分光光度计标准曲线的作用
分光光度计是一种化学分析仪器，它能够检测物质成分，它主要通过测量放射
光来获取精确的结果。分光光度计标准曲线是一种常用的标准曲线，它能够对放射光进行分析，可以帮助研究者获得更准确和精确的结果。
分光光度计标准曲线的核心作用是可以将放射光和元素的浓度直观的表示出来。曲线的左侧表示的是积累的光强度，右侧则是元素的浓度。使用这种曲线可以清楚的推断出元素的浓度，从而更好的研究物质的成分。
此外，分光光度计标准曲线也能够检测微量的元素，如果某种元素的浓度很低，研究者依然可以得出比较准确和明确的结果。更重要的是，只要标准曲线正确，就能提高试验分析可靠性，使结果更准确和精确。
最后，分光光度计标准曲线的使用也可以节省研究者的大量时间。在进行物质
成分的分析时，如果使用这种曲线，就可以让研究者更快速准确的找到结果，而且在记录结果上也更加方便。
总之，分光光度计标准曲线是物质成分分析的重要方法。它能够提高测试准确性，帮助研究者更好的分析物质成分，节省研究者的大量时间，使研究结果更加准确和精确。
第六章 吸光光度法 例6-1 铁(Ⅱ)-邻菲罗啉的摩尔吸光系数4 101.1?=ε，计算桑德尔灵敏度。 解 24 0050.010 1.185 .55-?=?= =cm g M S με 例6-2 一种含有+ 2Mn 、+ 3Cr 的未知试液，经氧化处理后得MnO ，CrO 试液，分别 在440nm ，545nm 测得吸光度为0.385，0.653，b=1cm ，求试液中+ 2Mn ，+ 3Cr 浓度。 (已知5092,201,23,786545440545440====Mn Mn Cr Cr εεεε) 解 =--=+++ Mn Cr Cr Mn Mn Cr Cr Mn Cr Cr Mn A A c 440 5454405454405455454402εεεεεε 141024.1201 237865092385 .023653.0786--??=?-??-?L mol =??-=-= -++786 1024.1201385.04440 4404403Cr Mn Mn Cr Mn Cr c A c εε 141058.4--??L mol 对于吸收曲线有重叠的混合物试样、混浊样品或其他北京吸收较大的试样，由于存在很强的散射和非特征吸收，难以找到一个合适的参比消除其影响。利用双波长技术可以从分析波长的信号中减去来自参比波长的信号，以消除散射以在测定波长时吸收的其它物质的干扰，从而提高选择性灵敏度，并简化了分析混合物的手续，扩大了光度分析的应用范围。双波长分光光度计测得值为两波长下吸光度差值定量测定依据为 bc A A A I I )(lg 12121 2 λλλλεε-=?=-=- 标准曲线c A -?曲线表示，试样溶液在两个波长1λ，2λ处的吸光度差值与试样溶液中待测物质浓度呈正比。用双波长测定时，作为参比的不是另外参比液而是试液本身对某一波长的吸光度，这样抵消了样品混浊与基本不一致的误差，提高了灵敏度及选择性。 例6-3 某有色溶液在2.00cm 吸收池中，测得百分透光率T=50%，若改用(1)1cm ，(2)3cm 厚的吸收池时，其T 和A 各为多少？ 解 先求有色溶液在2cm 吸收池中吸光度A ，由公式可得 30.0%50lg lg =-=-=T A 由吸光度与液层厚度成正比，可求得厚度为1cm 和3cm 时有色溶液的吸光度，又据公式可求各自的T ：
邻二氮菲分光光度法测定微量铁 一、实验目的 1、学会吸收曲线及标准曲线的绘制，了解分光光度法的基本原理。 2、掌握用邻二氮菲分光光度法测定微量铁的方法原理。 3、学会722型分光光度计的正确使用，了解其工作原理。 4、学会数据处理的基本方法。 5、掌握比色皿的正确使用。 二、实验原理 根据朗伯-比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。同时，还可应用相关的回归分析软件，将数据输入计算机，得到相应的分析结果。 用分光光度法测定试样中的微量铁，可选用显色剂邻二氮菲，邻二氮菲分光光度法是化工产品中测定微量铁的通用方法，在pH值为2-9的溶液中，邻二氮菲和二价铁离子结合生成红色配合，此配合物的lgK =21.3，摩尔吸光ε510=1.1×104L·mol-1·cm-1， 稳 =14.1。所以在加入显色剂之而Fe3+能与邻二氮菲生成3∶1配合物，呈淡蓝色，lgK 稳 前，应用盐酸羟胺(NH2OH·HCl)将Fe3+还原为Fe2+，其反应式如下： 2Fe3++2NH2OH·HCl→2Fe2++N2+H2O+4H++2Cl- 测定时酸度高，反应进行较慢；酸度太低，则离子易水解。本实验采用HAc-NaAc 缓冲溶液控制溶液pH≈5.0，使显色反应进行完全。为判断待测溶液中铁元素含量，需首先绘制标准曲线，根据标准曲线中不同浓度铁离子引起的吸光度的变化，对应实测样品引起的吸光度，计算样品中铁离子浓度。 本方法的选择性很高，相当于含铁量40倍的Sn2+、Al3+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、SiO32-；20倍的Cr3+、Mn2+、VO3-、PO43-；5倍的Co2+、Ni2+、Cu2+等离子不干扰测定。但Bi3+、Cd2+、Hg2+、Zn2+、Ag+等离子与邻二氮菲作用生成沉淀干扰测定。
