碳酸二甲酯作甲基化试剂的研究
【摘要】绿色化学概念出现之后，人们对低毒、无污染原料的使用呼声日渐升高，人们更多地重视在化学中使用对空气及人体无危害的化学制品。甲基化在化学及工业生产中是一种应用很广泛的反应。一般情况下人们都把碘甲烷、一卤代甲烷或格氏试剂等当作甲基化试剂使用。通常使用的甲基化试剂都是由剧毒物质构成的，因此，所有经过甲基化后的物质的生产过程及使用都应特别注意。稍有不慎就会造成人员中毒甚至更严重的情况发生，在这种情况下，寻找替代物就变得尤为迫切和重要。对此本文介绍了低毒且无污染的碳酸二甲酯的基本特点，并对其进行了研究。
【关键词】碳酸二甲酯甲基化试剂
碳酸二甲酯是工业中的重要原料，它可以与多种化学物质进行反应，并生成新的物质，如甲胺基甲酸萘酯等。它的毒性小，因此能够作为汽油添加剂、油漆涂料、清洁剂等使用，又由于它对空气无污染，所以它是一种绿色原料。如今化肥、化工企业一直承受着政府部门施加的法律法规压力。因此，相关企业应提高生产水平，但同时也须注意对环境的影响。碳酸二甲酯就是这些企业生产过程中的不二之选。
1 碳原子甲基化
1.1 芳基乙腈和芳基乙酸甲酯的甲基化
化学家曾经对碳酸二甲酯和芳基乙腈的甲基化反应深入的研究实验，并且在实验的最后得出了结论。该实验的反应条件为气-液
DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。 第一步：试剂准备 （1）3 M NaOH原料（用前现配） 把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。 （2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配） 配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。 （3）溶解试剂Ⅰ（用前现配） 打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。试剂Ⅰ避光保存以免分解。为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。 （4）溶解试剂Ⅱ 打开前将试剂瓶加温至室温。将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。充分混合确保完全溶解。过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。 第二步：DNA修饰程序 1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中（10ng/μl），混匀。 注意：如果样本含有的DNA量不到1.0μg，就向样本DNA中加入2 μl DNA修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。再加入7.0μl 3M NaOH并混匀。 2、50℃ DNA孵育10分钟（加热块或水浴）
第17卷 第1期 2003.3 沈 阳 化 工 学 院 学 报 JOURNAL OF SHEN YAN G INSTITU TE OF CHEMICAL TECHNOLO GY Vol.17 No.1 Mar.2003 文章编号: 1004-4639(2003)01-0001-03 用碳酸二甲酯和环戊二烯制备甲基环戊二烯的研究 张建西, 张大洋, 刘瑞祥, 赵鸣玉 (沈阳化工学院,辽宁沈阳110142) 摘 要: 以碳酸二甲酯为甲基化试剂,在二乙二醇二甲醚溶剂中,进行环戊二烯催化甲基化的研究.通过实验考察反应温度、反应时间、物料配比、催化剂量及碘化钾试剂对甲基环戊二烯产率的影响,确定反应最佳条件,甲基环戊二烯产率达8518%. 关键词: 碳酸二甲酯; 甲基环戊二烯; 环戊二烯; 合成中图分类号: TQ23112 文献标识码: A 收稿日期: 2002-07-12 作者简介: 张建西(1978-),男,山西原平人,硕士,主要从事精细化学品和有机化工产品的合成研究. 甲基环戊二烯是一种重要的有机化工原料,可用来制备环氧树脂固化剂MNA [1],也可用于合成MM T (甲基环戊二烯三羰基锰)[2].但是,甲基环戊二烯与环戊二烯相比,在乙烯裂解所产生的C 52C 6组分中含量很少.因此,以环戊二烯为原料,经过甲基化反应制备甲基环戊二烯的研究,具有十分重要的意义. 碳酸二甲酯(简称DMC )是近年来发展起来的一种新型“绿色”化工产品.它能代替剧毒的光气生产多种异氰酸酯、聚碳酸酯等及各种医药农药中间体.作为甲基化试剂,可代替剧毒的硫酸二甲酯.近年来,实验表明它是一种优良的甲基化、羰基化试剂[3].对于碳酸二甲酯,文献报道一般为在其它杂原子(如氧、氮等杂原子)上甲基化,而在碳原子上甲基化报道很少. 以碳酸二甲酯为甲基化试剂,与环戊二烯和钠反应制备甲基环戊二烯.结果表明:此方法具有反应时间短、产物产率高、无污染物排放、后处理方便、无污染等优点.这是一条与环境友好的符合可持续发展战略的工艺路线. 1 实验部分 111 主要仪器与药品 仪器:阿贝折光仪WZS 2Ⅰ型,上海光学仪器 厂;SP501型气相色谱仪;CDMC 21B 色谱数据处 理器,上海计算技术研究所. 药品:金属钠,分析纯,天津丽东区大东化工厂;双环戊二烯,83%工业品,辽化;二乙二醇二甲醚,分析纯,苏州工业园区正兴化工研究院;碳酸二甲酯,化学纯,上海石油化工有限公司. 分析条件:色谱柱:Φ3mm ×3m ;固定液:聚乙二醇20mol 10%;担体:Chromosorb G AW 2DMCS ,60～80目;柱温:70℃;汽化室:190℃;热导池检测器:150℃;桥电流:190mA ;氢气流速:60mL/min ;进样量:013μL.112 反应方程式 反应方程式如下: 113 甲基环戊二烯的制备 在通有氮气的干燥的250mL 圆底三口烧瓶中分别加入140mL 二乙二醇二甲醚,810g 金属钠,加热至钠呈熔融的液体状态时,立即开动搅拌器,将钠打成细小微粒,制成钠砂.将45g 新蒸环戊二烯滴入钠砂中,很快便可以观察到有大量气
