液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解-不能不看的精华-
液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解-不能不看的精华_.txt16生活，就是面对现实微笑，就是越过障碍注视未来；生活，就是用心灵之剪，在人生之路上裁出叶绿的枝头；生活，就是面对困惑或黑暗时，灵魂深处燃起豆大却明亮且微笑的灯展。17过去与未来，都离自己很遥远，关键是抓住现在，抓住当前。液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解－不能不看的精华
液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解
苯甲酸、山梨酸、糖精钠是衡量食品卫生质量的重要指标，苯甲酸、山梨酸的检测参照GB/T5009.29-2003，糖精钠的检测参照GB/T 5009.28-2003，即可开展实验。
苯甲酸、山梨酸、糖精钠虽是较常见的检测项目，但是要得到一个准确可靠的结果，也存在一定的难度，许多新手常出现因对方法理解发生偏差而
检测出错的事故。笔者根据自己多年该方面工作的实际经验出发，以苯甲酸、山梨酸为着重点，从样品前处理、检测仪器的选择、超标时的判断等几个易出问题的方面，进行了详细的阐述。
2 样品前处理的注意事项
GB/T5009.28-2003和GB/T5009.29-2003 在文字结构上有缺陷，在涉及用仪器法测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠时，只讲述了液体样品的前处理方法，没有涉及对固体样品的前处理。
食品样品往往含有大量的油脂、蛋白质，对提取极为不利；如处理不干净也会污染色谱柱，影响检测工作。这类样品处理的关键在于如何找到一
种较理想的沉淀剂，尽量排除待测样品中的油脂、蛋白质，且不影响待测物组分的回收率。
GB/T5009.29-2003使用5％硫酸铜溶液沉淀蛋白，对于蛋白质含量较低的食品尚可，对于豆粉、奶粉、月饼等高油脂、高蛋白样品则沉淀效果不理想。如用10％钨酸钠溶液作为沉淀剂，效果好些；如用10％亚铁氰化钾溶液和20％醋酸锌溶液则效果更理想（这是笔者目前用过最理想的沉淀剂）。
具体操作步骤如下：
取一定量样品，捣碎，利用四分法原理称取样品5.0 克于50ml比色管中，加水20ml，浸泡、振荡均匀，加入氢氧化钠溶液(1mol/L)1.0 ml，加
入9.5mL10%亚铁氰化钾溶液， 9.50mL 20%乙酸锌溶液，定容，振荡使其充分混匀后,用滤纸初滤除去沉淀物, 初滤液过0.45μm微孔滤膜,收集滤液于样品瓶中，样品处理液和标准有溶液各进样5uL测定。
用这种方法简单易行，接触有机试剂少，重复性和回收率都令人满意；缺点是一定要用液相色谱法检测，有一定局限。
3 检测仪器的选择
虽然液相色谱仪操作起来比气相色谱仪要复杂，但笔者建议如条件许可仍尽量用液相色谱法检测。原因如下：
3.1 液相色谱法所用的样品处理方法远比气相色谱法简单，且不需使用有机试剂。尤其对于高油脂样品（如月饼）若采用碱化－排油－酸化－提取－挥干－溶解等步骤，再上气相色谱仪检测，工作量大，试剂毒性也大，且结果由于处理步骤太多而难以保证准确。
3.2 用液相色谱法还可同时完成糖精钠项目的检测，而气相色谱法只能做苯甲酸、山梨酸的检测。
3.3 液相色谱仪所用的紫外检测器比气相色谱仪的氢火焰检测器灵敏，可进行更低含量的检测。如用二极管阵列检测器，还可辅助定性，这更是气相色谱氢火焰检测器不可比拟的。
4 选用气相色谱仪时的注意事项
GB/T5009.29所用的气相色谱柱为 5％DEGS＋1％磷酸固定液的60－80目 Chromosorb W AW，。这种柱有性能稳定、重复性好、保留时间稳定的优点，但同时也有稳定时间较长的缺点。
该柱的适用的样品提取溶剂为石油醚或乙醚，如果用甲醇或乙醇，则溶剂峰拖尾效应较大，对山梨酸的测定有影响。
如用毛细管柱，能取得更好的峰形和灵敏度，但其稳定性及特异性不如填充柱。一般可用非极性毛细管柱，0.530mm内径，10－15m长度。色谱
条件可能需用程序升温。
在气相色谱仪上的出峰次序为先出山梨酸，后出苯甲酸。
糖精钠不能直接用气相色谱进行检测，必须衍生化后才能汽化进样。
5 选用液相色谱仪的注意事项
按照GB/T5009.29，流动相应为5：95的甲醇：0.02M醋酸铵溶液，但是这个比例仅是个参考值，我们在工作中应根据实际情况进行调节。
为什么用甲醇溶液？甲醇有两个作用，（1）防腐，液相色谱柱最怕流动相长菌，尤其霉菌。甲醇可使蛋白质变性，有杀菌作用。（2）调节流动相极性，这是最重要的一点。甲醇在溶液中比例的较小变化都会使苯甲酸、山梨酸、糖精钠的保留时间发生明显的改变，因此可以通过改变流动相中甲醇含量，以调节这几个组分的出峰和分离，以得到较理想的色谱图。
5：95是一个通用的比例，如减少甲醇含量，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的出峰时间变慢，扩散效应增大，峰形较差，但这三组分的分离情况较好。如增加甲醇含量，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的出峰时间提前，扩散效应较小，峰形尖锐，但这三组分的分离情况可能受影响，产生重叠。在选择条件时，只能通过实验手段，如配制3：97，4：96，5：95，6：96，7：93的流动相，综合考虑分离效果和分离时间选择最佳比例。
不同柱的最适比例不同，举例来说，色谱科公司的液相柱最适比例为4：96，而岛津公司液相柱的最佳比例为7：93。就是同一根柱，一年前和一年后的极性也会有变化，需调节溶液配比。
为什么使用0.02M醋酸铵溶液？加入醋酸铵是为了调节离子强度，使待测物的峰形不致于变坏。如果单独检测苯甲酸和糖精钠，加不加醋酸铵没有什么关系，都可以得到较好的峰形；但是检测山梨酸时流动相一定要加醋酸铵，否则得不到一个完整的色谱峰，峰形呈破裂状。
醋酸铵溶液浓度不需严格控制，0.01M、0.02M、0.04M均可。
苯甲酸、山梨酸、糖精钠在液相上的出峰次序很有特点。在流动相5：95及以下比例时，次序是苯甲酸、山梨酸、糖精钠（注意一下气相的出峰次序），逐步增大甲醇含量，苯甲酸、山梨酸的出峰时间逐步提前，而糖精钠是出峰时间迅速提前，随着甲醇比例的逐步增大（15％－30％），原先在最后出峰的糖精钠集次和前面的山梨酸、山梨酸重叠，并位于最前面，其次序变为糖精钠、苯甲酸、山梨酸。再提高甲醇浓度，次序不变。
