甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶(GPDA)测定的临床意义
上海海员医院中心实验室张抗万雄萍
早在1966年，Hopsu-Havu和Glenner等在鼠的肝、肾组织中发现了一种新的二肽氨基肽酶。这种酶能水解甘氨酰-脯氨酰-B-萘胺，释放二肽甘氨酰脯氨酸，而被称为甘氨酰脯氨酸-B-萘胺酸〔1〕。由于甘氨酰脯氨酰-B-萘胺有致癌作用，Nagatsu等合成了新底物甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺〔2〕，并为大家广泛接受，这种酶也一度被称为甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺酶，现已通称为甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶(Glycyl proline dipeptidyl aminopeptidase,GPDA)。
GPDA分布于肝、肾、结缔组织、唾液腺和血清、唾液等体液中，但其生理功能尚不清楚。由于GPDA能特异地水解释放肽链N-末端的甘氨酰-脯氨酸(Gly-Pro)，而胶原分子中富含有这种Gly-Pro结构，提GPDA的生理作用可能与胶原肽降解有关。
七十年代，血清GPDA测定被逐渐引入到临床应用。
一、血清GPDA对肝癌鉴别诊断的价值
在若干学者发现肝胆疾病病人血清GPDA升高之后，Kojima等首先报道了原发性肝癌(PHC)病人血清GPDA活性(198±110.4U/L,n=53)不仅显著高于健康对照组(77.5±17.1U/L,n=100)，
而且显著高于慢性肝炎，肝硬变和其他胆道疾病(如胆石症、阻赛性黄疸等)病例组〔3〕。部分肝癌病人的血清GPDA 超过200U/L，而20例超过200U/L的病例中，除一例总胆管结石外，其余都是肝癌。
综合国内外文献报道，原发性肝癌病人血清GPDA约为健康人的1.5～2.5倍〔3～7〕；阳性率在57～100%不等。原发性肝癌病人血清GPDA水平与转移性肝癌病人无显著差异〔3〕。但Hutchinson等报道，转移性肝癌病人血清GPDA高达健康对照的3.3倍，阳性87.5%(14/16)；其中一例67岁老年女病人在血清GPDA升高一周后，血清转氨酶活性才出现高，提示血清GPDA对早期发现肝细胞损伤，可能比转氨酶更加敏感。
原发性肝癌病人血清GPDA活性与AFP水平不相关〔3，9〕。对178例原发性肝癌病人的检查发现，AFP阳性131例(阳性率73.6%)，AFP阴性47例(阴性率26.4%)。而AFP阳性和阴性两组病例的血清GPDA活性分别为82.60±3.33U/L和83.63±5.63U/L，升高的阳性率分别为63.4%和66.0%；把AFP阳性和阴性病例合并计算，血清GPDA活性为82.87±2.86U/L，升高的阳性率为64.0%；这些差异都不具有统计学意义。三例AFP阴性的亚临床期原发性肝癌病人，有2例GPDA升高。提示血清GPDA与AFP有良好的互补作用。亚临床期原发性肝癌病人的血清GPDA活性虽然显著高于健康人(P＜0.01)，但其活性水平和阳性率均显著低于临床期病人，反映了血清GPDA水平与原发性肝癌的病情有关〔5〕。
用3 甲基-DAB诱导肝癌的大鼠，血清中GPDA活性大约也为健康鼠的2倍，而肝癌组织的匀浆和微粒体部分的GPDA比活性都显著低于健康鼠者；而用肝癌组织制取的细胞液部分的GPDA比活性，显著高于用正确肝组织制取者。说明肝癌时血清GPDA的升高，是由于微粒体内酶向外释放增多引起，与血清r-GT升高是由于合成增多而引起的机制不同〔4〕。
急性肝炎，慢活肝、肝硬变、阻塞性黄疸等，血清GPDA可有不同程度升高，但升高幅度不及肝癌病人。但是，重症肝炎〔7〕、酒精性肝炎〔8〕时，血清GPDA升高幅度十分显著，可超过肝癌病人。
与上述肝胆疾病时血清GPDA升高不同，十九例肝血管瘤病人，无一例血清GPDA超过正常值上限〔5〕。说明对影象学诊断“占位性病变”者，血清GPDA测定具有定性鉴别作用。如果血清GPDA升高可以排除血管瘤的诊断。
二、血清GPDA在胃癌诊断中的价值
几乎在发现肝胆疾病病人血清GPDA升高的同时，发现胃癌病人血清GPDA明显下降〔10，11〕。尽管下降机理迄今不明，但这种现象已为国内外诸多报道证实。饶有趣味的是，用六种氨基酸合成六种X-脯胺酰对硝基苯胺(X=不同氨基酸)作底物，测定正常人和胃癌病人的血清GPDA，尽管不同底物测得的GPDA活性水平有十分明显的差别，但每种底物各自测得的胃癌病人血清GPDA活性均值，都在正常人的一半左右〔11〕。近年若干
报道采用较高浓度的底物，提高了GPDA活性的绝对值，但没有改变正常人和胃癌病人血清GPDA活性均值的倍比关系。
其它良性胃肠道病变，血清GPDA也可略有下降〔12〕。下降幅度较大的为胃溃疡，依次为慢性胃炎和十二指肠球部溃疡。把低于正常对照组血清GPDA活性均值减去三个标准差，作为判别胃部良、恶性病变的临界值，低于此值为阳性，则胃溃疡、慢性胃炎和十二指肠球部溃疡的阳性率依次为10.4%、6.2%和0；远低于胃癌的阳性率(72.5%)。良性病变时血清GPDA活性下降，可否作为癌变的早期信号，尚有待进一步研究。但是对血清GPDA显著下降者，应该警惕胃癌的可能。
肺癌、贲门癌和食管癌病人血清GPDA活性也有不同程度的下降，下降幅度依上述顺序依次由大到小。如果胃癌和这些器官癌症病人出现肝转移时，GPDA活性可明显升高。胃癌切除后，血清GPDA也有回升趋势。
