第十九章
药物的体外抗菌试验
教学要求
.（一）掌握常用的体外抑菌试验（连续稀释法、琼脂扩散法）。
.（二）熟悉杀菌试验（最低杀菌浓度、最低致死浓度的含义及测定的方法，活菌计数法，石碳酸系数测定法）；联合抗菌试验（纸条试验、梯度平板纸条试验、棋盘格法），协同、拮抗、无关、累加的概念。
.（三）了解体外抗菌试验的影响因素。
第一节
常用的体外抑菌试验
一、药物的体外抗菌试验
.又称药敏试验，主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性。
.最低抑菌浓度（MIC）：指药物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。
.优点：方法简便、需时短、用药量少，不需要动物。
.缺点：不能根据体外试验结果肯定或否定一个药物的抗菌作用。试验菌
.细菌、霉菌和酵母菌常用
.标准菌株：来自专门机构，我国是卫生部生物制品检定所菌种保藏中心提供。
.临床分离株：经形态、生化及血清学等方面鉴定。不得有杂菌污染，不宜用传代多次的菌种，最好是重新活化的。控制培养时间。
.接种菌量的多少的计算培养基
.根据试验菌的营养要求进行选择
.培养基质量控制供试药物
.药物的浓度和总量要精确配制
.供试药物用适宜溶剂溶解并稀释至所需浓度，难溶药物加助溶剂。
.中草药或某些生药原粉的样品，应先提取，再浓缩至所需浓度对照试验
.试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长
.已知药物对照：已知抗菌药对标准的敏感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。
.溶剂及稀释剂对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释剂应无抗菌作用
（一）连续稀释法
.方法：液体法和固体法。
.用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。
.抑菌：药物可抑制微生物生长繁殖，但不杀死它，在药物除去后，微生物又可恢复生长
.杀菌：药物能杀死微生物，当药物去除后，微生物不再继续生长。
1、液体培养基稀释法
.方法：两倍稀释法
.步骤：
液体培养基稀释药物成系列递减的浓度每
管加入一定量试验菌24-48小时后肉眼观察试管浑浊情况，记录能抑制细菌生长的最低浓度（MIC）将未见细菌生长的各试管内的培养液（各吸取0.1ml）移种到新鲜的琼脂培养基上重新长出细菌的只具有抑菌作用，无菌生长（菌落数﹤5个）具有杀菌作用，记录最低杀菌浓度（MBC）。
液体稀释法图解
抗菌药物的浓度增加最低抑菌浓度移种平板
最低杀菌浓度
图
20-1液体培养基连续稀释法
.优点：能与药物充分接触，结果更具有精确性和可重复性。
.缺点：药液和培养基的混合物若不澄清，无法直接观察结果，需进一步试验才能确定MIC 值。
杀菌曲线
.选择适当的药物浓度，取适量于无菌试管中
，加入试验菌液，使各试管菌浓度约为
105CFU/ml。
.一定间隔时间内将试验管充分混合后取样并稀释，用平板法进行活菌计数，绘制活菌数的对数-时间曲线。
2、固体培养基稀释法
.（1）平板法
.方法：系列浓度的药物混入琼脂平板，用微量加样
器或多点接种仪接种试验菌。
.用途：用于各种药物的抗菌活性测定及新抗菌药物
的筛选。特别适合于非酵母样的真菌药敏试验及颜
色深、澄明度差的样品的抗菌作用测定。
.优点：在一组平板中测定多种试验菌的MIC，不受药物颜色及浑浊度的影响；容易发现污染菌。
.缺点：不易进行再培养而确定MBC。
.（2）斜面法
.方法：不同浓度的药物混入培养基中制成斜面，于斜面上接种一定量的试验菌，观察其MIC 值。
.用途：用于需长时间培养的试验菌（如TB）或避免孢子飞扬污染环境的霉菌。
.优点：不受药物颜色及浑浊度的影响；容易发现污染菌。
.缺点：不易进行再培养而确定MBC。
（二）琼脂扩散法
.定性试验
.基本方法：利用药物可以在琼脂培养基中扩散的原理，将试验菌加入琼脂培养基，混合倾注平板或用L棒使试验菌均匀分布，然后加药于含菌平板，培养18-24小时后，根据抑菌圈或抑菌范围大小初步判断抑菌作用的强弱。
.用于细菌和酵母菌的药敏试验
1、滤纸片法
含药物的滤纸片含菌平板抑菌圈37℃培养
K-B法
.基本原理：滤纸片法，但需用统一的培养
基、菌液浓度、纸片质量、纸片含药量以
及其他试验条件。
.结果判断：卡尺精确量取，根据抑菌圈的直径大小判断该菌对该药物是抗药、中等敏感或敏感。
.打孔并注入药液代替滤纸片含菌平板药液
3、管碟法
.小管（玻璃管、铝管、钢管）放于含菌平
板上，小管内加入药液，根据抑菌圈直径
判断抗菌效力。含菌平板小管药液
4、挖沟法
.于无菌平板上挖沟取出琼脂条，沟内加入药液，然后在沟两旁接种几种试验菌。
.适用于一药多菌的测定。
ABC
1
2
3
4
5
药液细菌菌苔
接种的细菌
琼脂扩散法特点
.优点：简单、快速、可同时进行多样品或多菌株的研究。
.缺点：粗糙、重复性差、干扰因素较多，只用于抗菌药物的初筛。
第二节杀菌试验
一、最低杀菌浓度或最低致死浓度的测定
.最低杀菌浓度：指该药物能杀死细菌的最低浓度。
从对微生物广义而言，也可称之为最低致死浓度（
MLC）。
.
