4连接酶连接，连接体系如下：
10×Buffer 2.5 μL
SOCS2 CDS(约0.3 pmol) 5.5 μL
CMV(约0.03 pmol) 0.7 μL
T4连接酶(350U/μL) 1 μL
dH2O 15.3 μL
瞬时离心收集反应液，16℃孵育过夜，取10 μL连接产物按4.2.3步骤将重组穿梭穿
梭质粒转化DH5α感受态，于含Kan(100 μg/mL)的固体LB平板，37℃倒置培养过夜。挑取生长良好的单克隆，于含15 mL Kan(100 μg/mL)的LB液体培养基，37℃摇菌过夜，培养液浑浊后，取800 μL菌液甘油(15～20%)冻存备用，其余用于穿梭质粒提取和后期检测。
4.2.
5.4重组穿梭质粒的菌落PCR鉴定
取10 μL单克隆摇菌获得的菌液，用无菌水稀释至100 μL，以0.5 μL稀释后的菌液为模板，用SOCS2 CDS区的扩增引物为检测引物，按照SOCS2 CDS的扩增参数和体系见表1，进行PCR扩增。产物用1%琼脂糖凝胶检测，凝胶成像观察，依照扩增片段的大小，对挑取的单克隆做初级筛选，以备后续参考。
4.2.
5.5 重组穿梭质粒的小量提取
选取初级筛选正确的单克隆菌液，取5 mL依照4.2.4步骤小量提取穿梭质粒。
4.2.
5.6 重组穿梭质粒的鉴定和测序
A.PCR鉴定: 用无菌水10倍稀释提取的重组穿梭质粒，取0.5 μL作为模板，用SOCS2
CDS区的扩增引物为检测引物，按照表4-1 SOCS2 CDS全长扩增的反应体系及参数进行PCR检测。取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶检测，依照扩增片段的大小鉴定SOCS2是否与重组质粒连接。鉴定正确的质粒用将酶切鉴定。
B.酶切鉴定：重组质粒PCR鉴定正确的质粒，进行BglⅡ和XhoⅠ双酶切鉴定，体系：
重组质粒(0.5～1 μg/μL) 5 μL
BglⅡ0.6 μL
Xho I 0.6 μL
10× Buffer 2 μL
H2O 11.8 μL
瞬时离心收集，37℃酶切5 h，酶切产物取5 μL，与2 μL上样缓冲液混匀，于1%琼脂糖进行电泳检测，依照Mark大小判断是否酶切出大片段pAdTrack-CMV，和小片段SOCS2。
C.选择PCR与酶切鉴定均正确的质粒，送南京金斯瑞公司测序，测序结果与GenBank
所公布的序列一致的，命为pAdTrack-CMV-SOCS2。
4.2.6 pAd-SOCS2的构建
4.2.6.1 E.coli BJ5183及含pAdEasy-1质粒的E.coli BJ5183感受态的制备
A.E.coli BJ5183感受态制备：将-80℃冻存的E.coli BJ5183菌株，划线于含链霉素(30～
50 μg/mL)的LB平板，37℃倒置培养12～16 h，如果菌液冻存时间过长，有必要进
行二次活化，即挑取单克隆二次划线，最终获得的单克隆摇菌培养，CaCl2法制备感受态，具体步骤见4.2.2.
B.含pAdEasy-1质粒的BJ5183感受态制备：依照4.2.3步骤将pAdEasy-1质粒转化于
第四章SOCS2腺病毒载体的构建7
BJ5183感受态，涂于含Amp(100 μg/mL)的LB平板，挑取单克隆于含Amp(100 μg/mL)的液体LB培养基，待菌液浑浊后，同样用CaCl2法获得含pAdEasy-1质粒的BJ5183感受态，步骤见4.2.2。
4.2.6.2 PmeⅠ酶切线性化pAdTrack-CMV-SOCS2 和CIAP去磷酸化
小量提取质粒法获得质粒pAdTrack-CMV-SOCS2，用PmeⅠ酶切线性化，体系如下：
SOCS2重组质粒（≤4μg）25 μL
100×BSA 1 μL
10×Buffer 10 μL
内切酶 2 μL
双蒸水62 μL
离心收集，37℃温浴8 h，CIAP处理PmeⅠ单酶切的质粒，使其去磷酸化防止自我环化，体系如下：
线性化质粒60 μL(1～20 pmol)
10× Buffer 10 μL
CIAP 4 μL
H2O 26 μL
A.酶切反应：37℃或50℃水浴30 min，
B.抽提1：加100 μL有机溶液混合物Ⅰ(苯酚：氯仿：异戊醇比例为25:24:1)，用手激
烈摇动，使溶液成为乳浊液，12,000 rmp离心6 min，取上清液；重复此步骤一次；
C.抽提2：加等体积(约100 μL)的有机混合物Ⅱ(氯仿：异戊醇比例为24:1)，摇动成乳
浊液，离心后取上清；
D.乙醇沉淀：加10 μL即上清1/10体积的NaOAC(3M)，250 μL即上清2.5倍体积的-20℃
预冷乙醇，-20℃冷浴1 h；
E.收集和洗涤沉淀：12000 rpm离心12 min；加200 μL冷乙醇(70%)洗涤沉淀，12000 rpm
离心6 min；
F.干燥、溶解核酸：将离心管倒置于滤纸，待管内酒精挥发后，用30 μL无菌双蒸水
溶解沉淀，冻存备用。
4.2.6.3 线性化的重组质粒与骨架质粒重组
取一管-80冻存的BJ5183感受态，室温溶化后迅速置于冰上，加10 μL线性化的质粒到感受态细胞中，冰上静止30 min，热击法将线性化质粒转化如BJ5183与骨架质粒pAdEasy-1进行重组，详细步骤见4.2.3。转化产物涂于含Kan(100 μg/mL)的LB平板，37℃培养约20 h。
4.2.6.4 重组质粒的筛选和初级鉴定
重组质粒筛选：生长20 h的平板上可以观察到大小不一的菌落，挑取较小的菌落接种于15mL含Kan(100 μg/mL)的液体培养基，37℃振荡培养，菌液浑浊后，取800 μL菌液加200 μL 80%甘油-80℃冻存，其余菌液用作后续鉴定。重组质粒的初级鉴定即菌液PCR，步骤同4.2.6.4。
4.2.6.5 重组质粒的小量提取
取 5 mL初级筛选正确的菌液，依照小量提取质粒的方法提取质粒，具体步骤见4.2.4。获得的质粒微量定量仪测定浓度，以备后续使用。
4.2.6.6重组质粒的鉴定和测序
A.质粒PCR鉴定：同4.2.5.6A。
B.PacI酶切鉴定：Pac I酶切小量提取的重组质粒，酶切反应体系如下：
10× BufferⅠ 1 μL