三、其他疾病时的血清GPDA水平
对类风湿关节炎(RA)病人血清GPDA活性的观察发现，病程在15个月以上者，血清GPDA活性显著低于健康对照(P＜0.05)，酶活性水平与病程长呈负相关(γ=-0.53,P＜0.05)，两者之间的关系为Y(酶，U/L)=56.74-0.20X(病程，月)。可以推理，诸如RA这种进行性疾病，病程愈长，接受有效治疗愈多，病人的病情也愈重，疾病累及范围愈大，血清GPDA也愈低。
系统性红斑性狼疮(SLE)病人血清GPDA也显著低于健康对照(P＜0.01)，但酶活性与临床表现不相关〔13〕。
RA和SLE病人血清GPDA活性下降，可能是由于长期炎症，使结缔组织明显萎缩，导致全身总胶原减少引起。
急性淋巴细胞性白血病、淋巴肉瘤和何杰全氏病病人，血清GPDA显著低于健康对照，而慢性粒细胞性白血病病人与健康人无显著差
。
〔14〕
四、尿液中的GPDA
用荧光法测定人尿GPDA活性，发现同一健康人天内天间GPDA活性水平很小变异，以每克肌酐相应的酶活性报告时尤为如此
。肾小球肾炎病人的尿GPDA(10.56±9.1U/L或17.44±19.8U/克肌酐)显著高于健康对〔15〕
照(2.16±1.2U/L或4.30±1.7U/克肌酐)〔16〕。肌酐清除值(Ccr)较高者，尿GPDA较低，反之则较高。Ccr在1～30ml/min之间的病人，Ccr与尿GPDA活性略呈负相关(r=-0.567)。
将收集保存在4℃冰箱的正常人和肾小球肾炎病人的晨尿，超滤浓缩后，通过Sephadex G200柱层析，正常人尿GPDA主峰(峰Ⅰ)在靠近空容量处，分子量400000，其后紧随一个很小的峰(峰Ⅰ)，分子量230000；而肾病病人尿GPDA的峰Ⅰ、峰Ⅱ位置虽与正常人相当，但峰Ⅰ为小峰，峰Ⅱ为大峰。而用正常人和病人的新鲜尿液，两者的层析谱一致。正常人和病人尿GPDA的峰Ⅰ，对底物的Km值十分接近。肾病病人尿GPDA值峰Ⅱ的Km值略低于峰Ⅰ，与从人肾提纯的GPDA的Km值接近。峰ⅠGPDA的分子量远大于人血清GPDA分子量(220000)。以上结果提示，峰Ⅰ、峰Ⅱ的酶在分子特性、来源和进入尿液的机制存在着差异〔16〕。
把从人颌下腺提取的GPDA和肾病病人尿，分别加入到正常人尿中，GPDA的回收率为98±3.6%和95±
2.2%，提示尿中不存在该酶的激活剂、抑制剂等干扰物质，尿液毋须处理，可直接用于GPDA测定。
五、GPDA水平的生理变异
用脐带血为样品，测定血清GPDA活性，六十五例新生儿的血清GPDA显著低于健康成人(23～76岁)〔14〕，说明从婴儿出生到20岁的迅速发育价段，血清GPDA活性逐渐升高。这可能与胶原量的增加有关，也提示GPDA 在胶原肽降解中的作用。
四十岁以下的青年男子的血清GPDA，略高于青年女子(P＜0.001)；四十岁以上女子的血清GPDA略高于40岁以下的青年女子(P＜0.05)，但男子不然〔11〕。
以每克肌酐表示尿GPDA活性，四十岁以上的女性组和男女混合计算组均显著高于40岁以下的青年男、女组和男女混合计算组(P＜0.005)；如果不以年龄划分，则女性显著高于男性(P＜0.005)；一百六十二例健康人的尿GPDA活性呈明显的正态分布〔15〕。
综上所述，血、尿GPDA测定有着比较广泛的临床意义和应用前景。尤其是对原发性肝癌的诊断，对影象学诊断为“占位性病变”的定性鉴别，以及对胃癌的诊断和监测胃癌等其他器官的肝转移等，都是一项值得采
用的试验。由于原发性肝癌病人血清GPDA与AFP水平不相关，两者具有良好的互补作用。
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土壤亮氨酸氨基肽酶（S-LAP）活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC4025 规格：100T/48S 产品内容： 试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存；临用前加入3mL丙酮溶解。 产品说明： S-LAP是一类能水解肽链N-末端为亮氨酸的酶，由土壤微生物分泌。S-LAP活性变化与机体某些病理状态密切相关。 S-LAP分解L-亮氨酸对硝基苯胺生成对硝基苯胺，后者在405nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算S-LAP活性。 自备实验用品及仪器： 天平、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、甲苯、丙酮、30目筛（或更小）。操作步骤： 一、样本处理 土样自然风干，过30-50目筛。 二、测定步骤 1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，波长调至405nm，蒸馏水调零。 2、加样表： 测定管对照管 土样（g）0.030.03 甲苯（μL）1515 震荡混匀，室温静置15min。 试剂一（μL）255255 试剂二（μL）30-
