HL10005.1v.A
细胞样品亚细胞结构分离试剂盒产品说明书
主要用途
细胞样品亚细胞结构分离试剂是一种旨在通过细胞裂解和差速离心而获得动物细胞核、细胞浆和细胞器组分的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。适宜于各种动物细胞的亚细胞结构和功能的研究和鉴定。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，操作简便，分离清晰，成分完整。
技术背景
细胞分离成亚细胞结构成分单位是细胞生物学研究的基本手段。采用轻柔的机械物理方法或化学去污剂方法实现细胞裂解，然后运用差速离心的方法将细胞成分分离，由此获得独立的保留其原生化特性的具有活力的细胞器和大分子成分，从而进行细胞器和亚细胞部位的结构与功能的相关研究，同时检测各种分子元素的定位、运作和运输。
产品内容
清理液（Reagent A）毫升
保存液（Reagent B）毫升
萃取液（Reagent C）毫升
活性液（Reagent D）微升
产品说明书1份
保存方式
保存活性液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月
用户自备
HANK平衡盐溶液（HL12028）或PBS溶液（HL12033）：用于清理细胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HL12024）：用于细胞脱离
完全细胞培养液（HL12052）：用于细胞处理所需的培养基
1.5毫升离心管：用于细胞组分操作和保存的容器
2毫升离心管：用于细胞组分操作的容器
50毫升锥形离心管：用于细胞收集后离心的容器
台式离心机：用于细胞组分分离
超速离心机：用于分离纯化细胞浆成分
DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞
显微镜：用于观察细胞分离组分
实验步骤
实验开始前，将试剂盒里的活性液（Reagent D）从－70℃的冰箱里取出，放进冰槽里。溶化后，分别移出xx微升活性液（Reagent D）和xx的萃取液（Reagent C）到1.5毫升离心管里，混匀后，标记为萃取工作液，放进冰槽里。然后进行下列操作。
一、细胞预处理
1．准备3瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5X107细胞）
2．分别小心抽去细胞培养液
3．分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖细胞生长表面
4．分别小心抽去清洗液
5．重复实验步骤3至4一次
6．加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（TRYPSIN/EDTA），铺满整个培养表面
7．放进37℃培养箱孵育3分种
8．轻轻抖动培养瓶，使细胞脱落
9．分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液，混匀
10．合并移入到1个50毫升锥形离心管
11．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为200g（或1000rpm，例如EPPENDORF5810R）
12．小心抽去上清液
13．加入xx清理液（Reagent A），轻轻混匀细胞颗粒群
14．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为200g（或1000rpm，例如EPPENDORF5810R）
15．小心抽去上清液
16．重复实验步骤13至15一次
17．加入xx清理液（Reagent A），充分混匀细胞颗粒群
18．放进冰槽里（接到实验步骤二的第1步）
19．移出500微升细胞混匀物到1.5毫升离心管
20．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为500g（或2500rpm，例如EPPENDORF5415D）21．小心抽去上清液
22．加入xx保存液（Reagent B），轻轻混匀
23．放进－70℃冰箱里长期保存――
二、细胞核组分分离
1．将上述实验步骤一的第18步在冰槽里的50毫升锥形离心管放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为200g（或1000rpm，例如EPPENDORF5810R）
2．小心抽去50毫升锥形离心管的上清液
3．加入xx含有活性液（Reagent D）和萃取液（Reagent C）的萃取工作液，充分混匀细胞颗粒群
4．即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，用匀浆棒匀化细胞40下
5．置于冰槽中孵育30分钟
6．再次使用匀浆棒匀化细胞40下
（选择步骤：移出50微升细胞匀浆物在载玻片上，通过显微镜观察，细胞溶解而细胞核是完整的；如果细胞没有溶解，显微镜下可见发亮的细环状结构，这样需要进一步匀化细胞，但切莫过度匀化细胞）7．移取所有细胞匀浆物到2毫升离心管
8．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为500g（或2500rpm例如EPPENDORF5415D）
9．小心移出上清液到新的1.5毫升离心管
10．加入xx萃取液（Reagent C）到上述2毫升离心管，充分混匀沉淀颗粒
11．放进预冷的DOUNCE匀浆器匀化40下
12．置于冰槽中孵育15分钟
13．再次使用匀浆棒匀化细胞10下
14．移回所有匀浆物到2毫升离心管
15．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为500g（或2500rpm例如EPPENDORF5415D）
16．小心移出上清液合并到上述实验步骤二的第9步的1.5毫升离心管
17．再次加入xx萃取液（Reagent C）到2毫升离心管，充分混匀沉淀颗粒
18．同时将1.5毫升离心管和2毫升离心管放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为500g（或2500rpm 例如EPPENDORF5415D）
19．（分别）小心移出上清液（合并）到1个超速离心管（接到实验步骤三的第1步或第5步）
20．分别加入xx保存液（Reagent B）到1.5毫升离心管和2毫升离心管，轻轻混匀沉淀颗粒