MBC（或MLC）的含义也可定义为: 在一定条件下，使绝大多数微生物被杀死，但允许有最少量微生物存活的药物最低浓度。
.将待检药物先以合适的液体培养基在试管内进行连续稀释，每管内再加入一定量的试验菌液，培养后可得该药物的MIC，取MIC终点以上未长菌的各管培养液，分别移种于另一无菌平板上，培养后凡平板上无菌生长的药物最低浓度即为该药物的MBC（或MLC）。
图
20-1液体培养基连续稀释
法
.进行实验时，在药物连续稀释后，每管内加
入定量实验活菌液（105-106细菌/ml）。培
养后从肉眼观察无菌生长的试管内各取培养
液0.1ml或0.01ml涂布于平板上测定存活菌
数，以使99.9%微生物致死的药物最低浓度
为MLC，即在一定条件下，存活的菌数不多
于原始接种数的0.1%。
二、活菌计数
（viable counting method）
.是在一定浓度的定量药物内加入定量的实验菌，作用一定时间后，取样进行活菌计数，从存活的微生物数计算出药物对微生物的致死率。
方法
.取实验菌与药物作用后的混合液，经稀释后取定量混入琼脂培养基，倾注成平板。培养后计数长出的菌落数或菌落形成单位（CFU）。再乘以稀释倍数，即可得药物稀释后每毫升内存活的细菌数或CFU。
三、苯酚系数测定法
（phenol coefficient）
.又称酚系数法，是以苯酚为标准，在规定的实验条件下，作用一定时间，将待测的化学消毒剂与苯酚对伤寒沙门菌或金黄色葡萄球菌的杀菌效力相比较，所得杀菌效力的比值。
.苯酚系数是了解消毒剂杀菌效力的一种方法。
.苯酚系数=消毒剂的杀菌稀释度/苯酚的杀菌稀释度苯酚系数大于或等于2为合格。
.举例：将苯酚准确稀释为1：90、1：100，、、等；待测消毒剂准确稀释1：150、1：170、、、。分别取上述稀释液各5ml（10ml）加入一系列无菌试管中，置于20℃恒温水浴，使反应保持在20℃以下进行。各管内再加入伤寒沙门菌培养液各0.5ml,立即开始准确计时,在加菌后5、10、15分钟，分别从管中取一接种环的混合液接种于一支5ml（或10ml）的肉汤培养基中，培养一定时间后，观察并记录结果。
.
+为有菌生长，
-为无菌生长。
.根据5分钟不能杀菌，10分钟能杀菌的最大稀释度为标准来计算，则：
.苯酚系数=250/100=2.5
.或根据三个相同杀菌结果的稀释度比值的平均值来计算,则:
.苯酚系数=(225/90+250/100+275/110)/3=2.5
.苯酚系数愈大,则被测消毒剂的效力愈高。
.苯酚系数的应用有一定局限性,因为某一消毒剂对伤寒沙门菌的苯酚系数的大小并不能完全代表它对其他细菌作用的强弱。
苯酚系数法还有以下缺点
ü1)有机物存在时消毒剂失去活性;
ü2)消毒剂可能对组织有毒性;
ü3)随温度变化而影响测定结果
;
ü4)只适用于同类消毒剂的杀菌效力测
定,对非酚类、季铵盐及不稳定的次氯
酸盐等均不能给予正确评价.
第三节
联合抗菌试验
.抗菌药物联合应用的效果有四种：
.协同作用：加强药物抗菌作用
.拮抗作用：减弱药物抗菌作用
.累加作用：作用为两者之和
.无关作用：相互无影响
.常用方法：棋盘稀释法和琼脂扩散纸片法
一、纸条试验（paper strip test）
.即在已接种实验菌的平板表面垂直放置两条浸有一种药液的滤纸条，培养后根据抑菌区的加强、减弱或无影响来判断它们在联合应用时的效应。
二、琼脂扩散纸片法
.含不同的两张滤纸片，放于平板表面，间距约3-5mm。培养后，按各自抑菌圈形状，来判断两种抗菌药物联合时对受试菌株的作用情况。
协同作用
甲乙甲乙
甲乙两药抑菌环交界角平直
细菌对甲药不敏感，乙
药抑菌环向甲药扩大
甲乙
无抑菌作用的两药之间出现抑菌环
累加作用
甲乙
甲乙两药抑菌环交界角钝圆
无关作用
甲乙甲乙
甲乙
细菌对两药均耐药
细菌对甲药耐药，对乙药
敏感，抑菌环交界角尖锐
细菌对甲、乙两药均敏
感，抑菌环交界角尖锐
拮抗作用
甲乙甲乙
细菌对甲药耐药，对乙药敏
感，甲药对乙药发生切割状
拮抗现象
细菌对甲、乙两药均敏感
，乙药使甲药的抑菌环呈
扁圆形
三、梯度平板纸条试验
（paper strip-gradient plate test）
.含药的梯度平板的制备:
.先将琼脂培养基倒入平皿，平皿斜置待凝，再将
平板放置水平，加入含抗菌药物的琼脂培养基。
在重叠的双层平板中含有梯度浓度的抗菌药物，
自高浓度（
+）至低浓度（
-）依次递减。
.将实验菌悬液涂布于平板表面，
.取滤纸条浸透另一待检药液，按梯度平板中药物
浓度递减的方向置于平板表面。
.培养后，如待检药液对平板的药物有加强作用，
则可见纸条两端的抑菌区被扩大。
三、棋盘格法
.含两种不同浓度药物的试管或平板排列呈棋盘状
而得名。
.方法：分别测定联合药物各自对被检菌的
MIC，以确定药物联合测定的药物稀释度。选择6-8个稀释度，每种药物最高浓度为其MIC 的2倍，然后分别依次倍比稀释到其MIC的1/8-1/32。
2.0 1.0 0.5 0.25 0.12 0.06 0+ 0.25/ 0.50 -2.0/0 B A0 0.06 0.12 0.25 0.50 1.0 2.0
液体棋盘稀释法的药物浓度编排
部分抑菌浓度FIC 也称联合抑菌分数，指某一药在联合前后所测得的MIC
比值，可根据FIC指数来评价两抗菌药物联合作用时所
产生的效果。
如二待测药为A、B，则
A药与B药联合试验时A药的MIC ；FIC（A）= A药单独试验时的MIC
B药与A药联合试验时B药的MIC ；FIC（B）= B药单独试验时的MIC
所谓FIC指数，指二药各自的FIC之和，即FIC指数= FIC（A）+ FIC（B）
FIC指数与联合抗菌效应
FIC指数＜0.75协同作用
FIC指数0.75-1累加作用
FIC指数1-2无关作用
FIC指数＞2拮抗作用
FIC指数越小，则联合抗菌作用越强。
四、药物的体内抗菌试验
.在体外测定药物抗菌作用的同时，需进一步了解药物对试验感染动物是否有疗效，以确定体内抗菌效果。
.方法：将临床分离致病菌注入动物体内或感染外伤部位，，使动物感染发病或死亡，选用能引起小鼠全部死亡的最小菌悬液浓度即最小致死量（MLD）作为感染量；感染后再用欲测药物以不同剂量或不同给药途径进行治疗，同时试验对照组以生理盐水代替药物进行给药。
第四节
体外抗菌试验的影响因素
1、试验菌
.应用标准菌株。标准菌株来自专门的供应机构。
.我国由北京卫生部生物制品检定所菌种保藏中心供应。
.在特定条件下，有时需用临床新分离菌株。
.试验菌加以合理的保藏，使用前应加以纯化及必要的生物学特征鉴定。
2、培养基
.质量需加以控制；
.原料、成品的外观及性能应符合要求，经无菌检查合格后使用。
3、抗菌药物
.药物的浓度和总量直接影响抗菌试验的结果，需要精确配制；
.固体药物应配制成溶液使用，有些不溶于水的药物需用少量有机溶剂或碱先行溶解，再稀释成合适浓度，如氯霉素及红霉素需用少量乙醇溶解；
.药液的PH值应尽量接近中性，使能保持药物的稳定性而又不致影响试验菌的生长；中药制剂中含有鞣酸，且具有特殊色泽，影响结果判断。