重组质粒DNA(≤1 μg) 6.5 μL
100×BSA 0.2 μL
Pac I酶0.5 μL
H2O 11.8 μL
离心收集反应液，37℃酶切5 h后，65℃孵育20 min，使酶失活；取4 μL酶切产物，加2 μL 上样缓冲液，0.8%含EB琼脂糖凝胶进行检测，100 V 电泳1 h后凝胶成像观察，以空穿梭质粒以骨架质粒的重组质粒为对照。
C. 测序：上述鉴定均正确的质粒，送南京金斯瑞公司测序，与GenBank比对后，把测序正确的质粒命名为pAd-SOCS2。
4.2.7 大量pAd-SOCS2的获得和PacⅠ酶切线性化
BJ5183中的质粒提取率较低，所以将pAd-SOCS2转化DH5α，步骤详见4.2.3。从Kan(100 μg/mL)平板上挑取单克隆，于含Kan(100 μg/mL)的100 mL LB液体培养基中37℃ 250 rpm摇菌。待培养基浑浊后，取800 μL菌液加200 μL 80%甘油冻存，其余菌液全部依照步骤4.2.4提取质粒pAd-SOCS2，再用PacⅠ酶大量酶切重组质粒，体系如下：10× BufferⅠ15 μL
pAd-SOCS275 μL
100×BSA 1.5 μL
Pac I(10,000U/mL) 3 μL
dH2O 55.5 μL
37℃孵育8h，以下步骤同4.2.6.2B-F。
4.2.8 pAd-SOCS2的包装、扩繁和滴度测定
第四章SOCS2腺病毒载体的构建9
4.2.8.1 细胞株HEK293的复苏与培养
A.取液氮冻存的HEK 293，迅速于37℃中水浴解冻，期间不断晃动使离心管内溶液尽
量受热均匀；
B.解冻细胞迅速加到7 mL 含10%胎牛血清的DMEM培养液中，7 mL需要提前预热
至37℃，枪头轻轻吹打，无细胞团存在，1300 rpm 离心6 min，弃去上清；
C.向离心管中加2 mL 提前预热到37℃的含10%胎牛血清的DMEM培养液，吹打细胞
使其悬浮，按照5×104将细胞接种于培养皿，于恒温37 ℃的5 % CO2培养箱培养；
D.24 h 换液；以后每隔2 d换液一次；细胞密度达90%时传代。
4.2.8.2 pAd-SOCS2包装
转染前一天，按照每孔4×105个HEK 293细胞接种到6孔板，培养24 h后细胞约有70%融合，转染前4 h，用无双抗PBS清洗2次细胞，将含血清的培养液换为无双抗无血清的优化培养液Opti-MEMI(2 mL/孔)；Lipofectamine TM2000作为转染试剂将pAd-SOCS2转染至HEK293细胞，具体步骤依照说明书进行(所有试剂均为一个孔的试剂用量)：
A.用Opti-MEMI优化培养液将4 μg质粒稀释至250 μL，室温孵育；
B.同样用Opti-MEMI优化培养液将10 μL Lipofectamine TM2000稀释至250 μL，室温孵
育5 min；前两步操作不得超过25 min；
C.将孵育的质粒和Lipofectamine TM2000混匀，总体积为500 μL，整个过程尽量轻柔，
混合溶液室温孵育20 min；
D.将500 μL混合液加到培养板的一个孔中，轻轻晃动培养板混匀培养液；
E.37℃ 5 % CO2培养箱培养，6 h后将培养液换为含10%胎牛血清的DMEM培养液；
其中6孔板的4个空按上述步骤进行包装，另外两个孔一个为脂质体对照，一个为空白对照。
F.转染24 h后可在荧光显微镜下观察，记录细胞内的绿色荧光蛋白GFP的表达，观察
细胞病变(Cytopathic effect, CPE)情况。转染8～10 d后形成一般会有蚀斑出现，此时可将细胞刮下，将细胞收集在冻存管中，于-196℃(液氮中)和37 ℃反复冻融5次，12000 rpm离心5 min，收集的上清液即为病毒原液，直接用于后续细胞感染或于-80 ℃保存，将病毒液命名为Ad-SOCS2。
4.2.8.3 Ad-SOCS2的扩繁
60mm培养皿培养细胞，待细胞融合至90%时，将培养皿中的培养液换为新鲜的10% FBS DMEM培养液，将300 μL病毒原液加到培养皿中，轻轻晃动培养皿，加培养24 h 后观察细胞形态和荧光蛋白表达，待细胞病变后收取细胞，1500 rpm离心6 min收集细胞，加病毒保存液，于-196℃和37 ℃反复冻融五次，离心去除细胞碎片，根据所需病毒量，继续扩繁病毒或进行病毒滴度测定。
4.2.8.4 Ad-SOCS2滴度测定
按每孔2×104个细胞的密度接种HEK293于96孔板中，采用TCID50法和Karbers 法测定并计算Ad-SOCS2的病毒滴度。将以倍比(10-1~10-10)稀释的病毒液感染细胞，每孔加100 μL病毒稀释液，培养9~10d统计细胞的CEP病变。依照Karbers公式即：T=10×101+d (s–0.5) TCID50 /mL计算病毒得滴度；其中s 是阳性比率之和，也就是所用个稀释度之和。d = log10稀释度= 1 (这是对于10倍的稀释度而言)；并且根据公式：T = 1×10X TCID50 /mL = 1×10X – 0.7 PFU/mL，可将病毒滴度换为PFU/mL单位。
4.2.9 数据统计及分析
试验所得数据用SPSS 13.0统计软件中的One-way ANOV A进行方差分析和显著性检验，数据采用平均值 标准差即Means±SD的形式表示。
4.3结果与分析
4.3.1 SOCS2的克隆
提取小鼠皮下脂肪组织的总RNA，反转录获得总cDNA。用表4-1中的SOCS2-F 和SOCS2-R引物进行PCR扩增，获得大小约为700 bp的片段(如图4-1A)。凝胶回收试纯化纯化扩增片段(如图4-1B)，T-A克隆至p-MD18载体，获得重组质粒p-MD18-SOCS2，将重组质粒送金斯特生物公司测序，测序结果与GenBank中的NM_007706.3序列进行比对，同源性为100%。
图4-1 SOCS2基因PCR及胶回收产物的凝胶电泳分析
A.SOCS2基因的PCR产物；
B. SOCS2基因的胶回收产物。
Fig.4-1 SOCS2 genes electrophoresis analysis of PCR product and gel recovery product .