21．合并成1管，放进－70℃冰箱里长期保存――
三、细胞器和细胞浆组分分离
1．（选择步骤）将实验步骤二的第19步的上清液，放进4℃微型台式离心机离心30分钟，速度为10000g （或10000rpm例如EPPENDORF5415D）
2．（选择步骤）小心移出上清液到新的超速离心管
3．（选择步骤）加入xx保存液（Reagent B）到沉淀颗粒，轻轻混匀
4．（选择步骤）移入到1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里长期保存——
5．将实验步骤二的第19步的上清液或实验步骤三的第4步的上清液，放进4℃超速离心机离心60分钟，速度为100000g（注意：参见注意事项7）
6．小心移出3毫升上清液到2个新的1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里长期保存——
7．加入xx ENMED保存液（Reagent B）到沉淀颗粒，轻轻混匀
8．移入到1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里长期保存——
注意事项
1．本产品为10次操作
2．所有操作均须在4℃状态下进行
3．细胞核组分可以被用来进行电泳迁移率变动分析实验去研究转录因子或活体外转录反应；P53可作为细胞核成分的标准对照
4．对于易于脆裂的细胞核或难以溶解的细胞，采用化学去污剂加上物理匀浆法是优先推荐的技术处理5．实验步骤二的第6至19步，旨在尽最大可能溶解细胞，充分获得各种组分，建议用户进行操作；如果用户没有这一需求，可以跳过实验步骤二的第9至18步
6．实验步骤三的第1至4步，旨在获得独立的线粒体组分，如果用户没有这一需求，可以跳过
7．获得细胞浆成分，可以采取不同离心速度：最低不得低于10000g（或10000rpm例如EPPENDORF 5415D），由此获得的便是粗提细胞浆组分；根据用户需求，增加离心速度，其纯度相应增加，最高不要超过速度为100000g
8．所有组分建议保存在－70℃冰箱里，长期保持活性
9．本产品保留所有细胞内成分
10．本产品的分离成分可用于各种后续操作
11．本公司提供系列亚细胞分离和分析试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶
3．本产品经鉴定亚细胞结构分离清晰，维持正常活性
Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit 一、试剂盒说明 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS ）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS ）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca 2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V 进行荧光素FITC 标记，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI ）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。 二、试剂盒组份 组份 (20 assays) (50 assays) (100 assays) 储存条件 AnnexinV-FITC 100 μL 250μL 500 μL Propidium Iodide 100 μL 250μL 500 μL Binding Buffer 10.0 mL 25 mL 50 mL 注：1、Annexin V-FITC 组份建议按需分装小份冻存于-20 ℃，避免反复冻融； 2、Propidium Iodide 和Binding Buffer 组份不用时可放置于4℃保存，Propidium Iodide 需要避光。 3、Store at -20℃ for 12 months 三、试剂盒以外自备仪器和试剂 流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器 1.5m L Microtube 、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS 、不含EDTA 的胰酶消化液 四、使用注意事项 1. 微量试剂取用前请离心集液。 2. Annexin V-FITC ，Propidium Iodide （PI ）避光保存及使用。对于Annexin V-FITC 这个组份，建议您在收到产品之后，分装为小份避光保存于-20℃，即用即取。 3. Propidium Iodide （PI ）有毒，操作时要戴手套。 4. 本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1×105，不推荐用于检测组织样本。 5. 推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，需用不含EDTA 的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而 用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA 的PBS 中，防止进一步的损伤。 6. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。 7. 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每 次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。 五、 操作方法 1. 悬浮细胞离心（2000rpm 离心5min ）收集；贴壁细胞用不含EDTA 的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间不 易过长，否则容易引起假阳性）； -20℃避光 4℃避光 4℃