30℃水浴反应1h后立刻煮沸5min。流水冷却至室温。 试剂二（μL）-30 14000g常温离心10min，取200μL上清于405nm处测定吸光值，分别记为A测定管、A对照管，计算ΔA=A测定管-A对照顾管。 三、酶活计算公式 （1）按微量比色皿计算： 酶活性定义：每克土壤每分钟生成1nmol对硝基苯胺为一个酶活力单位。 S-LAP活性（U/g）=△A÷(ε×d)×109×V反总÷W÷T=0.507×△A÷W。 ε：对硝基苯胺摩尔消光系数：9.87×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，300μL=3×10-4L；W：土样质量，g；T：反应时间，60min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。 （2）按96孔板计算： 酶活性定义：每克土壤每分钟氧化1nmol对硝基苯胺为一个酶活力单位。 S-LAP活性（U/g）=△A÷(ε×d)×109×V反总÷W÷T=0.844×△A÷W。 ε：对硝基苯胺摩尔消光系数：9.87×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V反总：反应总体积，300μL=3×10-4L；W：土样质量，g；T：反应时间，60min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
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脯氨酸肽酶缺乏症 脯氨酸肽酶缺乏症（prolidase deficiency）是一种罕见的因先天性胶原代谢异常所致的疾病。本病系1968年首先由Goodman等报道，他们描述了1例47岁的男病人，临床上具有与山黧豆中毒相似的症状，并发现尿中有大量的亚氨基二肽排泄，认为此病例可能是一种较为特殊的疾病，并据此推测是由于组织中缺乏脯氨酸肽酶所致。1974年Powell等在1名7岁男孩中首先证实本病确实是由于脯氨酸肽酶缺乏所引起。随后在北美、西欧、中东和日本等地相继有类似病例报告，并已认识本病为一种独立的遗传性疾病。至今文献中记载的病例已达20余例（由于本病需作特殊的生化检验才能确诊，又有许多病例未被认识，故实际发病数应较此为多）。本病的皮肤症状十分多见且富于特征性，因而认识和了解其皮肤表现，将为患者的诊断提供可靠的证据。 临床表现 本病有多系统受累，可累及皮肤、中枢神经系统、眼、耳鼻咽、齿、骨骼和关节等组织器官。 一、皮肤表现：皮肤是本病的靶器官，其症状绝大多数出现在12岁以前，尤以婴幼儿时期发病者多见，最小者为出生后3个月时发病。大多数患者（90%以上）均有严重而有意义的皮损。其突出的皮肤科特征是诊断本病的最重要的依据。 （一）慢性复发性溃疡：在本病所有的皮肤变化中，顽固性溃疡是多见和最具有特征性的，也是本病最主要的表现。出现在约2/3的病人中。溃疡的特征主要为累及双下肢尤在小腿下部和足部（个别病人也可发生在上肢）、深在、慢性而难治，溃疡表面有肉芽组织和脓性分泌物，不痛也无压痛，往往伴有细菌感染，经数月后溃疡可能缓慢地痊愈，留下萎缩或硬化性瘢痕并有色素沉着或减退。挛缩性瘢痕可致足部畸形或可形成马蹄足。患者的皮肤往往变得脆弱易破故溃疡易于复发。其四周的皮肤可以增厚，伴局部多毛，但无静脉曲张，血管造影无血管闭塞。 由于本病皮肤溃疡的发生率高，故凡发生在婴幼儿和儿童时期的小腿慢性复发性溃疡，均应想到本病的可能。 （二）对光敏感和毛细血管扩张：为本病的另一皮肤体征。毛细血管扩张发生率约40%，多见于面、颊、上肢伸侧、肩部等暴露部位，并可合并皮肤瘙痒。 （三）紫癜性损害：可表现为多发性瘀斑和细小的紫癜性皮疹，但无引起出血的血液学证据。其发病与遗传性毛细血管脆弱有关。 （四）25%患者有青年白发，个别患者可发生早秃。 （五）25%病人皮肤有鳞屑性红斑丘疹损害。 （六）面部、四肢伸侧和臀部可出现小的浅表性棕色萎缩性瘢痕样损害，常伴有点状色素沉着。 （七）皮肤增厚的淋巴水肿：一般仅限局干皮肤溃疡周围，其发生可能与淋巴管进行性损伤有关，
亮氨酸氨基肽酶（LAP）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC4140 规格：50T/48S 产品内容： 试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存；临用前加入5mL丙酮溶解。 产品说明： LAP是一种膜结合酶，广泛存在于肝、胆、胰等组织中，参与组织蛋白和某些肽类的降解更新。各类肝病患者因肝细胞损伤，血清LAP的活性均有不同程度的升高，LAP可以作为各类肝病的一项初步检测指标，特别是肝癌鉴别诊断的指标。 LAP分解L-亮氨酸对硝基苯胺生成对硝基苯胺，后者在405nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算LAP活性。 自备实验用品及仪器： 天平、低温离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、丙酮、匀浆器/研钵。 操作步骤： 一、样本处理： 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 细胞：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 液体：直接检测。 二、测定操作：