用高甲醇比例条件（甲醇15％以上）做出的三种标准物质色谱图峰形较好，出峰时间也较快，但做实际样品时干扰较大；因此建议尽量使用低甲醇比例条件（甲醇5％左右）。
6 苯甲酸、山梨酸超标时的判断
苯甲酸、山梨酸超标的样品较多，由于它们往往牵涉到一批货物是否合格，因此责任重大。由于该方法定量较准确，因此遇到超标样品时应将精力集中于定性方面。
如同时有气相色谱仪和液相色谱仪，建议用这两种性质相差较大的仪器进行对照，如定量结果差不多，即可确认。
如只有气相色谱仪，应利用其在填充柱保留时间稳定的特性，同时进五针标准液和五针样品液（注：峰面积应差不多，否则需对一方按比例稀释），如标准和样品液的保留时间相差时间超过1 秒，可认为不是。（如进针的技术不过关，请不要做此实验）
如用液相色谱仪，当检测器为二极管阵列检测器时，根据保留时间和紫外吸收图结合定性，当只有紫外检测器时，改检测波长为220nm，230nm，250nm，重复进标准和样品液，由标准和样品在不同波长的峰高比值看是否吻合。
如有微生物检测手段，可加样品于有菌培养基中，观察有无抑菌现象，如无抑菌现象则无防腐剂。
不是很推荐用双柱法，因为有时柱极性相差不大，反而会影响最终判断。
7 糖精钠超标时的判断
当检测糖精钠超标时，除了采用二极管阵列检测器或波长验证，还可以利用糖精钠的荧光特性，用荧光检测器进行验证。荧光条件是激发波长为277nm，荧光波长为410nm。只有当用荧光检测器和用紫外检测器做出的定量结果相差不多，才可以判断为是。
还有一个简单粗糙、却也行之有效的验证方法，即感官法。糖精钠是一种甜味剂，用舌头可以感觉到它的甜味，如果含量超标，一定能尝出来。
8 标准溶液的配制贮存问题
苯甲酸、山梨酸、糖精钠的标准溶液如用水、乙醇作基体，一般几个月后会严重降解，。如用甲醇溶解再放于冰箱冷冻层，可保持稳定一两年。因此推荐用甲醇作溶剂。
在配制标准溶液时，初学者常犯的错误多为用甲醇溶解苯甲酸钠，用水溶解苯甲酸，晃了半天才发现怎么也不没溶解。应该用弱碱性水溶解苯甲酸钠、山梨酸钾，用甲醇溶解苯甲酸、山梨酸。
9 苯甲酸、山梨酸的应用范围
首先应注意到，并不是所有食品都需要加入防腐剂，只有那些富含营养物质，且需要长时间暴露于空气的才有这样的需要，否则对厂家来说会增
加不必要的成本。
酱油、酱料、咸菜、浓缩果汁等由于开封后不可能短期内吃完，月饼等需在货架上摆放，如不加防腐剂很快会发霉变质，有添加防腐剂的必要。而利乐装或易拉罐装的饮料由于很快可以食用完毕，即在细菌大量繁殖前己被消化了，因而没有添加的必要。
苯甲酸、山梨酸如果要起到防腐的作用，含量就不能太低。如果我们检测样品时只有几个ppm的浓度，有可能是从原料中带来的或由其它添加剂转化来的，而不是厂家出于防腐目的加入的。
苯甲酸、山梨酸也只是防腐剂中的两种。并不是所有需要加入防腐剂的食品都会添加苯甲酸、山
梨酸，有可能使用防霉剂或其它种类的防腐剂，或自行规定需冷藏（如某些月饼）。因此有些食品检测不出也属正常。
另外，我们应该比较清楚地理解苯甲酸与苯甲酸钠、山梨酸与山梨酸钾之间的关系。在食品中添加防腐剂通常以苯甲酸钠、山梨酸钾形式加入，它们不易汽化，易溶于水，但不溶于甲醇等有机试剂；而苯甲酸、山梨酸易汽化，易溶于有机试剂，但是几乎不溶于水。检测时要注意有机酸及其盐类之间的转换。
高效液相色谱法在水质检测中的应用 摘要：液相色谱仪已广泛应用于水环境监测中，逐步成为常规检测方法，其适用于分子量大、挥发性低、热稳定性差的有机污染物的分离和分析，具有准确、快速等特点。 关键词：液相色谱仪；水环境监测；有机污染物 1、引言 高效液相色谱法 ( high performance liquid chro-matography，简称 HPLC)，具有下列主要优点：固定相颗粒细且规则均匀，传质阻抗小，组分间分离效率高；利用高压泵输送流动相，大大缩短分析时间；使用高灵敏检测器，提高了检测灵敏度，在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化方面，达到了和气相色谱法相媲美的程度，气相色谱法仅适于分析蒸汽压低、挥发性高、沸点低、热稳定性好的样品。在全部已知的有机化合物中仅有20%的样品符合这些条件，近80%的有机化合物属于挥发性低、易受热分解或者大分子化合物，适合于高效液相色谱分析，因此，HPLC 应用前景更为广阔。 在环境监测中，高翔液相色谱法已逐步上升为常用的监测方法，如检测多环芳烃类、酚类、多氯联苯、苯胺类、阴离子和非离子表面活性剂、有机农药除草剂等。随着经济的快速发展，人们在获取大量化学物质以满足经济、生产和生活需要的同时，也将一些典型的有毒有害的有机污染物带入环境，其中部分有机污染物已经直接或间接被证明具有致癌、致畸和致突变的作用，给人类健康和自然生态环境带来了严重、持久、潜在的危害。根据发达国家的经验和我国经济发展
伴随的污染现状，有毒有机污染物也必将成为我国环境监测的重要目标。 2、实验部分 2.1主要仪器 岛津公司生产的高效液相色谱仪（LC-20A），包括： (1)CBM-20A—系统控制器； (2)CTO-20A—色谱柱柱温箱； (3)LC-20A—溶液传输单元； (4)SPD-20A—紫外可见光检测器； (5)RF-20A—荧光检测器； (6)SIL-20A—自动进样器； (7)DGU-20A3R—在线脱气机 (8)数据处理：LC-LabSolutions工作站软件。 (9)色谱柱：Shim-pack column size serial NO.VP-ODS。 2.2液相色谱原理简介 液相色谱法是在高压条件下溶质在固定相和流动相之间进行的 一种连续多次交换的过程，它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差别使不同溶质得以分离。 2.3建立实验方法 研究液相色谱测定苯系物的实验方法，结合查找的资料及实验验证，确定检测苯系物的实验方法如下： (1) 进样量：10微升；色谱柱：Shim-pack column size serial NO.VP-ODS 柱。