第一篇组成人体的细胞 第三章亚细胞结构的分离与鉴定 细胞山各种亚细胞结构组成。其重要的研究手段之一是分离纯化亚细胞组分，观察它们的结构或进行生化分析。离心技术是实现这一日标的基本手段。一般认为，转速为10?25Kr/mm的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min,离心力大于89Kg者称为超速离心机。U前超速离心机的最高转速可达lOOKr/min, 离心力超过500Kg。 第一节亚细胞结构分离的技术 分离亚细胞组分的第一步是制备组织匀浆或细胞匀浆。匀浆 (Homogenization)是在低温条件下，将组织或细胞放在匀浆器中加入等渗匀浆 介质(即0?25moLZL蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液)研磨，使细胞被机械地研碎成为各种 亚细胞组分和包含物的混合物。 分离亚细胞组分的第一步是分级分离。它通过山低速到高速离心技术，使非均一混合体中的颗粒按其大小轻《分批沉降到离心管的不同部位，再分部收集, 即可得到各种亚细胞组分。山于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时是均匀分布于整个离心管中，故每级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最巫的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。分离亚细胞组分主要离心技术是差速离心和密度梯度离心。 差速离心(differential centrifugation)是在密度均一的介质中山低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后为核糖体。山于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，一般重复2?3次效果会好一些。通过差速离心可将细胞器初步分离，但常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 密度梯度离心(density gradient centrifugation)是用一定的介质在离心管内 形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过? 力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离乂可分为速度沉降和等密度沉降两种。密度梯度离心常用的介质为氯化锂，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：能产生密度梯度，且密度高时，粘度不商；pH中性或易调为中性；浓度大时渗透圧不大；对细胞无毒。①速度沉降(velocity sedimentation)主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于彼分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒(细胞或细器)在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离：②等密度沉降(isopycnic sedimentation)适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。再者，这种方法所需要的力场通常比速度沉降法大10、100倍，故往往需要高速或超速离心，离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。因此，这种方法适于分
一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书 货号：T2190 规格：20次 保存：-20oC保存，荧光标记液需避光保存。 产品简介： 细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上绿色荧光探针荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。 一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测到呈现绿色荧光的凋亡细胞。 TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标。产品内容： 1.TdT酶100μl 2.荧光标记液900μl 3.TdT酶稀释液(选用)500μl
亚细胞结构分离的技术 分离亚细胞组分的第一步是制备组织匀浆或细胞匀浆。匀浆（Homogenization）是在低温条件下，将组织或细胞放在匀浆器中加入等渗匀浆介质（即0.25moL/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙溶液）研磨，使细胞被机械地研碎成为各种亚细胞组分和包含物的混合物。 分离亚细胞组分的第二步是分级分离。它通过由低速到高速离心技术，使非均一混合体中的颗粒按其大小轻重分批沉降到离心管的不同部位，再分部收集，即可得到各种亚细胞组分。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时是均匀分布于整个离心管中，故每级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。分离亚细胞组分主要离心技术是差速离心和密度梯度离心。 差速离心（differential centrifugation）是在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后为核糖体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，一般重复2～3次效果会好一些。通过差速离心可将细胞器初步分离，但常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 密度梯度离心（density gradient centrifugation）是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降两种。 密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； pH中性或易调为中性；浓度大时渗透压不大；对细胞无毒。 ①速度沉降（velocity sedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离； ②等密度沉降（isopycnic sedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被 100分离组分的最大密度。再者，这种方法所需要的力场通常比速度沉降法大10 ~倍，故往往需要高速或超速离心，离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。因此，这种方法适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。 分离亚细胞组分的第三步是对分级分离得到的组分进行分析，以确认。常要的分析方法包括形态和功能鉴定。
凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(通用)（BIOTIN标记POD法,适用于细胞、组织样本） 使用说明书 一、TUNEL制品说明 凯基TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA 的断裂情况，其原理是生物素（biotin）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3‘－OH末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH 形成，很少能够被染色。 本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。 本试剂盒特点 ●操作简便：使用Ready-to-Use型试剂，并配有Proteinase K 和DAB。 ●高灵敏度：可以单一检出初期的凋亡细胞。 ●高特异性：能特异性染色凋亡细胞。 ●快速操作：整体操作约需3小时。 ●用途广泛：可应用于组织切片、细胞样本等。 ●方便观察：使用光学显微镜观察实验结果。 ●高正确性：有阳性对照片的制备方法，可以确认试剂盒的有效性
使用注意事项 1．使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。 2．因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心集液。 3．为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。 4． TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。 5. 为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。 6. 固定好的样本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分钟或至过夜，以改善细胞的渗透性。 7. 使用PBS清洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。 8. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。 9. DAB为固体粉末，使用前加入PBS配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按说明书显色使用。 二、TUNEL试剂盒组分 试剂盒以外自备仪器和试剂
细胞器线粒体的分离与观察 高熹1120152430（李安一） （北京理工大学生命学院16121501班） 摘要：差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。离心分离出细胞核与线粒体，进行染色，对细胞核和线粒体的形态进行观察并记录。 关键词：差速离心法；细胞核；线粒体；实验。 1 引言 差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。 线粒体是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。细胞种的能源物质——糖、脂肪、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸华生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体的结构和功能的研究通常是在离体线粒体上进行的。 制备线粒体用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心某一时间内，组织匀降中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉降的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意样品保持4，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引而堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 Giemsa染液为天青色素、伊红、次甲蓝的混合物，本染色液最适于血液涂抹标本、血球、疟原虫、立克次体以及骨髓细胞、脊髓细胞等的染色。染前用蛋白酶等进行处理，然后再用姬姆萨染液染色，在染色体上，可以出现不同浓淡的横纹样着色。姬姆萨染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。 2 实验器材及材料 2.1 实验材料 大鼠肝脏。
一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒 产品简介： 碧云天生产的一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测到呈现绿色荧光的凋亡细胞。 细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上绿色荧光探针荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(T dT-mediated d U TP N ick-E nd L abeling)法检测细胞凋亡的原理。 注：FITC是fluorescein isothiocyanate的缩写，实际上大多数情况下所谓的FITC即为fluorescein。 本试剂盒有如下优点。(1) 高灵敏度：可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。