A. PCR product of SOCS2 genes;
B. Gel recovery product of SOCS2 genes.
4.3.2 pAd-CMV-SOCS2重组质粒的构建
4.3.2.1 SOCS2 基因的扩增及双酶切
质粒小提法提取p-MD18-SOCS2重组质粒(图4-2)，并于p-MD18-SOCS2为模板，用表4-1中带有酶切位点的SOCS2-F-BglⅡ和SOCS2-R-XhoⅠ引物扩增，琼脂糖凝胶检测可见一条大小约为650 bp的片段(图4-3A)，回收扩增产物并用BglⅡ和XhoⅠ进行双酶切，将双酶切产物纯化，琼脂糖凝胶检测同样可见大小约650 bp的条带(图4-3B)。
第四章 SOCS2腺病毒载体的构建
11
图4-2 p-MD18-SOCS2重组质粒及SOCS2 PCR 产物的凝胶分析及双酶切
（Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ）回收产物的鉴定
A. SOCS2基因的PCR 产物；
B. SOCS2基因的Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ双酶切产物。 Fig.4-3 The plasmid of p-MD18-SOCS2 and SOCS2 genes electrophoresis analysis of PCR product and gel
recovery product by restrictive digestion of Bgl Ⅱand Xho Ⅰ
A. PCR product with Bgl Ⅱand Xho Ⅰrestriction digestion site; B Gel recovery product of SOCS2 by double
digestion of Bgl Ⅱand Xho Ⅰ
4.3.2.2 pAdTrack-CMV 质粒的提取和双酶切回收
图4-3 pAdTrack-CMV 质粒及其双酶切（Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ）回收产物的凝胶分析
A. pAdTrack-CMV 质粒；
B. Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ双酶切pAdTrack-CMV 质粒产物
Fig.4-3 Electrophoresis analysis of plasmid pAdTrack-CMV and gel recovery product by restrictive
digestion of Bgl Ⅱand Xho Ⅰ
A. Plasmid pAdTrack-CMV;
B. Gel recovery product of Plasmid pAdTrack-CMV by double digestion of
Bgl Ⅱand Xho Ⅰ
质粒小提法提取pAdTrack-CMV 质粒，用Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ双酶切质粒pAdTrack-CMV ，1%琼脂糖电泳检测胶回收的酶切产物，可见一条大小约9200 bp 的片段(图4-4)。
4.3.2.3 pAdTrack-CMV-SOCS2重组质粒的筛选和鉴定
T4连接酶连接pAdTrack-CMV 和SOCS2基因的双酶切产物，CaCl 2法将连接产物转化入DH5α感受态细胞，LB 平板37℃倒置培养12 h ，观察并挑取生长良好的单克隆(如图4-5)。
图4-4 pAdTrack-CMV-SOCS2重组质粒的筛选
图4-4 Selection of recombinant plasmid pAdTrack-CMV-SOCS2
— 9416— — 6554— 1 2 3 4 M M 1 2 A. B.
—23130—
质粒小提法提取pAdTrack-CMV-SOCS2重组质粒，PCR鉴定得到的条带大小约为650 bp，与图4-3A一致(图4-6A)。重组质粒进行BglⅡ和XhoⅠ双酶切鉴定，凝胶电泳检测可见一条约9kb的大片段，为酶切开的pAdTrack-CMV质粒，和一条约650 bp的小片段即SOCS2基因片段(图4-6B)，结果与预期一致。选取3～5个酶切鉴定正确的质粒送金斯瑞生物公司测序，测序结果与GenBank中的NM_007706.3序列进行比对，同
源性为100%。
图4-6 pAdTrack-CMV-SOCS2重组质粒的鉴定
A. pAdTrack-CMV-SOCS2的PCR鉴定；
B. pAdTrack-CMV-SOCS2 的双酶切鉴定（BglⅡ和XhoⅠ）
Fig.4-3 Identification of recombinant plasmid pAdTrack-CMV-SOCS2
A. PCR product analysis of pAdTrack-CMV-SOCS2;
B. Gel analysis of pAdTrack-CMV-SOCS2 restrictive
digestion by BglⅡand XhoⅠ.
4.3.3重组质粒pAd-SOCS2的筛选和鉴定
用Pme I酶切测序真确的pAdTrack-CMV-SOCS2重组质粒，并用CaCl2法将线性化的pAdTrack-CMV-SOCS2质粒转化入BJ5183感受态细胞，BJ5183含有穿梭质粒和重组所需要的酶，37℃倒置培养20 h，观察并挑取生长良好的单克隆(如图4-7)。
图4-5 pAd -SOCS2的筛选
图4-5 Selection of pAd-SOCS2
质粒小提法提取pAd-SOCS2质粒(如图4-8A)，PCR扩增得到大小约为650 bp的片段(如图4-8B)，PacⅠ酶切重组质粒游离出一条4.5 kD的片段(如图4-8C)，与预期结果一致。鉴定正确的质粒测序，测序结果与Genbank公布序列(No. NM_007706.3) 100%同源，pAd-SOCS2质粒构建成功，测序与比对结果见附录1。
第四章SOCS2腺病毒载体的构建
13
图4-6 pAd-SOCS2质粒及鉴定
A. pAd-SOCS2质粒；
B. pAd-SOCS2的PCR鉴定；
C. pAd-SOCS2的PacⅠ酶切鉴定
Fig. 4-6 Plasmid of pAd-SOCS2 and identification of pAd-SOCS2
A. pAd-SOCS2 plasmid; B . PCR product analysis of pAd-SOCS2; C. Identification of pAd-SOCS2 by
PacⅠ restrictive digestion
4.3.4 pAd-SOCS2的包装
pAd-SOCS3质粒转染HEK293细胞，24 h后可观察到绿色荧光蛋白的表达(图4-8A)，转染3d细胞中的荧光增强，数量增加(图4-8C)。转染6d部分细胞出现明显的肿胀、变圆、等病变现象即CPE现象，转染7天由于部分细胞病变释放病毒感染周围细胞，可观察到荧光成束存在(图4-8D)，转染10天大部分细胞出现病变(图4-7)。
图4-8 重组腺病毒pAd-SOCS2的包装(×100)
A-F：转染pAd-SOCS2的HEK 293细胞
Fig.4-8. Adenovirus packaging of pAd-SOCS2
A-F: HEK 293 cells transfected by pAd-SOCS2.
4.3.5 Ad-SOCS2的扩繁与滴度测定
A.
F.
E.
D.
C.
B.