乳制品中三聚氰胺的高效液相色谱检测法 三聚氰胺（Melamine）是一种重要的三嗪类含氮杂环有机化工原料，主要用于生产三 聚氰胺-甲醛树脂，广泛用于木材加工、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革等行业，为白色晶体。三鹿奶粉事件引发了对三聚氰胺检测的广泛关注，国家质量监督检验检疫总局和国家标 准化管理委员会相继发布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T22388-2008）和《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》（GB/T22400-2008）的国家标准。本文参考了 以上标准并进行配制条件优化，建立了液相色谱检测法，前处理简单，检测限、精密度、重 现性以及回收率均符合国家标准。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 LC1620高效液相色谱仪（含UV1620紫外-可见检测器1台，P1620高压恒流泵1台，上海 舜宇恒平科学仪器有限公司）；AT-330色谱柱温箱（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；FA2004 分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；TGL-16G-A离心机（上海安亭科学仪器厂）； 三聚氰胺标准品(>99%，上海安谱)；辛烷磺酸钠(色谱纯，北京百灵威)；磷酸(分析纯)、乙 腈(色谱纯，美国Tedia)、纯净水(杭州娃哈哈)。 1.2 标准品溶液配制 精密称取三聚氰胺标准品，溶于50％的甲醇水溶液，配制称1.422mg/ml的标准储备液，于4℃避光保存。根据实验需要，用流动相逐级稀释成适当浓度的标准工作液。 1.3 样品前处理 称取2g酸奶样品与50ml具塞离心管中，加入乙腈：水＝50：50混合溶液15ml，充分混匀 后超声提取15min。取提取液250ul，加入0.1mol/l盐酸750ul，混匀，以12000r/min离心 5min，取上清液，0.22um滤膜过滤，作为HPLC测定溶液。 1.4 色谱条件： 色谱柱：Globalsil C18 5μm(ID4.6mm×250mm) 流动相：乙腈/缓冲盐=15/85（缓冲盐：10mM辛烷磺酸钠水溶液，含0.1％磷酸） 流速：1.0ml/min 波长：240nm 温度：40℃ 进样量：20μl 2 实验结果 2.1 精密度实验 取浓度为0.569μg/ml三聚氰胺标准工作液，按上述色谱条件，连续进样5次，以各成分峰 面积计算RSD(%)，所得结果如表1所示：保留时间相对标准偏差（RSD）为0.23％，峰面 积RSD为0.57％。 表1 精密度实验 time（min）Peak High Peak Area NO. Retention 1 11.933 289 4216.8 2 11.990 290 4264.2 3 11.928 287 4246.0 4 11.927 287 4242.8 5 11.923 284 4218.6 RSD(%) 0.23 0.82 0.57
食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定 1 范围 本标准规定了食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量的测定方法。 本标准第一法适用于食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定；第二法适用于酱油、水果汁、果酱中苯甲酸、山梨酸的测定。 第一法液相色谱法 2原理 样品经处理后，用液相色谱分离，紫外检测器检测，外标法定量。 3试剂和材料 注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 3.1 试剂 3.1.1氨水（NH3?H2O）。 3.1.2氢氧化钠（NaOH）。 3.1.3硫酸（H2SO4）。 3.1.4亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6?3H2O）。 3.1.5乙酸锌（Zn(CH3COO)2?2H2O）。 3.1.6氯化钠（NaCl）。 3.1.7酒石酸（C4H6O6）。 3.1.8硅酮树脂。 3.1.9磷酸二氢钠（NaH2PO4?12H2O）。 3.1.10磷酸二氢钾（KH2PO4）。 3.1.11中性氧化铝。 3.1.12甲醇（CH3OH）：色谱纯。 3.1.13乙酸铵（CH3COONH4）。 3.2 试剂配制 3.2.1 氨水（1+1）：氨水与水等体积混合，经微孔滤膜过滤后备用。 3.2.2 氢氧化钠溶液（4 g/L）：称取4 g氢氧化钠，溶于水并稀释至1000 mL。 3.2.3硫酸溶液（0.5 mol/L）：移取30 mL浓硫酸（约70%）边搅拌边慢慢加入至500 mL水中，冷却至室温后，转移至1000 mL容量瓶中，用水定容至刻度。 3.2.4亚铁氰化钾溶液（92 g/L）：称取106 g亚铁氰化钾加水至1000 mL。 3.2.5 乙酸锌溶液（183 g/L）：称取220 g乙酸锌溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，加水稀释至1000 mL。
酱油中山梨酸、苯甲酸含量的测定 概述：防腐剂是指能防止食品腐败、变质，抑制食品中微生物繁殖，延长食品保存期的物质，它是人类使用最悠久、最广泛的食品添加剂。 目前，我国允许使用的品种主要有苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐、对羟基苯甲酸乙酯和丙酯、丙酸钠、丙酸钙、脱氢乙酸等。 第一部分、苯甲酸 一、实验原理：苯甲酸及苯甲酸钠在近紫外光区具有较强的吸收。通过查找资料，苯甲酸在 230nm处具有最大吸收。另一方面，它在水中具有适当的溶解度，所以，可将标样和样品处理成水溶液，采用紫外分光光度计，通过标准曲线法而实现酸性食品中苯甲酸（钠）含量的测定。 二、实验试剂及器材 试剂：无水乙醚(回收后可重复使用)、苯甲酸标准液(1mg/ml)、5%NaHCO3溶液、5%NaCL 溶液、(1+2v)盐酸溶液 器材：紫外分光光度计、125ml分液漏斗×2，铁架台一套，量筒100ml、容量瓶（100ml、50ml、）移液管（5ml×2、1ml×2）、胶头滴管、试剂瓶100ml×2、水浴锅、蒸馏回流装置一套。 三、实验步骤： 1、试剂准备：标准液：125.0mg苯甲酸+250ml无水乙醚 5%NaHCO3：5.0g NaHCO3+100mlH2O (1+2)HCl：20ml浓盐酸+40mlH2O 2、样品的处理：取酱油5.00ml于125nl分液漏斗中加入（1+2）盐酸2ml酸化，再用无水乙醚萃取三次，每次用量30ml，每次振摇1min。