分光光度计是化学分析中常用的一种仪器，用于测量吸光度、透射率、反射率等参数，从而定量分析物质浓度。在使用分光光度计进行分析时，有两种常用的方法：标准曲线法和标准管法。本文将从深度和广 度方面对这两种方法进行全面评估，并探讨它们各自的优缺点。 一、分光光度计标准曲线法 1. 基本原理 标准曲线法是通过建立一系列浓度已知的标准溶液，测定它们的吸光度，然后绘制标准曲线（吸光度与浓度的关系曲线）。利用标准曲线，可直接通过待测溶液的吸光度值确定其浓度。 2. 优点 （1）精确度高：标准曲线法通过多点拟合，可以得到较精确的浓度值。（2）灵活性强：可以根据需要调整标准曲线的范围和斜率，适用于不同测量要求。 3. 缺点 （1）耗时耗材：建立标准曲线需要大量标准溶液和实验时间。 （2）可能存在误差：标准曲线法容易受到实验条件、操作技巧等因素的影响，导致测量误差。 二、分光光度计标准管法
1. 基本原理 标准管法是通过直接比较待测溶液的吸光度与标准溶液的吸光度来确定浓度。通常是在同一仪器上分别测定标准溶液和待测溶液的吸光度值，然后进行比较计算。 2. 优点 （1）简便快捷：不需要建立标准曲线，节省了大量时间和实验操作。（2）操作方便：只需进行一次测量，减少了实验中的操作环节和可能引入的误差。 3. 缺点 （1）精确度受限：标准管法受限于仪器本身精度和灵敏度，可能影响测量结果的精确度。 （2）适用范围窄：只适用于浓度较小的待测溶液，不适用于浓度较高或较低的情况。 总结回顾 分光光度计的标准曲线法和标准管法各有优缺点。标准曲线法精确度高、灵活性强，但耗时、耗材，并且容易受误差影响；标准管法简便快捷、操作方便，但精确度受限，适用范围窄。在实际应用中，可以根据实验要求和条件选择合适的方法进行分析。
分光光度法 云南先锋化工有限公司质量监测中心 1、分光光度法引言 （1）概念：分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。（是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。） （2）阐述概念：在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到不同波长相对应的吸收强度。如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。上述的紫外光区与可见光区是常用的。但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。 （3）特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、快速。对于复杂的组分系统，无须分离即可检测出其中所含的微量组分的特点。（4）波长范围 (1)200～400nm的紫外光区，(2)400～760nm的可见光区， (3)2.5～25μm(按波数计为4000cm<-1>～400cm<-1>)的红外光区。
2、分光光度法的原理 • Lambert 定律：一束单色光在通过透明溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液浓度不变，则溶液的厚度越大，光线强度的减弱也越显著，即光吸收的量与溶液的厚度成比例关系。若以I 0表示入射光强度，I 表示透过光强度，L 表示溶液的厚度， 而I/ I 0表示光线透过溶液的程度，称为透光率，用T 表示，则T= I/ I 0。K 为消光系数，在入射波长、溶液种类和温度一定的条件下，K 是一个定值。 • Beer 定律：一束单色光在通过透明溶液时，若溶液的厚度不变，则溶液浓度愈高，光线强度的减弱也愈显著，即溶液对光的吸收与溶液的浓度成比例关系。 分光光度法的原理 • Lambert-Beer （朗伯比尔）定律：如果同时考虑液层厚度和溶液浓度对光吸收的影响，将Lambert 和Beer 定律合并，描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系。 A=kcl 3、如何求被测组分的含量 (1).利用标准管计算测定物的含量 ＋ ＝
标准曲线测试注意事项 分析检测中测试标准曲线目的是可以根据标准曲线查出待测物质的含量，所以标曲的制定是实验室工作中必不可少的工作。在真实的实验过程中，测试标注曲线会遇到各式各样的问题，比如标准曲线弯曲、线性不够好等问题，造成不同情况的原因是什么呢？本文介绍一下。 测试要不要做平行样？应该怎样做平行样？常见原子吸收分光光度计用途及测试事项分析，实验室原始记录错误如何修改？检测报告有没有有效期？为什么要做能力验证？怎么做？关于实验室作业指导书，盘点实验室能力验证常见不满意结果的原因，检测方法的验证及确认，方法验证全知识点解读，如何做方法验证，国家标准的规定。盘点实验室能力验证常见不满意结果的原因，实验室溶液配制方法与技巧，化学分析方法确认和验证指南。 前期测试注意事项 1、仪器校验好。 2、移取液体体积要精确，保证迅速准确，尽可能用一根移液管；为减小人为误差同一种液体要一个人操作。 3、保证标准品的纯度，所用标准品最好是新打开的，纯度较高的固体或溶液，防止污染。 4、容器要保证洁净。