DNA甲基化——试剂盒+抗体解决方案 DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。 一、DNA甲基化修饰相关产品 DNA甲基化修饰研究手段——DNA亚硫酸盐转化，使用亚硫酸氢钠将胞嘧啶转化为尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶（5-mC）保持完整。即未甲基化的胞嘧啶残基被脱氨成尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶（5-mC）残基不受影响，这使PCR扩增可将尿嘧啶视为胸腺嘧啶，将5-mC或5-hmC识别为胞嘧啶。这样便能够区分甲基化和未甲基化的胞嘧啶残基，从而提供有关DNA甲基化区域的单核苷酸分辨率信息。 要成功地进行DNA甲基化研究，必须进行完全转化，并减少通常由于严酷的化学反应而导致的DNA降解量。基于亚硫酸氢盐和亚硫酸氢钠的方法是用于研究DNA甲基化并帮助制备基因组DNA进行基因特异性DNA甲基化分析的常用方法。亚硫酸氢盐转化后通常是下游应用，在基因特异性基础上分析DNA甲基化的流行下游方法包括亚硫酸氢盐测序，甲基化特异性PCR（MS-PCR）和基于甲基化的微阵列。 整个转换过程中，高质量的DNA是至关重要的，因为转换过程中的酸性物质会破坏DNA。而对于大规模亚硝酸氢盐转化实验，高通量选择对于节省时间和降低成本至关重要。 此外，还有高通量DNA修饰试剂盒，EpiNext高灵敏度亚硫酸氢盐测序试剂盒（Illumina），一步法DNA 修饰试剂盒，Methylamp通用甲基化DNA试剂盒，Methylamp全细胞亚硫酸氢盐修饰试剂盒等。
免疫组化操作步骤集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
免疫组化操作流程 试剂准备 1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L， KH2PO4 L。 2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。即抗原修复液 : PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。 操作流程 免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化： 脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。 从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟； 无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟； 自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） 高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰测序法） 基本原理在于：样本经亚硫氢酸盐处理后,甲基化的胞嘧啶（C）保持不变,但非甲基化的胞嘧啶被转化成脲嘧啶,因此在利用该处理产物作为模板的PCR产物中,甲基化的胞嘧啶还是胞嘧啶,但非甲基化胞嘧啶变成了脲嘧啶（胸腺嘧啶）,此时检测到的胞嘧啶（C）即是样品中本身的甲基化位点. 第一部分基因组DNA的提取。 DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。 此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。 使用两者的细节： 1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml； 2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。 验证提取DNA的纯度的方法有二： 1：紫外分光光度计计算OD比值； 2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。 我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。 第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。 1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul； 2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； 3：42℃水浴30min； 水浴期间配制： 4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色） 5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。 6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。 8：50℃避光水浴16h。 一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。 这一步细节： 1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。