合并乙醚层于另一分液漏斗，用5%NaCl 溶液洗涤二次，每次5—10ml，然后蒸馏回收乙醚，用20ml、5%NaHCO3溶解、定容到100ml 容量瓶中。备用。 3、标准曲线绘制：取苯甲酸标准使用液0、0.1、0.2、0. 4、0.6、0.8ml分别置于100ml 容量瓶中，各加入5%NaHCO3溶液2ml，(1+2v)盐酸溶液2ml，加水至刻度，摇匀。放置15min,尽量让CO2逸尽。 用1cm吸收池于波长230nm处测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。 4、取样品处理液5ml于100ml容量瓶中加入(1+2v)盐酸溶液2ml,摇荡以排除CO2，加水至刻度、摇匀、放置15min，与标准系列一起进行比色测定，根据测得吸光度，在标准曲线上查出其对应量，就可以计算出样品中苯甲酸（钠）的含量。 四、数据处理： 苯甲酸含量=0.025mg/L×样品稀释倍数20×（100ml/5ml）=10.0mg/L 实验结果分析：本实验测得该酱油中的苯甲酸含量为10.0mg/L，高于国标中最低检出浓度 1 mg／kg，低于G B／T 5009．29—1996中最大被检出量 1.0g/k g。该酱油合格。 注意事项：
顺平县腰山镇中学学生化学实验报告单 实验题目：实验活动1：氧气的实验室制取与性质 班级：日期：指导教师： 第组姓名：同组人： 【实验目的】 1、学习实验室制取氧气的方法。 2、加深对氧气性质的认识。 【实验用品】 大试管、试管夹、单孔橡胶塞、胶皮管、玻璃导管、集气瓶、水槽、铁架台（带铁夹）、酒精灯、玻璃片、坩埚钳、细铁丝、木条、棉花、火柴。 高锰酸钾、木炭、澄清石灰水。 【实验步骤】 1、制取氧气 （1）仔细观察图2-17所示的装置，使用了哪些仪器 （） 哪部分是气体发生装置（） 哪部分是气体收集装置（） 为什么可以用排水法收集氧气（） （2）用带有导管的橡胶塞塞紧试管，检验装置的气密性。确认装置不漏气后，拔开橡胶塞，在试管中装入少量高锰酸钾，并在试管口放一团棉花，用带有导管的橡胶塞塞紧管口，把试管口略向下倾斜固定在铁架台上。（如图2-17所示） （3）将两个集气瓶分别盛满水，用玻璃片盖住瓶口，然后把盛满水的集气瓶连同玻璃片一起倒立在盛水的水槽内。 （4）加热试管。先使酒精灯火焰在试管下方来回移动，让试管均匀受热，然后对高锰酸钾所在的部位加热。 导管口开始有气泡放出时，不宜立即收集，当气泡连续并比较均匀地放出时，再把导管口伸入盛满水的集气瓶。待集气瓶里的水排完以后，在水面下用玻璃片盖住瓶口。小心地把集气瓶移出水槽，正放在桌子上。用同样的方法再收集一瓶氧气（瓶中留有少量水）。
（想一想：为什么刚开始有气泡放出时不立即收集） （5）停止加热时，先要把导管移出水面，然后再熄灭酒精灯。 2、氧气的性质 （1）如图2-18所示，用坩埚钳夹取一小块木炭，在酒精灯上加热到发红，插入到上面实验收集到的氧气中（有瓶口向下缓慢插入），观察木炭在氧气里燃烧的现象（）。燃烧停止后，取出坩埚钳，向集气瓶中加入少量澄清石灰水，振荡。有什么现象发生（） （2）点燃系在螺旋状细铁丝底端的火柴，待火柴快燃尽时，插入盛有氧气的集气瓶中（瓶中预加有少量水）。观察铁丝在氧气中燃烧的现象（）。【问题与交流】 1、检验装置的气密性时，除了用手紧握的方法外，还可以用什么方法 2、如果某同学制得的氧气不纯，你认为可能的原因有哪些 3、把红热的木炭插入盛有氧气的集气瓶时，为什么要由瓶口向下缓慢插入
防腐剂苯甲酸和山梨酸的高效液相色谱分析 一、实验目的 1、了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理，初步掌握其操作技能。 2、掌握高效液相色谱保留值定性方法和外标定量方法。 二、实验原理 高效液相色谱法是重要的液相色谱法。它选用颗粒很细的高效固定相，采用高压泵输送流动相，分离、定性及定量全部分析过程都通过仪器来完成。 根据使用的固定相及分离机制的不同，一般将高效液相色谱法分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和空间排阻色谱等。 在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度取决于它们在固定相和流动相之间的分配系数K ； 组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度 K 显然，K 越大，组分在固定相上停留时间越长，固定相与流动相间的极性差值也越大，因此，相应出现了流动相为非极性而固定相为极性物质的正相液相色谱法和以流动相为极性而固定相为非极性物质的反相液相色谱法。目前应用最广的固定相是通过化学反应的方法将固定液键合到硅胶表面上，即所谓的键合固定相。若将正构烷烃等非极性物质（如n-C18烷）键合到硅胶基质上，以极性溶剂（如甲醇和水）为流动相，则可分离非极性或弱极性的化合物。据此，采用反相液相色谱法可分离防腐剂苯甲酸和山梨酸。 本实验采用外标法测定样品中苯甲酸和山梨酸的浓度。外标法又称定量进样-标准曲线法，指用欲测组分纯物质配制成不同浓度的标准溶液，取固定量标准溶液进行分析，从所得色谱图上测出响应信号（峰面积或峰高），然后绘制响应信号（纵坐标）对浓度（横坐标）的标准曲线。分析样品时，取和制作标准曲线时同样量的试样（固定量进样），测得该样品的响应信号，由标准曲线即可查出其浓度。 三、仪器 DIONEX UltiMate3000（USA ） 高效液相色谱仪（配有自动进样器，紫外检测器）。
高效液相色谱方法的验证 ?方法验证的目的 ?方法验证的内容 ?方法验证的项目及测定方法
方法验证的目的 目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。 方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。
方法验证的内容 ?准确度 ?精密度 ?专属性 ?检测限 ?定量限 ?线性和范围 ?耐用性
准确度 定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。 1. 主成分含量测定 原料药：对照品或方法比对 2. 制剂、中药：标准加样回收 杂质定量 测定：加样回收（n 3 9） 杂质对照品 方法比对 回收率 C-A %=′ B 100% 杂质与主成分的相对含量 A:试验供试品中被测成分的量 （通常为含量测定量的50%） B: 试验供试品中加入的对照品的量 （通常为±20%） C:试验测定值