5、根据标准品理化性质注意加样的先后顺序。 6、如果要测OD值，应保证测前各管液体充分混匀。 7、若还是有某个点误差较大，应舍弃。 8、样品的浓度等指标是根据标准曲线计算出来的，所以首先要把做标准曲线看作是比做正式实验还要重要的一件事，否则后面的实验结果无从谈起。 9、设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较大的跨度，并且要能涵盖你所要检测实验样品的浓度，即样品的浓度要在标准曲线浓度范围之内，包括上限和下限。而对于呈S型的标准曲线，尽量要使实验样品的浓度在中间坡度最陡段，即曲线几乎成直线的范围内。 10、最好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度，这样就能够保证标准样品的浓度不会出现较大的偏离。 11、检测标准样品时，应按浓度递增顺序进行，以减少高浓度对低浓度的影响，提高准确性。 12、标准曲线的样品数一般为7个点，但至少要保证有5个点。 13、做出的标准曲线相关系数因实验要求不同而有所变动，但一般来说，相关系数R至少要大于0.98，对于有些实验，至少要0.99甚至是0.999。 测试标准曲线所遇问题
分光光度法测定铁含量的方法 1.样品预处理： a.将待测样品采集到容器中，并通过适当的方法进行处理。如果样品 中存在与铁有害相互作用的物质，需要先进行前处理，如沉淀、过滤等， 以消除干扰。 b.对于含有金属离子的样品，也需要进行特殊处理，如用络合剂溶解。 c.需要将样品稀释到适当的浓度范围内，以确保测量结果的准确性。 2.制备标准曲线： a.准备一系列已知浓度的标准溶液，其含有已知浓度的铁离子。 b.使用浓度与吸光度之间的线性关系，通过分光光度法测量标准溶液 的吸光度。 c.将吸光度值绘制到图表上，然后通过回归分析得出标准曲线方程。 3.测量样品： a.使用分光光度计，选择合适的波长，一般为铁离子的吸收峰波长。 b.用纯溶剂（作为空白）调零仪器，并将样品放入测光池中进行测量。 c.测量样品的吸光度，根据标准曲线确定其铁离子的浓度。 需要注意的是，分光光度法测定铁含量时，可能会遇到一些干扰因素，如有机物的存在、其他金属离子的共存等。为了准确测定铁含量，可以采 取以下方法应对干扰： a.进行样品预处理，去除与铁有害相互作用的物质。
b.使用合适的络合剂，沉淀其他金属离子以免干扰。 c.选择适当的波长，避免有机物对测定结果的影响。 d.使用内标法，通过引入非干扰的物质作为内标物质，来减小干扰。 除了常规的分光光度法外，还可以使用原子吸收光谱法、离子色谱法、等离子发射光谱法等方法来测定铁含量，这些方法也具有高灵敏度和高准 确性。 总之，分光光度法是一种简单、快速、准确的测定铁含量的方法。通 过适当的样品预处理和标准曲线的制备，可以实现对溶液中铁含量的精确 测量。同时，应注意干扰因素的存在，采取相应的措施来提高测量结果的 准确性。
分光光度法原理 一、分光光度原理 1、分光光度法 分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。 在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。如以波长(λ)为横坐标，吸收强度(A)为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法;用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。上述的紫外光区与可见光区是常用的。但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。 2、基本原理 当一束强度为I的单色光垂直照射某物质的溶液后,由于一部分光被0 体系吸收,因此透射光的强度降至I,则溶液的透光率T为: I/ I 0 根据朗伯(Lambert)-比尔(Beer)定律: A=abc 式中A为吸光度，b为溶液层厚度(cm)，c为溶液的浓度(g/dm^3)， a为吸光系数。其中吸光系数与溶液的本性、温度以及波长等因素有关。溶液中其他组分(如溶剂等)对光的吸收可用空白液扣除。 由上式可知，当固定溶液层厚度L和吸光系数时，吸光度A与溶液的浓度成线性关系。在定量分析时，首先需要测定溶液对不同波长光的吸收情况(吸收光谱)，从中确定最大吸收波长，然后以此波长的光为光源，测定一系列已知浓度c溶液的
吸光度A，作出A-c工作曲线。在分析未知溶液时，根据测量的吸光度A，查工作曲线即可确定出相应的浓度。这便是分光光度法测量浓度的基本原理。 上述方法是依据标准曲线法来求出未知浓度值，在满足要求(准确度和精密度)的条件下，可以应用比较法求出未知浓度值。 二、仪器原理 依据分光光度法测量原理，把比较法应用到仪器之中——浓度直读功能。用标准溶液将仪器调整好，再测定样品时，直接显示样品浓度值。仪器主要结构功能块: 1(PLC 自动检测仪器的核心组成部分，通过运行检测程序和链接显示器以及其他外部设备，实现在线自动检测、数据储存于采集、远程控制等。 2(进样、计量装置 蠕动泵: 九通阀:实现多个反应试剂及样品的进液 计量装置:控制反应试剂及样品进样量 3(光源 发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度，稳定。(稳压装置) 4(反应池(吸收池) 检测时的化学反应均在反应池内进行，反应结束后被测试液将由检测系统将信号传输并分析。因此，反应池有两个作用:一是作为分光光度检测的化学反应装置;二是作为分光光度检测的比色皿。 玻璃—能吸收紫外光，仅适用于可见光区 石英—不吸收紫外光，适用于紫外和可见光区 5(检测系统