4、对照实验
1）试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长。
2）已知药物对照：已知的抗菌药物对标准的敏感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。
3）溶剂及稀释液对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释液应无抗菌作用。
小结
1、体外抑菌试验（连续稀释法、琼脂扩散法）。
2、杀菌试验（最低杀菌浓度or最低致死浓度的含义及测定的方法，活菌计数法，石碳酸系数测定法）；联合抗菌试验（纸条试验、梯度平板纸条试验、棋盘格法），协同、拮抗、无关、累加的概念。
3、体外抗菌试验的影响因素。
抗菌药物敏感性试验的技术要求 1 范围 本标准规定了临床抗菌药物敏感性试验的技术要求，包括常规药敏试验的药物选择和报告、药敏试验方法、各种属细菌药敏试验、常见菌特殊耐药表型检测、药敏试验的质量控制、商品化药敏试验检测系统的性能验证。 本标准适用于开展临床微生物学检验的各级临床实验室。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 抗微生物药物敏感性试验Antimicrobial susceptibility testing 检测微生物（本文件特指细菌）对抗微生物药物（本文件特指抗菌药物）的体外敏感性，以指导临床合理选用药物的微生物学试验，简称药敏试验。 2.2 最低抑菌浓度Minimal inhibitory concentration；MIC 在琼脂或肉汤稀释法药物敏感性检测试验中能抑制肉眼可见的微生物生长的最低抗菌药物浓度。2.3 折点Breakpoint 能预测临床治疗效果，用以判断敏感、中介、剂量依赖型敏感、耐药、非敏感的最低抑菌浓度（MIC）或者抑菌圈直径（mm）的数值。 2.3.1 敏感Susceptible；S 当抗菌药物对分离株的MIC值或抑菌圈直径处于敏感范围时，使用推荐剂量进行治疗，该药在感染部位通常达到的浓度可抑制被测菌的生长，临床治疗可能有效。 2.3.2 中介Intermediate；I 当菌株的MIC值或抑菌圈直径处于中介时，该数值接近药物在血液和组织中达到的浓度，从而治疗反应率低于敏感菌群。该分类意味着采用高于常规剂量治疗时或在药物生理浓集的部位，临床治疗可能
有效。该分类同样可作为“缓冲域”，以防止由微小、不可控的技术因素导致的重大偏差，尤其是毒性范围较窄的药物。 2.3.3 剂量依赖型敏感Susceptible-dose dependent；SDD 细菌菌株对抗菌药物的敏感性依赖于抗菌药物的剂量。当某种药物对菌株的MIC或抑菌圈直径在SDD 范围时，临床可通过提高剂量和（或）增加给药频率等修正给药方案以达到临床疗效。 2.3.4 耐药Resistant；R 当抗菌药物对分离株的MIC值或抑菌圈直径处于该分类范围时，使用常规治疗方案，该药在感染部位所达到的药物浓度不能抑制细菌的生长，和（或）被测菌株获得特殊耐药机制，且治疗性研究显示该药临床疗效不确切。 2.3.5 非敏感Nonsusceptible；NS 对于那些因未现或罕现耐药，而仅具有敏感折点的抗菌药物，当该药对某分离株的MIC值高于或抑菌圈直径低于敏感折点时，此分类为非敏感。 2.4 流行病学界值Epidemiological cutoff value；ECV 将微生物群体区分为有或无获得性耐药的MIC值或抑菌圈直径，是群体敏感性的上限。根据ECV，可将菌株分为野生型和非野生型。 2.4.1 野生型 Wild-type；WT 根据ECV值，将抗菌药物（包括抗真菌药物）评估中未获得耐药机制或无敏感性下降的菌株定义为野生型。 2.4.2 非野生型Non-wild-type；NWT 根据ECV值，将抗菌药物（包括抗真菌药物）评估中获得了耐药机制或存在敏感性下降的菌株，定义为非野生型。 2.5 效价Potency 抗菌药物中具有抗菌活性的成分，通过同类标准物质测定得出。单位mg/g、IU/g或用百分比表示。
实验五药物的体外抗菌试验 药物的抗菌试验是为了检查药物的抗菌能力。该项试验方法已广泛应用于新药研究和指导临床用药。如抗菌药物的筛选，提取过程的生物追踪、抗菌谱的测定、耐药谱的测定、药敏试验、药物血浓度测定等各个方面。 药物的体外抗菌试验在实验室进行，优点是方法简便、需时短、用药量少，不需要活的动物、实验条件容易控制。因此，药物的体外抗菌试验已广泛应用各种测定了。 药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。 （一）稀释法（结果示教） 稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种。这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用μg∕ml或U/ml表示。 （二）琼脂扩散法 它是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低，在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。 滤纸片法（K-B纸片法）－学生操作 滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试验（细菌药物第三性试验、以便选择用药）。滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片。一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。 至于干燥纸片的制备方法：选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片，120℃干燥灭菌2小时。然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液，每100张纸片加入0.5ml药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿中，