精密度 定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差 1. 重复性（n 9） 3 2. 中间精密度 3. 重复性 测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度， 分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。 同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。
专属性 定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。 1. 鉴别反应 2. 含量测定 杂质测定 测定： 限量检查 空白制剂，模拟复方 加速破坏试样测试 DAD峰纯度检查
液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解-不能不看的精华生活，就是面对现实微笑，就是越过障碍注视未来；生活，就是用心灵之剪，在人生之路上裁出叶绿的枝头；生活，就是面对困惑或黑暗时，灵魂深处燃起豆大却明亮且微笑的灯展。17过去与未来，都离自己很遥远，关键是抓住现在，抓住当前。液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解－不能不看的精华 液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解 苯甲酸、山梨酸、糖精钠是衡量食品卫生质量的重要指标，苯甲酸、山梨酸的检测参照GB/，糖精钠的检测参照GB/T ，即可开展实验。 苯甲酸、山梨酸、糖精钠虽是较常见的检测项目，但是要得到一个准确可靠的结果，也存在一定的难度，许多新手常出现因对方法理解发生偏差而检测出错的事故。笔者根据自己多年该方面工作的实际经验出发，以苯甲酸、山梨酸为着重点，从样品前处理、检测仪器的选择、超标时的判断等几个易出问题的方面，进行了详细的阐述。 2 样品前处理的注意事项 GB/和GB/ 在文字结构上有缺陷，在涉及用仪器法测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠时，只讲述了液体样品的前处理方法，没有涉及对固体样品的前处理。 食品样品往往含有大量的油脂、蛋白质，对提取极为不利；如处理不干净也会污染色谱柱，影响检测工作。这类样品处理的关键在于如何找到一种较理想的沉淀剂，尽量排除待测样品中的油脂、蛋白质，且不影响待测物组分的回收率。
GB/使用5％硫酸铜溶液沉淀蛋白，对于蛋白质含量较低的食品尚可，对于豆粉、奶粉、月饼等高油脂、高蛋白样品则沉淀效果不理想。如用10％钨酸钠溶液作为沉淀剂，效果好些；如用10％亚铁氰化钾溶液和20％醋酸锌溶液则效果更理想（这是笔者目前用过最理想的沉淀剂）。 具体操作步骤如下： 取一定量样品，捣碎，利用四分法原理称取样品克于50ml比色管中，加水20ml，浸泡、振荡均匀，加入氢氧化钠溶液(1mol/L) ml，加入%亚铁氰化钾溶液， 20%乙酸锌溶液，定容，振荡使其充分混匀后,用滤纸初滤除去沉淀物, 初滤液过μm微孔滤膜,收集滤液于样品瓶中，样品处理液和标准有溶液各进样5uL测定。 用这种方法简单易行，接触有机试剂少，重复性和回收率都令人满意；缺点是一定要用液相色谱法检测，有一定局限。 3 检测仪器的选择 虽然液相色谱仪操作起来比气相色谱仪要复杂，但笔者建议如条件许可仍尽量用液相色谱法检测。原因如下：
高效液相色谱 高效液相色谱仪 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。 目录 化学信息 基本信息 性状描述 物理说明 药理作用 危险说明 历史 特点 主要类型 结构组成 综述 高压输液泵 色谱柱 进样器 检测器 馏分收集器 数据获取和处理系统 分离原理 液—固色谱法 离子交换色谱法 离子对色谱法
离子色谱法 空间排阻色谱法 流程 使用方法 综述 色谱柱的理论板数分离度 拖尾因子 测定方法 综述 面积归一化法 主成分自身对照法内标法 外标法 设备选型 综述 相对分子质量 溶解度 化学结构 仪器设备 综述 高压泵 梯度洗提 进样装置 色谱柱 检测器 应用实例 化学信息 基本信息 性状描述 物理说明 药理作用 危险说明 历史 特点 主要类型 结构组成 综述 高压输液泵 色谱柱 进样器 检测器 馏分收集器 数据获取和处理系统
分离原理 液—固色谱法 离子交换色谱法 离子对色谱法 离子色谱法 空间排阻色谱法 流程 使用方法 综述 色谱柱的理论板数 分离度 拖尾因子 测定方法 综述 面积归一化法 主成分自身对照法 内标法 外标法 设备选型 综述 相对分子质量 溶解度 化学结构 仪器设备 综述 高压泵 梯度洗提 进样装置 色谱柱 检测器 应用实例 展开 化学信息 基本信息 中文名称：葛根素(HPLC),98% 中文别名：葛根黄酮，8-beta-D-葡萄吡喃糖-4',7-二羟基异黄酮 英文名称：Puerarin 英文别名：8-(β-D-Glucopyranosyl-7-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one 纯度：98% CAS号：3681-99-0 分子式：C21H20O9 分子量：416.38
高效液相色谱法测定手册 一目的：制定高效液相色谱法，规范高效液相色谱法的测定操作。 二适用范围：适用于高效液相色谱法的测定。 三责任者：品控部。 四正文 1 简述 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 高效液相色谱仪基本由泵，进样器，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705—90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