【2017年整理】标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量 一、标准曲线 一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。 二、蛋白质含量测定方法 1、凯氏定氮法 2、双缩脲法 3、Folin-酚试剂法 4、紫外吸收法 5、考马斯亮蓝法 三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作 (一)、试剂: 1、考马斯亮蓝试剂: 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% HPO，34 加蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝 乙醇，8.5%(W/V)HPO。 G—250,4.7%(W/V)34 2、标准蛋白质溶液: 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同 0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。 (二)、器材: 1、722S型分光光度计使用及原理 2、移液管使用
(三)、标准曲线制作: 1、 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 100ug/ml标准蛋白(ml) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.15mol/L NaCl (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 考马斯亮蓝试剂 (ml) 5 5 5 5 5 5 5 摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色 A595nm 2、以A为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、595nm 40 ug、50 ug、60 ug)，在坐标轴上绘制标准曲线。 1)、利用标准曲线查出回归方程。 2)、用公式计算回归方程。 3)、或用origin作图，测出回归线性方程。即A=a×X( )+6 595nm一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。 4)、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。 (四)、蛋白质含量的测定: 样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内)，依照操作步骤1操作，测出样品的A，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。 595nm 一般被测样品的A值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A值太595nm595nm 大，可以稀释后再测A值，然后再计算。 595nm (五)、注意事项: 1、玻璃仪器要洗涤干净。 2、取量要准确。
基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，称为吸光光度法。根据物质对不同波长范围的光的吸收，吸光光度法包括比色分析，可见与紫外分光光度法以及红外吸收光谱分析等。包括比色分析和分光光度法的吸光光度法（简称光度法），历史悠久，应用十分广泛。它是现代分析化学中的“ 常规武器” 。其主要特点为： 1 、灵敏度高：与滴定分析和重量法相比，光度法具有很高的灵敏度，测定物质的浓度下限（最低浓度）一般可达10-5～10-6 mol?L-1，相当于含量低于0.01 ～0.001 ％的微量组分。 2 、准确度较高：分光光度法的相对误差一般为2 ～5 ％，但对微量组分的测定是允许的。例如测定试样中含量为 0.02 ％的杂质，即使相对误差为±5 ％，则测定的结果为0.019 ～0.021 ％，这样的结果应该认为是很准确的。 3 、操作简便、快速、应用广泛：比色分析和分光光度法无需复杂，昂贵的仪器设备，操作也比较简便，分析速度快。例如钢铁中Mn 、P 、Si 三元素的快速比色分析，一般在 3 －4min 内可报出结果。几乎所有无机离子和许多有机化合物都可直接或间接地用光度法测定。 本章主要讨论比色分析和可见光区的吸光光度法。