1、分光光度计预热30min以上，波长调至405nm，蒸馏水调零。 2、加样表：在1mL玻璃比色皿中分别加入下列试剂 试剂名称（μL）测定管空白管 试剂一50 样品上清50 试剂一850850 试剂二100100在1mL玻璃比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于405nm处测定30s时的吸光值A1，迅速置于37℃水浴3min，拿出迅速擦干测定210s时的吸光值A2，计算△A测定管=A2测定-A1测定，△A空白管=A2空白-A1空白，△A=△A测定管-△A空白管。空白管只需做一次。 三、酶活计算公式 1、液体LAP活力的计算： 单位的定义：每mL液体每分钟生成1nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。 LAP（U/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=675.4×ΔA 2、组织、细菌或细胞中LAP活力的计算: （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。 LAP（U/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr)÷T=675.4×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。 LAP（U/g鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=675.4×ΔA÷W （3）按细胞密度计算： 单位的定义：每1万个细胞每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。 LAP（U/104cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.35×ΔA V反总：反应体系总体积，1×10-3L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.87×103L/mol/cm；109：单位换算系数，1mol=109nmol；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入试剂一体积，1mL；T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，需单独测定；W：样本质量，g；
脊髓损伤后大鼠甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的达及甲基强的松龙干 预后的变化 目的：研究大剂量甲基强的松龙对脊髓损伤后甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶（glycylproline dipeptidyl aminopeptidase，GPDA）基因表达变化的影响。方法：Sprague-Dawley大鼠36只。将所有大鼠随机分为三组，假手术组、脊髓损伤未使用药物干预组（创伤组）、脊髓损伤+甲强龙干预组（甲强龙组）。在大鼠脊髓损伤后24 h将损伤的脊髓组织切取，进行逆转录PCR反应并检测GDPA的表达。结果：假手术组GDPA的mRNA的表达的相对丰度为1.5403±0.1604；脊髓损伤24 h后创伤组GDPA的表达的相对丰度为0.5994±0.3414，与假手术组相比差异有非常显著统计学意义（P＜0.01）；GDPA在脊髓损伤后使用甲强龙干预组中的表达相对丰度为1.8432±0.1294，与创伤组比较差异有非常显著统计学意义（P＜0.01）。结论：大剂量甲基强的松龙的早期使用能促进脊髓损伤后甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表达恢复，发挥细胞保护作用。 脊髓損伤后，神经细胞增生肥大，胞浆呈嗜酸性，突起变粗，分支增多。这些改变可起到减轻损伤及填补组织损伤而形成的空洞等作用，为神经再生创造条件；但聚集的星形胶质细胞所形成的胶质性瘢痕及其所分泌和表达的抑制性因子形成机械及化学屏障对上下行神经元轴突的再生有明显的阻碍作用[1]。N2末端为甘氨酰2脯氨酰的肽键能被GDPA特异地水解，而该肽键正是构成胶质的基本结构[2]，因此，推测GPDA在缓解星形胶质细胞所构成的机械和化学屏障中起到作用，从而改善脊髓继发性损伤的进一步发展。本文对GDPA基因在多种情况下表达的变化进行研究，并探讨脊髓损伤早期，GDPA对继发性脊髓损伤的影响，现报告如下。 1 材料与方法 1.1 动物及分组Sprague-Dawley大鼠（中科院上海实验动物中心提供，10周龄）36只，体重180～240g。根据随机表分为三组。假手术组、脊髓损伤未使用药物干预组（创伤组）、脊髓损伤+甲强龙干预组（甲强龙组）。每组12只。在大鼠脊髓损伤后24 h将损伤的脊髓组织切取，进行逆转录PCR反应。检测GDPA的表达。 1.2 手术方法腹部消毒后腹腔内注射戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，腰背部备皮消毒，充分暴露T8～9脊髓腰膨大。采用改良的Allen打击法（5 g×5 cm）制作脊髓损伤模型，甲强龙组大鼠静脉注射甲基强的松龙（30 mg/kg），假手术组未做任何处理关闭切口，创伤组大鼠静脉内注射等量的0.9%氯化钠溶液。24 h 后切除脊髓损伤部位上下1 cm的脊髓组织切取，进行RT-PCR反应。1.3 逆转录PCR反应 1.3.1 脊髓神经细胞总的RNA使用Trizol液提取1 ml Trizol液中加入1 g组织，反复吹打数次。混合均匀后加入0.2 ml氯仿，并予以离心（12 500 r/min，10 min）。吸取上部清液，加入0.5 ml异丙醇，离心（12 500 r/min，10 min）。 沉淀物加入30 μl DEPC溶化。 1.3.2 RNA定量和鉴定紫外分光光度计定量RNA，计算OD260、OD280及比值。取总RNA3 μg，电泳（琼脂糖凝胶）30 min，使用紫外光显示28 s及18 s 两条rRNA带，说明RNA提取完整性好。