(2) 特异性：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。(3) 快速：仅需约1-2个小时即可完成。(4) 方便：只需一步染色反应，洗涤后即可观察，不必使用二抗等进行多步操作。(5) 应用范围广：可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。 TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。 极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标。 本试剂盒足够检测20个样品。 保存条件： -20℃保存，荧光标记液需避光保存。 注意事项： 需自备用于洗涤细胞的PBS或HBSS，用于封片的抗荧光淬灭封片液(P0126)，用于固定的4%多聚甲醛或向碧云天订购免疫染色固定液(P0098)，同时需自备含0.1％ Triton X-100的PBS或向碧云天订购免疫染色洗涤液(P0106)。 如果用于石蜡切片的检测，需自备蛋白酶K，二甲苯。蛋白酶K(ST533)可以向碧云天订购。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1.对于贴壁细胞或细胞涂片： a.PBS或HBSS洗涤一次。 b.如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。 c.用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。 d.用PBS或HBSS洗涤一次。 e.加入含0.1％ Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106)，冰浴孵育2分钟。 f.转步骤5。 2.对于悬浮细胞或细胞悬液： a.收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。 b.用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或 水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。 c.用PBS或HBSS洗涤一次。
简 答 题 1．下图是植物细胞亚显微结构模式图，据图回答（括号内填标号，横线上填名称） （l ）该细胞有氧呼吸的主要场所是（ ） 。 （2）本细胞所特有，动物细胞不含有的细胞器是 （ ） ，它是绿色植物进行 的 场所。 （3）对吸收水分有重要作用的结构是（ ） ， 此细胞若发生质壁分离，它将明显 。 （4）细胞中含有少量的遗传物质并与能量转换有关的 细胞器是（ ） 和（ ） 。 （5）图中1的主要成分是 ，它对细 胞具有 作用。 （6）细胞中的DNA 分子主要存在于（ ） 中。 2．右图是一个研究光合作用过程的实验。实验前溶液中加入ADP 、磷酸盐、叶绿体等。实验时按图示控制条件进行。并不断测定有机物合成率，用此数据绘成曲线。请你用已学过的光合作用知识，解释曲线形成的原因。 ?AB 段 。 ?BC 段 。 ?CD 段 。 3．将长势相同的3盆麦苗分别置于无色玻璃罩内（如下图）。请据图回答： （l ）甲盆覆盖着绿色透明膜，乙盆覆盖着 品红色透明膜。一段时间后，与丙盆麦苗相比， 甲盆的长势 ，原因是 ；乙盆的长势 ，原因 是 。 （2）甲盆内浇足含18O 的水，乙盆内充满 含18O 的CO 2。一段时间后，甲盆罩壁上出现含 18O 的 ，它是 产生 的；甲盆罩内的空气中出现含18O 的 ，它是 产生的；乙的罩壁上出现含18O 的 ，它是 产生的；乙盆植物细胞里出现含18O 的 ，它是 作用的产物。 4．下图是绿色植物体内与能量有关的生理活动图解，请据图回答下列问题： （1）图中叶绿素将光能转变为化学能时，首先将能量贮存在（ ） 中，然后再贮存在C 6H 12O 6中。 时间
超微结构病理（亚细胞病理） virchous在19世纪中期奠定了细胞病理学说。随着科学信息的进步发展，建立了亚细胞病理，通过对疾病发生发展中超微结构的认识，扩大和加深了对疾病的理解。 一细胞膜 细胞膜是包于细胞表面，将细胞与周围环境隔开的弹性薄膜，厚约7.5~9.0mm，液态镶嵌模型（双分子脂质和蛋白质构） (一）细胞之间连接方式的变化成 1、肿瘤细胞的变化 癌细胞之间的各种连接在数量上比正常细胞间的少，而且细胞之间的间隙扩大。 鳞癌——桥粒数目减少 疣细胞之间、角化棘皮瘤——桥粒增多、丰富 基底细胞癌——癌细胞之间保存着密切的相互黏着。 连接结构的变化对区别未分化癌和肉瘤有所帮助。 有桥粒存在——癌的可能性较大 间胚叶肿瘤——不典型桥粒，类似中间结构。 2、损伤和炎症的变化 正常人的滑膜之间没有中间连接，但在损伤和风湿性关节炎以及绒毛结节性滑膜炎增生时，可出现桥粒或类桥粒。 胞浆中出现桥粒 多核巨细胞中出现——巨噬细胞融合 角化棘皮瘤进行分裂的角化不良细胞中亦可出现。
微绒毛见于正常的肾曲管和肠黏膜上皮。在病理情况下发生数量上的多或少，形态上的气球样变和融合。 肝细胞、胆管上皮细胞微绒毛的变化 微绒毛增加：小鼠肝炎、兔注射抗原抗体之后。 微绒毛消失：肝癌失分化的细胞。 小鼠部分肝切除，胆小管微绒毛消失或减少 微绒毛形态变化：CCl4，30分钟后，微绒毛气球样变。 肠绒毛变化：（中轴含有微丝） 脂肪泻——变短、变宽和融合，排列也不规则。（其它吸收不良时，变化不显著）。 给氨甲喋呤后——扩张和形成水泡。 霍乱弧菌——球状绒毛，毒素及水分通过微绒毛逸出。 毛细胞性白血病，毛细胞有许多突起，甚至在红细胞表面也有分支或不分支的细胞突起。（还出现于特发性血小板减少性紫癜、恶性贫血、何杰金氏病）这种细胞吞饮作用增高。 环境中缺少某些因子或存在某种刺激因子。 （三）纤毛的变化 细胞表面游离面伸出的能摆动的细胞突起，比微绒毛粗而长。 1、复合绒毛表现为纤毛中有许多轴微管存在于共同的基质和一个膜的包绕中。这种变化出现在第三脑室胶样囊肿的衬里上皮、卵巢恶性多囊性畸胎瘤、卵巢癌、鼻乳头状瘤、重度吸烟、支气管癌上皮、过敏状态的上颌窦黏膜、聋子的中耳黏膜 2.、纤毛肿胀，微管脱失和膜的空泡变 纤毛脱落后不再生 二.线粒体Mitochondria