1 物质对光的选择性吸收 1.1 光的基本性质 比色分析和分光光度法的依据是物质对光的选择性吸收。为此，必须对光的基本性质有所了解。 我们知道，光是一种电磁辐射，具有波动性和微粒性。光在传播时表现了它的波动性，例如光的折射、衍射、偏振和干涉等现象。描述波动性的主要物理量是波长（λ ）、频率（ν ）和速度（с ），它们的关系是： λν ＝с 式中с 为光速，在真空中约等于3×108 m ·s-1；ν 为光的频率，以Hz 表示；λ 为光的波长，在紫外和可见光区，以纳米（1nm=10-9 m ）为单位。波长在400 ～760 nm 范围内的电磁辐射，人眼可以看见，称为可见光；波长在10 ～400 nm 是紫外光区。理论上将具有同一波长的光称为单色光，由不同波长的光组合成复合光。我们日常所见到的白光（如日光和白炽灯光）就是波长范围在400 ～760 nm 之间的复合光。白光通过棱镜后可以分解为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等七种颜色的光，各种颜色的光具有一定的波长范围。反过来，这些不同的光也可以按比例混合得到白光，而且不仅七种色光可以混合成白光，如果把适当颜色的两种色光按一定强度比例混合，也可
分光光度计使用要点 一、分光光度计的基本原理 分光光度计是一种用来测量物质溶液中的吸光度的仪器。它的基本原 理是根据琴斯特方程：A = εlc，其中A为吸光度，ε为摩尔吸光系数，l为路径长度，c为溶液浓度。分光光度计利用光源产生光束，经过样品 池后，光束会与样品发生相互作用，进而测量吸光度。 二、分光光度计的使用要点 1.样品准备：在进行分光光度计测量之前，需要将待测样品准备成透 明的溶液，并确保溶液中没有悬浮物和杂质，以避免对光学系统的干扰。 2.测量波长选择：根据样品的特性和需要测量的吸光度范围，选择合 适的测量波长。对于测量吸光度随时间变化的反应过程，可以进行多波长 连续测量。 3.校准仪器：在进行实际测量之前，应该根据厂家提供的校准方法对 仪器进行校准。校准常常包括空白校准和全程校准。空白校准是在无样品 的情况下，将仪器的读数调整为零值。全程校准是使用已知浓度的标准溶 液进行校准，以建立浓度和吸光度之间的线性关系。 4.设置测量参数：根据测量的需要，设置适当的光通量、路径长度、 测量次数、积分时间等参数。一般情况下，光通量越大，测量结果越准确；路径长度越长，灵敏度越高；测量次数和积分时间需要根据样品的吸光度 范围和仪器的要求选择。
5.保持恒温：在测量过程中，要保持恒定的温度，避免温度的变化对测量结果产生影响。可以使用温度控制器和温度传感器对仪器进行温度控制。 6.数据分析：根据测量结果绘制吸光度与浓度的标准曲线，并应用标准曲线对待测样品的浓度进行计算。根据需要，还可以进行数据处理、统计分析等操作，以获得更加准确和可靠的结果。 三、分光光度计的注意事项 1.防止光路污染：使用分光光度计时，要确保光路中的透镜、镜片等光学元件干净无尘，并避免手指或其他物体直接接触光学元件，以免影响测量的准确性。 2.避免温度和湿度变化：分光光度计的测量精度容易受到环境温度和湿度的影响。因此，在测量过程中要避免温度和湿度的变化，可以通过恒温器和湿度控制器来控制实验环境。 3.注意溶液的浓度范围：分光光度计的线性范围是有限的，过高或过低的浓度可能会超出仪器的线性测量范围，导致测量结果不准确。因此，在进行测量前要确定样品的适宜浓度范围，避免超量程测量。 4.规范操作流程：使用分光光度计时，应按照操作手册上的要求进行操作，严格控制实验条件和环境，避免操作失误和误差的产生。 5.定期校准：根据实验室的要求和设备的性能，定期对分光光度计进行校准，以确保测量结果的准确性和可靠性。 总之，分光光度计是一种常用的实验仪器，使用正确的方法和注意事项可以获得准确、可靠的测量结果。在进行实验前，要仔细阅读仪器的操作手册，了解各种参数和功能的设置方法。并根据实验的需要对样品进行
bca法测蛋白浓度实验报告 BCA法测蛋白浓度实验报告 引言： 蛋白质是生物体内重要的基础组分，对于细胞的生命活动起着至关重要的作用。因此，准确测定蛋白质浓度对于生物学研究和医学诊断具有重要意义。本实验 旨在使用BCA法（Bicinchoninic Acid Assay）测定蛋白质浓度，并探讨其原理 和应用。 实验步骤： 1. 制备标准曲线 首先，准备一系列已知浓度的蛋白质标准溶液。将一定浓度的蛋白质标准溶液 分别加入不同的试管中，每个标准溶液重复3次。然后，加入适量的BCA试剂，并在37°C恒温水浴中孵育30分钟。之后，冷却至室温，使用分光光度计测定 吸光度值。 2. 处理待测样品 将待测样品稀释至适当浓度，使其在标准曲线范围内。然后，按照相同的步骤 处理待测样品，加入适量的BCA试剂，并孵育30分钟。 3. 测定吸光度值 使用分光光度计测定标准曲线和待测样品的吸光度值。确保在合适的波长下进 行测量。根据标准曲线和待测样品的吸光度值，计算出待测样品的蛋白质浓度。实验结果： 根据实验数据，我们制作了标准曲线并计算出待测样品的蛋白质浓度。标准曲 线呈现出良好的线性关系，吸光度与蛋白质浓度呈正相关。通过对待测样品的