DNA 甲基化重亚硫酸氢盐修饰法（DNA METHYLATION BISULFITE MODIFICATION） 实验操作原理及方法 一、实验目的： 通过本实验，可以检测特定DNA序列的甲基化状态。 二、实验原理： DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG 二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-m C）的一种化学反应。DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗传的修饰方式。 DNA 甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。DNA 甲基化引起基因转录抑制的机制可能主要有以下3 种：（1）DNA甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位置的结合。（2）序列特异性的甲基化DNA 结合蛋白与启动子区甲基化CpG 岛结合，募集一些蛋白，形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的转录。（3）DNA 甲基化通过改变染色质结构，抑制基因表达。 重亚硫酸氢盐修饰法检测DNA甲基化的基本原理是基于DNA变性后用重亚硫酸氢盐处理，可将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。此反应的步骤是：1、在C-6位点磺化胞嘧啶残基；2、在C-4处水解去氨基来产生尿嘧啶磺酸盐；3、在碱性条件下去硫酸化。在这个过程中，5-甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸氢盐进入到C-6位点而保持着未反应的状态。在重亚硫酸氢盐处理后，使用针对每个修饰后DNA链的引物进行PCR反应。在这个PCR产物中，每5-甲基胞嘧啶显示为胞嘧啶，而由未甲基化胞嘧啶转变成的尿嘧啶则在扩增过程中被胸腺嘧啶所取代。 BSP(bisulfate sequencing PCR) ：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行PCR扩增。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。
HER2检测试剂盒（免疫组化法）说明书 【产品名称】 通用名称：HER2检测试剂盒（免疫组化法） 英文名称：HercepTest? for Automated Link Platforms 【包装规格】 50测试/盒 【预期用途】 用于常规经福尔马林固定、石蜡包埋的乳腺癌组织的组织学评估和HER2的过表达的半定量检测。以及经福尔马林固定、石蜡包埋的胃腺癌组织切片，包括胃食管连接处肿瘤中的HER2的过表达检测。 该抗体着色为棕色DAB染色，定位于细胞膜。是一种半定量免疫组化分析方法，适用于考虑接受曲妥单抗治疗患者的辅助评价方法。 人HER2基因（也称之为ERBB2或NEU）编码蛋白通常称之为HER2或p185HER2。HER2蛋白是一种膜受体酪氨酸激酶，与表皮生长因子受体（EGFR或HER1）具有同源性(1-8)。HER2蛋白通常由各种表皮细胞表达，是一种正常组织成分（8）。 部分乳腺癌患者，HER2蛋白过表达是其恶性转化及肿瘤进展过程的一部分（9）。乳腺癌细胞的表面过表达HER2，提示可能是抗体治疗的一个靶点。曲妥单抗是一种人源的单克隆抗体（10），该抗体能够HER2蛋白高亲和力结合，而且，体内和体外研究已经证实，这种结合可以抑制过表达HER2蛋白的细胞的生长。 大量研究结果表明胃癌中HER2蛋白过表达，HER2基因扩增（31）。无论是IHC还是FISH检测结果中，大约20%的胃癌患者HER2阳性。体内和体外前期临床研究表明，曲妥单抗在不同的胃癌模型上被证实有效，从而带动了多项临床研究（31-35）。在一项III期BO18255临床研究中，ToGA试验，HER2-阳性患者，以及不能手术治疗局部进展期胃癌，胃部复发性/转移性胃癌，或胃食管连接处癌，这些患者被随机地分配接受5-FU或卡培他滨以及顺铂治疗，既可以单独应用也可以与曲妥单抗联合应用。在一项III期BO18255临床研究中，ToGA试验，不能手术治疗局部进展期胃癌，胃部复发性/转移性胃癌，或胃食管连接处癌等HER2-阳性患者被随机地分配接受5-FU或卡培他滨以及顺铂治疗，可单独应用也可与曲妥单抗联合应用。联合治疗的患者整体生存率（OS）有显著性差异（36,37）。曲妥单抗是一种人源化的单克隆抗体（10），可与HER2蛋白高亲和力结合，体内和体外研究均显示，其可抑制肿瘤细胞的生长（32-35）。 【检测原理】 HercepTest?检测试剂盒包含对常规处理的、石蜡包埋的样本进行两步法免疫组化染色所需要的全部试剂。兔抗人HER2蛋白一抗孵育后，该试剂盒采用基于葡聚糖技术的即用型显色试剂。该试剂包含羊抗兔二抗和偶联至葡聚糖多聚体骨架上的辣根过氧化酶分子。因此，不需要再依次使用连接抗体，人免疫球蛋白显色试剂和胎牛血清之间的交叉反应也因为使用固相吸附材料而消除。依次填加的色素原的酶转换，也使得显色反应发生于抗原所在部位。标本需要复染和封片。反应结果在光学显微镜下观察。质控玻片包含3个福尔马林固定、石蜡包埋的人类乳腺癌细胞系，染色强度分别在0、1+、以及3+，提供用于对染色结果进行评估。这些细胞的染色强度与其所表达的受体密度一致。