细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(PI法) 产品简介： Leagene细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是一种采用经典的碘化丙啶染色(PI staining)方法进行细胞周期与细胞凋亡分析的检测试剂盒。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种可以嵌合到双链DNA和RNA的碱基对中与直接和的荧光染料，无碱基特异性。碘化丙啶与双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被Propidium Iodide染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。 碘化丙啶染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生DNA片段化(DNA fragmentation)导致部分基因组DNA片断在染色过程中丢失，因此凋亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染，即荧光强度小于1，在流式检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰。 细胞凋亡时，流式细胞检测可呈现亚二倍体核型的特征，根据光散射的特点，PI染色可以区分细胞凋亡和细胞坏死的细胞峰型。细胞凋亡时，出现凋亡细胞皱缩、染色质浓缩、核碎裂，产生凋亡小体，使细胞的前向光散射低于正常。在细胞凋亡的早期，细胞对前向角光散射的能力显著降低，对侧向光散射的能力增加或没有变化。在细胞凋亡的晚期，前向和侧向光散射的信号均降低。细胞坏死时细胞多表现为细胞肿胀，因此前向光散射高于正常，对侧向光散射高于正常。 Leagene Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit经常用于培养的贴壁或悬浮细胞的细胞周期与细胞凋亡检测，亦可用于区分细胞凋亡和细胞坏死。该试剂盒检测细胞含量范围一般为0.1～1×106之间。 主要成分：
细胞凋亡-Hoechst 染色试剂盒 简介： 细胞凋亡-Hoechst 染色试剂盒(Hoechst Staining Kit)是一种采用经典的Hoechst33258进行细胞凋亡检测的快速简便的试剂盒。当细胞发生凋亡时，染色质会固缩，Hoechst33258染色后在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白。Hoechst Staining Kit 经常用于培养的贴壁或悬浮细胞以及组织切片的细胞凋亡检测。该试剂盒检测细胞含量范围一般为0.1～1×106之间。 组成： 操作步骤(仅供参考)： (一)贴壁细胞 1、取洁净盖玻片在70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用无菌的PBS 或生理盐水洗涤3次，再用细胞培养液洗涤1次。 2、加入干预条件使细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入Hoechst 固定液0.5ml 。 3、去除固定液，用PBS 或生理盐水洗，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动。 4、加入Hoechst 33258染色液0.5ml 孵育。也宜用摇床，或手动晃动数次。 5、弃染色液，用PBS 或生理盐水洗，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动。 6、滴一滴抗荧封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片剂，尽量避免气泡。 7、荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长350nm 左右，发射波长460nm 左右。 (二)悬浮细胞 1、离心收集细胞样品于1.5ml 离心管内并弃液，加入Hoechst 固定液0.5ml ，缓缓悬起细胞固定。 2、低速离心去除固定液，用PBS 或生理盐水洗。洗涤时手动晃动数次。 3、低速离心离心后吸去大部分液体保留约50μl 液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上， 编号 名称 DA0032 100T Storage 试剂(A): Hoechst 固定液 50ml RT 试剂(B): Hoechst 染色液 50ml -20℃ 避光 试剂(C): 荧光封片剂 5ml 4℃ 避光 使用说明书 1份
专题一动物细胞亚显微结构图或植物细胞亚显微结构图 1、图3—5是高等植物细胞的亚显微结构图，据图回答 （1）[ ①]是，主要成分是 和，对细胞具有支持和保护的作用。 （2）[②]是，由分子和分子构 成，其基本支架是。 它的结构特点是具有性； 从生理特性看，它又是一种性膜。 （3）[⑤ ]是，作用是增大细胞内膜面积，并 与蛋白质的加工和有机物合成有关。 （4）[ ]是，对细胞有支撑的作用。 若该细胞中的溶液浓度小于外界环境溶液的浓度，则细胞将发生现象。 含有西瓜果肉细胞色素的是[ ] （5）[⑥]是，是合成的场所。 （6）结构[⑧]是，它普遍存在于植物细胞和动物细胞中，它与的形成有关，在该植物细胞分裂时，与的形成有关。能对进行加工和转运。 （7）[ 12 ]是在中，它是遗传物质储存和复制的场所。 [ ]所指的物质是（易被碱性燃料染成深色），其主要成分是和。 在有丝分裂前期消失的是[ ⑨ ] 和[ 11 ] 。 （8）[13 ]是，是细胞进行的主要场所。提供生命活动所需的能量。（9）[ 14 ]是，是进行的细胞器。其内部有可以吸收、传递和转化光能的色素。 （10）该细胞结构不同于动物细胞的是具有[ ] 、[ ] 和[ ] 。 （11）消化酶、抗体等分泌蛋白的合成和运输需要四种细胞器： [ ] ，[] ，[ ] ，[ ⒀ ] 。 （12）原核细胞含有的细胞器有。 （13）具有双层膜的细胞器有。含有少量DNA的细胞器