吸光度值进行测定和计算，我们得到了待测样品的蛋白质浓度。 实验讨论： BCA法是一种常用的测定蛋白质浓度的方法，其原理是利用蛋白质与BCA试剂中的铜离子发生络合反应，形成紫色络合物。这种络合物在560 nm波长下的吸光度与蛋白质浓度成正比。通过制备标准曲线，我们可以根据待测样品的吸光度值，计算出其蛋白质浓度。 然而，BCA法也存在一些限制。首先，BCA法对于某些干扰物质如还原剂、络合剂等敏感，可能会影响测定结果。其次，BCA法对于某些特定类型的蛋白质可能不够准确，因为不同蛋白质的氨基酸组成和结构差异较大，可能会导致测定结果的误差。因此，在使用BCA法测定蛋白质浓度时，需要注意样品的特性和实验条件的选择。 结论： 通过本次实验，我们成功使用BCA法测定了蛋白质的浓度，并得到了准确的结果。BCA法作为一种常用的蛋白质浓度测定方法，在生物学研究和医学诊断中具有重要的应用价值。然而，我们也要注意该方法的局限性，并结合实际情况选择合适的测定方法。 总结： 蛋白质浓度的准确测定对于生物学研究和医学诊断至关重要。BCA法作为一种常用的测定方法，通过与BCA试剂中的铜离子发生络合反应，可以快速、准确地测定蛋白质浓度。然而，我们在使用BCA法时需要注意样品特性和实验条件的选择，以获得更准确的测定结果。
荧光分光光度计的基本原理 荧光分光光度计（Fluorescence Spectrophotometer）是一种测量物质荧光强度的仪器。它可用于分析、研究、检测生物分子的结构、功能和相互作用等领域，在生物学、化学、生物医学、制药等领域有着广泛的应用。本文将介绍荧光分光光度计的基本原理及其测量过程。 荧光的基本原理 荧光是自然界中一种常见的现象，指的是物质受到激发后放出的短波长光线，这种现象与物质的分子结构和化学成分有关。当物质受到激发后，外部能量使得其激发态能量提高，分子内部发生跃迁，最终返回到基态时发出荧光。荧光的光谱分布范围通常从400nm到750nm，与吸收光谱的重叠区有关。 荧光测量的原理 荧光的强度与物质的分子结构、环境条件和激发波长等因素有关。荧光分光光度计采用的测量原理是荧光分析，它通过激发光激发荧光，然后测量荧光发射的强度，从而分析样品中某种荧光物质的含量。 在荧光分析中，激发光的波长需要与目标荧光物质的吸收光谱重叠，以激发目标荧光物质的分子。当荧光物质受到激发后，分子会从基态到激发态跃迁，然后辐射出相应的荧光。荧光的强度与荧光物质的浓度成正比，因此可以通过测量荧光强度来计算荧光物质的浓度。 荧光强度的测量需要使用荧光分光光度计。该仪器可以选择恰当的激发波长，测量荧光发射的强度，并将荧光强度转换为相应的荧光物质浓度值。 荧光分光光度计的组成及测量过程 荧光分光光度计的组成包括光源、单色器、样品室、检测器和记录装置等。在测量过程中，样品需放置在样品室内，通过调节激发光波长和荧光发射波长来测定样品中荧光物质的浓度。 荧光分光光度计的具体测量过程如下： 1.设定激发波长：荧光分析中，激发波长需要与目标荧光物质的吸收光 谱重叠，以激发目标荧光物质的分子。通过调节单色器可以选择恰当的激发波长。 2.注入样品：样品通过样品室，可以防止激发光对测量的影响。样品需 要与激发波长重叠，并且需要稳定地放置在样品室内。
分光光度计的原理与使用 一、目的要求： 1、学会紫外-可见分光光度计的原理和使用方法 2、学会测量溶液的浓度。 二、实验原理： 1、分光光度计原理： 分光光度计是目前化验室中使用比较广泛的一种分析仪器，其测定原理是利用物质对光的选择性吸收特性，以较纯的单色光作为入射光，测定物质对光的吸收，从而确定溶液中物质的含量。其特点是灵敏度高；准确度高；测量范围广；在一定条件下，可同时测定水样中两种或两种以上的物质组分含量等。 分光光度计按其波长范围可分为可见分光光度计（工作范围360～ 800nm）、紫外-可见分光光度计（工作范围200～1000nm）和红外分光光度计（工作范围760～4000nm）等。 2、在日常使用及维护当中应注意以下几点： 第一，在使用仪器前，必须仔细阅读其使用说明书。 第二，若大幅度改变测试波长，需稍等片刻，等灯热平衡后，重新调零及满度后，再测量。 第三，指针式仪器在未接通电源时，电表的指针必须位于零刻度上。若不是这种情况，需进行机械调零。 第四，操作人员不应轻易触动灯泡及反光镜灯，以免影响光效率。 第五，放大器灵敏度换挡后，必须重新调零。 第六，比色皿使用时要注意其方向性，并应配套使用，以延长其使用寿命。
新的比色皿使用前必须进行配对选择，测定其相对厚度，互相偏差不得超过2%透光度，否则影响测定结果。使用完毕后，请立即用蒸馏水冲洗干净（测定有色溶液后，应先用相应的溶剂或（1+3）的硝酸进行浸泡，浸泡时间不宜过长，再用蒸馏水冲洗干净），并用干净柔软的纱布将水迹擦去，以防止表面光洁度被破坏，影响比色皿的透光率。第七，比色皿架及比色皿在使用中的正确到位问题。首先，应保证比色皿不倾斜。因为稍许倾斜，就会使参比样品与待测样品的吸收光径长度不一致，还有可能使入射光不能全部通过样品池，导致测试准确度不符合要求。其次，应保证每次测试时，比色皿架推拉到位。若不到位，将影响到测试值的重复性或准确度。 第八，干燥剂的使用问题。干燥剂失效将会导致以下问题： ①数显不稳，无法调零或满度。②反射镜发霉或沾污，影响光效率，杂散光增加。因此分光光度计应放置在远离水池等湿度大的地方，并且干燥剂应定期更换或烘烤。 第九，分光光度计的放置位置应符合以下条件： 避免阳光直射；避免强电场；避免与较大功率的电器设备共电；避开腐蚀性气体等。 3、吸光光度法测定溶液浓度原理 基于物质对不同波长的光波具有选择性吸收的能力而建立起来的分析方法。 （1）光线： 光线的波长：200nm-400nm紫外线，400-750nm可见光，>750nm红外线光具有波粒二相性，波长不同，其能量不同。 （2）物质的吸收光谱及颜色： A．物质的原子吸收光谱和原子发射光谱： 原子的最外层电子可以选择性吸收特征波长的电磁波成为激发态而产生的光谱称为原子吸收光谱。激发态原子恢复到基态，则释放出特征波长的光子，