Data Supplement Title: Circulating methylated SEPT9 DNA in Plasma is a Biomarker for Colorectal Cancer. Theo deVos1, Reimo Tetzner2, Fabian Model1,3, Gunter Weiss2,Matthias Schuster2, Jürgen Distler2, Kathryn V. Steiger1 , Robert Grützmann5, Christian Pilarsky5, Jens K. Habermann6, Phillip R. Fleshner7, Benton M. Oubre8, Robert Day1, Andrew Z. Sledziewski1, Catherine Lofton-Day1 1) Detailed m SEPT9 Assay Protocol: DNA Extraction: DNA was extracted from 5 mL of blood plasma using a modified viral DNA/RNA extraction kit (chemagen AG, Baesweiler Germany). Plasma samples were thawed at room temperature and extracted following the directions of the kit with modifications. Samples were lysed and treated with protease at 56?C for 10 min in a 50 mL Falcon tube. 100 μL of magnetic particles and 15 mL of binding buffer were then added, and binding was performed for 60 min at room temperature on a rotator. Magnetic particles were captured for 4 min, the supernatant discarded and the pellet was resuspended in 3 mL of wash buffer. 1.5 mL of particle solution were transferred to a 2 mL SafeLock, the beads captured and the supernatant discarded. This was repeated to complete the 3 mL transfer. Tubes were briefly centrifuged and the residual wash buffer was removed by pipetting after bead separation. The tubes were then placed in a 56?C dry block for 5 min, 100 μl of elution buffer was added, the tubes incubated at 65?C with shaking on a thermomixer for 15 min, the particles separated on a magnetic stand and the eluted DNA transferred to a 0.5 mL SafeLock tube (Eppendorf). A 5μl aliquot of the DNA sample was transferred to 45 μl of elution buffer for the measurement of genomic DNA. Bisulfite Conversion: The sample input for bisulfite treatment was 95-100 μl of extracted DNA in elution buffer. The bisulfite reagents (for 25 reactions) were prepared as follows. Bisulfite solution: Sodium bisulfite (4.71gm) and sodium sulfite (1.13gm) were dissolved in 10 mL of ddH2O in a falcon tube, by vigorous shaking and heating to 50?C if required, and the pH adjusted to 5.4-5.5 with 0.2M NaOH as necessary. DME-radical scavenger solution: 188 mg of 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-chroman-2-carboxylic acid was dissolved in 1.5 mL diethyleneglycoldimethylether (DME), vortexing to ensure an uniform solution. Bisulfite Reaction: 190 μL of bisulfite solution and 30μl DME-radical scavenger solution were added to the 95-100 μl DNA sample in 0.5 mL SafeLock tubes. The tubes were incubated in a Eppendorf Mastercycler (Eppendorf)according to the following protocol: 