HEK293细胞铺满90%时，用包装的病毒原液Ad-SOCS2感染细胞。24 h 后观察细胞内GFP 表达，3-4d 细胞出现明显病变时，收取细胞，-196℃(液氮)和37℃反复冻融5次，离心收集上清液继续感染HEK293细胞，重复3次。随着扩繁次数增多，病毒滴度增大，细胞出现病变的时间缩短。最后用TCID 50法测定扩繁病毒液的滴度，达到1×1010 PFU/mL 。
图4-9 Ad-SOCS2扩繁图片
A. 第一次扩繁(×100)；
B.第三次扩繁(×40)；
C.细胞病变图片(×100)；
Fig.4-9 Amplification of Ad-SOCS2
A: The first amplification; B: The third amplification; C.CPE of cell. 4.4讨论
在无细胞因子或激素诱导刺激的细胞中，SOCS 蛋白以较低的水平存在。为进一步研究SOCS2对GH 信号通路的调控作用，我们选择构建SOCS2腺病毒载体。与其他载体相比，腺病毒载体对宿主毒性小，适合外源基因大量表达，并且可插入较大的目的片段，对细胞类型限制较小，可感染非分裂期的细胞(V orburger SA and Hunt KK 2002)。另外腺病毒载体pAdEasy 系统操作比较简单(Luo JY et al. 2007)，并且容易获得高纯度的病毒液。
设计SOCS2 CDS 区扩增引物时，我们在下游引物加入了Flag 标签。Flag 标签由8个亲水氨基酸组成，不占据融合蛋白表位，也不影响蛋白结构域形成，定位于融合蛋白的表面，容易与抗体结合，广泛应用于WB 、免疫荧光、免疫组化、流式细胞等检测。由于标签序列的设计，上下游引物的碱基数目和Tm 值差异较大，为有效扩增目的基因，我们选择Touch-down PCR 反应程序，成功获得了目的序列。
为全面了解SOCS2对GH 调控脂质代谢的影响，我们选择从个体和细胞两个水平超表达SOCS2。但是腺病毒个体注射要求在很短的时间内，注入实验动物体内的液体量相当于体液循环量，这种注射方法必然引起大型动物的心力衰竭。小鼠个体较小，相对更容易成功。并且不同物种的SOCS2序列同源性很高，小鼠和猪的SOCS2核算序列同源性达91%，氨基酸序列同源性达94%。基于以上考虑，我们扩增鼠SOCS2 CDS 区，构建了鼠SOCS2基因的重组腺病毒载体。
A. C.
B.
第四章SOCS2腺病毒载体的构建15
腺病毒骨架质粒和穿梭质粒同源重组有两种方式，一、制备BJ5183感受态，pAdEasy 和pAdTrack-CMV-SOCS2共转化BJ5183感受态；二、先将含有pAdEasy质粒的BJ5183菌株制备成感受态，pAdTrack-CMV-SOCS2转化BJ5183感受态获得重组质粒。这两种同源重组的方法我们都使用过，均能获得重组同源重组质粒pAd-SOCS2。值得注意的是BJ5183中质粒拷贝数较低，若要大量获得pAdEasy或pAd-SOCS2质粒，首先将少量提取质粒转化DH5α，再进行菌液的大量扩繁和质粒的大量提取。
另外，重组质粒包装对细胞密度要求比较严格，细胞融合60%-70%时转染效率较高。细胞密度过低，脂质体毒性相对过大；密度过大则转染效率就会降低，所以把握细胞密度，对重组质粒转染非常关键。
腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10
5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒 Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对 BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNA cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯 DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时 ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟 MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量 TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型 X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 第一章简介 当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广
体外连接法快速高效构建表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒载体 作者：王家宁, 王传成郭凌郧, 黄永章 [摘要] 目的: 采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ，为构建具有治疗价值的重组腺病毒载体奠定基础。方法: PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒，回收4.6 kb 的LacZ基因表达盒，与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接，连接产物用SwaⅠ酶切，最终产物转化DH5α。重组质粒用PCR法和PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切鉴定。pAdeno-X-LacZ用PacⅠ线性化后，用脂质体介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒，采用CsCl 密度梯度离心法纯化重组腺病毒Adeno-X-LacZ。采用X-gal染色观察Adeno-X-LacZ在AD293细胞内包装和HVSMC表达情况。结果: PCR扩增可见312 bp特异性条带，PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切重组质粒后释放出4.6 kb LacZ基因表达盒。X-gal染色证实了在AD293细胞内成功扩增包装出重组腺病毒Adeno-X-LacZ和LacZ基因在HVSMC中得到有效表达。结论: 体外连接法是一种快速、简便、高效的构建重组腺病毒质粒的方法，本研究为构建具有治疗价值的重组腺病毒奠定了基础，Adeno-X-LacZ为研究腺病毒介导的基因转移提供了一良好的对照载体。 [关键词] 体外连接;腺病毒;β－半乳糖苷酶;PI-SceⅠ;I-CeuⅠ Abstract: Objective To construct recombinant adenoviral v ector expressing β-galactosidase by in vitro ligation and provide a basis for construction of recombinant adenovirus vector expressing therapeutic gene of interest.Methods pShuttle2-LacZ was digested with PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰand 4.6 Kb fragment of LacZ gene expression cassette was recovered .This fragment was ligated to predigested Adeno-X viral DNA with PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ. The ligated product was digested with Swa Ⅰ.The resultant DNA was transformed into E. Coli. DH5α.The correct recombinant plasmid, pAdeno-X-LacZ ,was identified by PCR and PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰdigestion. The Pac I-digested, linearized pAdeno-X-LacZ was transfected into AD293 cells by Lipofectamine. Recombinant adenovirus , Adeno-X-LacZ, was purified with CsCl density gradient ultracentrifugation. HVSMC was infected with Adeno-X-LacZ. X-gal staining was performed to monitor the expression