有。 （14）若该图为植物的根尖细胞，则不应该含有[14 ] （15）若该图为低等植物细胞，则还应该有 2、（5分）下图为某高等动物细胞的亚显微结构模式图， （1）与分泌物形成有关的细胞器是[ 3 ] 。 （2）图中增大了细胞内的膜面积、膜上附有多种酶， 以保证生命活动的各种化学反应能正常进行的 细胞器是[ 8 ] 。 （3）图中[ 12 ] 与动物细胞有丝分裂有关。 （4）有氧呼吸的主要场所是[ ] 。 提供细胞能量的“动力工厂”为[ ]＿＿。 (5)抗体（蛋白质）合成的场所是[ ] （6）[1]是，它的结构特点是。它的 生理特点是 3．在一定时间内使某种动物细胞吸收放射性同位素标记的氨基 酸，经检查发现放射性依次出现在下图所示的①②③④⑤部位。请据图回答下列问题。(5分) (1)⑤部位的物质(图上方的黑圆点)首先是由附着在[ ]___________上方的[ ]___________合成的___________物质。 (2)它是由[ ]___________运输到[ ]___________加工形成的。 (3)此动物细胞对该物质还具有___________功能。
请在使用前仔细阅读说明书 Annexin V,FITC 凋亡检测试剂盒(100次) 产品名称货号规格储存条件运输条件 Annexin V,FITC结合物AD01-10 100次×1 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温 PI Solution AD02-05 50次×2 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温 10×Annexin V Binding Buffer AD03-05 50次×2 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温 *注：规格中的每“次”是以细胞浓度1×106 cells/ml计算 产品描述 细胞凋亡是指为维持有机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。正常情况下任何细胞在形成过程中发生的异常都会通过凋亡消除。例如体内的癌细胞增长为肿瘤的过程会受细胞凋亡的引导而被抑制。然而在抑癌基因p53出现问题时，凋亡就不会诱导发生，从而导致癌细胞的不断增长。细胞凋亡可以通过细胞形态的变化或生物化学的变化来检测。目前常用的指标有caspase活性变化、DNA碎片、磷脂酰丝氨酸的外翻等。 Annexin V染色的细胞可以用于检测细胞凋亡早期的细胞膜变化。在细胞凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V 是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜特异性结合，因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。用绿色荧光FITC标记的Annexin V 通过流式细胞仪或荧光显微镜可以检测到细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料，PI只能透过凋亡晚期和死细胞的细胞膜，因此Annexin V和PI结合使用，可以区分凋亡早晚期的细胞及死细胞。 所需的设备和材料 -合适量程的移液枪-样品和诱导剂 -细胞培养用6，12，24，96孔板-PBS、去离子水 -流式细胞仪或荧光显微镜。*最大激发/发射波长Annexin V,FITC:494 nm/518 nm; PI:535 nm/617 nm 溶液制备 1×Annexin V Binding solution -将10×Annexin V Binding Buffer用蒸馏水稀释10倍。 稳定性 试剂盒在0-5°下可以保存6个月，请避光保存Annexin V,FITC结合物。 操作流程 Ⅰ.悬浮细胞的操作流程 （Ⅰ）诱导凋亡的操作步骤 1.制备细胞（Jurkat cell）悬液（1×106 cells/ml） 2.加入终浓度为1 μg/ml的凋亡诱导剂（Staurosuporine） 3.在37℃下培养3.5 h。* Staurosuporine用于诱导Jurkat cell凋亡。最佳诱导条件请根据实验的细胞类型与诱导剂调整。（Ⅱ）Annexin V染色操作步骤 1.将细胞悬液转移到离心管中，1,000 rpm离心3 min，取出上清液。 2.加入PBS，1,000 rpm离心3 min，去除上清液。再重复本步操作一次。 3.用之前准备好的1×Annexin V Binding Solution制备细胞终浓度为1×106 cells/ml的细胞悬液。* 细胞悬液体积根据实验目的自行调整，一般推荐不少于500 μl细胞悬液。 4.取100 μl步骤3中制备的细胞悬液，加入到一个新的tube中。 5.向细胞悬液中加入5 μl Annexin V,FITC结合物，再加入5 μl PI Solution。 6.室温下避光培养15 min。 7.加入400 μl 1×Annexin V Binding Solution，请在在1小时内检测。 Ⅱ. 贴壁细胞的操作流程 （Ⅰ）诱导凋亡的操作步骤 1.制备细胞（Caco-2）悬液（1×106 cells/ml） 将细胞悬液接种到培养皿或者培养板中。 2.在5% CO2培养箱中37℃预培养。 3.加入终浓度为25 μmol/ml的凋亡诱导剂（Cisplatin） 4.37℃培养4 days。*Cisplatin用于诱导Caco-2 cell凋亡。最佳的诱导条件请根据实验的细胞类型与诱导剂调整。 （Ⅱ）Annexin V染色操作步骤 1.弃去培养皿或培养板中的上清液。 2.用PBS洗细胞2次。 3.用胰蛋白酶消化细胞。 4.用适量的培养基或PBS将细胞悬液转移至离心管中。 5.1,000 rpm离心3 min，弃上清。 6.加入PBS后1,000 rpm离心3 min，弃上清。重复本步操作一遍。 7.加入预先配好的1×Annexin V Binding Solution，制成终浓度为1×106 cells/ml的细胞悬液。* 细胞悬液体积根据实验目的自行调整，一般推荐不少于500 μl细胞悬液。 8.取100 μl步骤7中的细胞悬液，加入到新的tube中。 9.向细胞悬液中加入5 μl Annexin V,FITC结合物，再加入5 μl的PI Solution。 10.室温下避光培养15 min。 11.加入400 μl 1×Annexin V Binding Solution，请在1小时内检测。 Ⅲ. 设定的对照 1.未染色细胞。 2. Annexin V-FITC染色细胞（没有PI）。 3.PI染色细胞（没有Annexin V-FITC）。