5 min 99°C, 25min 50°C, 5 min 99°C, 1h 25min 50°C, 5 min 99°C, 4h 55min 50°C, hold 20°C. This protocol allowed overnight bisulfite conversion. Bisulfite Purification: Following bisulfite conversion, DNA was purified using a customized kit from chemagen AG. The bisulfite reaction (320 μL) was transferred to a 2 mL SafeLock tube, and 1 μLof polyA (500 ng/μL) and 1.5 mL of binding buffer were added. 10 μL chemagen magnetic particles were added and the sample was mixed by vortexing. The samples were incubated at room temperature on a thermal mixer at a rotation of 1000 rpm for 60 min. Magnetic particles were separated on a magnetic stand, the liquid discarded, the tubes briefly centrifuged and the residual liquid removed following magnetic separation. The particles were washed twice with wash buffer II from the kit, and once with 70% ethanol. Following the ethanol wash, the tubes were centrifuged again, and the residual liquid removed following magnetic
碳酸二甲酯(简称DMC)是近年来受到国内外广泛关注的环保型绿色化工产品。由于其分子中含有CH3-、CH3O-、CH3O-CO-、-CO-等多种官能团，因而具有良好的反应活性；另外，1992年DMC在欧洲通过了非毒性化学品(Non toxic substance)的注册登记，属于无毒或微毒化工产品。因此，一方面DMC有望在诸多领域全面替代光气、硫酸二甲酯(DMS)、氯甲烷及氯甲酸甲酯等剧毒或致癌物进行羰基化、甲基化、甲酯化及酯交换等反应生成多种重要化工产品；另一方面，以DMC为原料可以开发、制备多种高附加值的精细专用化学品，在医药、农药、合成材料、染料、润滑油添加剂、食品增香剂、电子化学品等领域获得广泛应用；第三，其非反应性用途如溶剂、溶媒和汽油添加剂等也正在或即将实用化。所以，DMC被誉为21世纪有机合成的一个“新基块”，其发展将对我国的煤化工、甲醇化工、C1化工起到巨大的推动作用。 1 DMC的性质 DMC结构式(CH3O)2CO，分子量为90.08，相对密度1.070，折射率1.3697；熔点4℃，沸点90.1℃。在常温下为无色液体，具有可燃性，微溶于水但能与水形成共沸物，可与醇、醚、酮等几乎所有的有机溶剂混溶；对金属无腐蚀性，可用铁筒盛装贮存；微毒(LD50＝6400~12900mg/kg，而甲醇的LD50＝3000mg/kg)。由于DMC 的化学性质非常活泼，可与醇、酚、胺、肼、酯等发生化学反应，故可衍生出一系列重要化工产品；其化学反应的副产物主要为甲醇和CO2。与光气、DMS等的反应副产物盐酸、硫酸盐或氯化物相比，危害相对较小。 2 DMC合成技术评述 DMC合成方法可分为三大类：光气法、甲醇氧化羰基化法、酯交换法。后两法将成为未来DMC的主要生产方法。 2.1 光气法 2.1.1 光气甲醇法 是最早的DMC合成方法，反应分两步进行，氯甲酸甲酯为中间产物。 COCl2十CH3OH→ClCOOCH3十HCl ClCOOCH3十CH3OH→(CH3O)2CO十HCl 总反应：COCl2十2CH3OH→(CH3O)2CO十2HCl 原料剧毒，产品含氯，且副产大量HCl，属于淘汰型工艺。一般只有生产光气的企业就近生产DMC，且须采取周密安全措施。 2.1.2 光气醇钠法 光气和甲醇钠直接反应合成DMC，是光气甲醇法的改进。 COCl2十2CH3ONa→(CH3O)2CO十2NaCl 2.2 甲醇氧化羰基化法 2CH3OH十CO十1/2O2→(CH3O)2CO十H2O 该法以CH3OH、CO和O2为原料，原料价廉易得，投资少，成本低且理论上甲醇全部转化为DMC，无其他有机物生成，受到工业界极大重视，被认为是DMC最有前途的生产方法，也是各大工业国家重点研究、开发的技术路线。 2.2.1 ENI液相氧化羰基化法 2CH3OH十1/2O2十2CuCl→2Cu(OCH3)Cl十H2O CO十2Cu(OCH3)Cl→(CH3O)2CO十2CuCl 总反应： 2CH3OH十1/2O2十CO→(CH3O)2CO十H2O 以氯化亚铜为催化剂，反应在两台串联的带搅拌的反应器中分两步进行。甲醇