微量肉汤稀释法（borth microdilution method） 实验方法： 1.用无菌蒸馏水在聚丙烯离心管中将抗菌肽和抗生素溶解制成1280 g/L的储 备液，然后用等量无菌的0.02%乙酸（含0.4% BSA）稀释，在用0.01%乙酸（含0.2% BSA）溶液对等量稀释后的溶液在进行一系列的双倍稀释，得到质量浓度为640，320，160……1.25 mg/L的共10个梯度的系列稀释液， 4 ?C下保存备用。 2.将待测细菌在灭菌MH肉汤琼脂平板上过夜培养，挑取菌落接种于灭菌试管 中的MH肉汤，37 ?C，180 r/min过夜培养。将培养后的菌液稀释至2*10^5-7*10^5 CFU/mL，向无菌的96孔平板中的1-11孔各加入100 μL的菌液，12孔不加入菌液而加入100 μLMH肉汤，然后从1～10孔逐一加入相应的待测抗菌肽，11孔作为扫描对照组不加肽。37 ?C，90 r/min培养18-24 h，这样待测抗菌肽的终质量浓度分别为64，32，16，……0.125 mg/L。（不知道待测抗菌肽添加量是多少，最终抗菌肽的终浓度怎么缩小了10倍） 3.最小抑菌浓度MIC（mininmal inhibitory concentration）就是能阻止50%以 上细菌生长的最小肽浓度。用酶标仪在490 nm下对平板进行扫描，肽的MIC 的确定按照比对照孔（11孔）的浑浊程度低50%以上的最小质量浓度计算。 4.最小杀菌浓度MBC（minimal bactericidal concentration）就是能抑制任何残 余菌落生长的肽的最低浓度。从没有细菌生长的平板孔中的内容物中取10 μL涂布到MH琼脂平板上，37 ?C培养18 h，以此来确定肽的MBC。 参考文献： 【1】汪以真，抗菌肽与抗生素的体外抗菌效果比较[J].中国兽医学报，2004，24（3）：270-273. 抗菌肽的体外抑菌实验（平板法） 1.稀释：将一定效价的抗菌肽做6个浓度的稀释，将抗生素按正常使用剂量同 样做6个浓度的稀释 2.指示菌：指示菌用液体LB培养基培养24 h后稀释至10^6 CFU/mL
实验十一抗生素的抑菌试验 一目的要求 1、掌握纸片法测定抗生素抗菌作用的基本方法 2、了解抗生素的抗菌谱 二实验原理 抗生素是某些植物与微生物生长到对数期前后所产生的次生代谢产物，其在低浓度下可其它微生物生长具抑制作用或杀死作用的物质。抗生素对敏感微生物的作用机理分为抑制细胞壁的形成、破坏细胞膜的功能、干扰蛋白质合成及阻碍核酸的合成。 由于不同微生物对不同抗生素的敏感性不一样，抗生素的作用对象就有一定的范围，这种作用范围成为抗生素的抗菌谱，作用对象广的抗生素称为广谱抗生素，作用对象少的抗生素称为窄谱抗生素。而且当某种抗生素长时间用于敏感微生物生长后，即使同一种菌的不同菌株对不同药物的敏感性也常发生改变，甚至出现耐药菌株，亦即产生抗性菌株，则抗生素将失去对抗性菌株生长的抵制，只以采用新的抗生素才可能控制抗性菌株的生长与繁殖，因而不断开发新的抗生素是保健人类身体健康的重要工作。新抗生素产生菌的分离筛选应通过拮抗菌发酵，然后以发酵产物进行抗菌活性实验，根据实验结果而获得产新抗生素的菌株。微生物代谢产物的抗菌活性常以管碟法与纸法进行检测，根据透明抑菌圈的有无与大小作为依据。 三实验器材 1、菌种枯草杆菌、大肠杆菌。 2、培养基MH（Mueller-Hintion）琼脂。 3、试剂青霉素、链霉素。 四方法步骤 1、无菌滤纸片以孔径6mm打孔器将滤纸打为圆形纸片，放入培养皿内，121℃蒸汽湿热灭菌，100℃烘干2h。 2、抗生素溶液制备将取适量青霉素、链霉素，以无菌水溶解。 3、指示菌悬浮液的制备枯草杆菌、大肠杆菌斜面菌种分别以无菌水洗下菌苔细胞，到入无菌三角瓶内，制备适宜浓度的细胞悬浮液。 4、混菌平板制备取批示菌细胞悬浮液1mL加入无菌培养皿内，再加入温度为43~45℃的PDA培养基或牛肉膏蛋白胨琼脂培养基20mL，立即振荡使细胞与培养基混合均匀，静置冷凝。 5、平板加抗生素溶液将滤纸片在抗生素溶液中充分浸泡2min以上，然后将纸片放于混菌平板上，每皿呈三角形放3点，每点贴放纸片2张。 6、培养与观察将平板放于33℃左右的温度培养，每24h测量一次透明抑菌圈直径，共测量3次。
纸片法抗菌药物敏感实验操作标准 4.３标准比浊管 用硫酸钡比浊管(０、5麦氏比浊标准),标定接种菌液浓度。比浊管制备方 法如下:(１)0、048mｏl/L BaＣｌ 2,(１、175% w／v BaＣｌ 2 ·2H 2 O)0、５ml, 加到99、5ml的０、18 mol/Ｌ(0.3６N)H 2SＯ 4 (1％v/ｖ)溶液中,制成比浊管;(2) 用光径为1cｍ的分光光度计测定光吸收来标定比浊管。0、5麦氏标准比浊管在６25nｍ波长的吸收光度应为0、0８-0、1;(3)选管径与制备菌液试管相同的螺口试管,每管分装4-6ml;(4)将试管帽拧紧,放室温暗处保存;(5)用前,将比浊管在旋转振荡器上混匀。如出现大颗粒,应更换;(6)每个月更换比浊管或复检比浊管的浊度。 ５操作步骤 5、1 制备接种菌液 5、1、１增菌法步骤如下:(1)选琼脂平板上形态相同的菌落至少4-5个,用接种环挑其顶部,移至4－5ml肉汤或大豆酪蛋白消化液中;(２)置35℃培养至菌液浓度达到或超过比浊管浓度(一般需2－6小时),浓度约1－２×10８CFU/ml;(３)用生理盐水或肉汤校正菌液浓度,与比浊管相同。可用光电比浊。目测比浊须在适当光照下以黑色线条为反衬。 5、１、2 直接菌悬液法步骤如下:(1)做常规药敏试验,可直接用过夜培养的菌落(必须用无选择性培养基平板,如普通琼脂培养基)在盐水或肉汤中制备接种菌液。菌液浓度调至0、5麦氏管;(2)此法适用于在肉汤培养基中生长不好的细菌如嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌与链球菌及葡萄球菌的甲氧苯青霉素或苯唑青霉素的耐药试验;(３)当用此法做复方磺胺药的试验时,从平板上直接挑菌落时会携带相当量的拮抗剂,造成敏感菌株的抑菌环内出现轻微的生长菌膜。 ５.2 接种平板步骤如下:(1)校正的菌液须在15分钟内使用。用一无菌棉试子蘸取菌液并在上端管壁旋转挤压几次,去掉过多的菌液;(2)用试子涂布整个琼脂平板表面,反复涂布几次,每次将平皿旋转60度,保证涂布均匀。(3)将平皿盖打开3-5分钟,使培养基表面的水份吸收掉。然后贴药敏纸片;(4)注意:避免用过浓的菌液,禁用未经稀释菌或其她不标准菌液接种平板。 5、３贴纸片 (1)接种平板后,贴上药敏纸片。用镊子或针尖压一下纸片使其与培养基表面贴牢。纸片要贴得均匀,纸片与纸片中心距离不得小于24mm。原则上,直径150ｍm得平板贴１2张纸片,直径100mm平板贴5张纸片。纸片贴后不应再移动,因为有些药物会立即扩散;(2)贴上纸片15分钟内,须把平板倒放在35℃恒温箱中。因为抑菌环解释标准就是在普通环境中标定的,所以除嗜血杆菌与淋病 奈瑟氏菌外,平板不可放在高CO ２的环境中。ＣO 2 与某些因素作用可使抑菌环增 大。 5、4 读取结果 (１)经16-18小时培养后,观察结果。菌液浓度适合且涂得好,抑菌环规则,细菌呈融合生长。如果出现单个菌落,说明接种量小,需重做试验,测量抑菌环直径须包含纸片直径:手持平皿从背面目测检查每块平板,借反射光(黑色无放光背景),用卡尺、普通尺或特制的模板量取抑菌环直径,单位为毫米。培养基中如果加了血液,须打开平皿盖,借反射光,从正面量抑菌环。如果就是葡萄球菌或肠球菌,须培养２4小时后,经投射光检查苯唑青霉素与万古霉素的抑菌
《生物工程综合实验平台》——《抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验》 专业班级： 学号： 姓名： 小组成员： 实验日期：5月27日-5月30日 微生物综合实验
抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验 班级16级生物技术1、2班姓名 学号座位号 实验日程安排 日期开始时间实验内容备注 5月27日（周一）14:30-15:30 实验背景、原理、方法 讲解 15:30-18:00 分组准备试剂、培养基、 实验器具 5月28日（周二） 上午 8:00-8:30 体内抑菌实验细菌接 种、培养 8:30-10:30 体外抑菌实验：MIC法 10:30-11:40 固体培养基的配制、体 外抑菌实验：纸片法、 5月28日（周二） 下午12:30-13:30 体内抑菌实验：4小时 实验组稀释涂布 5月28日（周二） 晚上20:00-21:00 体内抑菌实验：12小时 实验组稀释涂布 5月29日（周三） 上午10:00-12:00 体内抑菌实验：24小时 实验组稀释涂布； 体外抑菌实验：纸片法、 MIC法结果观察，分析； 5月30日（周四） 上午8:30-12:00 体内抑菌实验：4小时、 12小时、24小时实验组 结果观察、分析； 所有实验结果的统计与 讨论 抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验
一、实验原理 抗菌药物一般是指具有抑菌或杀菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物。由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而得到的某些产物，或用化学半合成法制造的相同或类似的物质，也可化学全合成。抗菌药物在一定浓度下对病原体有抑制和杀灭作用。 药物的体外抑菌实验，是指在体外测定药物抑制或杀灭细菌能力的实验。它是常用抗菌实验的方法，其中最常用的方法有系列稀释法和琼脂扩散法。 稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种，这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用ug/ml或U/ml表示。其结果判断方法为凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该菌的最小抑菌浓度（MIC）。 琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低。在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈。抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。一般药敏实验常采用纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。 世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈的大小来判断，如： 复方新诺明（SXT）左氧氟沙 星（LEV） 庆大霉 素（CN） 苯唑西 林（OXA） 氯霉素 （CM） MIC ug/ml 敏感（S）≤2/38 ≤1 ≤4 ≤2 ≤8 中度敏感（I）-- 2 8 -- 16 耐药（R）≥4/76 ≥4 ≥16 ≥4 ≥32
第十九章 药物的体外抗菌试验 教学要求 .（一）掌握常用的体外抑菌试验（连续稀释法、琼脂扩散法）。 .（二）熟悉杀菌试验（最低杀菌浓度、最低致死浓度的含义及测定的方法，活菌计数法，石碳酸系数测定法）；联合抗菌试验（纸条试验、梯度平板纸条试验、棋盘格法），协同、拮抗、无关、累加的概念。 .（三）了解体外抗菌试验的影响因素。 第一节 常用的体外抑菌试验 一、药物的体外抗菌试验 .又称药敏试验，主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性。 .最低抑菌浓度（MIC）：指药物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。 .优点：方法简便、需时短、用药量少，不需要动物。 .缺点：不能根据体外试验结果肯定或否定一个药物的抗菌作用。试验菌 .细菌、霉菌和酵母菌常用 .标准菌株：来自专门机构，我国是卫生部生物制品检定所菌种保藏中心提供。 .临床分离株：经形态、生化及血清学等方面鉴定。不得有杂菌污染，不宜用传代多次的菌种，最好是重新活化的。控制培养时间。 .接种菌量的多少的计算培养基 .根据试验菌的营养要求进行选择 .培养基质量控制供试药物 .药物的浓度和总量要精确配制 .供试药物用适宜溶剂溶解并稀释至所需浓度，难溶药物加助溶剂。 .中草药或某些生药原粉的样品，应先提取，再浓缩至所需浓度对照试验 .试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长 .已知药物对照：已知抗菌药对标准的敏感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。 .溶剂及稀释剂对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释剂应无抗菌作用 （一）连续稀释法 .方法：液体法和固体法。 .用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。 .抑菌：药物可抑制微生物生长繁殖，但不杀死它，在药物除去后，微生物又可恢复生长 .杀菌：药物能杀死微生物，当药物去除后，微生物不再继续生长。 1、液体培养基稀释法 .方法：两倍稀释法 .步骤： 液体培养基稀释药物成系列递减的浓度每 管加入一定量试验菌24-48小时后肉眼观察试管浑浊情况，记录能抑制细菌生长的最低浓度（MIC）将未见细菌生长的各试管内的培养液（各吸取0.1ml）移种到新鲜的琼脂培养基上重新长出细菌的只具有抑菌作用，无菌生长（菌落数﹤5个）具有杀菌作用，记录最低杀菌浓度（MBC）。 液体稀释法图解 抗菌药物的浓度增加最低抑菌浓度移种平板
怀化医专《微生物学检验》教案编号：10