一、测定溶液中物质的含量 可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。测定标准溶液（浓 度已知的溶液）和未知液（浓度待测定的溶液）的吸光度，进行比较，由于所用吸收池的厚度是一样的。也可以先测出不同浓度的标准液的吸光度，绘制标准曲线,在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线，然后测定出未知液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。 含量测定时所用波长通常要选择被测物质的最大吸收波长，这样做有两个好处： ⑴灵敏度大，物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异； ⑵可以避免其它物质的干扰。 二、用紫外光谱鉴定化合物 使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横座标，以吸光度为纵座标绘制吸光度——波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。各 种物质有它自己一定的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。当一种未知物质的吸收光谱曲线和某一已知物质的吸收光谱曲线开关一样时，则很可能它们是同一物质。一定物质在不同浓度时，其吸收光谱曲线中，峰值的大小不同，但形状相似，即吸收高峰和低峰的波长是一定不变的。紫外线吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物表现出吸收峰。紫外吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。除了特殊情况外，单独依靠紫外吸收光谱决定一个未知物结构，必须与其它方法配合。紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。 选几个体积梯度，然后稀释成相同的体积，得到了不同浓度C的几个标准 溶液样组，用紫外分光光度计分别测得相应的吸光度A1、A2、A3••…，然后要以浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制曲线。当然有时候根据实际需要，也会有小小的变动。 配制标准溶液，用紫外可见分光光度计测量，得到浓度与吸光度的曲线，并且利用线性拟合得到回归方程，直接利用Origin的线性拟合功能得到的方程往往截距不等于零，即方程的形式为y=A+Bx。那是否需要强制令A=0,再来进行拟合呢？如果 y=A+Bx这样的形式可以，那么A需要多小才是可以接受的？ 答：如果用样品空白溶液做参比，一般可以设置强制过零点；如果用蒸储水做参比，一般不能强制过零点。 做曲线时一是要带双空白并减去空白A0,二是应加0回归。减去A0是希望消除试验方法固定偏倚对校准曲线的影响，当用校准曲线来估计未知样的浓度时，要考虑到试样的测量吸光度也会受到固定偏倚的影响，如果校准曲线和试样 测定过程中出现的偏倚一样，偏倚是无需校正的，可有时两者的操作往往不是同时同批进行的，如由于时间或批次不同，固定偏倚有所变化，那么两者的吸光度就要做不同的校正。即在每批分析时带空白，并对相应的信号进行校正。试验证明加零回归的校准曲线与不加零回归校准曲线比较，两者的r和b值均无差异， 但加零回归校准曲线截距a的绝对值明显变小，因此在作校准曲线的回归计算时必须加零回归，使回归线接近原点。 截距a对低浓度样品计算却影响甚大。尤其是当样品浓度接近空白浓时，用回归方程计算时会出现负值，这是因为校准曲线回归后截距a＞空白信号值所致，
分光光度技术的基本原理及应用 有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长线的吸收能力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。有些无色溶液，光虽对可见光无吸收作光光度技术吸收用，但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。分光谱来鉴定物质性质及含量的技术，其理论依据是（分光光度法）主要是指利用物质特有的Lambert 和Beer定律。 分光光度法是比色法的发展。比色法只限于在可见光区，分光光度法则可以扩展到紫外光区和红外光区。