慢性乙肝患者肝纤维化脯氨酸肽酶检测 发表时间：2011-07-12T11:31:02.890Z 来源：《中外健康文摘》2011年第16期供稿作者：秦忠琦[导读] 华医学会检验分会特别强调各临床实验室应根据ROC曲线确定诊断某类疾病适当的临界值[7]。 秦忠琦（辽宁省临床检验中心辽宁沈阳 110016）【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085 (2011)16-0031-02 【关键词】慢性乙型肝炎脯氨酸肽酶肝纤维化 肝纤维化是肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程。减缓或阻止肝纤维化进程具有非常重要的意义。使用灵敏的、特异的指标早期预测肝纤维化是预防肝纤维化的关键。肝脏穿刺活检一直是重要依据[1]，但是由于它的创伤性和局限性，常规检查尚存在困难，因此非侵入性的间接诊断指标更受到临床医师的关注。有研究认为脯氨酸肽酶（prolidase,PLD）与乙型肝炎患者肝纤维化病变有一定的相关性。为了解乙型病毒性肝炎肝纤维化过程中PLD的变化情况，来确定PLD的检测在慢性乙肝患者肝纤维化中的作用，我们选择2008年1月-2010年4月沈阳市传染病医院住院的慢性乙型肝炎病人进行实验检测，现报告如下。 1 资料与方法 1.1资料选择2008年1月-2010年4月沈阳市传染病医院住院的慢性乙型肝炎病人191例，其中男124例，女67例，年龄12～66岁。按肝纤维化程度进行分期，S0-1期（无明显肝纤维化）101例，S2-4期（明显肝纤维化）90例。所有病例均符合以下条件：（1）有慢性乙型肝炎病史；（2）入院前无其他型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒感染；（3）排除肝癌和器官移植；（4）排除脂肪肝和酒精肝。以上患者的诊断均符合2000年西安会议肝炎诊断标准[2]，在性别、年龄、病情和病程方面均有可比性。 1.2方法静脉真空采血2ml，检测白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白（Hb）、血小板（PLT）等血常规检查用全血细胞分析仪检测（美国贝克曼公司）；静脉真空采血5ml，检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）等生化指标，用7170生化分析仪进行检测（日本日立公司）。PLD(脯氨酸肽酶)活性测定采用脯氨酸肽酶ELISA试剂盒（上海生科生物科技有限公司），按说明操作。 1.3统计分析采用SPSS13.0软件进行统计分析。描述结果以中位数（最小值～最大值）表示。连续性变量用Mann-Whitney U Test分析；分类性变量用x2检验。利用ROC曲线(receiver operating characteristic curve)确定最优截断点，同时计算ROC曲线下面积(AUROC)和各截断点的灵敏度、特异度、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)及Youden指数等。 2 结果 2.1 不同肝纤维化程度的患者各指标比较（表1）在S0-1和S2-4不同分期中，除了性别、Hb、TP外，其他各项指标差异有统计学意义(P<0.05)。 表1 慢性乙型肝炎患者的临床特点 2.2 血清ALT，AST，AST/ALT和PLD活性的ROC曲线面积和最优截断点 ALT、AST、AST/ALT比值和PLD的ROC曲线下面积分别为0.614，0.648，0.655和0.807。PLD的AUROC最大，其95％的可信区间为0.739～0.874。最优截断点约为1250 U/L，灵敏度和特异度分别为75.6%和75.2%。 2.3 不同截断点PLD特征（表2）列出PLD在不同截断点的灵敏度、特异度、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）。如果以PLD≤1250 U/L作为无明显肝纤维化的诊断，PLD≤1250 U/L的99中有77人诊断正确（77.8％）；PLD≥1250U/L 的92人中有68人具有明显肝纤维化(7 3.9％)。当PLD≤1300 U/L的Youden指数为0.535，灵敏度和特异度分别为73.3％和80.2％，当PLD≥1400 U/L的Youden 指数为0.555，灵敏度和特异度分别为6 4.4％和91.1％，与最优截断点为1250U/L时比较，灵敏度降低，但是特异度增加。表2 血清PLD在不同截断点下的灵敏度和特异度
1. 以锌为例，说明金属离子在金属酶中所起的两种以上作用。 锌离子作为催化中心 以人的碳酸酐酶B为例。人碳酸酐酶B负责催化CO2的可逆水合，含有一个Zn2+，由His93、His95、His117侧链咪唑环的N配位结合。Zn2+的第四个配位位点催化位点，通常由水分子或含羧基离子结合，在发挥催化功能时，配位的水发生电离，带负电的氧进攻CO2的C，进而发生后续的反应。需要说明的是利用X射线分析脱锌碳酸酐酶，发现其结构与正常碳酸酐酶相同，但完全丧失了催化活性，说明锌离子只有催化中心的功能。 锌离子对蛋白结构的稳定作用 以非洲爪蟾的TFⅢA蛋白为例。该蛋白是一个转录因子，调控非洲爪蟾的5S RNA转录。该蛋白靠近N端处有9个连续的具有一定保守性的序列，每个序列都能通过其中的两个Cys 和两个His结合Zn2+。