细菌对抗菌药物敏感试验 药敏试验(antimicrobial susceptibility,AST) （一）概念：在体外检测药物抑制或杀死细菌能力的试验。 （二）检测意义： 1、疾病的治疗：指导用药。 2、耐药菌检测和流行病学调查。 3、评价新药抗菌作用。 4、某些菌种的鉴定。 第一节临床常用的抗菌药物 抗菌药物：是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。 一、青霉素类抗生素： 青霉素种类抗菌活性 1、天然青霉素不产青霉素酶的G+G-球菌、普雷沃菌等。 青霉素G、青霉素V 2、耐青霉素酶青霉素产青霉素酶的G+G-球菌 甲氧西林、奈夫西林、苯唑西林等 3、广谱青霉素青霉素G敏感细菌、大部分大肠埃希菌、 氨苄西林、阿莫西林奇异变形杆菌、流感嗜血杆菌等G-菌 替卡西林、羧苄西林、氨苄西林无效的G-菌，产β-内酰胺酶 美洛西林、派拉西林克雷伯菌、铜绿假单胞菌、肠杆菌、厌氧菌 二、头孢菌素类抗生素： 1、第一代头孢菌素 （头孢噻啶、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢羟氨苄等） 作用：对G+菌作用强，如金葡菌、链球菌等。 2、第二代头孢菌素 （头孢羟唑、头孢呋辛、头孢克洛、头孢尼西、头孢雷特等） 作用：产青β-内酰胺酶G-菌有作用，如肠杆菌科细菌，铜绿假单胞菌等。 3、第三代头孢菌素 注射用头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢派酮：对产青β-内酰胺酶G-菌有很大
抗菌活性。 口服用头孢克肟、头孢布坦等：对肠球菌、铜绿假单胞菌及不动杆菌无用。 4、第四代头孢菌素（头孢匹罗、头孢匹美） 作用：对肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌作用强。 三、其它β-内酰胺类抗生素： 1、单环β-内酰胺类抗生素（氨曲南、卡芦莫南） 对G-菌作用强 2、头霉素类：对G+菌、厌氧菌作用较好 氧头孢烯类抗生素：抗菌谱广，对产β-内酰胺酶G-菌作用强，对产酶的金葡菌有效3、碳青酶烯类抗生素（亚胺培南、米洛培南等） 广谱（最广），抗菌活力强 4、β-内酰胺酶抑制剂（克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦） 与β-内酰胺类抗生素联用能增强后者的抗菌活性。 四、氨基糖苷类抗生素： 链霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素、奈替米星、阿米卡星等 作用：对需氧G-杆菌有强大抗菌活性 对沙雷菌属、气单胞菌属、产碱杆菌、不动杆菌属、分枝杆菌属也有一定抗菌活性。但对G-球菌效果差。 五、喹诺酮类抗生素： 第一代：（新恶酸等）窄谱抗生素（G-） 第二代：（环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等）对G+G-菌均有作用。 第三代：（斯帕沙星、妥舒沙星、左氟沙星等）超广谱抗生素。 六、大环内酯类抗生素： 红霉素、麦迪霉素、乙酰螺旋霉素等 作用：和青霉素相似，主要是G+菌、厌氧菌。 新一代：克拉霉素、罗红霉素、地红霉素、氟红霉素、阿齐霉素等。 七、四环素、氯霉素、林可酰胺类抗生素： 八、糖肽类抗生素 九、磺胺类药物及其增效剂
实验六、抗菌药物的体外药效试验 （药敏试验） 各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床对控制细菌性传染病的流行至关重要。此外，通过药物敏感试验可为新抗菌药物的筛选提供依据。药敏试验的方法很多，普遍使用的有滤纸片扩散试验 （Kirby-BaueerDiceDiffusion）；最低抑菌浓度试验（MinimumInhibitoryConcentration,MIC）和最低杀菌浓度试验（MinimumBactericidalConcentration,MBC）。 ［目的要求］ 1、熟悉体外抗菌试验操作技术。 2、掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途。 ［实验原理］ 常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释法。琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面，然后用不同的方法将药物置于已含试验菌的琼脂平板上。根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打洞法、管碟法及挖沟法等。经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力。浓度系列稀释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内，加入一定量的试验菌，经适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC）。 1、细菌：所用细菌应包括主要致病菌。革兰氏阳性球菌包括金黄色葡萄球菌(产酶与不产酶菌株)、表皮葡萄球菌，链球菌、肠球菌等。革兰氏阴性球菌如淋球菌等。革兰氏阴性杆菌包括流感杆菌、肠杆菌科细菌8～10种，绿脓杆菌与其它假单孢菌属及不动杆菌属等，厌氧菌包括脆弱类杆菌、消化球菌和消化链球菌等。对临床应用有代表性的菌株数量，创新药应不小于1000株。其它类新药根据新药抗菌谱宽窄可作200-500株。试验时应包括有国际公认质控菌株(如金葡菌ATCC25925，大肠杆菌ATCC25922和绿脓杆菌ATCC27853等)。
体外抑菌实验方案 体外实验室是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。药物对细菌代谢的影响，可以使细胞呼吸量减低，或酶系统受到抑制等，因而出现细菌停止生长或部分抑制，借以判断药物对细菌有无抗菌作用或抗菌范围。体外实验是细菌与药物直接接触，没有机体诸因素参与，故体外和体内实验的结果不一定完全一致，需两方面综合分析进行评价。 一、体外实验的准备 （一）实验菌株的选择 一般使用实验室保存的典型菌株和临床分离菌株。 （二）培养基的制备 选择适合细菌生长繁殖的营养物质的培养基 （三）实验器皿的准备 抗菌实验的步骤需用无菌操作，应用的试管、平皿、吸管等与细菌接触的器皿，均需经过高压灭菌后应用。 （四）药物的准备 实验时称取一定量的药物，铵盐基折算成效价/mg，配成溶液或制成均匀的混悬液，pH调至中性。 （五）菌液制备 抗菌药物实验是针对细菌的作用，实验菌株不能含其他杂菌。 （六）细菌计数 将菌稀释至OD值为0.002（实验时1ml菌液加1ml药液OD值降为0.001）二、体外抗菌实验（试管稀释法） （一）1ml药液采用8个梯度：500、100、50、25、10、5、2.5、1.25（ug）。 配置方法： 每个药液浓度为1ml，8个梯度总共694ug，取整700ug。 （1）称取700ug待测物，溶解在1.4ml溶剂中得到500ug/ml的药液。 （2）从500mg/ml的药液中取0.4ml，加入1.6ml溶剂得到100ug/ml的药液。（3）从100mg/ml的药液中取1ml，加入1ml溶剂得到50ug/ml的药液。