of β-galactosidase gene. Results There was a specific band of 312bp when pAdeno-X-LacZ was amplified by PCR. PI-SceⅠ/I-CeuⅠdigestion of pAdeno-X-LacZ released 4.6Kb of LacZ gene fragment. X-gal staining confirmed Adeno-X-LacZ was packaged successfully within AD293 cells and the expression of β-galactosidase gene in HVSMC. Conclusion In vitro ligation is a simple, rapid and efficient method for constructing recombinant adenoviral vector. This study provides a basis for construction of recombinant adenoviral vector carrying therapeutic gene of interest, Adeno-X-LacZ is also a useful control vector for the research of gene transfer mediated by recombinant adenovirus. K ey words: In vitro ligation; Adenovirus; β-galactosidase; PI-Sce Ⅰ; I-Ceu Ⅰ
合同编号：YT-FS-4484-56 腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书 (完整版) Clarify Each Clause Under The Cooperation Framework, And Formulate It According To The Agreement Reached By The Parties Through Consensus, Which Is Legally Binding On The Parties. 互惠互利共同繁荣 Mutual Benefit And Common Prosperity
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书(完整版) 备注：该合同书文本主要阐明合作框架下每个条款，并根据当事人一致协商达成协议，同时也明确各方的权利和义务，对当事人具有法律约束力而制定。文档可根据实际情况进行修改和使用。 服务方（甲方）：_____ 地址：______ 邮编：______ 电话：______ 传真：______ e-mail：_____ 开户银行：_____ 帐号：______ 委托方（乙方）：_____ 地址：______ 邮编：______ 电话：______ 传真：______
甲乙双方根据《中华人民共和国合同法》等法律法规，在平等互利的原则下，经协商一致，订立本合同，以兹双方共同遵照执行。 第一条病毒名称 甲方接受乙方的委托，为其载体构建、重组、扩增和纯化_____腺病毒，腺病毒滴度_____pfu/ml。 第二条费用及价格（人民币） 1．病毒的载体构建、重组、扩增和纯化所需的原料由甲方自行购买； 2．合同总价_____元，（大写）_____。 第三条乙方责任 1．乙方所购买的甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品将只供乙方或乙方所能控制的实验组中进行实验研究，在任何情况下决不用于人类，决不用于以谋利（直接或间接）为目的的生物制药以及临床分析等方面。 2．未征得甲方授权或同意，乙方不能以任何名义将购买的腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品转移、
腺病毒中文操作手 册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10
5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清
重组腺病毒构建的标准操作规程（编号：048） 1、目的及适用范围 该SOP用于规范真核细胞表达重组蛋白的操作。 2、主要仪器及试剂 电转仪、Adeasy-1系统（穿梭载体pshuttle-cmv,pAdtrack-CMV）、骨架病毒（pAdeasy-1）、重组菌（BJ5183感受态）、包装细胞（293A）、Taq酶。限制性内切酶、碱裂解法提取质粒溶液I、II、III、酚、氯仿 3、操作步骤 3.1目的基因的克隆：引物设计时要GOI中有没有Pme I/EcoRI和PacI酶切位点。 3.1.1通过限制酶切分析/PCR/基因测序确认GOI克隆到穿梭载体，翻译方向跟启动子方向相同。 3.1.2如果采用pShuttle 或pAdTrack，必须提供启动子和多聚腺苷酸信号。所有的穿梭载体必须包括一个Kozak 信号序列。 3.1.3因为在转化和转染前，用Pme I/EcoRI和PacI酶，所以要避免GOI中有这些酶的酶切位点。如果有PacI酶酶切位点，建议通过点突变除去。 3.1.4如果表达多个基因，避免头对头的方向，采用头尾相接的方式。 3.1.5建议在穿梭载体中，通过瞬时转染检测GOI的表达。 3.2制备电转 BJ5183 感受态细胞：BJ5183为链霉素抗性，固体和液体LB加终浓度为30μg/mL 的链霉素培养。划线培养、挑单菌落摇床培养，转接到200-300mL液体培养基中，37℃摇床培养至A550约0.8，转移到无菌离心管中冰浴10～30min，4℃3000rpm离心10min，用50mL灭菌的超纯水配制的10%甘油重悬,重复两次离心重悬，4℃3000rpm离心10min，用10mLWB重悬，4℃3000rpm离心10min最后用0.5mL重悬。分装20μL/管，-80℃冻存。 3.3用卡那抗性培养基培养2mL含有GOI穿梭质粒的细菌培养过夜。提取质粒DNA。推荐使用碱裂解法提取质粒，保证穿梭质粒的完整性可以提高在BJ5183细菌中重组的效率。 3.4 用Pme I或EcoRI线性化穿梭质粒：必须保证酶切完全。0.1μg-0.5μgDNA用300U的酶100μL 体系。电泳检测酶切是否完全。 3.5乙醇沉淀法回收纯化线性化的穿梭载体。 3.6 冰上操作：向20μLBJ5183感受态细胞中加入pAdeasy-1腺病毒骨架质粒和线性化的穿梭质粒，混匀，总体积不超过30μL。 3.7 将感受态和DNA混合物转移到用冰预冷的电转杯中，电击转化。电击完成后加入预热的LB 101
pAAV--‐CMV--‐iRFP 编号 载体名称 北京华越洋VECT10016 pAAV--‐CMV--‐iRFP pAAV--‐CMV--‐iRFP载体基本信息 载体名称: pAAV--‐CMV--‐iRFP 质粒类型: 腺病毒载体；荧光蛋白报告载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: CMV 载体大小: 5603 b p 5' 测序引物及序列: pCAX--‐F (CAGCTCCTGGGCAACGTGC) 3' 测序引物及序列: C--‐CMV--‐24 (TATTAGGACAAGGCTGGTGGGCAC) 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 红外荧光蛋白iRFP 克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble 宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系 备注: --‐--‐ 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 腺病毒 pAAV--‐CMV--‐iRFP载体质粒图谱和多克隆位点信息