天然的TFⅢA蛋白能够特异地识别并结合一段45bp的DNA序列，并保护其不受核酸酶降解，如果使用螯合剂去除其中的Zn2+，则这种特异地结合将会消失，外加Zn2+可以恢复特异性。CD谱也证明没有Zn2+存在时蛋白缺乏完整性，加入Zn2+后CD谱的变化说明蛋白结构得以重建。 锌离子对酶活性的调节作用 以亮氨酸氨基肽酶为例。亮氨酸氨基肽酶从N端开始水解肽链，当N端为亮氨酸时具有最大的活性。在亮氨酸氨基肽酶中有两个锌离子，向正常的酶中加入过量Mg2+和Mn2+，可以提高酶活，而向脱锌氨基肽酶中加入Mg2+和Mn2+则不能恢复酶活。这说明两个锌离子有不同功能：对活性有无其决定作用的锌离子不易被交换；而对活性起调节作用的锌离子容易与其他离子交换，改变酶活。有研究证明两个锌离子在底物结合及催化过程中有不同功能。 2. 顺铂的吸收过称和抗癌机理 以二氯二氨合铂为例。顺铂通过静脉注射进入人体，在血浆中以两种形式存在：一类是其本身和水解产物；另一类是与蛋白质结合的形式。在水溶液中，顺铂中的氯离子可以和水分子进行交换，这一过程由溶液的pH和氯离子浓度决定。包括血浆在内的细胞外液中氯离子浓度高，大部分顺铂为原始形态。不带电的顺铂原形和部分水解物具有合适的油水分配系数，能够容易的穿透细胞膜，或者通过与蛋白结合进入细胞。进入细胞的顺铂在低氯离子浓度下水解，产物主要为[PtCl(OH)(NH3)2]、[Pt(OH)2(NH3)2] 、[Pt (OH)(H2O)(NH3)2]+。 顺铂的主要靶分子是DNA。液相的顺铂与DNA反应会形成很多加合物，最主要的形式是和鸟苷及腺苷的加合。鸟苷是顺铂的首选结合分子，X射线晶体分析证明配位原子是鸟苷的N7，进入细胞的顺铂的一个配体首先被鸟苷的N7取代。腺苷由于结构与鸟苷类似，配位原子也是N7。而利用寡聚核苷酸与顺铂作用发现，顺铂倾向于与同一条核苷酸单链上相邻的两个鸟苷结合，配位原子都是N7，顺铂两个氨配体上的氢则和鸟苷的O6及单链5’端的磷脂基团形成氢键，这种链内加合会导致DNA的扭曲。另有研究发现，在pH中性溶液中，鸟苷的N1由于受配位顺铂的影响可能脱去质子然后与另一顺铂配位，形成链内的N1、N7交联，阻碍GC间的氢键。 3. 以血红蛋白、Cyto C和过氧化氢酶为例说明辅基在不同蛋白中的功能。 血红蛋白 血红蛋白中的血红素的作用是可逆地结合氧分子。由于游离的血红素容易被水和氧氧化为高铁血红素，失去载氧能力，因此血红素被放置在血红蛋白的一个疏水区以防止铁的氧化。血红蛋白中的铁离子在未结合氧分子时处于高自旋态，在结合氧分子后变成低自旋态拥有较小的半径，能更深地嵌入卟啉环平面，拉动与之相连的His，引发蛋白质亚基的变构，最后促进其他卟啉环与氧分子的结合。
脯氨酸内切蛋白酶的测定方法 1定义：pH5.0 37℃条件下每分钟从Z-Gly-Pro-pNA释放1μM pNA所用的酶量为一个酶活力单位，以U表示。 2原理：脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase，PEP)能特异性水解多肽链中脯氨酸残基羧基端肽键的丝氨酸蛋白酶。以Z-Gly-Pro-pNA (N-卞氧羰基-甘氨酸- 脯氨酸-硝基苯胺)为底物时，它水解脯氨酸羧基端肽键，生成Z-Gly-Pro 和硝基苯胺，而硝基苯胺在410nm下的吸光值与其浓度在一定成范围内成 正比，通过测定硝基苯胺的生成量来检测脯氨酸内肽酶的酶活力。 3试剂和溶液 本标准中所用的试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T 6682中规定的三级水。 3.1 0.1M柠檬酸溶液：C4H2O7·H2O分子量为 210.14，0.1 mol/L溶液为21.01 克/升。秤取21.01克柠檬酸溶解在去离子水中并定容至1000ml； 3.20.2M磷酸氢二钠：Na2HPO4·2H2O分子量为 178.05，0.2 mol/L溶液为35.01 克/升。秤取35.01克磷酸氢二钠溶解在去离子水中并定容至1000ml； 3.3PH 4.0缓冲溶液：将0.1M柠檬酸12.29ml与0.2M磷酸氢二钠7.71ml混匀。 3.4 4mM Z-Gly-Pro-pNA(N-卞氧羰基-甘氨酸-脯氨酸-硝基苯胺，分子量 426.43，瑞士Bachem)，准确称取0.0171g Z-Gly-Pro-pNA (N-卞氧羰基-甘氨酸-脯氨酸-硝基苯胺)，加入4ml二恶烷溶解，加入6mlPH4.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液溶解后即为PH5.0的底物溶液。 3.5 终止剂：0.2 mol/L碳酸钠溶液 称取无水碳酸钠2.12g于烧杯中溶解，转至100mL容量瓶中定容。 4仪器和设备 4.1 实验室常用仪器设备。 4.2 恒温水浴：（37±0.1℃）。 4.3 分光光度计：有10mm比色皿，可在410nm下测定吸光度。 4.4 磁力搅拌器。 4.5 酸度计：精确至小数点后2位。 5试验流程
甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒（GPN底物法） 适用范围：用于体外定量测定人血清或血浆中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶（GPDA）的活性。 1.1包装规格 包装规格见表1。 表1包装规格 包装规格 1.2主要组成成分 主要组成成分见表2。 表2主要组成成分