（4）从50mg/ml的药液中取0.5ml，加入0.5ml溶剂得到25ug/ml的药液。（5）从50mg/ml的药液中取0.5ml，加入2ml溶剂得到10ug/ml的药液。 （6）从10mg/ml的药液中取1ml，加入1ml溶剂得到5ug/ml的药液。 （7）从5mg/ml的药液中取1ml，加入1ml溶剂得到2.5ug/ml的药液。 （8）从2.5mg/ml的药液中取1ml，加入1ml溶剂得到1.25ug/ml的药液。 （图示如下图） （二）1ml菌液采用OD值0.002的菌液 配置方法：菌悬液在600nm波长下测定其OD值，根据具体的OD值按10倍稀释使菌悬液的OD值接近0.002，在接近0.002后缩小稀释倍数使菌悬液OD 值为0.002。 （三）菌药混合培养 取稀释药液各1ml分装于小试管内（从稀到浓可不换吸管），做好标记，然后取经培养16-18h细菌培养液，每管1ml，每小试管总量为2ml，置37℃培养箱内培养16-18h，检查结果。 （四）结果分析 如加入细菌的药液管仍未澄清，即表明无细菌生长，则该管药物有抗菌作用；如为浑浊，即表明细菌已生长，该管药物无抗菌作用。以完全无细菌生长的最低药物浓度作为细菌对药物的敏感度，即为该药物最小抑菌浓度。
抗菌药物敏感试验题 库1-2-10
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列可使K-B法抑制圈直径扩大的因素是（）. A.测量时未经过纸片中心 B.接种细菌浓度为1麦氏比浊 C.孵育时间36小时 D.药敏纸片失效 E.培养基厚度为3mm 纸片扩散法若菌悬液浓度若超过0.5麦氏浊度，若药敏纸片效力下降、测量时不经过纸片中心、细菌过度生长均可使抑菌圈变小，若MH培养基厚度不够4mm，则细菌生长不良使抑菌圈增大。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]耐甲氧西林表皮葡萄球菌是（）. A.MRS B.MRSA C.MRSE D.MRCNS E.SPA 耐甲氧西林表皮葡萄球菌（methecillinresistancestaphylococcusepidermidis），缩写即MRSE。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]容易引起过敏性休克的药物是（）. A.SMZTMP B.磷霉素 C.克林霉素 D.加替沙星 E.青霉素 青霉素或其降解产物、青霉素制剂中污染物所致过敏症。青霉素衍生物（如青霉酸）与蛋白质结合，形成青霉噻唑酰基衍生物，可作为半抗原，主要引起Ⅰ型超敏反应。 (辽宁11选5 https://www.doczj.com/doc/8b13635425.html,)
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列既是ESBLs的主要产生菌，又是泌尿系统感染主要病原菌的是（）. A.大肠埃细菌 B.肺炎克雷伯菌 C.阴沟肠杆菌 D.铜绿假单胞菌 E.伤寒沙门菌 大肠埃希菌既是ESBLs的主要产生菌，又是泌尿系统感染的主要病原菌。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]K-B法试验中，头孢他定的抑菌环直径为20mm，头孢噻肟的抑菌环直径为22mm，正确判断是（）. A.报告头孢他定和头孢噻肟都敏感 B.报告头孢他定耐药，头孢嚷肟敏感 C.可排除该菌产生ESBLs D.怀疑该菌产生ESBLs E.可确认该菌为ESBLs菌株 筛选产ESBL菌时对头孢泊肟、头孢他啶抑菌圈≤22mm或氨曲南、头孢噻肟≤27mm时高度怀凝，需进行ESBL确证实验。
抗菌药物敏感试验题 库1-0-8
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]关于K-B纸片扩散法结果判读的描述，下列说法错误的是（） A.平板置于黑色无反光背景 B.抑菌圈的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限 C.参照标准解释结果 D.培养基中如果加有血液需打开皿盖 E.加有血液的培养基应借透射光从正面测量抑菌圈 培养基中如果加有血液需打开皿盖，借反射光从正面测量抑菌圈。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]关于K-B纸片扩散法结果“I”的描述中，说法错误的是（） A.敏感性的度量 B.作为"缓冲域" C.为防止由微小的技术因素失控导致的结果偏差 D.不应作为临床报告 E.通过提高测定药物的剂量或在该药物浓度较高的部位，细菌生长可被抑制 中介度I不是敏感性的度量。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列药敏纸片描述中，不正确的是（） A.密封贮存于-20℃无霜冷冻箱 B.只能在有效期内使用 C.密封贮存于2～8℃冰箱 D.使用前将贮存器移至室温平衡1～2h E.吸水量20μl 反复使用的纸片可保存于2～8℃冰箱，长期保存需密封贮存于-20℃无霜冷冻箱。出处：山东11选5 https://https://www.doczj.com/doc/8b13635425.html,;
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]目前结核分枝杆菌药物敏感性试验最常用的方法是（） A.直接比例法 B.间接比例法 C.直接绝对浓度法 D.间接绝对浓度法 E.耐药率法 目前结核分枝杆菌药物敏感性试验最常用的方法是间接比例法。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列不是CLSINCCLS推荐用于筛选ESBLs的细菌的是（） A.大肠埃希菌 B.肺炎克雷伯菌 C.产酸克雷伯菌 D.奇异变形杆菌 E.普通变形杆菌 CLSINCCLS推荐用于筛选ESBLs没有普通变形杆菌。
天然植物体外抑菌实验 中国中学：陆思怡尹意添陈玺梁栋指导老师： 摘要： 我国是一个农业大国，随着化学农药和化肥的大量不科学使用．很多弊端突出，在这种情况下，植物源农药悄然兴起。因此，本课题开始研究天然植物提取物的抑菌效果。课题采用，苹果，姜，大蒜进行汁液提取，抗生素溶解，使用大肠杆菌作为样品进行实验。经数据研究分析，抗生素具有明显抑菌作用，且这四种提取物所表现的抑制作用随浓度的增大而提高。但由于实验中出现的误差及实验材料的不完备，致使实验结果与预测有偏差。苹果，清水，蒜，姜均对大肠杆菌有一定抑制作用。其中蒜溶液的抑菌作用大于其他溶液，但相对于抗生素效果较弱。 关键词大肠杆菌抑菌试验天然植物提取液 前言 微生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活密切相关。我国是一个农业大国。毋容置疑，农药、化肥对于从根本上解决我国人口温饱问题和促进农业经济的腾飞功不可没。但是，随着化学农药和化肥的大量不科学使用．很多弊端突出，如有害生物的抗药性、对环境的污染和生态系统的破坏等已成为当前应用农药的主要问题。在这种情况下，植物源农药悄然兴起，因其与环境兼容性好、高效、低毒、低残留，并且对有害生物的选择压力小．目前已成为农药研究开发领域的热门之一。因此，本课题探究的是天然植物源对于微生物的抑菌效果。为此，我们选用了清水，苹果，姜蒜和抗生素进行对大肠杆菌的抑菌试验。 研究方法和过程： 实验法：