气相色谱法测定食品中的山梨酸、苯甲酸 邓燕 雅安职业技术学院 【摘要】本文介绍了采用氢火焰离子检测器及毛细管柱气相色谱测定食品中山梨酸、苯甲酸的快速检测方法。采用无水乙醚提取样品中的山梨酸、苯甲酸，反复振荡提取两次，经氯化钠酸性溶液盐析，无水硫酸钠脱水，旋转蒸发仪蒸干，丙酮定容后待测。用外标法定量，取1ul待测样，HP-FFAP石英毛细管柱内分离后进入FID检测器验证。结果表明100ug/ml浓度与峰面积有着良好的线性关系，相关系数大于0.999，山梨酸、苯甲酸的检出限为 1.0mg/kg，回收率为82.4%~92.0%，相对偏差为6.1%。此方法具有检出限低，检测快速，定量准确，操作性强，适用于山梨酸、苯甲酸的检测工作。 【关键词】气相色谱；山梨酸；苯甲酸；食品；测定 食品的保鲜和保存通常主要依赖于防腐剂，山梨酸又是被国际粮农组织和世界卫生组织重点推荐的，低毒、高效的防腐剂，主要用于儿童食品等新兴食品领域，而传统领域还在大量使用苯甲酸及其钠盐[1]。并且，每年山梨酸的需求量可达6500t,苯甲酸的需求也很可观[2]。并且，大量的毒理学试验表明：防腐剂成分用量过多会对人体肝脏产生危害，甚至致癌。因此，对山梨酸、苯甲酸的检测技术的研究已成为一种必然。目前，对其进行检测主要方法有气相色谱法、高效液相色谱法及毛细管电泳法等。[3]]本文选用气相色谱法测定食品中的山梨酸、苯甲酸，探求有效提取食品中的山梨酸、苯甲酸的有效方法，确定检测的最佳线性关系及最低检测限值。 1实验方法 1.1主要仪器和试剂
美国Agilent7890A气相色谱仪，配置有自动进样器，附有FID检测器，选配Agilent的HP-FFAP(30m×0.32mm×0.25um)毛细柱。瑞士旋转蒸发仪、50ml 的比色管。 丙酮（色谱纯）、无水乙醚（分析纯）、氯化钠（分析纯）、无水硫酸钠（分析纯）、浓盐酸、山梨酸、苯甲酸的标准品均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。 1.2 试剂配制及前期处理 6mol/ml的盐酸配制：用浓盐酸的浓度12mol/l，稀释至6mol/ml备用 5%氯化钠酸性溶液的配制：在5%的氯化钠溶液中，加入10ml的冰醋酸，使其呈酸性(PH=4.5)。 无水硫酸钠（分析纯）:在700摄氏度下烧灼4小时，密封瓶中备用。 1.3 GC条件 选配毛细柱HP-FFAP（30m×0.32mm×0.25um），载气为高纯氮气（纯度≧99.9%），进样方式：分流进样（分流比=10:1）。进样器温度：200℃检测器温度：250℃ 柱温： 150℃→220℃（3min）,以30℃/min的速率升温 载气流速（氮气）：2.0ml/min 氢气流速：30ml/min 空气流速：400ml/min 1.4标准溶液的配制; 储备液的配制： 1.4.1山梨酸储备液的配制：称取0.050g的山梨酸的标准品，于50ml的容量
实验四高效液相色谱法测定有机化合物的含量 [目的要求] 1、了解仪器各部分的构造及功能。 2、掌握样品、流动相的处理，仪器维护等基本知识。 3、学会简单样品的分析操作过程。 [基本原理] 高效液相色谱仪液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。 液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广，键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。 反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37―）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的碳十八柱。 [仪器试剂] 高效液相色谱仪（包括储液器、高压泵、自动进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、工作站）、过滤装置 待测样品（浓度约100 ppm）、甲醇、二次水 [实验步骤] 1、仪器使用前的准备工作 （1）样品与流动相的处理 配好的溶液需要用0.45 μm的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。 水、甲醇等过滤后即可使用；水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理，或使用色谱纯的流动相。 （2）更换泵头里清洗瓶中的清洗液 流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用50%的甲醇；如果流动相含有电解质，通常用95%去离子水甚至高纯水。 如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。（3）更换托盘里洗针瓶中的洗液 洗液一般为：50%的甲醇。
实验二 高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因 一、目的要求 1、学习高效液相色谱仪的操作。 2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。 3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。 二、基本原理 咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因约为1.2~1.8%，茶叶中约含2.0~4.7%。可乐饮料、APC 药片等中均含咖啡因。其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式为： N N CH 3 H 3C O O N N CH 3 定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R 和峰面积A 后，可直接用t R 定性，用峰面积A 作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。 三、仪器和试剂 1、Agilent 1100高效液相色谱仪。 2、色谱柱：Kromasil C18，5μ 150×4.6mm 。 3、流动相：30%甲醇（色谱纯）+70%高纯水；流动相进入色谱系统前，用超声波发生器脱气10min 。 4、 咖啡因标准贮备溶液：将咖啡因在110℃下烘干1h 。准确称取0.1000g 咖啡因，用二次蒸馏水溶解，定量转移至100mL 容量瓶中，并稀释至刻度。标样浓度1000μg·mL -1。 5、测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。