pAAV--‐CMV--‐iRFP载体序列: ORIGIN 1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCGTCG G GCGACCTTT 61 G GTCGCCCGG C CTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT G CGGCCGCAC G CGTGGAGCT A GTTATTAAT A GTAATCAAT T ACGGGGTCA 181 T TAGTTCATA G CCCATATAT G GAGTTCCGC G TTACATAAC T TACGGTAAA T GGCCCGCCT 241 G GCTGACCGC C CAACGACCC C CGCCCATTG A CGTCAATAA T GACGTATGT T CCCATAGTA 301 A CGTCAATAG G GACTTTCCA T TGACGTCAA T GGGTGGAGT A TTTACGGTA A ACTGCCCAC 361 T TGGCAGTAC A TCAAGTGTA T CATATGCCA A GTACGCCCC C TATTGACGT C AATGACGGT 421 A AATGGCCCG C CTGGCATTA T GCCCAGTAC A TGACCTTAT G GGACTTTCC T ACTTGGCAG 481 T ACATCTACG T ATTAGTCAT C GCTATTACC A TGGTGATGC G GTTTTGGCA G TACATCAAT 541 G GGCGTGGAT A GCGGTTTGA C TCACGGGGA T TTCCAAGTC T CCACCCCAT T GACGTCAAT 601 G GGAGTTTGT T TTGCACCAA A ATCAACGGG A CTTTCCAAA A TGTCGTAAC A ACTCCGCCC 661 C ATTGACGCA A ATGGGCGGT A GGCGTGTAC G GTGGGAGGT C TATATAAGC A GAGCTCGTT 721 T AGTGAACCG T CAGATCGCC T GGAGACGCC A TCCACGCTG T TTTGACCTC C ATAGAAGAC 781 A CCGGGACCG A TCCAGCCTC C GCGGATTCG A ATCCCGGCC G GGAACGGTG C ATTGGAACG 841 C GGATTCCCC G TGCCAAGAG T GACGTAAGT A CCGCCTATA G AGTCTATAG G CCCACAAAA 901 A ATGCTTTCT T CTTTTAATA T ACTTTTTTG T TTATCTTAT T TCTAATACT T TCCCTAATC 961 T CTTTCTTTC A GGGCAATAA T GATACAATG T ATCATGCCT C TTTGCACCA T TCTAAAGAA 1021 T AACAGTGAT A ATTTCTGGG T TAAGGCAAT A GCAATATTT C TGCATATAA A TATTTCTGC 1081 A TATAAATTG T AACTGATGT A AGAGGTTTC A TATTGCTAA T AGCAGCTAC A ATCCAGCTA 1141 C CATTCTGCT T TTATTTTAT G GTTGGGATA A GGCTGGATT A TTCTGAGTC C AAGCTAGGC 1201 C CTTTTGCTA A TCATGTTCA T ACCTCTTAT C TTCCTCCCA C AGCTCCTGG G CAACGTGCT 1261 G GTCTGTGTG C TGGCCCATC A CTTTGGCAA A GAATTGGGA T TCGAACATC G ATTGAATTC 1321 C CCGGGGATC T GCCGCCACC A TGGCGGAAG G ATCCGTCGC C AGGCAGCCT G ACCTCTTGA 1381 C CTGCGACGA T GAGCCGATC C ATATCCCCG G TGCCATCCA A CCGCATGGA C TGCTGCTCG 1441 C CCTCGCCGC C GACATGACG A TCGTTGCCG G CAGCGACAA C CTTCCCGAA C TCACCGGAC 1501 T GGCGATCGG C GCCCTGATC G GCCGCTCTG C GGCCGATGT C TTCGACTCG G AGACGCACA 1561 A CCGTCTGAC G ATCGCCTTG G CCGAGCCCG G GGCGGCCGT C GGAGCACCG A TCACTGTCG 1621 G CTtCACGAT G CGAAAGgAC G CAGGCTTCA T CGGCTCCTG G CATCGCCAT G ATCAGCTCA 1681 T CTtccTCGA G CTCGAGCCT C CCCAGCGGG A CGTCgccga g ccgcaggcg t tcttccgcc 1741 g caCCAACAG C GCCATCCGC C GCCTGCAGG C CGCCGAAAC C TTGGAAAGC G CCTGCGCCG 1801 C CGCGGCGCA A GAGGTGCGG A AGATTACCG G CTTCGATCG G GTGATGATC T ATCGCTTCG 1861 C CTCCGACTT C AGCGGCGAA G TGATCGCAG A GGATCGGTG C GCCGAGGTC G AGTCAAAAC 1921 T AGGCCTGCA C TATCCTGCC T CAACCGTGC C GGCGCAGGC C CGTCGGCTC T ATACCATCA 1981 A CCCGGTACG G ATCATTCCC G ATATCAATT A TCGGCCGGT G CCGGTCACC C CAGACCTCA 2041 A TCCGGTCAC C GGGCGGCCG A TTGATCTTA G CTTCGCCAT C CTGCGCAGC G TCTCGCCCG 2101 T CCATCTGGA A TTCATGCGC A ACATAGGCA T GCACGGCAC G ATGTCGATC T CGATTTTGC 2161 G CGGCGAGCG A CTGTGGGGA T TGATCGTTT G CCATCACCG A ACGCCGTAC T ACGTCGATC 2221 T CGATGGCCG C CAAGCCTGC G AGCTAGTCG C CCAGGTTCT G GCCTGGCAG A TCGGCGTGA 2281 T GGAAGAGTG A GTCGACGCG G CCGCTCGAG C CTAAGCTTG C CTCGAGCAG C GCTGCTCGA 2341 G AGATCTACG G GTGGCATCC C TGTGACCCC T CCCCAGTGC C TCTCCTGGC C CTGGAAGTT
什么是腺病毒载体疫苗 腺病毒载体疫苗是指以腺病毒作为载体，将保护性抗原基因重组到腺病毒基因组中，使用能表达保护性抗原基因的重组腺病毒制成的疫苗。 腺病毒载体疫苗特点 研究发现，携带各种抗原的腺病毒载体能刺激机体产生很强的体液免疫或细胞免疫。此外，由于腺病毒载体能感染呼吸道和肠道细胞，可以方便地通过黏膜进行免疫，并能诱导机体产生黏膜和系统免疫应答。 腺病毒载体疫苗的临床研究 1、腺病毒载体诱导的天然免疫反应 腺病毒载体本身的病原相关分子模式与细胞表面模式识别受体结合，促进炎性细胞因子的分泌和未成熟树突状细胞分化为专职抗原呈递细胞，激活宿主的天然免疫系统。研究表明，通过静脉给小鼠注射大剂量的表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒，6h即可检测到IL-6、IL-1和TNF-α的分泌，脾脏边缘也有树突状细胞和巨噬细胞聚集，在恒河猴中也观察到类似现象。 2、腺病毒载体疫苗能迅速刺激机体产生高水平的体液免疫 很多疫苗是通过刺激机体产生中和抗体来发挥保护机体预防疾病作用的。腺病毒载体疫苗能有效产生针对相应靶抗原的高水平抗体。如携带狂犬病毒糖蛋白的复制缺陷型或复制型的5 型重组腺病毒载体疫苗，都能诱导高水平中和抗体，保护动物抵抗致死剂量狂犬病毒的攻击。 3、腺病毒载体疫苗能刺激机体产生很强的细胞免疫 特异性T细胞免疫在对抗寄生虫病、病毒性疾病及肿瘤治疗中都具有重要作用。大量的临床前和临床研究发现，腺病毒载体疫苗能刺激机体产生很强的针对外源基因的特异性T 细胞反应。有研究报道，携带恶性疟原虫抗原的腺病毒载体疫苗能刺激小鼠产生很强的CD8+T 细胞免疫反应，最高能达到92％的保护率。 4、腺病毒载体疫苗可方便地通过黏膜进行免疫 能通过黏膜免疫诱导局部或全身体液免疫反应是腺病毒载体疫苗的一个重要特点。黏膜免疫与全身免疫相比有许多不同，注射免疫诱导的全身免疫虽然可以清除其感染，但通常不能保护黏膜表面；而经黏膜接种疫苗可以非侵入性地诱导机体产生黏膜和系统免疫应答，从而可以保护机体免受通过黏膜表面和其他途径的感染。研究发现，在多种动物模型中，口服或滴鼻接种肺炎球菌、委内瑞拉马脑炎病毒、狂犬病毒、乙肝病毒的重组腺病毒载体疫苗，都能刺激机体产生很强的体液免疫和局部的黏膜反应，并保护机体免受相应病原的侵害。
编号：JS-20213689 甲 方：______________________________ 乙 方：______________________________ 日 期：_________年________月_______日 腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技 术服务合同书样本 Promises resulting from either express or an implied agreement can be enforced.