<医学生物学实验>整理 1. 常用的吸量管有： 奥氏吸量管、移液管、刻度吸量管 4. 如何正确使用吸量管？ 答：(1) 选用原则：就近原则 (2) 吸量管的使用：吸-擦-调-放 5. 如何正确使用微量加样器？ 答：转-按-吸-擦-按 6. 如何正确使用离心机？ 放置-装管-平衡-启动-取出 二、主要实验方法原理 1.分光光度法基本原理是什么？ 答：不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此每种物质都具有其特异的吸收光谱，在一定条件下，其吸收程度与该物质浓度成正比，故可利用各种物质的不同的吸收光谱特征及其强度, 对不同物质进行定性和定量的分析。分光光度法常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其基本原理是根据Lambert和Beer定律。该定律阐明了溶液对单色光吸收的多少与溶液浓度及溶液厚度之间的关系。 2. 利用分光光度法对物质进行定量测定的方法主要有哪两种？ 答：直接比较法（公式法）、标准曲线法 3. 层析法基本原理是什么？ 答：层析法就是利用混合物在经过固定相和流动相两相的过程中，其中的待分离物质在不同的两相中不断地进行交换、分配、吸附及解吸附等过程，由于混合物中各组分间在理化性质如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等方面存在着差异，因此当它们经过上述相同重复过程时，各自的情况就会有所不同从而使各物质得以分离。 4. 常用的层析法有哪几种？ 答：薄层层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析。 5. 离子交换剂的作用原理是什么？ 答：①阳离子交换剂吸附阳离子；②阴离子交换剂吸附阴离子； 当离子结合到固定相交换基团上以后，用提高流动相中离子强度或改变pH的办法，把它们从离子交换剂上依次洗脱下来，达到分离纯化的目的。 6. 凝胶层析的作用原理是什么？ 答：分子筛 7．亲和层析的作用原理是什么？ 答：亲和层析是以能与生物分子进行特异结合的配基作为固定相，对混合物中某一生物分子进行高效分离纯化的层析技术。 9. 影响电泳的主要因素是什么？ 答： (1) 电泳溶液的pH值|: 当溶液的pH值等于某种两性电解质的等电点时，不带电荷。当溶液pH小于其等电点时，则呈正离子状态，移向负极；反之，溶液pH值大于其等电点时，则呈负离子状态，移向正极。 (2) 缓冲液的离子强度: 离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰。常用离子强度为0.02~0.2。 (3) 电场强度: 电泳速度和电场强度成正比关系。电场强度愈高，则带电粒子的移动愈快，但电压增加，相应电流也增大，电流过大时易产生热效应, 可使介质中溶液蒸发及生物样品
流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡 (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7) 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits 试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)
Annexin V 检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。 3 3. 微量加样器和加样头。
凯基Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒 （Annexin V-EGFP Apoptosis Detection Kit） Cat number：KGA For Research Use Only Store at4℃ for one year Expire date： 一、 试剂盒说明 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。与FITC的绿色荧光信号相比，EGFP的绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点，故本试剂盒采用EGFP作为荧光标记探针。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。 二、 试剂盒组份 组份Cat: KGA101 10 assays Cat: KGA102 20 assays Cat: KGA103 50 assays Cat: KGA104 100 assays 储存条件 AnnexinV-EGFP 50μL 100μL 250μL 500μL 4℃避光 Propidium Iodide 50μL 100μL 250μL 500μL 4℃避光 Binding Buffer 5 mL 10.0 mL 25 mL 50 mL 4℃ 三、 试剂盒以外自备仪器和试剂 流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器 1.5m L Microtube、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS、不含EDTA的胰酶消化液 四、 使用注意事项 1．微量试剂取用前请离心集液。 2．Annexin V-EGFP，Propidium Iodide（PI）避光保存及使用。 3．Propidium Iodide （PI）有毒，操作时请戴手套。 4．本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不应低于1×105，，不推荐用于检测组织样本。 5．推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，需用不含EDTA的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存 在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。 6．细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。 7．因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。 五、操作方法 1．悬浮细胞离心（2000rpm离心5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）； 2．用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集1~5×105细胞；