甲基化DNA定量试剂盒与羟甲基化DNA定量试剂盒产品特点 --Epigentek 启维益成提供---甲基化DNA定量试剂盒(比色法) MethylFlash Methylated DNA Quantification Kit (Colorimetric) 产品优点： 1、整个比色法检测实验的操作简单易学，方便快捷，能定量检测全基因组的DNA甲基化 水平，只需要4小时就能完成实验。 2、新颖的试剂盒组分使背景信号极低，去掉了平板封闭并使分析更加地简单、精确、可靠、 稳定。 3、灵敏度高，能在50ng的基因组DNA中检测出低至0.2ng的甲基化DNA。 4、优化的抗体和增强溶液对检测5mC具有高度特异性，不会对未甲基化的胞嘧啶产生交 叉反应，且在指定的样品DNA的浓度范围内与羟甲基胞嘧啶无交叉反应或有轻微的交叉反应 5、试剂盒提供通用阳性和阴性对照，能用于定量检测任何物种来源的甲基化DNA，包括 哺乳动物、植物、真菌、细菌以及病毒； 6、96孔板模式使分析具有灵活性，您可以根据自己的需要选择用手工或者高通量分析。 启维益成提供---甲基化DNA定量试剂盒(荧光法) MethylFlash Methylated DNA Quantification Kit （Fluorometric） 产品优点： 甲基化定量试剂盒荧光法的产品优点与比色法基本相同，不同点为灵敏度不同，比色法能在50ng的基因组DNA中最低检测出0.2ng的甲基化DNA；荧光法能在20ng的基因组DNA中最低检测出50pg的甲基化DNA。 启维益成提供---羟甲基化DNA定量试剂盒(比色法) MethylFlash Hydroxymethylated DNA Quantification Kit (Colorimetric) 关于5-hmC 5-hmC是近年来在动物组织中发现的，由胞嘧啶修饰而来。5-hmC在表观遗传学上的功能可能与5-甲基化胞嘧啶(5-mC)不同，尽管到现在为止还不确知其功能。有研究者猜测它在调控基因的表达与关闭过程中起着重要的作用。5-mC的发现让我们不得不重新评估DNA
碳酸二甲酯在有机合成中的应用 摘要： 介绍新的绿色化工基本原料---碳酸二甲酯（DMC ）在有机合成中的应用. 主要介绍碳酸二甲酯参与的甲基化反应, 羰基化反应, 酯交换反应和氨解反应. 关键词：碳酸二甲酯(DMC); 光气; 甲基化; 羰基化; 酯交换; 氨解 1. 前言 碳酸二甲酯(DMC) 是一种新的低污染、环境友好型的绿色基础化工原料，对于环境保护具有重大意义。分子式为CO(OCH 3)2，其分子结构中含有一CO 、一 COOCH 3、一CH 3等多种官能团，化学性质非常活泼，作为有机合成中间体能与酚、 醇、胺、肼、酯类化合物发生反应合成许多具有特殊性质的化合物[1]。1992年它在欧洲通过了非毒性化学品的注册登记，因而在许多领域有望全面替代剧毒的光气、硫酸二甲酯、氯甲烷及氯甲酸甲酯等[2]。 2. 羰基化反应 2.1 碳酸二甲酯和3一戊酮合成丙酸甲酯. + CH 3CH 2CCH 2CH 3CH 3OCOCH 2CH 3CH 2CCHCOCH 3O O O CH3 +CH 3OH 2 CH 3CH 2COCH 3 O O 以碳酸二甲酯(DMC)和3-戊酮为原料, 以具有中强碱位的Mg 为催化剂合成丙酸甲酯[3]. 丙酸甲酯是一种重要的化工原料,可以用作香料、溶剂、萃取剂及增塑剂等，在食品、香料等行业有着广泛的应用. 2.2 碳酸二甲酯和苯乙酮反应合成苯甲酸甲酯. CCH 3+CH 3OCOCH 3 O COCH 3+CH 3COCH 3O O 碳酸二甲酯和苯乙酮在固体碱催化下合成苯甲酸甲酯. Bronsted — Lewis 酸碱离子对和固体碱表面配位不饱和的02-所造成的强碱位由有利于碳
大鼠ASIC1A ASIC1A 免疫组化试剂盒免疫组化试剂盒 该试剂盒以HRP 标记的链霉亲和素复合物（HRP Streptavidin Conjugate，HRP-SA）为基础，可用于检测细胞、组织内的特异性ASIC1A 抗原。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、定性定位准确、背景清晰。在所用的ASIC1A 一抗与相应靶抗原结合后，用生物化二抗与一抗特异性结合，最后加入HRP-SA，形成抗原—特异一抗—生物素化二抗—HRP-SA 复合物，显微镜下观察成像。 试剂盒所含试剂试剂盒所含试剂：： 试剂A 通透液：0.1% Triton-X 100 10 mL（选用） 试剂B 封闭缓冲液（封闭用） 20 mL 试剂C （原装进口分装）已稀释的即用型ASIC1A 一抗（2.5ml） 试剂D （原装进口分装）生物素化羊抗兔IgG 1支 （浓度1.5 mg/mL，稀释比为1:300~1:500）50 μL+抗体稀释液20ml 试剂E HRP-SA 复合物1支（浓度1 μM，稀释比1:50~1:200）100 μL 试剂F DAB 显色液 5ml 用户自备试剂用户自备试剂：： 1． 10mM TBS（pH7.2~7.4） 三羟基氨基甲烷1.21g 氯化钠7.6g 加蒸馏水800mL，浓盐酸调pH 值至7.2~7.4，最后定容至1000mL
TBS-T：TBS+Tween 20（0.05%体积比） 2．抗原修复液（依检测抗原不同而选择不同的修复液） 10mM pH6.0 柠檬酸缓冲液 柠檬酸0.38g 柠檬酸三钠2.45g 加蒸馏水900mL，浓盐酸调pH 值至6.0，最后定容至1000mL 或：0.5M EDTA 修复液（pH8.0） EDTA·2H2O 186.1g 柠檬酸三钠2.45g 加蒸馏水700mL，用10mM NaOH 调pH 值至8.0，最后定容至1000Ml 3. 缓冲甘油封固剂10 mL 4. Tween 20 5 mL 石蜡包埋组织切片免疫染色石蜡包埋组织切片免疫染色 实验步骤实验步骤（（建议方案建议方案）：）： 石蜡包埋组织切片3~4μm 厚度 1.烤片： 将待做切片置于切片架上，于60℃恒温烤箱中至少烤1 hr； 2.脱蜡： 切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min； 3.水化： 切片经下行酒精水化，无水乙醇5min，95%乙醇2次（每次2min），85%乙醇2 min；75%乙醇2min，自来水冲洗，ddH2O 洗2×2min； 4.