[标签:titlecontent] 服务方(甲方)：_________ 地址：_________ 邮编：_________ 电话：_________ 传真：_________ e-mail：_________ 开户银行：_________ 帐号：_________ 委托方(乙方)：_________ 地址：_________ 邮编：_________ 电话：_________ 传真：_________ 甲乙双方根据《中华人民共和国合同法》等法律法规，在平等互利的原则下，经协商一致，订立本合同，以兹双方共同遵照执行。 第一条病毒名称
甲方接受乙方的委托，为其载体构建、重组、扩增和纯化_________腺病毒，腺病毒滴度_________pfu/ml。 第二条费用及价格(人民币) 1.病毒的载体构建、重组、扩增和纯化所需的原料由甲方自行购买; 2.合同总价_________元，(大写)_________。 第三条乙方责任 1.乙方所购买的甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品将只供乙方或乙方所能控制的实验组中进行实验研究，在任何情况下决不用于人类，决不用于以谋利(直接或间接)为目的的生物制药以及临床分析等方面。 2.未征得甲方授权或同意，乙方不能以任何名义将购买的腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品转移、出售或租借给他人使用。 3.保证乙方应用甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品进行的研究符合现行的法律法规，不得应用甲方腺病毒产品进行有损于人类安全或其它非法目的的研究。 4.所有在研究过程中经本产品及其一切复制、衍生产品处理过之动物、植物、蛋类以及乳制品等均应妥善处理，决不可食用或出售。 5.乙方及乙方的课题组在发表文章中注明该重组腺病毒购自甲方，并将已发表文章复印一份给甲方。 6.甲方的腺病毒产品是由人5型腺病毒改造而来，在特殊情况下仍可能具有一定的致病性，乙方必须遵守国家安全使用腺病毒原则。
pAAV--‐CAG--‐GFP 编号 载体名称 北京华越洋VECT10004 pAAV--‐CAG--‐GFP pAAV--‐CAG--‐GFP载体基本信息 载体名称: pAAV--‐CAG--‐GFP 质粒类型: 腺病毒载体；荧光蛋白报告载体 高拷贝/低拷贝: 低拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: CAG (CMV e nhancer/chicken β--‐actin p romoter) 载体大小: 5439 b p 5' 测序引物及序列: pCAG f wd p rimer 5’CAACGTGCTGGTTATTGTG 3’ 3' 测序引物及序列: cggcttctggcgtgtgac 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: EGFP 克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble 宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系 备注: --‐--‐ 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 腺病毒 pAAV--‐CAG--‐GFP载体质粒图谱和多克隆位点信息
pAAV--‐CAG--‐GFP载体序列: ORIGIN 1 C TTCCGCTTC C TCGCTCACT G ACTCGCTGC G CTCGGTCGT T CGGCTGCGG C GAGCGGTAT 61 C AGCTCACTC A AAGGCGGTA A TACGGTTAT C CACAGAATC A GGGGATAAC G CAGGAAAGA 121 A CATGTGAGC A AAAGGCCAG C AAAAGGCCA G GAACCGTAA A AAGGCCGCG T TGCTGGCGT 181 T TTTCCATAG G CTCCGCCCC C CTGACGAGC A TCACAAAAA T CGACGCTCA A GTCAGAGGT 241 G GCGAAACCC G ACAGGACTA T AAAGATACC A GGCGTTTCC C CCTGGAAGC T CCCTCGTGC 301 G CTCTCCTGT T CCGACCCTG C CGCTTACCG G ATACCTGTC C GCCTTTCTC C CTTCGGGAA 361 G CGTGGCGCT T TCTCATAGC T CACGCTGTA G GTATCTCAG T TCGGTGTAG G TCGTTCGCT 421 C CAAGCTGGG C TGTGTGCAC G AACCCCCCG T TCAGCCCGA C CGCTGCGCC T TATCCGGTA 481 A CTATCGTCT T GAGTCCAAC C CGGTAAGAC A CGACTTATC G CCACTGGCA G CAGCCACTG 541 G TAACAGGAT T AGCAGAGCG A GGTATGTAG G CGGTGCTAC A GAGTTCTTG A AGTGGTGGC 601 C TAACTACGG C TACACTAGA A GAACAGTAT T TGGTATCTG C GCTCTGCTG A AGCCAGTTA 661 C CTTCGGAAA A AGAGTTGGT A GCTCTTGAT C CGGCAAACA A ACCACCGCT G GTAGCGGTG 721 G TTTTTTTGT T TGCAAGCAG C AGATTACGC G CAGAAAAAA A GGATCTCAA G AAGATCCTT 781 T GATCTTTTC T ACGGGGTCT G ACGCTCAGT G GAACGAAAA C TCACGTTAA G GGATTTTGG 841 T CATGAGATT A TCAAAAAGG A TCTTCACCT A GATCCTTTT A AATTAAAAA T GAAGTTTTA 901 A ATCAATCTA A AGTATATAT G AGTAAACTT G GTCTGACAG T TACCAATGC T TAATCAGTG 961 A GGCACCTAT C TCAGCGATC T GTCTATTTC G TTCATCCAT A GTTGCCTGA C TCCCCGTCG 1021 T GTAGATAAC T ACGATACGG G AGGGCTTAC C ATCTGGCCC C AGTGCTGCA A TGATACCGC 1081 G AGACCCACG C TCACCGGCT C CAGATTTAT C AGCAATAAA C CAGCCAGCC G GAAGGGCCG 1141 A GCGCAGAAG T GGTCCTGCA A CTTTATCCG C CTCCATCCA G TCTATTAAT T GTTGCCGGG 1201 A AGCTAGAGT A AGTAGTTCG C CAGTTAATA G TTTGCGCAA C