注：不同批号的校准品、质控品赋值有差异。 2.1外观 试剂1为无色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物； 试剂2为浅黄绿色到黄绿色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物； 校准品为白色或淡黄色粉末状物质，复溶后为浅黄色或黄褐色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物； 质控品为白色或淡黄色粉末状物质，复溶后为浅黄色或黄褐色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物； 试剂盒标签标识清晰，外包装完整无损。 2.2净含量 试剂的净含量应不少于标称量。 2.3试剂空白吸光度 2.3.1A405nm下测定空白吸光度应≤1.0000。 2.3.2A405nm下测定试剂空白吸光度变化率（ΔA/min）应≤0.0500。 2.4准确度 与已上市产品进行比对试验：在[5，500]U/L区间内，相关系数r≥0.975，在[5，60]U/L区间内测定的绝对偏差应不超过±6U/L，在（60，500]U/L区间内测定的相对偏差应不超过±10%。 2.5分析灵敏度
样本浓度为100U/L时，其吸光度变化率≥0.0160。 2.6线性区间 在[5，500]U/L区间内，线性相关系数r≥0.990，在[5，60]U/L区间内测定的绝对偏差应不超过±6U/L，在（60，500]U/L区间内测定的相对偏差应不超过±10%。 2.7测量精密度 2.7.1重复性 使用高、低不同浓度的血清样本或质控品重复测定10次，其测定值的变异系数（CV％）应不大于10％。 2.7.2批间差 随机抽取三批试剂盒的批间相对极差（R）应不大于15%。 2.8校准品、质控品测量精密度 2.8.1重复性 对不同浓度的校准品、质控品分别重复测定10次，其测定值的变异系数（CV％）应不大于10％。 2.8.2瓶间精密度 校准品、质控品的瓶间精密度CV应≤15%。 2.9质控品赋值有效性 使用质控品进行测定，所得结果应在靶值范围内。 2.10稳定性 2.10.1试剂盒稳定性 试剂盒在2℃～8℃密封避光保存，有效期为12个月。在试剂盒有效期满后一个月以内，应符合2.1、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7.1、2.9的要求。 2.10.2校准品复溶稳定性 复溶后校准品在2℃～8℃保存7天，取复溶7天后的校准品定标后，测量试剂准确度，应符合2.4的要求。 2.10.3质控品复溶稳定性 复溶后质控品在2℃～8℃保存7天，测定复溶7天后的质控品，应符合2.9的要求。 2.11校准品溯源性
亮氨酸氨基肽酶测定试剂盒（L-亮氨酰-p-硝基苯胺底物法） 适用范围：用于体外定量测定人血清或尿液中亮氨酸氨基肽酶的活性。 1.1包装规格 3×50ml；2×40ml；2×80ml；2×24ml；1×40ml。 1.2主要组成成分 L-亮氨酸-p-硝基苯胺2mmol/L Tris缓冲液100mmol/L 2.1 外观和性状 2.1.1 试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏；外包装完好、无破损，标签完好、字迹清晰。 2.1.2 试剂应为无色或淡黄色透明液体，无沉淀、无悬浮物、无絮状物。 2.2 净含量 液体试剂的净含量应不少于标示值。 2.3 试剂空白 2.3.1 试剂空白吸光度 在405nm处测定试剂空白吸光度，应≤0.5。 2.3.2 试剂空白吸光度变化率 试剂空白吸光度变化率△A/min≤0.005。 2.4 分析灵敏度 测试220U/L的被测物时，吸光度变化率（ΔA/min）应不低于0.04。 2.5 准确性
与比对试剂盒同时测试40例线性范围内的不同浓度的样本，样本浓度在(1,240)U/L区间内，其相关系数（r）≥0.975；测定浓度在(1,40]U/L范围内绝对偏差不超过±6U/L；测定浓度在（40，240)U/L范围内相对偏差不超过±15%。 2.6 重复性 重复测试正常浓度和高浓度样品，批内变异系数（CV）应≤5%。 2.7 线性 2.7.1 在(1,240)U/L区间内，线性相关系数r应不低于0.990； 2.7.2 在（40，240)U/L区间内，相对偏差不超过±10%；在(1,40]U/L区间内，绝对偏差不超过±4U/L。 2.8 批间差 抽取3个不同批号试剂，对同一浓度样品进行重复检测，批间相对极差≤10%。 2.9 稳定性 该产品在2℃～8℃条件下贮存有效期为18个月，取效期末的产品进行检测，应符合2.1、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7之规定。
甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶(GPDA)测定的临床意义 上海海员医院中心实验室张抗万雄萍 早在1966年，Hopsu-Havu和Glenner等在鼠的肝、肾组织中发现了一种新的二肽氨基肽酶。这种酶能水解甘氨酰-脯氨酰-B-萘胺，释放二肽甘氨酰脯氨酸，而被称为甘氨酰脯氨酸-B-萘胺酸〔1〕。由于甘氨酰脯氨酰-B-萘胺有致癌作用，Nagatsu等合成了新底物甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺〔2〕，并为大家广泛接受，这种酶也一度被称为甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺酶，现已通称为甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶(Glycyl proline dipeptidyl aminopeptidase,GPDA)。 