高效液相色谱仪常用的检测器及其性能 (1)紫外吸收(UV)检测器 UV检测器是目前HPLC应用最广泛的检测器。它是依据光吸收原理，以适当的光路和电路，输出一个与试样组分浓度成正比的紫外一可见光吸收信号，其结构与一般光度计相似。其流通池是组分流过的光学通道，池体积一般为8μl，内径小于lmm，长度10mm左右。这种检测器灵敏度高，线性范围宽，对流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱分离。紫外吸收检测要求被检测样品组分有紫外一可见光吸收，而使用的流动相无吸收，或在被测组分吸收波长处无吸收。一般选择在欲分析物有最大吸收的波长处进行检测，以获得最大灵敏度和抗干扰能力。在没有最大吸收时，可采用末端吸收。检测波长的选择除取决于待测物质的成分和分子结构外，还必须考虑流动相组成、共存组分干扰等因素。特别是各种溶剂都有一定的透过波长下限值，超过这个波长，溶剂的吸收会变得很强，以至于不能很好地测出待测物质的吸收强度。表1列出了HPLC中一些常用的溶剂透过波长的下限。 (2)光电二极管阵列(IJDA)检测器 PDA检测器又称为二极管阵列检测器(diode array UV detector，DAD)，这种检测器以光电二极管阵列作为检测元件，可进行多通道并行检测，在一次色谱测量中，可同时获得时间、波长、吸光度三者的关系，通过计算机处理，在荧光屏上显示出三维图谱，也可作出任意波长的吸光度一时问曲线和任意时间的吸光度一波长曲线。DAD的光路与紫外检测器不同，光源发出的光聚焦后先通过检测池，通过检测池的透射光由全息光栅色散成多色光，不同波长的色散光按波长顺序聚焦在阵列元件上，每个元件对应一定的纳米数。当光照射到光电二极管时，光电二极管产生讯号。由于色散过程及透射光的检测是全波长范围的，可在瞬间检测流经检测池的全吸收光谱，得到三维色谱一光谱图。计算机化的数据处理，还可进行色谱峰光谱相似性比较、峰纯度检测及利用谱图库对掣定样品进行检索等，为定性、定量分析提供更丰富的信息。 ①多通道多波长检测可以同时得到多个波长的色谱图，每个成分均可在最佳波长下检测定量。 ②光谱相似性比较在HPLC中，两个物质出峰时间一致并不能完全说明为同一物质，通过色谱峰紫外光谱一致性比较，可提高测定的可靠性。 ③峰纯度检测对色谱峰峰顶、上、下3个点的光谱进行比较，完全吻合意味这是1个单组分峰，不吻合则表示为未分离峰。并可计算出纯度系数PI，PI值在0~1之问，越接近1，表示峰纯度越好，PI可由计算机自动计算。 ④光谱检索与比较二极管阵列检测器得到的光谱图可分类存储到光谱库中，当测定类似成分时，可调出相关谱图，进行检索和比较，也可通过比较光谱相似系数比较相似性。
紫外分光光度法测定山梨酸及苯甲酸 2009-11-10 15:16:32| 分类：默认分类| 标签：|字号大中小订阅 为了防止食品在储存、运输过程中发生变质、腐败，常在食品中添加少量防腐剂。防腐剂使用的品种和用量在食品卫生标准中都有严格规定。苯甲酸和山梨酸以及它们的钠盐、钾盐是食品卫生标准允许使用的两种防腐剂。苯甲酸具有芳烃结构。在波长228nm和272nm处有K吸收带和B吸收带；山梨酸具有α、β不饱和羰基结构。又称花椒酸，其化学结构为： 为了防止食品在储存、运输过程中发生变质、腐败，常在食品中添加少量防腐剂。防腐剂使用的品种和用量在食品卫生标准中都有严格规定。苯甲酸和山梨酸以及它们的钠盐、钾盐是食品卫生标准允许使用的两种防腐剂。苯甲酸具有芳烃结构。在波长228nm和272nm处有K吸收带和B吸收带；山梨酸具有α、β不饱和羰基结构。又称花椒酸，其化学结构为：CH3CH=CHCH=CHCOOH 在波长250nm处有π→π*跃迁K吸收带，因此，根据它们的紫外吸收光谱特征可以对它们进行定性 和定量测定。 由于食品中防腐剂用量很少，一般在1/1000左右，同时食品中其它成分也可能产生干扰，因此，需要预先将防腐剂与其它成分分离，并经提纯浓缩后进行测定。常用的从食品中分离防腐剂的方法有蒸馏法和溶剂萃取法等。本实验采用溶剂萃取法，用乙醚将防腐剂从样品中提取出来，再经碱性水溶液处理及乙 醚萃取以达到分离、提纯的目的。 采用最小二乘法处理标准溶液的浓度和吸光度数据，以求得浓度与吸光度之间的回归直线方程，并 根据直线方程计算样品中防腐剂的含量。 在波长250nm处有π→π*跃迁K吸收带，因此，根据它们的紫外吸收光谱特征可以对它们进行定性 和定量测定。 由于食品中防腐剂用量很少，一般在1/1000左右，同时食品中其它成分也可能产生干扰，因此，需要预先将防腐剂与其它成分分离，并经提纯浓缩后进行测定。常用的从食品中分离防腐剂的方法有蒸馏法和溶剂萃取法等。本实验采用溶剂萃取法，用乙醚将防腐剂从样品中提取出来，再经碱性水溶液处理及乙 醚萃取以达到分离、提纯的目的。 采用最小二乘法处理标准溶液的浓度和吸光度数据，以求得浓度与吸光度之间的回归直线方程，并 根据直线方程计算样品中防腐剂的含量。
标准操作规程 1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1.色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分
离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2?8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。 4.1.2.检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应。结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定围呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 4.1.3.流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。 正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变围为0.7X?1.3X；当X大于33%时，允许改变围为X—10%?X+10% 。
此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC 主要内容包括： 1.高效液相色谱法（HPLC）的概述 2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼） 3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类 4. 液相色谱的适用性 5.应用 高效液相色谱法（HPLC）的概述 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。 由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有5 0种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。 高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。 目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）为最常使用的化学键合相。 根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相