抗原修复： 根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复，常采用高压、微波（温度达到98~100℃）或酶消化修复法，室温自然冷却，自来水冲洗，ddH2O 洗2×2min，TBS 洗涤（2×2min）（具体修复方法见附1）* 注：有些抗原勿需修复，直接进入第5步封闭。 5.封闭： 滴加试剂B，37℃湿盒孵育30 min； 6.加一抗：滴加用试剂C（即用型一抗），37℃湿盒孵育2 hr 或4℃过夜； 7.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min）； 8.封闭： 滴加试剂B，37℃湿盒孵育10 min； 9.加二抗： 滴加用抗体稀释液稀释的生物素化二抗（试剂D），37℃湿盒中孵育30 min； 10.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min）； 11.封闭： 滴加试剂Tween 20，37℃湿盒孵育封闭20 min； 12.加HRP-SA： 滴加用抗体稀释液稀释的试剂E（1：50~200，终浓度5~20 nM），37℃湿盒中孵育30 min； 13.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min），TBS 洗涤（2×5 min）； 14.显色：应用DAB 溶液（试剂F）显色； 15.复染：自来水充分冲洗，复染，脱水，透明； 16.封片： 待组织标本干后，用试剂缓冲甘油封固剂封片；
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法） 第一部分基因组DNA的提取。 这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA 应该是完整的。 此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。 使用两者的细节： 1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml； 2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。验证提取DNA的纯度的方法有二： 1：紫外分光光度计计算OD比值； 2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。 我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。 第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。 1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul； 2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； 3：42℃水浴30min； 水浴期间配制： 4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色） 5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。 8：50℃避光水浴16h。 一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。 这一步细节： 1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。 2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。 3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。
一.产品介绍 碳酸二甲酯(Dimethyl carbonate,简称为DMC)就是无毒无公害的主要化工原料与产品之一,化学式CH3OCOOCH3,分子量为90、08,常温下为透明液体,略带香味。难溶于水,但能与醇、酮、酯等任意比混溶。DMC 毒性很小,对金属基本上无腐蚀性。DMC 具有酯的通性,可与水发生水解反应;可与含活泼氢基团的醇、酚、胺、酯等化合物反应;与二元醇或二元酚反应生成聚碳酸酯。DMC 分子中含有羰基、甲基、甲氧基等基团,具有良好的反应性能,可代替剧毒的光气、硫酸二甲酯、氯甲烷等作为羰基化剂、甲基化剂与甲氧基化剂,成为开发一系列洁净化工工艺的新基块。一种新型的绿色有机合成中间体,被称为“21世纪有机合成领域的新基块”。 二.主要用途 DMC就是一种重要的有机合成中间体,其结构中含有甲基、甲氧基、羰基、甲氧基羰基,因而具有良好的反应活性,能与酚、醇、胺、肼、酯类化合物发生反应,生成许多重要的化工产品。DMC可代替有毒的硫酸二甲酯作甲基化剂,制备苯甲醚(苯甲醚就是重要的农药、医药中间体),还可用作油脂工业抗氧化剂、食用香料等,以及生产主要用于照相印刷中作显影液的四甲基醇胺(TMAH)。可代替有剧毒的光气作羰基化剂,合成如聚碳酸酯等工程材料,也可用于制造磁带、磁盘等光电子产品。另外,由于DVD等高档视听产品的普及,光盘需求量大幅提高,对以DMC为原料生产的聚碳酸酯的需求将不断增大,因而用在此方面的DMC用量会大幅上升。DMC还可用于生产烯丙基二甘醇碳酸酯(ADC)。ADC就是一种性能优异的热固性树脂,可替代玻璃用于眼镜片与光电材料等新的领域,代替各种有毒溶剂(苯、甲苯)作涂料、油漆的溶剂,也可代替甲基叔丁基醚作汽油添加剂。DMC的分子量含氧高达53％,且辛烷值高,可用作汽油添加剂,以增加汽油含氧量,提高燃烧效率,降低毒性尾气排放,这些方面都要优于MTBE。DMC还就是与环境友好的“绿色化合物”,随着世界各国对环境污染的日益重视,利用DMC的特性及将其作为合成中间体开发绿色化工产品,有着巨大的吸引力与市场潜力。 1.代替光气作羰基化剂 光气(Cl-CO-Cl)虽然反应活性较高,但就是它的剧毒与高腐蚀性副产物使其面临巨大的环保压力,因此将会逐渐被淘汰;而DMC(CH3O-CO-OCH3)具有类似的亲