GPDA分布于肝、肾、结缔组织、唾液腺和血清、唾液等体液中，但其生理功能尚不清楚。由于GPDA能特异地水解释放肽链N-末端的甘氨酰-脯氨酸(Gly-Pro)，而胶原分子中富含有这种Gly-Pro结构，提GPDA的生理作用可能与胶原肽降解有关。 七十年代，血清GPDA测定被逐渐引入到临床应用。 一、血清GPDA对肝癌鉴别诊断的价值 在若干学者发现肝胆疾病病人血清GPDA升高之后，Kojima等首先报道了原发性肝癌(PHC)病人血清GPDA活性(198±110.4U/L,n=53)不仅显著高于健康对照组(77.5±17.1U/L,n=100)， 而且显著高于慢性肝炎，肝硬变和其他胆道疾病(如胆石症、阻赛性黄疸等)病例组〔3〕。部分肝癌病人的血清GPDA 超过200U/L，而20例超过200U/L的病例中，除一例总胆管结石外，其余都是肝癌。 综合国内外文献报道，原发性肝癌病人血清GPDA约为健康人的1.5～2.5倍〔3～7〕；阳性率在57～100%不等。原发性肝癌病人血清GPDA水平与转移性肝癌病人无显著差异〔3〕。但Hutchinson等报道，转移性肝癌病人血清GPDA高达健康对照的3.3倍，阳性87.5%(14/16)；其中一例67岁老年女病人在血清GPDA升高一周后，血清转氨酶活性才出现高，提示血清GPDA对早期发现肝细胞损伤，可能比转氨酶更加敏感。 原发性肝癌病人血清GPDA活性与AFP水平不相关〔3，9〕。对178例原发性肝癌病人的检查发现，AFP阳性131例(阳性率73.6%)，AFP阴性47例(阴性率26.4%)。而AFP阳性和阴性两组病例的血清GPDA活性分别为82.60±3.33U/L和83.63±5.63U/L，升高的阳性率分别为63.4%和66.0%；把AFP阳性和阴性病例合并计算，血清GPDA活性为82.87±2.86U/L，升高的阳性率为64.0%；这些差异都不具有统计学意义。三例AFP阴性的亚临床期原发性肝癌病人，有2例GPDA升高。提示血清GPDA与AFP有良好的互补作用。亚临床期原发性肝癌病人的血清GPDA活性虽然显著高于健康人(P＜0.01)，但其活性水平和阳性率均显著低于临床期病人，反映了血清GPDA水平与原发性肝癌的病情有关〔5〕。 用3 甲基-DAB诱导肝癌的大鼠，血清中GPDA活性大约也为健康鼠的2倍，而肝癌组织的匀浆和微粒体部分的GPDA比活性都显著低于健康鼠者；而用肝癌组织制取的细胞液部分的GPDA比活性，显著高于用正确肝组织制取者。说明肝癌时血清GPDA的升高，是由于微粒体内酶向外释放增多引起，与血清r-GT升高是由于合成增多而引起的机制不同〔4〕。 急性肝炎，慢活肝、肝硬变、阻塞性黄疸等，血清GPDA可有不同程度升高，但升高幅度不及肝癌病人。但是，重症肝炎〔7〕、酒精性肝炎〔8〕时，血清GPDA升高幅度十分显著，可超过肝癌病人。 与上述肝胆疾病时血清GPDA升高不同，十九例肝血管瘤病人，无一例血清GPDA超过正常值上限〔5〕。说明对影象学诊断“占位性病变”者，血清GPDA测定具有定性鉴别作用。如果血清GPDA升高可以排除血管瘤的诊断。 二、血清GPDA在胃癌诊断中的价值 几乎在发现肝胆疾病病人血清GPDA升高的同时，发现胃癌病人血清GPDA明显下降〔10，11〕。尽管下降机理迄今不明，但这种现象已为国内外诸多报道证实。饶有趣味的是，用六种氨基酸合成六种X-脯胺酰对硝基苯胺(X=不同氨基酸)作底物，测定正常人和胃癌病人的血清GPDA，尽管不同底物测得的GPDA活性水平有十分明显的差别，但每种底物各自测得的胃癌病人血清GPDA活性均值，都在正常人的一半左右〔11〕。近年若干
亮氨酸氨肽酶测定试剂盒（L-亮氨酰-p-硝基苯胺底物法）组成： 适用范围：用于体外定量测定人血清中亮氨酸氨基肽酶的活性。 规格1（试剂1：15ml；试剂2：5ml)； 规格2（试剂1：30ml；试剂2：10ml)； 规格3（试剂1：45ml；试剂2：15ml)； 规格4（试剂1：60ml；试剂2：20ml)； 规格5（试剂1：60ml×2；试剂2：20ml×2)； 规格6（试剂1：60ml×3；试剂2：20ml×3)； 试剂盒组成见表1 表1 亮氨酸氨肽酶测定试剂盒组成 2.1外观
试剂盒外观应整洁,液体无渗漏，文字符号标识清晰；试剂1为无色透明液体，不得有沉淀和絮状物；试剂2为淡黄色液体，不得有沉淀絮状物. 2.2 装量 每瓶不少于标示值。 2.3试剂空白吸光度 用指定的空白样品测试试剂（盒），在光径1cm下，在波长405nm处测定试剂空白吸光度A≤0.8，试剂空白吸光度变化率△A/min≤0.005。 2.4分析灵敏度 试剂测定50 U/L被测物，吸光度变化率△A/min≥0.01。 2.5线性范围 2.5.1在[5，200]U/L内,相关系数R≥0.990。 2.5.2在[5，50]U/L内，线性绝对偏差不超过±5U/L；(50，200] U/L内，线性相对偏差不超过±10%。 2.6精密度 2.6.1重复性 重复测试(20±4)U/L和(60±12)U/L的样本，所得结果的变异系数（CV%）应不大于5%。 2.6.2批间差 测定(20±4)U/L样本，所得结果的批间相对极差（R）应不大于10%。 2.7准确度 回收率应在85%-115%范围内。 2.8稳定性 试剂有效期为12个月，取到效期后一个月内进行检测，测定结果应符合 2.3-2.6.1、2.7项要求。