比色法用的单色光是来自滤光片，谱带宽度从40-120nm,精度不高，分光光度法则要求近于真正单色光，其光谱带宽最大不超过3-5nm,在紫外区可到1nm以下，来自棱镜或光栅，具有较高的精度。 基本原理 一、光的基本知识 光是由光量子组成的，具有二重性，即不连续的微粒和连续的波动性。波长和频率是光的波动性和特征，可用下式表示： 式中λ为波长，具有相同的振动相位的相邻两点间的距离叫波长。V为频率，即每秒钟振动次数。C为光速等于299770千米/秒。光属于电磁波。自然界中存在各种不同波长的电磁波，列成表1-1所示的波谱图。分光光度法所使用的光谱范围在200nm-10μ（1μ= 1, 000nm ）之间。其中200nm-400nm为紫外光区，400nm-760nm为可见光区，760nm-10,000nm为红外光区。 二、朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律
朗伯-比尔定律是比色分析的基本原理，这个定律是有色溶液对单色光的吸收程度与溶液及液层厚度间的定量关系。此定律是由朗伯定律和比尔定律归纳而得。 一束单色光通过溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，光的强度就要减弱：若溶液浓度不变，则溶液的厚度愈大（即光在溶液中所经过的途径愈长），光的强度减低也愈显着。 如果同时考虑吸收层的厚度和溶液浓度对光吸收的影响，则必然将朗伯定律和比尔定律合并起来，吸光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比，这就是朗伯-比尔定律。 分光光度计基本结构简介 能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器称为分光光度计。 分光光度计因使用的波长范围不同而分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用（全波段）分光光度计等。无论哪一类分光光度计都由下列五部分组成，即光源、单色器、狭缝、样品池，检测器系统。 一、光源 要求能提供所需波长范围的连续光谱，稳定而有足够的强度。常用的有白炽灯（钨比灯、卤钨灯等），气体放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等多种。 钨灯和卤钨灯发射320-2000nm连续光谱，最适宜工作范围为360-1000nm,稳定性好，用作可见光分光光度计的光源。氢灯和氘灯能发射150-400nm的紫外结，可用作紫外光区分光光度计的光源。红外线光源则由纳恩斯特（Nernst）棒产生，此棒由ZrO2:Y2O3=17:3（Zr为锆，
测定阿司匹林药片的含量-分光光度法 一、【实验目的】 1.了解应用可见分光度法测定阿司匹林药片的方法。 2.熟练掌握722（721）型分光光度计的操作方法。 3.掌握吸收曲线和标准曲线的绘制 二、【实验原理】 阿司匹林，由水杨酸合成的白色晶体化合物，CH 3COOC 6H 4C00H ，常以片剂的方式用于减轻疼痛，退烧及消炎。 阿司匹林主要成分为乙酰水杨酸，其中酯基在碱性中可与羟胺反应生成羟肟酸，后者在酸性条件下与三氯化镁形成红色的羟肟酸铁，此物质的最大吸收波长为520nm 。且在一定浓度范围内符合Lambert-Beer 定律。可采取标准曲线法求出阿司匹林药片中阿司匹林的含量。 标准对照法：在相同测定条件下，可分别测出标准溶液和待测溶液的吸光度，代入公式： A 标准=abc 标准 A 待测=abc 待测 将两式相除可求得待测溶液的浓度： A 标准A 待测 = c 标准c 待测 c 待测= A 待测A 标准 ×c 标准 标准曲线法：同时测定一系列已知准确浓度的标准溶液的吸光度，并以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制成标准曲线（或称工作曲线），在同等条件下，测定待测溶液的吸光度后，即可从标准曲线上查出该吸光度所对应的溶液浓度。 为提高测定灵敏度，通常选取最大吸收波长λmax 作为测定的入射光。通过测定待测溶液在不同波长下的吸光度A ，以吸光度A 为纵坐标，波长λ为横坐标，可得吸收光谱图，从图中可找出最大吸收波长λmax 。 三、【仪器材料和试剂】 仪器：722（721）型分光度计，容量瓶（25ml ×5），吸量管（1ml ×5，2ml ），比色管（25ml ×6），滴管，洗瓶，烧杯（200ml 、100ml ），分析天平 材料与试剂：2mol ·L -1NaOH ，4mol ·L -1HCl ，10％FeCl 3，0.5g ·L -1乙酰水杨酸乙醇溶液，7％盐酸羟胺乙醇液，阿司匹林样品液 四、【实验步骤】 取适量阿司匹林药片称重，制成样品溶液，按表1-1所示，分别取0.5mg ·ml -1乙酸水杨 酸乙醇液0.00ml ﹑0.50ml 、1.00ml 、1.50ml 、2.00ml 和阿司匹林样品溶液1.00ml 置于25ml 容量瓶中 ↓ 各加入7%盐酸羟胺乙醇液1.00ml ，2 mol ·L -1NaOH 1.00ml ，静置三分钟 ↓ 加入4mol ·L -1HCl 和10％FeCl 3各1.00ml ↓ 加水至刻度线处，摇匀 ↓ 放置十分钟后备用 ↓