碳酸二甲酯 碳酸二甲酯(DMC)是近年来受到国内外广泛关注的绿色化工产品。1992年在欧洲通过了非毒性化学品(Non toxic substance)的注册登记，属于无毒或微毒化工产品。由于其分子中含有多种官能团，因而具有良好的反应活性；一方面碳酸二甲酯有望在诸多领域替代光气、硫酸二甲酯(DMS)、氯甲烷及氯甲酸甲酯等剧毒或致癌物进行羰基化、甲基化、甲酯化及酯交换等反应生成多种重要化工产品；另一方面，以它为原料可以开发、制备多种高附加值的精细化学品，在医药、农药、合成材料、染料、润滑油添加剂、食品增香剂、电子化学品等领域获得广泛应用；如用于合成环丙沙星、碳酸二苯酯（DPC）、甲基二异氰酸酯（TDI）、二苯基甲烷二异氰酸酯（MDI）、MPAN、苯甲醚、聚碳酸酯（PC）、聚碳酸酯二醇（PCD）、ADC透明树脂、甲胺基甲酸钠酯（西维因）、四甲基醇铵（TMAH）。第三，其非反应性用途：溶剂、溶媒和汽油添加剂。如作药物制备的溶媒介质，特种快干油漆的溶剂、喷雾剂的溶剂等。所以，碳酸二甲酯被誉为21世纪有机合成的一个“新基块”，其发展将对我国的煤化工、石油化工、甲醇化工、C1化工起到巨大的推动作用。 DMC是性能优良的溶剂、溶煤，具有如下优点： (1)与其他有机物相溶性好； (2)微毒且蒸发速度快； (3)脱酯能力比较高。 所以有可能在下述领域得到广泛应用： (a)是半导体工业使用的对大气臭氧层有破坏作用的清洗剂CFC和三氯乙烷的替代品之一； (b)在清洗剂和特殊涂料(油漆、油墨)、医药化学品等的生产中用作溶剂、溶媒； (c)作为CO2的载体，应用于喷雾方面。 产品市场分析: 碳酸二甲酯及其相关的丙二醇等产品，被中国列入“九五”重点开发的50 个精细化工品种范围。为了防止大气污染，提高汽油的含氧率，国外用甲基叔丁
国内的碳酸二甲酯生产厂家及相关情况 厂家名称产量（吨/年）价格所用工艺 山东石大胜华化工股份有限公司60000 6200元/吨酯交换法 40000 6500元/吨酯交换法 安徽铜陵金泰化工有限公司精细 化工厂 东营市海科新源化工有限责任公 40000 6000元/吨酯交换法 司 唐山朝阳化工集团30000 6200元/吨酯交换法 山东维尔斯化工有限公司25000 6200元/吨酯交换法 盘锦辽河油田大力集团有限公司16000 6500元/吨酯交换法 黑龙江黑化集团12000 6300元/吨液相氧化羰基化 （不成熟） 锦西炼油化工总厂10000 6000元/吨酯交换法 10000（20000在建）6300元/吨酯交换法 山东泰丰矿业集团中科化工有限 公司 山东德普化工科技有限公司10000 6200元/吨酯交换法 中石油锦西炼油化工总厂10000 6000元/吨酯交换法（不成熟） 湖北兴山兴利华化工有限公司4000 6500元/吨液相氧化羰基化 （不成熟）
一．碳酸二甲酯简介：碳酸二甲酯（dimethyl carbonate,以下简称DMC），在常温下为无色液体，沸点90.1 ℃，熔点4℃，密度1.069g/cm3,闪点（开杯）21.7℃，与水部分混溶，但可以与醇、醚、酮等几乎所有的有机溶剂混溶。对眼、皮肤、黏膜有轻度刺激作用，大鼠经口LD50为6.4~12.8g/kg,对金属无腐蚀性。其分子中含有羰基、甲基、甲氧基等多种官能团，因而具有良好的反应活性；另外，1992年DMC在欧洲通过了非毒性化学品（Non toxic substance）的注册登记，属于无毒或微毒化工产品。由于一方面DMC有望在诸多领域全面替代光气、硫酸二甲酯（DMS）、氯甲烷及氯甲酸甲酯等剧毒或致癌物进行羰基化、甲基化、甲酯化及酯交换等反应生产多种化工产品；另一方面，以DMC为原料可以开发制备多种高附加值的精细专用化学品，在医药、农药、合成材料、染料、润滑油添加剂、食品增香剂、电子化学品等领域获得广泛应用；第三，它的非反应性用途是用作溶剂和汽油添加剂，所以，DMC被称为21世纪有机合成的“新基石”，它的发展将对煤化工、甲醇化工起到巨大的推动作用。 二．DMC的生产、市场概况DMC的生产情况国外DMC的生产能力已超过3.55万吨/年,其中西欧占31.25%，日本占25%，美国占43.75%。主要生产厂家为：美国的PPG、法国的SNPE、德国的BASF、意大利的ENI、日本的Daicel 和宇部兴产等公司。但意大利的ENI装置到期，加之该工艺不如酯交换法优越，目前已停产。我国现有碳酸二甲酯生产厂家约10余家，其中较大规模的有朝阳化工集团、锦西炼油化工总厂、山东泰丰矿业集团、铜陵金泰化工有限公司、山东石大胜华化工有限公司、山东海科科技股份公司、山东维尔斯化工有限公司等，总生产能力为24万吨左右。国外DMC主要生产厂家公司生产能力（吨/年）生产方法美国德士古20000 酯交换法美国PPG 1000 光气法法国SNPE 2000 光气法德国BASF 3000 光气法意大利ENI 10000 液相氧化羰基化法日本Daicel 6000 液相氧化羰基化法日本宇部兴产6000 气相氧化羰基化法国内DMC主要生产厂家厂家生产能力（吨/年）生产方法朝阳化工集团30000 酯交换法锦西炼油化工总厂10000 酯交换法山东泰丰矿业集团10000（20000）酯交换法安徽铜陵金泰化工有限公司精细化工厂40000 酯交换法山东石大胜华60000 酯交换法山东海科科技股份40000 酯交换法山东德普化工科技有限公司8000 酯交换法山东维尔斯化工有限公司25000