的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。 在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。 系统组成： （一）高压输液系统 由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。 1.贮液罐 由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。2.流动相 流动相常用甲醇-水或乙腈－水为底剂的溶剂系统。 流动相在使用前必须脱气，否则很易在系统的低压部分逸出气泡，气泡的出现不仅影响柱分离效率，还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。脱气的方法有加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。 3.高压输液泵 是高效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。对泵的要求是：耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量范围宽、流速恒定，且泵体易于清洗和维修。高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵（其压力随系统阻力改变而流量不变）。 （二）进样系统 常用六通阀进样器进样，进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置（L OAD），此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置（INJECT），使定量环接入输液管路，样品由高压流动相带入色谱柱中。 （三）色谱柱 由柱管和填充剂组成。柱管多用不锈钢制成。柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶（又称ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷键合硅
酱油中苯甲酸和山梨酸含量测定 摘要：目的：采用碱溶液反相萃取—高效液相色谱法（HPLC）测定酱油中苯甲酸和山梨酸。方法：以国标萃取法为基础，再对其用碱溶液进行反萃取的方法，对酱油样品进行前处理，通过加内标物的方法提高实验的精确度。结果：苯甲酸和山梨酸的线性回归相关指数都大于0.99、最小检出限（LOD）都低于0.1ppm，加标回收率皆大于84%，相对偏差皆小于16%。结论：该方法灵敏、可靠，可用于酱油中苯甲酸和山梨酸的快速定量检测。 关键词：反相萃取；高效液相色谱法；酱油；苯甲酸；山梨酸 酱油是我国传统的、富有特色的、使用最广的、味道鲜美的调味品，它赋予食品以适当的色、香、味，具有杀菌治病、调味之功用。由于酱油营养丰富，适于微生物生长繁殖，而微生物又是到处不在无孔不入，所以细菌、霉菌和酵母之类微生物的侵袭通常是导致酱油败坏的主要因素。为了保藏酱油，防止酱油腐败变质，保持酱油的鲜度和良好的品质，达到其对保质期的要求，酱油中一般都使用食品常用防腐剂—苯甲酸和山梨酸，但过多防腐剂会严重损害人体健康，国家对防腐剂的使用有严格限量规定，因而检测酱油中防腐剂的含量具有重要意义。 目前酱油中苯甲酸和山梨酸的测定方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法和薄层色谱法，其中高效液相色谱法因其仪器精确度高，在苯甲酸和山梨酸的检测中最常用。对于酱油的前处理国标是对其先进行酸化，再通过乙醚进行萃取，除此之外还有其他诸多方法，如对粘度比较大的进行固相萃取、通过加入亚铁氰化钾和乙酸锌溶液沉淀蛋白质、脂肪并过滤后进行测定、还有就是本文所用的对国标处理后的样品进行碱溶液反相萃取。这样可以大大的减少样品中的杂质，从而减少了杂质峰对高效液相色谱检测的影响。另外本文所采用的内标法的处理方法是一个创新之举，避免了外标法测定时前处理萃取不完全以及其他处理过程带来的损失从而大大的提高了检测的准确度。 1 实验部分 1.1 溶液配制 乙酸铵溶液( 0. 02 mol /L) : 准确称取乙酸铵1. 542 g, 用水溶解, 定容至1 000 mL, 经0. 45Lm 膜过滤。 苯甲酸、山梨酸、肉桂酸储备液（1000lg/ml）：准确称取100mg苯甲酸、山梨酸对照品，50mg肉桂酸标准品与3个不同的50ml小烧杯中，加甲醇溶解后，转移到对应的100ml、100ml、50ml的容量瓶中，苯甲酸、山梨酸对照品加水稀释至刻度，肉桂酸标准品加甲醇稀释至刻度。置于4℃冰箱中。 苯甲酸、山梨酸混合溶液的标准溶液：用移液管分别移取苯甲酸储备液和山梨酸储备液各2ml、4ml、6ml、8ml、10ml于5个不同的100ml容量瓶中，再分别向个容量瓶中加5ml肉桂酸储备液，然后加超纯水稀释至刻度，由此得到20ppm、40ppm、60ppm、80ppm、100ppm的苯甲酸和山梨酸混合溶液的一系列标准溶液，其中每份苯甲酸、山梨酸混合溶液标准溶液中均含内标物肉桂酸50ppm。 1.2 样品的制备 1.2.1 乙醚萃取 称取1g左右（精确至0.0001g）酱油样品与25ml带塞锥形瓶中，加2.5ml 100ppm肉桂酸标液，0.25ml 的0.1mol/l盐酸溶液混均，加乙醚9ml，超声一分钟，静置分层，用针筒吸取乙醚萃取液至10ml大试管中。 1.2.2 碱液反萃取 向乙醚萃取液试管中加1ml的0.1mol/l的氢氧化钠溶液反萃取1分钟，静置分层，乙醚层尽量吸去，将氢氧化钠萃取液试管加入40℃水浴中10分钟挥去残留乙醚，将溶液5ml容量瓶中，加水稀释至刻度，使用前测定ph（ph需大于3，否则会损坏色谱柱），过0.45lm水系滤膜2次，供液相色谱仪分析。