1.实验材料 苹果、姜、蒜、大肠杆菌群落、清水、头孢药片 2.实验器材 培养皿、量筒、研钵、玻璃棒、烧杯、胶头滴管、滤纸、漏斗、移液管、酒精灯、涂布棒、镊子、接种环 实验步骤： 1.制作液体培养基（酵母菌提取物：0.50g 蛋白胨：1.06g 氯化钠：1.00g 水：100ml） 制作固体培养基（酵母菌提取物：0.55g 蛋白胨：1.00g 氯化钠：1.00g 琼脂：2.00g 水：100ml ）并调节PH值（弱碱性） 2.将固体、液体培养基进行高温蒸汽灭菌（121.3摄氏度 1.05kg/cm^2 20分钟） 3.将固体培养基倒入培养皿，制作培养基平板，静置16个小时 4.将接种环加热杀菌，待冷却后，用其刮取挂肠杆菌菌落，加入液体培养基内，放入恒温 摇床中，4小时 5.将苹果，蒜，姜放入研钵中进行研磨，获取苹果、姜、蒜汁液，并过滤。 6.将抗生素加水溶解，制成溶液，另取50ml清水。 7.制作抑菌纸片24片（圆形，直径8mm，滤纸），将抑菌纸片（12片）浸入过滤后的橙 皮橙肉溶液，将6片抑菌纸片浸入清水，同样6片浸入头孢溶液，静置1小时，后取出风干（斜置于干净培养皿中，不可直接粘贴在培养皿中） 8.将培养好的大肠杆菌液体培养基取出，带入无菌操作室中进行固体培养基大肠杆菌种 植，用移液管取1ml液体培养基加入培养基平板，涂布棒垂直均匀涂抹培养基平板。9.取已风干的完好的橙汁、橙皮、头孢溶液和清水的抑菌纸片（各3片），轻放于固体培 养基之上（每片抑菌纸片之间的间隔为2~3cm） 10.将已放入抑菌纸片的固体培养基放入人工气候箱（37摄氏度湿度24）培植大肠杆菌 静置16~24h 11.测量抑菌圈直径，并对结果进行数据分析
目前，我国抗菌药物的应用现状是临床无指征治疗性、预防性用药严重及选择错误的品种、剂量及疗程。而不合理用药可导致治疗失败、不良反应增多、细菌耐药性增长迅猛、医药资源大量消耗等不良后果。而我们应该如何为临床正确选用抗生素呢？正确的答案是，我们应该根据感染菌株的药物敏感性试验合理选用抗生素。 抗菌药物的敏感性试验就是测定抗菌药物在体外抑制病原微生物生长的效力。目前，我科遵循美国临床实验室标准化研究所（CLSI）2010版抗微生物药物敏感性试验执行标准进行操作。由于CLSI标准的公认程度和准确性，许多国家都采用该标准。该标准根据不同的细菌分类（如肠杆菌科、葡萄球菌属、铜绿假单胞菌等）制定可选用的抗生素及其药敏试验的判读标准，并将它们分成四组：A组：一级试验并常规首选报告的抗微生物药物；B组：一级试验，临床使用的主要抗生素（尤其在院内感染时）有选择报告的药物；C组：补充试验，有选择报告的药物；U组：补充试验，仅用于泌尿道感染细菌的抗微生物药物。CLSI 标准所制定的三级划分制及临床意义如下：高度敏感（S）：用该种药物常用剂量治疗有效；中介（I）：仅在应用高剂量抗菌药物时才有效，或者细菌处于体内抗菌药物的浓缩部位（如尿液、胆汁等）才被抑制；耐药（R）：药物对某一细菌的MIC高于药物在血或体液中可能达到的浓度，有时细菌能产生灭活抗菌药物的酶，则不论其MIC值大小如何，均应判定该菌为耐药。 在临床实践中，我们常可以听到一些关于细菌药敏试验与临床药效不符的抱怨。这一现象的出现，国内外的一些文献认为主要与以下几方面有关。①与临床是否正确地获得合格的标本至为相关；我们应规范标本的取材、送检及减少送检污染部位的标本（如：痰、咽拭子等）。②可能出现真菌等二重感染。③CLSI药敏标准制定中的局限性。④细菌感染的诊断是否正确。⑤药敏试验操作不当。⑥用药剂量不足或出现耐药菌株。⑦一般医院的微生物实验室做细菌培养仅限于需氧非苛养菌的检测。总之体外药敏试验为临床治疗提供依据, 但疗效好坏应取决于医师和检验师的判断。没有最好的抗生素,只有最合适的抗生素；我们治疗的应该是感染菌,而非污染或定植菌! 2 临床感染性疾病的诊断与治疗结合，微生物实验室的药物报告 在各类医院的临床治疗中，大多数感染性疾病都是应用各类广谱抗生素，由于很多感染是由耐药菌株引起的，所以广谱抗生素根本没有任何效果，反而极易引起由真菌引发的二重感染，对临床治疗带来极大的困难。 以下是我院几例感染病例，从中看出细菌药敏试验的重要性。脑出血患者，行微创术后，气管切开，继发肺内感染，微生物鉴定结果是肺炎克雷伯菌感染，头孢类耐药，呱啦西林/舒巴坦还未广泛应用于临床，无法购到，以致于错过了最佳治疗时间，患者死于感染性休克。同一疗区，同样是一例脑出血患者行微创术后患者，未行气管切开术，亦出现肺内感染，右侧肺不张，实验室微生物鉴定亦为肺炎克雷伯菌感染，药敏试验亦为复方呱啦西林敏感，家
实验六抗菌药物的体外 药效试验 集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
实验六、抗菌药物的体外药效试验 （药敏试验） 各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床对控制细菌性传染病的流行至关重要。此外，通过药物敏感试验可为新抗菌药物的筛选提供依据。药敏试验的方法很多，普遍使用的有滤纸片扩散试验（Kirby-Baueer Dice Diffusion）；最低抑菌浓度试验（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和最低杀菌浓度试验（Minimum Bactericidal Concentration, MBC）。 ［目的要求］ 1、熟悉体外抗菌试验操作技术。 2、掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途。 ［实验原理］ 常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释法。琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面，然后用不同的方法将药物置于已含试验菌的琼脂平板上。根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打洞法、管碟法及挖沟法等。经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力。浓度系列稀释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内，加入一定量的试验菌，经适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC）。 1、细菌：所用细菌应包括主要致病菌。革兰氏阳性球菌包括金黄色葡萄球菌(产酶与不产酶菌株)、表皮葡萄球菌，链球菌、肠球菌等。革兰氏阴性球菌如淋球菌等。革兰氏阴性杆菌包括流感杆菌、肠杆菌科细菌8～10种，绿脓杆菌与其它假单孢菌属及不