GTTGTTGCC A TTGCTACAG 1261 G CATCGTGGT G TCACGCTCG T CGTTTGGTA T GGCTTCATT C AGCTCCGGT T CCCAACGAT 1321 C AAGGCGAGT T ACATGATCC C CCATGTTGT G CAAAAAAGC G GTTAGCTCC T TCGGTCCTC 1381 C GATCGTTGT C AGAAGTAAG T TGGCCGCAG T GTTATCACT C ATGGTTATG G CAGCACTGC 1441 A TAATTCTCT T ACTGTCATG C CATCCGTAA G ATGCTTTTC T GTGACTGGT G AGTACTCAA 1501 C CAAGTCATT C TGAGAATAG T GTATGCGGC G ACCGAGTTG C TCTTGCCCG G CGTCAATAC 1561 G GGATAATAC C GCGCCACAT A GCAGAACTT T AAAAGTGCT C ATCATTGGA A AACGTTCTT 1621 C GGGGCGAAA A CTCTCAAGG A TCTTACCGC T GTTGAGATC C AGTTCGATG T AACCCACTC 1681 G TGCACCCAA C TGATCTTCA G CATCTTTTA C TTTCACCAG C GTTTCTGGG T GAGCAAAAA 1741 C AGGAAGGCA A AATGCCGCA A AAAAGGGAA T AAGGGCGAC A CGGAAATGT T GAATACTCA 1801 T ACTCTTCCT T TTTCAATAT T ATTGAAGCA T TTATCAGGG T TATTGTCTC A TGAGCGGAT 1861 A CATATTTGA A TGTATTTAG A AAAATAAAC A AATAGGGGT T CCGCGCACA T TTCCCCGAA 1921 A AGTGCCACC T AAATTGTAA G CGTTAATAT T TTGTTAAAA T TCGCGTTAA A TTTTTGTTA 1981 A ATCAGCTCA T TTTTTAACC A ATAGGCCGA A ATCGGCAAA A TCCCTTATA A ATCAAAAGA 2041 A TAGACCGAG A TAGGGTTGA G TGTTGTTCC A GTTTGGAAC A AGAGTCCAC T ATTAAAGAA 2101 C GTGGACTCC A ACGTCAAAG G GCGAAAAAC C GTCTATCAG G GCGATGGCC C ACTACGTGA 2161 A CCATCACCC T AATCAAGTT T TTTGGGGTC G AGGTGCCGT A AAGCACTAA A TCGGAACCC 2221 T AAAGGGAGC C CCCGATTTA G AGCTTGACG G GGAAAGCCG G CGAACGTGG C GAGAAAGGA 2281 A GGGAAGAAA G CGAAAGGAG C GGGCGCTAG G GCGCTGGCA A GTGTAGCGG T CACGCTGCG 2341 C GTAACCACC A CACCCGCCG C GCTTAATGC G CCGCTACAG G GCGCGTCCC A TTCGCCATT 2401 C AGGCTGCGC A ACTGTTGGG A AGGGCGATC G GTGCGGGCC T CTTCGCTAT T ACGCCAGCT 2461 G CGCGCTCGC T CGCTCACTG A GGCCGCCCG G GCAAAGCCC G GGCGTCGGG C GACCTTTGG
2004 年 10月The Chinese Journal of Process Engineering Oct. 2004 重组腺病毒生产技术研究进展 祁丽，顾铭，丛威 (中国科学院过程工程所生化工程国家重点实验室，北京 100080) 摘要：目前基因治疗，尤其是对癌症的基因治疗越来越多地得到人们的关注. 随着基因工程技术 的发展，对癌症在基因水平上的认识不断深化，发现了很多对治疗癌症有帮助的基因，但临床面 临的最大问题就是如何建立一个安全、高效、实用、可重复的基因转移系统，将这些治疗基因有 效地导入靶细胞. 人们构建了各种载体，重组腺病毒就是基因治疗的重要载体之一. 能否生产出大 量高质量的腺病毒载体是制约体外实验和临床实验的关键因素. 本文从感染机制、生产和纯化计数 等几个方面讨论生产重组腺病毒载体的进展. 关键词：基因治疗；重组腺病毒载体 中图分类号：Q952 文献标识码：A 文章编号：1009?606X(2004)05?0475?06 1 前言 基因治疗是近年来兴起的一种针对单基因和多基因遗传病、心血管疾病、恶性肿瘤和一些传染病的新的治疗模式，目的是将外源治疗基因导入靶细胞，在体内产生疗效. 基因导入系统是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统. 到目前为止，病毒载体在基因治疗中仍然是最有效的基因导入系统[1]. 腺病毒就是已经用于基因治疗的载体之一，与其它病毒载体相比，腺病毒载体一个主要优势是在包装细胞中能获得较高的病毒滴度，能感染分裂期和非分裂期的细胞，目前应用最多的是Ad5[2]. 用外源DNA置换出一定长度的病毒基因片断及获得重组的腺病毒，根据腺病毒载体中的病毒基因置换程度，可将其分为第一代、第二代和第三代. 第一代腺病毒载体去除了基因序列中的E1和E3区，包装外源基因的能力较小，在8.5 kb以内，主要用于单基因疾病的治疗[3]，缺点是导入基因的表达时间短和引起宿主的免疫反应，导致直接的细胞致病变作用(Cytopathic Effects，CPE)，另外，在293细胞内同源重组作用导致野生腺病毒(Replicative Competent Adenovirus，RCA)的产生[4]. 为了避免上述缺点，第二代腺病毒载体进一步去除了E2a, E2b或E4，载体的容量和安全性比第一代有所改进，但是其介导的外源基因的转染和表达时间并没有明显延长，而且产生重组病毒滴度低，另外保留的病毒基因仍有低水平的表达并引起细胞免疫反应[5,6].第三代腺病毒缺失全部或大部分腺病毒基因，或者包装腺病毒微染色体系统，这种载体缺失了病毒蛋白，所以很大程度上降低了细胞的免疫源性，并且外源基因的表达时间明显延长，但对包装细胞的要求很高，分离辅助病毒困难. 至今在临床中应用的腺病毒载体主要是第一代腺病毒载体. 重组腺病毒的生产过程主要包括包装细胞的培养、病毒感染、病毒的分离纯化和病毒计数及滴度测定等几个主要步骤. 以下从腺病毒的感染机制、生产和纯化计数几个方面论述重组腺病毒载体的生产技术. 收稿日期：2003?09?28，修回日期：2003?11?05 基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(编号: 2001AA217121) 作者简介：祁丽(1979?)，女，河南省原阳县人，硕士研究生，生物工程专业；丛威，通讯联系人，E-mail: weicong@https://www.doczj.com/doc/8f5794523.html,.